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La présente invention concerne un procédé d'accroisse-
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ment d'adrânooorticotrophine et plus particulièrement un procédé de aorication d'un produit d'hormone adrénocorticotrophique
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présentant une puissance accrue lors le 1'administration sous-
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cutanée, ainsi que le produit d'adrénocorticotrophine obtenu ;3.r ce procédé.
Liadrénocorticotrophine est la SLi.bs t8.dC<;; sécrétée par 1-es glandes pituitaire de uauuiiiî ères qui stimule la production ue st3ro.de à action biologique par .! substance corticale de la .glande ±::J.rdnale. Au cours des dernières années, l t C!'1X'Gl1ocortico- trophine a été extraite des glandes pituitaires de ma:nn2.:'.res,
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tels que porcs, bovins et moutons et, après épuration., adminis- trée à des animaux domestiques et à des êtres humains, pour le traitement de certaines maladies.
L'activité de produit d'adrénocorticotrophine peut être mesurée par la déplétion dans la teneur d'acide ascorbique de la glande animale dans des rabs hypophysectomisés suivant le mode opératoire d'essai sous-cutané de corticotrophine selon le Codex U.S. Dans les êtres humains, la détermination de -L'activité d'adrénocorticotrophine peut être obtenue en déterminant; la réduction de concentration éosinophile du sang, ensemble avec l'élévation dans le niveau sanguin de stéroïdes et l'accroissement dans l'excrétion de cétostéroïdes.
On a trouvé qu'un extrait d'acétone à 70% acide déshydraté de tissu pituitaire présente une puissance d'adrénocorticotrophine par administration sous- cutanée d'environ 0,3 à 2 unités par mg. Le brevet américain No 2.669.536, déposé le 15 Août 1950 décrit un procédé d'épu- ration d'adrénocorticotrophine, qui consiste à amener un concentré aqueux brut d'adrénocorticotrophine en contact avec une matière cellulosique à un pH d'environ 4,5 pour adsorber l'adrénocorticotrophine sur cette matière et ensuite à séparer par élution l'adrénocorticotrophine de la matière cellulosique avec une solution aqueuse a u.. pH d'environ 1,0 à 1,5.
Le traitement d'un concentré aqueux brut d'adrénocorticotrophine porcine par ce procédé donne un produit ayant une puissance sous-cutanée d'environ 40 unités Codex US. par mg. Ainsi, ce pro- duit montre une puissance sous-cutanée d'environ 20 à 130 fois supérieure à celle de l'extrait d'acétone acide déshydraté prémentionné de tissu pituitaire, mais, d'une manière surprenante, l'épuration sur la base de solides n'est que de l'ordre de 6 à 40 fois.
En conséquence, l'adrénocorticotrophine porcine traitée par le procédé du brevet pr@mentionnée présente une puissance sous-cutanée environ triple de ce que l'on pourrait attendre de la réduction en solides. cependant, un accroisse- ment de la puissance sous-cutanée de cette importance n'est pas obtenu par le traitement d'adrénocorticotrophine bovine ou
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ovine par le procédé de ce brevet. En conséquence, on ne considère actuellement pas possible d'utiliser des glandes pituitaires de ooeufs et de moutons comme source d'adrénocortico- trophine pour des usages pharmaceutiques..
De même, étant donné que le mode d'administration sous-cutané est avantageux dans la pratique médicale et étant donné que les sources de glan- des pituitaires sont insuffisantes pour satisfaire les nécessités un thérapeutiques, il y a/besoin continu de procédés pour accroître la puissance sous-cutanée d'adrénocorticotrophine dérivée d;une source quelconque.
L'invention crée précisément un procédé renforçant la puissance de préparations d'adrénocorticotrophine. Cet accrois- sement de puissance -se manifeste notamment dans l'administration sous-cutanée. Le produit obtenu par ce procédé est complètement soluble dans l'eau dans la gamme de pH neutres. L'invention ' augmente notamment la puissance sous-cutanée d'adrénocorticotro- phine porcine dans une plus grande mesure que l'accroissement obtenu par le fractionnement sur une matière cellulosique. Le procédé accroît la puissance sous-cutanée d'adrénocorticotro- phine bovine et ovine à un niveau au moins comparable à celui d'adrénocorticotrophine porcine obtenu par le procédé du brevet précité.
L'invention crée aussi un dérivé d'adrénocorticotro- phine de tissus pituitaires bovins et ovins qui montre une puis- sance sous-cutanée au moins aussi grande que celle de l'adrénocor- ticotrophine porcine obtenue par le procédé du brevet'précité qui est complètement soluble dans l'eau dans la gamme de pH neutres.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention rassortent de la description qui suit.
L'accroissement de puissance d'adrénocorrticitrophine peut être obtenu en faisant incuber un mélange aqueux d'adréno- corticotrophine à un pH rentrant dans la gamme de pH 4,5 à 8.
La durée nécessaire pour obtenir le renforcement maximum de puis- sance d'adrénocorticotrophine est diminuée lorsque la température' du mélange aqueux d'adrénooorticotrophine cet élevée à une
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limite de cempâratiure supérieure au-dessus de laquelle Ita(ir3liocorticotropiiine serait détruite dans ce mélange aqueux.
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Par exemple, à la température ambiante, le temps nécessaire .pour obtenir l'accroissement maximum de puissance d'adrénocorico- trophine peut être de plusieurs mois, tandis qu'à une tempé- rature d'environ 100 C un accroissement équivalent de puissance d'adrénocorticotrophine peut être obtenu en quelques heures. De même, étant donné que la pureté de l'adrénocorticotrophine est augmentée, la durée nécessaire pour l'accroissement maximum de .
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sa puiobaace dans ce procédé est diminuée.
Par exemple, le
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renforcement maximum de la puissance d'un mélange aqueux d'un
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extrait d'acétone acide déshydraté de tissu pitui-caire de boeuf, incubé à uno température de 100 C environ, à un plî rentrant dans la oHJ,le pralüentionnie, peut être obtenu en 18 à 30 heures envi- ron, tandis qu'environ 8 , 12 heures peuvent être nécessaires'
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sous cas conditions d'incubation pour produire un renforcement équivalent de puissance d'adrénocorticotrophine bovine épurée par le procéda du brevet précité.
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Bien que , dans cergains eus, ce procédé puisse avoir pour résultat un accroissements de puissance d'adrénocorticotro-
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phine démonbré par injections intraveineuses, on a trouvé que
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l'augmentation de puissance d'aurénocorticotrophine manifestée par administration sous-cu tc..:.n5e est beaucoup plus poussée et, étant donné Que le mode d1 administration sous-CUtJ.i13 est avantageux dais la ...-Ir.... Gh¯ue ..,:dicale, il est particulièrement désirable.
Par exemple, l'airénocorticotrophine porcine obtenue
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par le procédé du brevet précité,et soumise au traitement prémen-
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tionné, montre un ac,:roi.:e"ent de puissance sous-cutanée de l'or- dre de 20 u 50 , tandis que l'accroissement de puissance sous- cutanée obtenu par l'adr5nocorticotrophine bovine préparée de J.<..çon analogue peut âtre ue ijs à 400 >J et, éventuellement, jusqu'à 500 ;". Ce pout ,3t.r\3 utilisé pour accroître la puiosauce sous-cutdiiôu d'airétiocorbicobrophine dérivée de tissus pituitaires de ::d"u,.isras..
De iueilleures résultats peuvent être obtenus avec de l'a.rno;orticotroi.iine ovine et spécialement
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l'accroissement de.Lraole de puissance sous-cutanée est obtenu avec 11 adrénocorticotrophine bovine Bien que ce procédé soit particulièrement applicable aux produits d'adrénocorticotrophine d'une pureté appropriée pour l'administration parentérale, tels que l'adrénocorticotrophine obtenue par le procédé du brevet précité, il peut être utilisé dans le traitement de préparations
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doadrénocortîco rophine relativement brutes, telles que l'extrait à l'acétone acide déshydraté prémentionné de tissus pituitaires et il peut rationnellement être appliqué directement sur le tissu. pituitaire même.
Dans le traitement prémentionné, le mélange d'adréno- corticotrophine doit être incubé.à une température d'au moins 15 C. Cependant, pour assurer l'accroissement maximum de puissan- ce dladrénocorticotrophine sous-cutanée en un laps detemps per-
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mettant une exploitation industrielle, la temp0r: ¯: : dlincub"a- tion peu être de 50 à 150 C. Les meilleurs r0suJ..l,,,,t.:; sont obte- nus à une température de 75 à 125 C et un accroissement particu- lièrement désirable de la puissance d'adrénocorticotrophine dans la fabrication sur une grande échelle peut être obtenu à une tem- pérature de 1CO C environ.
Dans la mise en oeuvre préférée de l'invention, on incorpore dans le mélange aqueux, pendant l'incubation, un agent
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réducteur contenant au moins urygroupe su11yéir,yle. On a trouvé que l'activité d'adrénocorticotrophine manifestéelors de l'adminis- tration sous-cutanée a tendance à être réduite ou annihilée aux températures supérieures qui sont désirables pour produire 1'accroissement maximum de cette puissance sous-cutanée en un laps de temps permettant l'application industrielle de ce procédé.
Ainsi, bien qu'il y ait un accroissement total de la puissance, tout l'avantage de ce procédé ne peut pas être obtenu par suite
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de la perte d'une partie de la puissance da crtocortiootrophine sous-cutanée. Cette perte partielle de puissance peut être rédui- te en incluant dans le .élan -. aqueux d'adrénooorticotrophine, au cours de l'incubation, un a,,erib réducteur de la nature prémen- tionn3c, tel qu'acide sulyr7.rïque, bien qu'une meilleure stabi-
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lisation puisse être obtenue avec un agent réducteur organique contenant au moins un groupe sulfydryle, tel que le beta-
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mercapto-éthanol et l'acide thioglycolique, des résultats parti- culièrement bons étant atteints avec la cystiiae.
Cet agent stabilisateur à base de cystéine peut être une base de cystéine-1 ou du chlorhydrure de cystéine -1. Cependant, il semble que le ohlorhydrure de . ey.stéine-1 peut diminuer la réaction dans une certaine Masure par suite de la formation de chlorure de sodium
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co..I,ne sous-produit de réaction.
Cet agent réducteur peut être inclus dans le mélange d'incubation d'àdrénocortiootrophine à une concentration d'au coins ,025 , (poids/volume) et lorsque, par exemple, la cystéine est incorporée dans le mélange, son effet stabilisant peut Être
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plus rationnellement obtenu à une 'concentration de 005 à 5,0 zoo
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(poids/ volume) . Los meilleurs résultats sont obtenus avec c'.. la cystéine à une .concentration entre 0,5 et le5 &. (poids/volume), puis une stabilisation spécialement désirable avec de la cystéine est assurée à une concentration d'environ 1,0 (poids/volume).
Bien que la stabilisation d'activité d'adrénocortico- trophine sous-cutanée nouvellement produite par cet agent réduc- teur puisse être effectuée en faisant incuber le mélange aqueux
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aladrénocorticotroptiine à un pH rantrant dans la gamme de 4,5 à 8 de meilleurs résultats peuvent être obtenus à un pH entre 5,5 et 7,5, puis une stabilisation particulièrement désirable . est obtenue à un pH d'environ 6,5. Le réglage d'un mélange aqueux
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acide d'adrénocorticotrophine à un pH rentrant dans la gaJ1ane critique peut être obtenu avec tout agent alcalinisant, tel que phosphate trisodique, bien qu'un plus haut degré d'accroisse- ment soit, obtenu lorsque cet aent alcalinisant
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est de l'hJtiXoxjQe de sodium.
On a eut outre trouvé que l'inclusion de gélatine dans . le mélange aqueux d'adrénocorticotrophine élève la vitesse à laquelle la puissance d'adrénocorticotrophine sous-cutanée est accrue à toute température d'incubation, bien que le niveau
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maximum d'accroissement puisse être quelque peu inférieur à celui obtenu en faisant incuber un tel mélange aqueux en l'absence de gélatine. Toute gélatine de qualité pharmaceu- tique peut être utilisée dans ce procédé, par exemple de la .gélatine précurseur-acide, bien qu'un plus haut degré d'ac- croissement soit semble-t-il obtenu avec de la gélatine pré- curseur-alcalin.
Par "pharmaceutique", on entend que la palatine serait appropriée à l'infection sur des êtres humains lorsque l'adrénocorticotrophine est destinée à l'usage humain et appropriée à l'injection sur des animaux lorsque l'adrénocorticotrophine est destinée à des usages vétérinaires.
La gélatine peut être incluse dans le mélange aqueux d'adréno- corticotrophine à urie concentration entre 8 et 40% (poids/ volume, mais lorsqu'on utilise une gélatine partiellement hydrolysée, une concentration de cette gélatine entre environ 12 et 18% ( poids/ volume) a une fluidité désirable. Cependant lorsqu'une gélatine plus complètement hydrolysée ayant un point de gélification inférieur à 22 C est incorporée dans un mélange aqueux de cette nature, la fluidité désirée peut être obtenue à une concentration d'environ 28% et parfois à une concentration aussi élevée qu'environ 32% (poids/volume)..
Des extraits acides de tissus pituitaires et d'adrénocor- ticotrophine obtenus par le procédé du brevet précité sont relativement insoluoles dans l'eau dans la gamme de pH neutres.
Aussi, une adrénocorticotrophine de ce type lore une suspen- sion ou dispersion lors du mélange avec de l'eau dans le trai; tement de cette invention. L'incubation de cette suspension ou dispersion aqueuse pour 'accroître la puissance sous-cutanée de l'adrénocorticotrrophine qui s'y trouve a pour résultat la solubilisation de la majeure partie de l'élément d'activité d'adrénocorticotrophine, tout en laissant une faible partie d'un résiuu insoluble sensiblement inactif.
Cette fraction soluble d::.ns l'eaupeut être séparée de la fraction insoluble dans l'eau pour donner une adrénocorticotrophine présentant une puissance accrue par rapport à l'élément de
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puissance sous-cutané qui est complètement solubla dans l'eau
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dans la gauiiae de pH neutres. La s5po.rd"tiol1 de cette fraction soluble du résidu insoluble peut être obtenue par filtrage . centrifugation, etc.
On ne comprend pas complètement le mécanisme de ce phénomène d'accroissement de la puissance sous-cutanée, mais on croit que l'on obtient une transforma- tion de la structure moléculaire d'adrénocorticotrophine dans ce traitement et que cela donne un nouveau produit de la
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nature pr5wentionnée. Bien que, COl1Üle on l'a rj,,iiurou6 dans ce qui précède, ce phénomène soit produit dans une certaine mesure avec toute adr6nocorticotro itinee une plus grande modi- fication est obtenue avec de lladrénocorticotrophine ovine et un changement particulièrement désirable est produit avec de 3.'adrénocorticotrophine bovine.
L'effet stabilisant de l'agent réducteur spécial-, par ' exemple la eystéine, sur l'activité d'adrnocort;1cotr J.)üÍne produite par ce procédé peut être obtenu pendant l' (;;l.\lIa;;a8i- nage du produit d'adrénocorticotrophine résultant ..Il incluant
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dans une solution aqueuse de ce dernier la con Dau2ation indiquée dans ce qui précède de cet ajent réducteur li un pli rentrant dans la gamme critique.
Un élément de conservation, tel qu'acide pa.:r:'ab8ÜZoï'lue de méthyle ou d'éthyle, peut aussi être incorpora dans le
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mélange aqueux d'adrénocorticotrophine pendant l'iacuoation ou dans la solution aqueuse du produit d'adrénocorticotrophine résultant, Cependant, des résultats particulièrement d3&!irabl.s sont obtenus avec un agent conservateur ayant une action
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anesthésique locale lors de l'administration parMnt#r ale, tel que phénol. Une concentration convenable de, par exemple, phénol dans la solution aqueuse d'au rnocorticotrophine peut être;d'environ 0,5 4.
ZtadrênocorticotrophinQ à action accrue obtenue par ce procédé peut être épurée par 2n nouveau fractionnement avec, par exemple, des résines d'échange ionique ou elle peut être empaquetée pour l'utilisation comme préparation thérapeutique.
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La solution aqueuse d'adrénocorticotrophine résultant de ce procéda peut être stérilisée par filtrage ou. traitement à l'autoclave et on peut ensuite la mettre dans des flacons - pharmaceutiques appropries. Lorsque la gélatine est incluse dans le mélange de réaction d'adrénocorticotrophine, la géla- tine aqueuse d'adrénocorticotrophine résultante peut être utilisée directement dans la préparation du produit d'adréno- corticotrophine de puissance accrue.
L'invention peut être en outre illustrée par les exemples particuliers suivants ; Exemple @
2oo mg de base de cystéine,-l furent ajoutés à 20 ml d'une solution aqueuse d'adrénocorticotrophine porcine préparée suivant le brevet précité. La solution, obtenue fut réglée à ' un pH de 7,4 avec une solution à 10% d'hydroxyde de sodium.
Ce réglage de pH eut pour résultat la formation d'un précipité dans la solution. Ce mélange fut versé dans un flacon en verre et le :flacon fut fermé d'une manière étanche aveo un bouchon de caoutonouc et un joint d'aluminium.
Le flacon fermé hermétiquement fut immergé dans l'eau .bouillante pour incubation. Des parties du produit contenu dans le flacon furent retirées à des intervalles de temps déterminés. Ces parties furent combinées avec de la gélatine aqueuse à 16 /J contenant 0,5% de phénol pour l'essai par le mode opératoire de gélatine sous-cutanée Codex US.
La température d'incubation moyenne était de 90 à 100 C. Les résultats d'essai furent les suivants :
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Intervalles de temps Puissance (Unités Codex US par lui) (minutes)
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<tb> 0 <SEP> 252
<tb>
<tb> 15 <SEP> 256
<tb>
<tb> 30 <SEP> 220
<tb>
<tb> 60 <SEP> 176
<tb>
<tb> 120 <SEP> 504
<tb>
<tb> 240 <SEP> 320
<tb>
<tb> 480 <SEP> 260
<tb>
Ces résultats indiquant que l'accroissement maxium de la puissance sous-cutanée d'adrénocorticotrophine porcine praparée par le procédé du brevet précité peut être produit en deu heures, ehviron à une température de 90 à 100 C et qu'ensuite l'activité tombe très rapidement.
. Exemple 2
200 mg de base 1-cystéine furent ajoutés à 40 ml d'une solution aqueuse d'adrénocorticotrophine porcine préparée sui- vant le brevet précité. La solution résultante fut réglée à un pH de 6,5 avec une solution à 105 d'hydroxyde de sodium, après quoi un précipité fut formé dans la solution.
Une partie de ce mélange, 4 ml, fut versée dans un flacon de verre d'une contenance de 5 m1. L'air contenu, dans le flacon rempli fut refoulé par de l'azote et le flacon fut fermé hermétiquement. Le flacon rempli fut introduit dans un four à une température de 100 C. Des parties , du contenu de ce flacon furent retirées à des intervalles de temps dssirés pendant l'incubation. Ces parties furent combinées avec de la gélatine aqueuse à 16 % contenant 0,5% de phénol pour essai par le mode opératoire à gélatine sous-cutanée suivant Codex US.
Les résultats furent les suivants Intervalles de temps Puissance (Unités Codex US par ml) (geures)
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<tb> 0 <SEP> 530
<tb>
<tb> 1 <SEP> 545
<tb>
<tb> 2 <SEP> 670
<tb>
<tb> 3 <SEP> 675
<tb>
<tb> 4 <SEP> 450
<tb>
<tb> 20 <SEP> 510
<tb>
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E..d.ple 3 De 1 t adrénücor ticotrclhne porcine brute, par exemple avant épuration, suivant le brevet précité, en une quantité de
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210 m, fut dissoute dans 30 ml d'eau réglée au pH °,0 à l'acide acétique. On additionna à la solution résultante 150 mg d'un chlorhydrure de Cjstéine-1 et cette solution fut rlée au pH 7,3 avec une solution à 10% d'hyiroxyde de sodium. Ensuite un précipité fut formé dans la solution.
Ce mélange fut versé dans un flacon de verre et le flacon rempli fut fermé hermétiquement. Ce flacon fut ensuite placé pour incubation sous une température de 90 à 100 C et des parties de son contenu furent retirées à des intervalles de temps choisis au cours de l'incubation. Ces parties furent com-
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binées avec de la gélatine aqueuse à 16 coa-tenant 0,5 / - de phénol pour essai par le mode opératoire à gélatine sous- cutanée suivant Codex US.
Les résultats furent les suivants :
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Intervalle de taups waissance (Unités Codex US par mil) (heures) ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
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<tb> 0 <SEP> 0,8
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1 <SEP> 1,1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2 <SEP> 1,09
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 4 <SEP> 1,1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 6 <SEP> 1,1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 8 <SEP> 2,2
<tb>
Ces résultais indiquent que l'accroissement maximum de puissance sous-cutanée est obtenu avec de l'adrénocorticotrophine porcine brute en au ,Joins 8 heures à une température d'au moins 90 à 100 C et à un pH de 7,3.
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:8....;,.::pl e 4 De 1 'aarénocoruicotrophine bovine, préparée par le précité procédé du breveta en une quantité de 210 mg fut dissoute dans
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30 Mil d'eau réglée au p73 °,5 . l'acide acétique. On ajouta à la solution ootenue 150 ,..; de chlorhydrure de oystéine-1. Cette solution fut réglée au pi-i 7,2 avec un solution à 10 I d'hydroxycb
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de sod@um, après quoi un précipité se forma dans la solution.
Ce mélange fut versé dans un flacon de verre et le flacon rempli fut fermé hermétiquement. scellé
On plaça le flacon/ pour incubation sous une température de 90 à 100 C et des parties du contenu du flacon furent retirées à des intervalles de temps choisis au cours de l'incubation...
Ces parties furent combinées avec de la gélatine aqueuse à 16% contenant 0,5% de phénol pour essai par le ,mode opéra- toire à gélatine sous-cutanée suivant Codex US. Les résultats furent connue suit : Intervalles de temps Puissance (Unités Codex US par ml) (heures)¯¯¯¯
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<tb> 0 <SEP> 10
<tb> 2 <SEP> 12
<tb>
<tb>
<tb> 4 <SEP> 15
<tb>
<tb> 6 <SEP> le <SEP> 0 <SEP>
<tb>
<tb> 8 <SEP> 22
<tb>
<tb> 16 <SEP> 27
<tb>
Ces résultats indiquent que 1'accroissement Maximum de puissance sous-cutanée peut être obtenu avec de l'adrénocortico- trophine bovine préparée par le procédé du brevet précité en environ 16 heures, à une température de 90 à 100 C et à un pH de 7,2.
Exemple 5 L'adrénocorticotrophine bovine préparée par le procédé du brevet précité en une quantité de 60 mg fut dissoute dans 30 mg d'une solution aqueuse contenant 16% de gëlabine partiel- lement hydrolysée et 0,5% de phénol. On ajouta à la solution résultante 120 mg de chlorydrure de cystéine-1. Cette solution fut réglée au pH 6,5 avec une solution à 10% d'hydroxyde de sodium. Ce mélange lut versé dans des flacons de verre de 5 ml qui lurent fermés hermétiquement.
Les flacons ainsi fermés furent mis pour incubation sous une température de 100 C et des parties de leur contenu furent retirées à des intervalles de temps choisis pour/essai par le mode opératoire à la gélatine
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sous-catanée suivant Jodex US. j-.es rJsulats furent comme suit :
lnterv@@les de temps Puissance (Unités Codex US par ni) (genres) ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
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<tb> 0 <SEP> 10
<tb> 4 <SEP> 19,5
<tb> 8 <SEP> 17
<tb> 16 <SEP> 15,4
<tb> 24 <SEP> 16,1
<tb>
Ces résultats indiquent que lorsque la gélatine et le phénol sont inclus dans le mélange d'incupation, on obtient une élévasion de la vitesse d'accroissement de l'adrénocorticotro- pnine bovine préparée par le procédé du, brevet précité, à une te-pérature particulière.
Exemple 6
De l'adrénocorbicotrophine bovine préparée par le procédé du brevet précité, en une' quantité de 100 mg,fut mise en suspension dans 10 ml d'eau exempte de pyrogène et la suspension résultante fut réglée au pH 4,7. On trouva, par le mode opératoire d'essai à la gélatine sous-cutanée suivant Codex US, que cette solution avait une puissance de 100 unités Codex US par ml.
Cette suspension fut versée dans -un flacon de verre qui fut hermétiquement fermé. Ce flacon fut immergé dans de . l'eau'bouillante pendant 6 heures. Après incubation, on nalysa de nouveau la suspension par le procédé à la gélatine sous-cutanée suivant Codex US et on trouva qu'elle contenait 196,5 unités Codex US par mù.
Ces résultats indiquent qu'un accroissement apparent à 100% de la puissance sous-cutanée d'adrénocorticotrophine bovine prépe @e par le procédé dudit brevet pe@t être obtenu en 6 heures environ.
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-Exemple I
De l'adrénocorticotrophine bovine préparée par ledit rocédé fut dissoute dans une solution d'acide acétique à 0,1 pour obtenir une solution aqueuse contenant 10 mg par cm3 d'adré- nocorticotrophine. On ajouta à cette solution 0,5% de chlorhy- drure de cystéine-1 et la solution résultante .¯fut réglée à un pH de 6,9 avec une solution il 10 .; d'hydroxyde de sodium.
On versa la solution obtenue dans un flacon de verre et l'air qu'il contenait fut chassé par de l'azote. Le flacon rempli fut formé hermétiquement et placé pour incubation sous une température de 90 à 100 C pendant 11 heures.
La suspension incubée fut refroidie à une température de 30 à 50 C et ensuite filtrée à travers une toile de nylon. Le filtrat fut combiné avec une solution de gélatine aqueuse à ' 16 contenant 0,5 de phénol. On ajouta à cette solution de gélatine 0,1 de chlorhydrure de cystéine-1.
La solution de gélatine fut clarifiée par filtrage, mise en flacon sous azote et chauffée à l'autoclave pendant 20 minutes sous pression, à une température de 120 C.
Au cours de la préparation de ce produit, on obtint une courbe pilote en retirant des parties du contenu du flacon à des intervalles de temps choisis pendant l'incubation. Ces parties furent essayées par le mode opératoire à la gélatine sous-cutanée suivant Codex US. Les résultats de cette courbe pilote furent comme suit : Intervalles de temps Puissance (Unités Codex US par ml) (heures) ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
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<tb> 0 <SEP> 10 <SEP> ¯ <SEP> 20%
<tb>
<tb>
<tb> 4 <SEP> 20 <SEP> essai <SEP> à <SEP> un <SEP> niveau
<tb>
<tb>
<tb> 31 <SEP> (essai <SEP> à <SEP> un <SEP> niveau.)
<tb>
<tb>
<tb> 12 <SEP> 3,11 <SEP> 4,5 <SEP> (essai <SEP> à <SEP> trois <SEP> niveaux)
<tb>
<tb> 16 <SEP> 21 <SEP> (essai <SEP> à <SEP> un <SEP> niveau).
<tb>
Sur la base de cette courbe pilote, un intervalle de temps de 11 heures fut choisi pour l'incubation de la masse principale. Le produit fini fut essayé par le ..iode opératoire à la gélatine sous-cutanée suivant Codes US et, dans un essai
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à trois niveaux, on trouva qu'il contenait 30,0 t 2,7 unités par mg ou ml.
Le précipité séparé fut obtenu en un rendement de.
40 mg et l'on trouva par le ,iode opératoire à la gélatine sous- cutanée suivant Codex US qu'il contenait moins de 5 unités Codex US par mg.
Ces résultats indiquent qu'une adrénocorticotrophine bovine complètement soluble dans l'eau à une gamme de pH neutres peut être obtenue avec une puissance sous-cutanée accrue. Le résidu insoluble séparé par le procédé fut trouvé contenir une activité d'adrénocorticotrophine négligeable.
L'expression "activité" utilisée ici se réfère à un effet physiologique .pouvant être démontré obtenu avec de l'adré- nocorticotrophine sous des conditions courantes, tandis que l'expression "puissance" se réfère à l'activité d'une prépara- tion d'adrénocorticotrophine par unités de poids ou volume. De même, "puissance accr..e" signifie une augmentation manifeste d' activité pour une préparation d'adrénocorticotrophine, qui' est supérieure à ce que l'on pourrait attendre sur la base du en contenu/solides. De plus, 1'expression "gamme de pH neutres" se réfère à la ga-ae de pH physiologique qui est d'environ 6,2 à 7,5.
Bien que divers modes de réalisation du procédé de l'invention aient @té exposés et décrits en détail dans ce qui précède, il est bien évident que de nombreuses modifications peuvent y être apportées et diverses variantes peuvent être réalisée.:, sans sortir du cdre de l'invention.
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The present invention relates to a method of increasing
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ment of adrenoorticotrophin and more particularly a method of aorication of an adrenocorticotrophic hormone product
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showing increased potency when administered under
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cutaneous, as well as the adrenocorticotropin product obtained; 3.r this process.
Liadrenocorticotropin is SLi.bs t8.dC <;; secreted by the pituitary glands of uauuiiiî eras which stimulates the production of a biologically acting st3ro.de by.! cortical substance of the ± gland :: J.rdnale. In recent years, C! '1X'Gl1ocortico-trophin has been extracted from the pituitary glands of ma: nn2.:'. Res,
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such as pigs, cattle and sheep and, after purification, administered to domestic animals and humans, for the treatment of certain diseases.
Adrenocorticotropin product activity can be measured by the depletion in the ascorbic acid content of the animal gland in hypophysectomized rabs following the US Codex Subcutaneous Corticotropin Test Procedure In humans, the determination of the activity of adrenocorticotrophin can be obtained by determining; the reduction in eosinophilic concentration in the blood, together with the rise in the blood level of steroids and the increase in the excretion of ketosteroids.
It has been found that a 70% acetone dehydrated extract of pituitary tissue has an adrenocorticotropin potency upon subcutaneous administration of about 0.3 to 2 units per mg. U.S. Patent No. 2,669,536, filed August 15, 1950, describes a process for removing adrenocorticotrophin, which involves bringing a crude aqueous concentrate of adrenocorticotrophin into contact with cellulosic material at a pH of about 4, 5 to adsorb adrenocorticotrophin onto this material and then to elute adrenocorticotrophin from the cellulosic material with an aqueous solution at a pH of about 1.0 to 1.5.
Treatment of a crude aqueous concentrate of porcine adrenocorticotropin by this method gives a product having a subcutaneous potency of about 40 US Codex units. per mg. Thus, this product shows a subcutaneous potency of about 20 to 130 times that of the described dehydrated acid acetone extract from pituitary tissue, but, surprisingly, the purification based on of solids is only on the order of 6 to 40 times.
As a result, porcine adrenocorticotropin treated by the method of the mentioned patent exhibits a subcutaneous potency about three times what would be expected from the solids reduction. however, an increase in subcutaneous potency of this magnitude is not obtained by the treatment of bovine adrenocorticotropin or
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sheep by the process of that patent. Therefore, it is not currently considered possible to use pituitary glands from eggs and sheep as a source of adrenocorticotrophin for pharmaceutical uses.
Likewise, since the mode of subcutaneous administration is advantageous in medical practice and since sources of pituitary gland are insufficient to meet therapeutic needs, there is a continuing need for methods of increasing. the subcutaneous potency of adrenocorticotropin derived from any source.
The invention specifically creates a method of enhancing the potency of adrenocorticotrophin preparations. This increase in potency manifests itself in particular in subcutaneous administration. The product obtained by this process is completely soluble in water in the neutral pH range. In particular, the invention increases the subcutaneous potency of porcine adrenocorticotropin to a greater extent than the increase obtained by fractionation on cellulosic material. The method increases the subcutaneous potency of bovine and ovine adrenocorticotropin to a level at least comparable to that of porcine adrenocorticotropin obtained by the method of the aforementioned patent.
The invention also creates an adrenocorticotropin derivative of bovine and ovine pituitary tissues which exhibits a subcutaneous potency at least as great as that of porcine adrenocorticotropin obtained by the process of the above-mentioned patent which is completely soluble in water in the neutral pH range.
Other characteristics and advantages of the invention can be found in the description which follows.
The increase in potency of adrenocorticotropin can be obtained by incubating an aqueous mixture of adrenocorticotropin at a pH within the range of pH 4.5 to 8.
The time required to achieve maximum adrenocorticotropin potency boost is decreased when the temperature of the aqueous adrenoorticotropin mixture is raised to a high.
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upper cempâratiure limit above which Ita (ir3liocorticotropiiin would be destroyed in this aqueous mixture.
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For example, at room temperature the time required to achieve the maximum increase in potency of adrenocoricotrophin may be several months, while at a temperature of about 100 ° C an equivalent increase in potency adrenocorticotrophin can be obtained within a few hours. Likewise, since the purity of adrenocorticotropin is increased, the time required for maximum increase of.
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its power in this process is reduced.
For example, the
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maximum strengthening of the potency of an aqueous mixture of
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dehydrated acid acetone extract from beef pitui-caire tissue, incubated at a temperature of about 100 C, at a temperature within the OHJ, the pralüentionnie, can be obtained in about 18 to 30 hours, while about 8, 12 hours may be needed '
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under incubation conditions to produce an equivalent reinforcement of bovine adrenocorticotropin potency purified by the procedure of the aforementioned patent.
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Although, in some cases, this process may result in increases in adrenocorticotro-
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phine demonstrated by intravenous injections, it was found that
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the increase in the potency of aurenocorticotrophin manifested by sub-cu tc ..:. n5e administration is much more extensive and, since the sub-CUtJ.i13 mode of administration is advantageous for ...- Ir ... . Gh¯ue ..,: dicale, it is particularly desirable.
For example, porcine airenocorticotropin obtained
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by the process of the aforementioned patent, and subjected to the pre-treatment
EMI4.11
increased, shows an increase in subcutaneous potency of the order of 20 to 50, while the increase in subcutaneous potency obtained by bovine adr5nocorticotropin prepared from J. < .. A similar lesson can hearth at 400> J and possibly up to 500; ". This pout, 3t.r \ 3 used to increase the subcutaneous puiosauce of airetiocorbicobrophin derived from pituitary tissues of :: d "u, .isras ..
Good results can be obtained with ovine a.rno; orticotroi.iine and especially
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The increase in subcutaneous potency is obtained with bovine adrenocorticotrophin Although this method is particularly applicable to adrenocorticotrophin products of a purity suitable for parenteral administration, such as adrenocorticotropin obtained by the method of aforementioned patent, it can be used in the treatment of preparations
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relatively crude doadrenocortico rophin, such as the described dehydrated acid acetone extract of pituitary tissue and it can rationally be applied directly to the tissue. pituitary even.
In the above treatment, the adrenocorticotropin mixture should be incubated at a temperature of at least 15 C. However, to ensure the maximum increase in potency of the subcutaneous adrenocorticotrophin in a short period of time.
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putting an industrial operation, the temp0r: ¯:: dlincub "a- tion can be from 50 to 150 C. The best r0suJ..l ,,,, t.:; are obtained at a temperature of 75 to 125 C and a particularly desirable increase in the potency of adrenocorticotropin in large scale manufacturing can be obtained at a temperature of about 1CO C.
In the preferred embodiment of the invention, an agent is incorporated into the aqueous mixture during the incubation.
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reducing agent containing at least urygroupe su11yéir, yle. It has been found that the adrenocorticotropin activity manifested upon subcutaneous administration tends to be reduced or eliminated at the higher temperatures which are desirable to produce the maximum increase in this subcutaneous potency over a period of time. allowing the industrial application of this process.
Thus, although there is a total increase in potency, the full advantage of this process cannot be obtained as a result.
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loss of some of the potency of the subcutaneous crtocortiootropin. This partial loss of power can be reduced by including in the .elan -. aqueous adrenooorticotrophin, during incubation, a reducing α ,, erib of the premen tional nature, such as sulyr7ric acid, although better stabilized.
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lization can be obtained with an organic reducing agent containing at least one sulfydryl group, such as beta-
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mercaptoethanol and thioglycolic acid, particularly good results being achieved with cystiae.
This cysteine-based stabilizing agent may be a cysteine-1 base or cysteine-1 hydrochloride. However, it appears that dehydrochloride. ey.stein-1 may decrease the reaction in a certain area due to the formation of sodium chloride
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co..I, no reaction by-product.
This reducing agent can be included in the adrenocortiootropin incubation mixture at a concentration of at corners, 025, (w / v) and when, for example, cysteine is incorporated into the mixture, its stabilizing effect may be.
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most rationally obtained at a concentration of 005 to 5.0 zoo
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(weight / volume). The best results are obtained with cysteine at a concentration between 0.5 and 5%. (w / v), then an especially desirable stabilization with cysteine is provided at a concentration of about 1.0 (w / v).
Although stabilization of the activity of newly produced subcutaneous adrenocortico-trophin by this reducing agent can be effected by incubating the aqueous mixture.
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aladrenocorticotroptiin at a pH in the range 4.5 to 8 better results can be obtained at a pH between 5.5 and 7.5, followed by particularly desirable stabilization. is obtained at a pH of about 6.5. Setting an aqueous mixture
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adrenocorticotrophin acid at a pH within the critical gaJ1an can be obtained with any alkalizing agent, such as trisodium phosphate, although a higher degree of increase is obtained when this alkalizing agent
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is sodium hydroxide.
It was further found that the inclusion of gelatin in. the aqueous admixture of adrenocorticotropin increases the rate at which the potency of subcutaneous adrenocorticotropin is increased at any incubation temperature, although the level
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Maximum increase may be somewhat less than that obtained by incubating such an aqueous mixture in the absence of gelatin. Any gelatin of pharmaceutical grade can be used in this process, for example precursor-acid gelatin, although a higher degree of enhancement is apparently obtained with precursor gelatin. -alkaline.
By "pharmaceutical" is meant that the palatine would be suitable for infection in humans when adrenocorticotropin is intended for human use and suitable for injection into animals when adrenocorticotrophin is intended for veterinary use. .
The gelatin can be included in the aqueous mixture of adrenocorticotropin at a concentration between 8 and 40% (w / v, but when partially hydrolyzed gelatin is used, a concentration of this gelatin between about 12 and 18% (w / v). / volume) has a desirable fluidity. However, when a more fully hydrolyzed gelatin having a gel point below 22 ° C is incorporated into an aqueous mixture of this nature, the desired fluidity can be achieved at a concentration of about 28% and sometimes at a concentration as high as about 32% (w / v).
Acid extracts of pituitary tissue and adrenocorticotrophin obtained by the process of the aforementioned patent are relatively insoluole in water in the neutral pH range.
Also, an adrenocorticotrophin of this type becomes a suspension or dispersion when mixed with water in the process; ment of this invention. Incubation of this aqueous suspension or dispersion to increase the subcutaneous potency of the adrenocorticotrophin therein results in the solubilization of most of the adrenocorticotrophin activity element, while leaving a residue of adrenocorticotrophin. small part of a substantially inactive insoluble residue.
This water soluble fraction can be separated from the water insoluble fraction to give an adrenocorticotropin having increased potency relative to the element of.
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subcutaneous potency which is completely soluble in water
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in the neutral pH range. The salt of this soluble fraction of the insoluble residue can be obtained by filtration, centrifugation, etc.
The mechanism of this increased subcutaneous potency phenomenon is not fully understood, but it is believed that a transformation of the molecular structure of adrenocorticotrophin is obtained in this treatment and results in a new product of the
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pr5wentente nature. Although, as has been seen in the foregoing, this phenomenon occurs to some extent with any adrenocorticotrosis, a greater modification is achieved with ovine adrenocorticotropin and a particularly desirable change is produced with adrenocorticotropin. 3. Bovine adrenocorticotropin.
The stabilizing effect of the special reducing agent, eg eysteine, on the drug activity produced by this process can be obtained during the (;; l. \ LIa ;; a8i- nage of the resulting adrenocorticotropin product .. It including
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in an aqueous solution of the latter the con Dau2ation indicated in the above of this reducing adjent li a fold within the critical range.
A preservative, such as methyl or ethyl acetate, can also be incorporated into the mixture.
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aqueous mixture of adrenocorticotrophin during the lactation or in the aqueous solution of the resulting adrenocorticotropin product. However, particularly good results are obtained with a preservative having an effective action.
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local anesthetic when administered byMnt # r ale, such as phenol. A suitable concentration of, for example, phenol in the aqueous solution of aucorticotropin can be: about 0.5 4.
The increased acting ZtadrenocorticotrophinQ obtained by this method can be purified by further fractionation with, for example, ion exchange resins or it can be packaged for use as a therapeutic preparation.
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The aqueous solution of adrenocorticotrophin resulting from this process can be sterilized by filtration or. autoclaving and can then be put into appropriate pharmaceutical bottles. When the gelatin is included in the adrenocorticotropin reaction mixture, the resulting aqueous adrenocorticotropin gel can be used directly in the preparation of the increased potency adrenocorticotropin product.
The invention can be further illustrated by the following specific examples; Example @
200 mg of cysteine base were added to 20 ml of an aqueous solution of porcine adrenocorticotropin prepared according to the aforementioned patent. The resulting solution was adjusted to pH 7.4 with 10% sodium hydroxide solution.
This pH adjustment resulted in the formation of a precipitate in the solution. This mixture was poured into a glass flask and the flask was sealed with a rubber stopper and an aluminum seal.
The tightly closed vial was immersed in boiling water for incubation. Parts of the product in the vial were withdrawn at set time intervals. These portions were combined with 16 µl aqueous gelatin containing 0.5% phenol for testing by the Codex US subcutaneous gelatin procedure.
The average incubation temperature was 90 to 100 C. The test results were as follows:
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Power time intervals (US Codex Units per him) (minutes)
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<tb> 0 <SEP> 252
<tb>
<tb> 15 <SEP> 256
<tb>
<tb> 30 <SEP> 220
<tb>
<tb> 60 <SEP> 176
<tb>
<tb> 120 <SEP> 504
<tb>
<tb> 240 <SEP> 320
<tb>
<tb> 480 <SEP> 260
<tb>
These results indicate that the maximum increase in the subcutaneous potency of porcine adrenocorticotropin prepared by the method of the aforementioned patent can be produced in two hours, at about a temperature of 90 to 100 ° C., and that thereafter the activity drops very much. quickly.
. Example 2
200 mg of 1-cysteine base were added to 40 ml of an aqueous solution of porcine adrenocorticotropin prepared according to the aforementioned patent. The resulting solution was adjusted to pH 6.5 with 105 sodium hydroxide solution, after which a precipitate was formed in the solution.
Part of this mixture, 4 ml, was poured into a glass flask with a capacity of 5 ml. The air contained in the filled flask was discharged with nitrogen and the flask was sealed. The filled vial was placed in an oven at a temperature of 100 C. Parts of the contents of this vial were withdrawn at designated time intervals during the incubation. These parts were combined with 16% aqueous gelatin containing 0.5% phenol for testing by the subcutaneous gelatin procedure according to Codex US.
The results were as follows Time intervals Potency (US Codex units per ml) (hours)
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<tb> 0 <SEP> 530
<tb>
<tb> 1 <SEP> 545
<tb>
<tb> 2 <SEP> 670
<tb>
<tb> 3 <SEP> 675
<tb>
<tb> 4 <SEP> 450
<tb>
<tb> 20 <SEP> 510
<tb>
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E..d.ple 3 From 1 t crude porcine ticotrclhne adrénücor, for example before purification, according to the aforementioned patent, in an amount of
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210 m, was dissolved in 30 ml of water adjusted to pH 0, 0 with acetic acid. 150 mg of Cjstein-1 hydrochloride were added to the resulting solution and this solution was brought to pH 7.3 with 10% sodium hyiroxide solution. Then a precipitate was formed in the solution.
This mixture was poured into a glass vial and the filled vial was sealed. This vial was then placed for incubation at 90-100 ° C and parts of its contents were removed at selected time intervals during the incubation. These parts were com-
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binated with aqueous gelatin at 16 coa-tenant 0.5 / - phenol for testing by the gelatin subcutaneous procedure according to Codex US.
The results were as follows:
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Taups waissance interval (US Codex units per mil) (hours) ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
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<tb> 0 <SEP> 0.8
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1 <SEP> 1.1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2 <SEP> 1.09
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 4 <SEP> 1.1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 6 <SEP> 1.1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 8 <SEP> 2.2
<tb>
These results indicate that the maximum increase in subcutaneous potency is obtained with crude porcine adrenocorticotropin in at least 8 hours at a temperature of at least 90 to 100 ° C. and at a pH of 7.3.
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: 8 ....;,. :: pl e 4 Bovine aarenocoruicotropin, prepared by the aforementioned process of the patent in an amount of 210 mg was dissolved in
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30 mil of water set at p73 °, 5. acetic acid. 150, ..; of oystein-1 hydrochloride. This solution was adjusted to pH 7.2 with a 10 I solution of hydroxycb
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of sodium, after which a precipitate formed in the solution.
This mixture was poured into a glass vial and the filled vial was sealed. sealed
The vial / for incubation was placed at 90-100 C and parts of the contents of the vial were withdrawn at selected time intervals during the incubation.
These parts were combined with 16% aqueous gelatin containing 0.5% phenol for testing by the subcutaneous gelatin procedure according to Codex US. The results were known as follows: Time intervals Power (US Codex Units per ml) (hours) ¯¯¯¯
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<tb> 0 <SEP> 10
<tb> 2 <SEP> 12
<tb>
<tb>
<tb> 4 <SEP> 15
<tb>
<tb> 6 <SEP> the <SEP> 0 <SEP>
<tb>
<tb> 8 <SEP> 22
<tb>
<tb> 16 <SEP> 27
<tb>
These results indicate that the maximum increase in subcutaneous potency can be obtained with bovine adrenocorticotrophin prepared by the process of the aforementioned patent in about 16 hours, at a temperature of 90-100 C and at a pH of 7. , 2.
Example 5 Bovine adrenocorticotropin prepared by the process of the aforementioned patent in an amount of 60 mg was dissolved in 30 mg of an aqueous solution containing 16% partially hydrolyzed gelabine and 0.5% phenol. To the resulting solution 120 mg of cysteine-1 hydrochloride was added. This solution was adjusted to pH 6.5 with 10% sodium hydroxide solution. This mixture was poured into 5 ml glass flasks which were hermetically sealed.
The bottles thus closed were incubated at a temperature of 100 ° C. and parts of their contents were withdrawn at time intervals chosen for testing by the gelatin procedure.
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subcatanate according to Jodex US. The results were as follows:
lnterv @@ times Power (US Codex Units per ni) (genres) ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
EMI13.1
<tb> 0 <SEP> 10
<tb> 4 <SEP> 19.5
<tb> 8 <SEP> 17
<tb> 16 <SEP> 15.4
<tb> 24 <SEP> 16.1
<tb>
These results indicate that when gelatin and phenol are included in the incupation mixture, there is obtained an increase in the rate of increase of bovine adrenocorticotropine prepared by the process of the aforementioned patent at a temperature. particular.
Example 6
Bovine adrenocorbicotropin prepared by the process of the aforementioned patent, in an amount of 100 mg, was suspended in 10 ml of pyrogen-free water and the resulting suspension was adjusted to pH 4.7. This solution was found by the subcutaneous gelatin test procedure according to US Codex to have a potency of 100 US Codex units per ml.
This suspension was poured into a glass flask which was hermetically sealed. This flask was immersed in. boiling water for 6 hours. After incubation, the suspension was again analyzed by the subcutaneous gelatin method according to Codex US and found to contain 196.5 US Codex units per ml.
These results indicate that an apparent 100% increase in the subcutaneous potency of bovine adrenocorticotropin prepared by the process of said patent can be achieved in about 6 hours.
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-Example I
Bovine adrenocorticotrophin prepared by said process was dissolved in a 0.1 acetic acid solution to obtain an aqueous solution containing 10 mg per cm 3 of adrenoorticotropin. To this solution was added 0.5% of cysteine-1 hydrochloride and the resulting solution was adjusted to a pH of 6.9 with a solution of 11; of sodium hydroxide.
The resulting solution was poured into a glass flask and the air it contained was expelled with nitrogen. The filled flask was sealed and placed for incubation at 90-100 C for 11 hours.
The incubated suspension was cooled to a temperature of 30-50 ° C and then filtered through a nylon cloth. The filtrate was combined with a 16% aqueous gelatin solution containing 0.5 phenol. 0.1 cysteine-1 hydrochloride was added to this gelatin solution.
The gelatin solution was clarified by filtering, bottling under nitrogen, and autoclaving for 20 minutes under pressure, at a temperature of 120 C.
In the preparation of this product, a pilot curve was obtained by removing portions of the contents of the vial at selected time intervals during incubation. These parts were tested by the subcutaneous gelatin procedure according to Codex US. The results of this pilot curve were as follows: Time intervals Power (US Codex Units per ml) (hours) ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
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<tb> 0 <SEP> 10 <SEP> ¯ <SEP> 20%
<tb>
<tb>
<tb> 4 <SEP> 20 <SEP> test <SEP> to <SEP> a <SEP> level
<tb>
<tb>
<tb> 31 <SEP> (test <SEP> to <SEP> a <SEP> level.)
<tb>
<tb>
<tb> 12 <SEP> 3.11 <SEP> 4.5 <SEP> (test <SEP> at <SEP> three <SEP> levels)
<tb>
<tb> 16 <SEP> 21 <SEP> (test <SEP> at <SEP> a <SEP> level).
<tb>
Based on this pilot curve, a time interval of 11 hours was chosen for the incubation of the main mass. The finished product was tested by the subcutaneous gelatin iodine according to US Codes and, in a test
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at three levels it was found to contain 30.0 t 2.7 units per mg or ml.
The separated precipitate was obtained in a yield of.
40 mg and was found by US Codex subcutaneous gelatin operative iodine to contain less than 5 US Codex units per mg.
These results indicate that completely water soluble bovine adrenocorticotropin at a neutral pH range can be obtained with increased subcutaneous potency. The insoluble residue separated by the process was found to contain negligible adrenocorticotropin activity.
The term "activity" used herein refers to a physiological effect demonstrably obtained with adrenoorticotropin under current conditions, while the term "potency" refers to the activity of a preparation. tion of adrenocorticotropin by units of weight or volume. Likewise, "increased potency" means a marked increase in activity for an adrenocorticotropin preparation, which is greater than one would expect on a content / solids basis. In addition, the term "neutral pH range" refers to the physiological pH ga-ae which is about 6.2-7.5.
Although various embodiments of the method of the invention have been exposed and described in detail in the foregoing, it is obvious that numerous modifications can be made to them and various variations can be carried out.:, Without departing from the framework of the invention.