BG64694B1 - Полиол - интерферон - бета конюгати - Google Patents

Полиол - интерферон - бета конюгати Download PDF

Info

Publication number
BG64694B1
BG64694B1 BG104871A BG10487100A BG64694B1 BG 64694 B1 BG64694 B1 BG 64694B1 BG 104871 A BG104871 A BG 104871A BG 10487100 A BG10487100 A BG 10487100A BG 64694 B1 BG64694 B1 BG 64694B1
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
polyol
peg
interferon
ifn
thiol
Prior art date
Application number
BG104871A
Other languages
English (en)
Other versions
BG104871A (bg
Inventor
Tayar Nabil El
Michael Roberts
Milton Harris
Wayne Sawlivich
Original Assignee
Applied Research Systems Ars Holding N.V.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Applied Research Systems Ars Holding N.V. filed Critical Applied Research Systems Ars Holding N.V.
Publication of BG104871A publication Critical patent/BG104871A/bg
Publication of BG64694B1 publication Critical patent/BG64694B1/bg

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Изобретението се отнася до получаване на ПЕГ-IFN-бета конюгати, в които ПЕГ остатъкът е ковалентно свързан с Cys17 от човешки интерферон-бета чрез метод на сайтово специфично пегилиране с тиолно реактивоспособни пегилиращи агенти, до фармацевтичен препарат и до метод за лечение на инфекции, тумори и автоимунни и възпалителни заболявания. Изобретението се отнася и до метод за степенно прикрепване в серии на ПЕГ остатъци към полипептид и по-специално към интерферон-бета.

Description

Област на техниката
Изобретението се отнася до полиол-IFNβ конюгати, характеризиращи се с това, че полиолната единица е ковалентно свързана с Cys17. Други обекти на настоящото изобретение са методи за тяхното сайтово - специфично получаване, както и тяхното използване при терапия, прогнозиране или диагностика на бактериални инфекции, вирусни инфекции, автоимунни заболявания и възпалителни заболявания. Настоящото изобретение освен това се отнася до метод за степенно прикрепване на два или повече ПЕГ остатъка към полипептид.
Предшестващо състояние на техниката
Човешкият фибробластен интерферон (IFN-β) притежава антивирусна активност и може освен това да стимулира естествените клетки-убийци срещу новообразуващи се клетки. Той представлява полипептид от около 20 000 Da и се индуцира от вируси и двойно верижни РНКи. От нуклеотидната последователност на гена за фибробластния интерферон, клониран чрез рекомбинантна ДНК технология, Derynk et al. (Nature, 285:542-547,1980) изведе пълната аминокиселинна последователност на белтъка. Той е с дължина 166 аминокиселини.
Shepard et al. (Nature, 294:563-565, 1981) описа мутация на база 842 (цистеин - тирозин в позиция 141), който унищожава неговата антивирусна активност и вариант на клон с делеция на нуклеотида 1119-1121.
Mark et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81(18):5662-5666, 1984) въведе изкуствена мутация чрез заместване на база 469 (Т) с (А), предизвиквайки аминокис единно превключване от Цистеин - Серин в позиция 17. Беше съобщено, че полученият в резултат на това β-интерферон е толкова активен както и “нативния” β-интерферон и стабилен при продължително съхранение (-70°С).
Ковалентното прикрепване на хидрофилен полимер - полиетиленгликол (ПЕГ), още известен като полиетиленов окис (ПЕО) към молекули има важни приложения в биотехнологията и медицината. В повечето си най-често срещани форми ПЕГ е линеен полимер, притежаващ хидроксилни групи в двата си края:
HO-CHj-CI^OiCHjCI^OLCHjCI^-OH
Тази формула може да бъде представена в съкратен вид като HO-ПЕГ-ОН, където се има предвид, че - ПЕГ представлява полимерния скелет без крайните групи.
“-ПЕГ-”означаш“-СН2-СН20(СН2СН20)пСН!СН[-”
ПЕГ обикновено се използва като метокси-ПЕГ-ОН (m-ПЕГ), при който единия от двата края е относително инертна метокси група, докато другият край е хидроксилна група, която е обект на химическо модифициране.
СН3О-(СН2СН2О)11-СН2СН2-ОН
Също така често се използват разклонени полиетилен гликоли. Разклонените ПЕГи могат да бъдат представени чрез Я(-ПЕГ-ОН)т, при които R представлява централния остатък на сърцевината, като пентаеритритол или глицерол, и m представлява броя на разклонените рамена. Броят на разклонените рамена (ш) може да варира от три до сто или повече. Хидроксилните групи са обект на химическа модификация.
Друга разклонена форма, като тази описана в РСТ патентна заявка WO 1996/021469, притежава единичен край, който е обект на химическа модификация. Този тип ПЕГ може да бъде представен като (СН3О-ПЕГ-)pR-X, където р е равно на 2 или 3, R представлява централната сърцевина, като лизин или глицерол, и X представлява функционална група като карбоксилна група, която е обект на химическо активиране. Друга разклонена форма, “висящ ПЕГ” притежава реактивоспособни групи като карбоксилна група по продължението на ПЕГ скелета отколкото в края на ПЕГ веригите.
В допълнение на тези форми на ПЕГ, полимерът може да бъде получен със слаби или разградими връзки в скелета. Например, Harris е показал в патентна заявка на САЩ 06/026,716, че ПЕГ може да бъде получен с естерни връзки в полимерния скелет, които могат да бъдат подложени на хидролиза. В резултат на тази хидролиза се получава отцепване на полимера на фрагменти с по-ниски молекулни маси, съгласно следната реакционна схема:
-ПЕГ-СО2-ПЕГ-+ЦО ->-ПЕГ-СО2Н+НО-ПЕГСъгласно настоящото изобретение, с понятието полиетиленгликол или ПЕГ се има предвид да се обобщят всички гореспоменати производни.
Съполимерите на етиленовия оксид и пропиленовия оксид са тясно свързани с ПЕГ и неговата химия и те могат да бъдат използвани вместо ПЕГ в много от неговите приложения. Те притежават следната химична формула:
HO-CH2CHRO(CH2CHRO)nCH2CHR-OH, където R е Н или СН3.
ПЕГ е полезен полимер, притежаващ свойството на висока разтворимост във вода, както и висока разтворимост в много органични разтворители. Освен това ПЕГ е нетоксичен и неимуногенен. Когато ПЕГ се прикрепва по химически начин (ПЕГилиране) към водонеразтворимо съединение, полученият в резултат на това конюгат по принцип става водоразтворим, както и разтворим в много органични разтворители.
Понастоящем ПЕГ-белтъчни конюгати се използват при терапии, заместващи белтъци и за други терапевтични цели. Например, ПЕГилирана аденозин деаминаза (Adagen®) се използва за лечение на комбинирано заболяване с липса на имунитет (SCIDS), ПЕГилирана L-аспарагиназа (Oncapspar®) се използва при лечение на остра лимфобластна левкемия (ALL), и ПЕГилиран α-интерферон (Intron(R) А) е в трета фаза на опити за лечение на хепатит С.
За общ преглед на ПЕГ-белтъчни конюгати с клинична ефикасност виж N.L. Burnham, Am. J. Hosp. Pharm., 15: 210-218, 1994.
Разработени са различни методи за ПЕГилиране на белтъци. Прикрепването на ПЕГ към реактивоспособните групи, намиращи се върху белтъка обикновено се осъществява, използвайки електрофилно активирани ПЕГ производни. Прикрепването на ПЕГ към а- и ε-амино групи, установени при лизинови остатъци и N-края, води до образуването на конюгат, състоящ се от смес от продукти.
Най-общо такива конюгати се състоят от популация от различни ПЕГ молекули, прикрепени към белтъчната молекула (“ПЕГмери”), вариращи от нула до голям брой амино групи в белтъка. За белтъчната молекула, която е била еднократно модифицирана, ПЕГ единицата може да бъде прикрепена на няколко различни амино сайта.
Този вид неспецифично ПЕГилиране води до образуването на няколко конюгата, които обикновено са почти неактивни. Намаляването на активността обикновено се причинява от скриване на белтъчния активен свързващ домейн, както е в случая с много цитокини и антитела. Например, Katie et al. в патенти на САЩ4,766,106 и 4,917,888 описва ПЕГилиране на IFN-β и 11-2 с голям излишък на метокси-полиетилен гликолил N-сукцинимидил шутарат и метокси-полиетилен гликолил N-сукцинимидил сукцинат. И двата белтъка са получени в микробни клеткигостоприемници, което позволи сайтово-специфична мутация на свободен цистени до серии. Мутацията беше необходима при микробна експресия на IFN-β за подпомагане нагъването на белтъка. По-специално, IFN-β, използван при тези експерименти, е търговски продукт Betaseron®, при който Cys17 остатъка е заменен със серин. Допълнително, липсата на гликозилиране намалява неговата разтворимост във водни разтвори. Неспецифичното ПЕГилиране доведе до повишена разтворимост, но основният проблем беше намаленото ниво на активност и добив.
Заявка за ЕР 593 868, озаглавена ПЕГ-интерферон конюгати, описва получаването на ПЕГIFN-α конюгати. Обаче, реакцията на ПЕГилиране не е сайтово специфична и следователно са получени смес от позиционни изомери на ПЕГ-IFN-a конюгати (виж още Monkarsh et al., ACS Symp. Ser., 680:207-216, 1997).
Kinstler et al., в заявка на ЕР 675 201 показват селективно модифициране на остатъка на N-края на фактора за мегакариоцитен растеж и фактора за развитие (MGDF) с тПЕГ-пропионалдехид. Това позволи възпроизводимо ПЕГилиране и фармакокинетика от партида на партида. Gilbert et al. в патент на US 5,711,944 показва, че може да бъде постигнато ПЕГилиране на IFN-α с оптимални нива на активност. В този случай беше необходим етап на трудоемко пречистване за получаване на оптимален конюгат.
Болшинството цитокини, както и други белтъци, не притежават специфичен сайт за прикрепване на ПЕГ, освен примерите споменати погоре, много е вероятно някои от тези изомери, тично или напълно неактивни, следователно предизвикващи загуба на активност на крайната смес.
Следователно, желаната цел при получаването на такива белтъчни конюгати е сайтово специфично моно-ПЕГилиране.
Woghiren et al. в Bioconjugate Chem., 4(5): 314-318,1993, синтезира тиол-ПЕГ производни, селективни за такова сайтово специфично ПЕГилиране. Стабилно тиол-защитено ПЕГ производно под формата на пара-пиридил дисулфид реактивоспособна група, беше показано, че специфично конюгира със свободен цистеин в белтъка папаин. Новообразуваната дисулфидна връзка между папаин и ПЕГ може да бъде разцепена при меки редуциращи условия до регенериране на нативния белтък.
С цитирането на който и да е документ тук, не се има предвид да се приеме допускането, че такъв документ се отнася към предшестващото ниво на техниката или да се счита материал за подлагащ на съмнение патентността, на която и да е патентна претенция на настоящото изобретение. Всяко становище по отношение на съдържанието или дата на документ се основава на информация налична на заявителите по време на регистрацията на заявката и не представлява допускане по отношение коректността на такова становище.
Обобщение на изобретението
В настоящото изобретение са представени полиол-ΙΡΝ-β конюгати и по-специално ПЕГIFN-β конюгати, характеризиращи се с това, че полиолната единица е ковалентно свързана с Cys17. Специфичното конюгиране се получава чрез позволяване на тиол-реактивоспособните групи да реагират с остатъка Cys17 в βπΗτερφεрон. Очаква се такива конюгати да показват повишена ефективност in vivo. Целта е да се получи повишена разтворимост при неутрално pH, повишена стабилност (понижена агрегация), понижена имуногенност и да няма загуба на активност по отношение на “нативен” β-интерферон. Резултатите от такова конюгиране биха намалили броят на дозите, необходими за постигането на желания ефект, би опростило и стабилизирало обработката на фармацевтичния препарат и би дало възможност да се увеличи дългос рочната ефективност.
Настоящото изобретение освен това осигурява метод за степенно прикрепване в серии на ПЕГ остатъците към полипептида.
Кратко описание на фигурите
Фигура 1 показва графика на капилярна електрофореза на полиол-ΙΡΝ-β конюгат преди пречистване.
Фигури 2 А-2В показват пречистването на полиол-ΙΡΝ-β конюгат, проведено чрез гел проникваща хроматография (Супероза 12): фиг. 2А първи цикъл; фиг. 2Б - втори цикъл; фиг. 2В трети цикъл.
Фигура 3 показва SDS - ПААГЕ на пречистен след третия хроматографски цикъл полиол-ΙΡΝ-β конюгат.
Фигура 4 показва графика на капилярна електрофореза на пречистен полиол-ΙΡΝ-β конюгат, при който IFN-β е ПЕГилиран с тПЕГOPSS5k.
Фигура 5 показва MALDI MS спектъра на пречистен полиол-ΙΡΝ-β конюгат.
Фигура 6 показва сравнение между антивирусната активност на “нативен” IFN-β и ПЕГIFN-β конюгат. Клетки WISH бяха инкубирани с посочените концентрации на проби от IFN-β за 24 h преди обработка с цитопатична доза от везикуларен стоматитен вирус. Цитопатичният ефект беше определен след допълнителна 48часова конверсия с МТТ.
Фигура 7 показва свързващият профил на IFN-β и ПЕГ-IFN в клетки Daudi.
Фигура 8 показва фармакокинетичният профил на IFN-β и ПЕГ-IFN в мишки след интравенозно прилагане. Линията от точки показва LOQ анализа за всяка стандартна крива.
Фигура 9 показва фармакокинетичният профил на IFN-β и ПЕГ-IFN в мишки след подкожно прилагане. Линията от точки показва LOQ анализа за всяка стандартна крива.
Подробно описание на изобретението
Настоящото изобретение се основава на откритието, че прикрепването на полиолния остатък, по-специално на ПЕГ остатъкът към остатъка Cys’7 на човешки IFN-β, неочаквано увеличава (или поне запазва и не води до намаля4 ване) на биологичната активност на IFN-β, сравнено с тази на нативен човешки - интерферон. Следователно, не само IFN-β с полиолен остатък прикрепен към остатък Cys17, показва същата или повишена биологична активност на IFN-β, но този полиол-ΙΕΝ-β конюгат освен това осигурява желани характеристики дадени от полиолния остатък, като например повишена разтворимост.
Понятието “IFN-β“, както е използвано тук, означава човешки фибробластен интерферон, получен чрез изолиране от биологични течности или чрез ДНК рекомбинантни техники от прокариотни или еукариотни клетки-гостоприемници, както и негови соли, функционални производни, прекурсори и активни фракции, осигуряващи цистеинов остатък, намиращ се в позиция 17 в естествено срещащата се форма.
Полиолният остатък в ποπΗοπ-ΙΡΝ-β конюгат съгласно настоящото изобретение може да бъде всеки водоразтворим моно- или бифункционален полиалкиленов оксид, притежаващ линейна или разклонена верига. Обикновено, полиола е полиалкилен гликол като например полиетилен гликол (ПЕГ). Обаче, всеки с опит в съществуващото ниво на техниката ще разбере, че други полиоли като например полипропилен гликол и съполимери на полиетилен гликол и полипропилен гликол могат да бъдат подходящо използвани.
Както е използвано тук, с понятието “ПЕГ остатък” се възнамерява да се включват без да се ограничава до, линейни и разклонение ПЕГ, висящи ПЕГ, дендримерни ПЕГ, съполимери на ПЕГ и един или повече полиоли и съполимери на ПЕГ и PLGA (полимлечна гликолова киселина).
Определението “соли” се използва тук по отношение както на соли на карбоксилни групи, така и на соли на амино група на съединения, които се получават по известни методи. Солите на карбоксилните групи включват неорганични соли като например натриеви, калиеви, калциеви соли и соли с органични бази като такива образуващи се с амино групата на триетаноламин, аргинин или лизин. Солите на аминогрупи включват например соли с неорганични киселини като например солна киселина и с органични киселини като например оцетна киселина.
Определението “функционални производ ни” както е използвано тук се отнася до производни, които могат да бъдат приготвени от функционални групи, присъстващи в странични вериги на аминокиселинни остатъци или на терминални Ν- и С-групи, съгласно известни методи и са включени в настоящото изобретение, когато те са фармацевтично приемливи, т.е. когато те не разрушават белтъчната активност или не придават токсичност на съдържащия ги фармацевтичен препарат. Такива производни включват например естери или алифатни амиди на карбоксилни групи и N-ацилни производни на свободни аминогрупи или О-ацилни производни на свободни хидроксилни групи и се образуват с ацилни групи като например алканоилни или ароилни групи.
“Прекурсори” са съединения, които се превръщат в IFN-β в човешкото или животинско тяло.
Към понятието “активни фракции” на белтък, настоящото изобретение отнася всеки фрагмент или прекурсор на полипептидна верига на самото съединение, самостоятелно или в комбинация със свързани молекули или остатъци, свързани с него, например, остатъци на захари или фосфати, или агрегати на полипептидни молекули, когато такива фрагменти или прекурсори показват същата активност като IFN-β като медикамент.
Конюгагите от настоящото изобретение могат да бъдат получени, чрез който и да е метод, известен в съществуващото ниво на техниката. Съгласно един от методите на изобретението, IFN-β реагира с ПЕГилиращ агент в подходящ разтворител и желаният конюгат е изолиран и пречистен, например чрез прилагането на един или повече хроматографски методи.
“Хроматографски метод” означава всяка техника, която е използвана за разделяне на компоненти в смес чрез прилагането на тази смес на носител (стационарна фаза), през която преминава разтворител (подвижна фаза). Принципите на разделяне на хроматографията се основават на различната физическа природа на стационарната и подвижна фаза.
Някои по-специални видове хроматографски методи, които са добре известни в литературата включват: течна, течна при високо налягане, йоноообменна, абсорбционна, афинитетна, разпределителна, хидрофобна, обратно фазова, гелпроникваща, ултрафилтрационна или тънкослойна хроматография.
“Понятието “тиол-реакгивоспособен ПЕГилиращ агент”, както е използвано в настоящата заявка, означава всяко ПЕГ производно, което притежава способност да реагира с тиолната група на цистеиновия остатък. То може да бъде например ПЕГ, съдържащ функционална група като ортопиридил дисулфид, винилсулфон, малеимид, йодоацетамид и други. Съгласно предпочитан метод на настоящото изобретение, тиолреактивоспособен ПЕГилиращ агент е ортопиридил дисулфидно (OPSS) производно на ПЕГ.
ПЕГилиращият агент се използва в неговата моно-метоксилирана форма, където само единият край е наличен за конюгация или в би5 функционална форма, където и двата края са налични за конюгация, като например при образуването на конюгат с два ковалентно прикрепени IFN-β към един ПЕГ остатък. Той притежава поспециално молекулна маса между 500 и 100 000. 10 Типична схема на реакция за получаване на конюгатите от изобретението е представена подолу:
Белтък-SH + тПЕГ-S-S -о рН<7
-----* тПЕГ-Б-Б-Белтьк
β-меркаптоетанол
Белтьк-S-H + тПЕГ-S-H + HOCH2CH2-S-S-CH2CH2OH
Вторият ред на гореспоменатата схема показва метод за разцепване на връзката ПЕГ-белтък. Производното тПЕГ-OPSS е високо селективно съм свободни сулфхидрилни групи и реагира бързо при кисели условия на pH, където IFN-β е стабилен. Високата селективност може да бъде показана чрез редукцията на конюгата до активната форма на IFN-β и ПЕГ.
Беше показано, че дисулфидната връзка, която се получава между белтъка и ПЕГ остатъка, е стабилна при циркулиране в телесните течности, но тя може да бъде редуцирана при навлизане в околната среда на клетката. Следователно се очаква, че този конюгат, който не навлиза в клетката ще бъде стабилен при циркулиране в телесните течности, докато не бъде изхвърлен.
Трябва да се отбележи, че горната реакция е сайтово-специфична, т.к. останалите два цистеинови остатъци, намиращи се в позиция 31 и 141 на естествено срещащата се форма на IFN-β не реагират с тиол-реакгивоспособен ПЕГилиращ агент т.к. те образуват дисулфидни мостове.
Освен това, настоящото изобретение е насочено към метод за постепенно прикрепване на два или повече ПЕГ остатъка към полипептид. Този метод се основава на разбирането, че активиран ПЕГ с ниска молекулна маса реагира по-пълно със стереохимично скрит реакционен сайт на белтък, отколкото активиран ПЕГ с висока молекулна маса. ПЕГ-модифицирането на скъпи терапевтични белтъци трябва да бъде ефективно по отношение на цената, за да е практически възможно получаването на ПЕГ конюгати. В допълнение, за да се намали свиващото филтруване и да се оптимизират фармакологичните свойства на ПЕГ-белтъчен конюгат, конюгатьт трябва да притежава ефективен размер, еквивалентен на този на белтък с молекулна маса от 70 kDa. Това означава, че за сайтово специфично модифициране, където ще бъде прикрепен един ПЕГ, за предпочитане се прикачва ПЕГ производно, притежаващо молекулна маса повисока от 20 kDA. Ако сайта на модифициране е стереохимично претрупан, реактивоспособната група на голям ПЕГ остатък може трудно да достигне сайта на модифициране и това би довело до ниски добиви. Предпочитан метод на ПЕГилиране на полипептид, съгласно настоящото изобретение, увеличава добива на сайтово-специфичното ПЕГилиране чрез първоначално прик6 репване на малък хетеро- или хомополимерен ПЕГ остатък, който благодарение на своя относително малък размер може да реагира с стереохимично претрупани сайтове. Последващото прикрепване на ПЕГ производно с висока молекулна маса към малък ПЕГ води до висок добив на желания ПЕГилиран белтък.
Метод за степенно прикрепване на два или повече ПЕГ остатъка в серии към полипептид, съгласно настоящото изобретение включва прикрепването на хетеробифункционален или хомобифункционален ПЕГ остатък с ниска молекулна маса първо към полипептид и след това прикрепването на монофункционален или бифункционален ПЕГ остатък към свободния край на ПЕГ остатък с ниска молекулна маса, който вече е прикрепен към полипептида. Следвайки степенното прикрепване в серии на два или повече ПЕГ остатъка към полипептид, който полипептид е поспециално IFN-β и където Cys17 локализиран в стереохимично претоварен сайт е предпочитания сайт на ПЕГ прикрепване, ПЕГ-полипептидния конюгат може да бъде пречистен, използвайки една или повече от техниките за пречистване като например йонообменна хроматография, гелпроникваща хроматография, хроматография с хидрофобно взаимодействие, афинитетна хроматография и обратно фазова хроматография.
ПЕГ остатъка с ниска молекулна маса притежава формулата
W-CH2CH2O(CH2CH2O)BCH2CH2-X, където W и X са групи, които независимо реагират с амино, сулфхидрилна, карбоксилна или хидроксилна функционална група, за да прикрепи ПЕГ остатъка с ниска молекулна маса към полипептид. W и X са по-специално независимо подбрани от ортопиридил дисулфид, малеимиди, винил сулфони, йодоацетамиди, амини, тиоли, карбоксили, активни естери, бензотриазолни карбонати, р-нитрофенолни карбонати, изоцианати и биотин. ПЕГ остатъка с ниска молекулна маса, по-специално притежава молекулна маса в диапазона от около 100 до 5 000 Da.
Монофункционален или бифункционален ПЕГ остатък за прикрепване към свободния край на ПЕГ с ниска молекулна маса, който е прикрепен към полипептид, по-специално притежава молекулна маса в диапазона от около 100 до 200 kDa, и по-специално е метокси ПЕГ, разклонен
ПЕГ, хидролитично или ензимно разградим ПЕГ, висящ ПЕГ или дендримерен ПЕГ. Освен това, монофункционалният или бифункционален ПЕГ притежава формулата
Y-CHjCHjOCCHjCHjO^CHjCHj-Z, където Y е реактивоспособен към терминалната група на свободния край на ПЕГ остатък с ниска молекулна маса, който е прикрепен към полипептид и Z е -ОСН3 или група, реактивоспособна за образуване на бифункционален конюгат.
ПЕГ-полипептидният конюгат, получен по гореспоменатия метод за степенно прикрепване на два или повече ПЕГ остатъци, може да бъде използван за получаването на лекарствен препарат или фармацевтичен препарат за третиране на заболявания или нарушения, при които полипептидът е ефективен като активна съставка.
Друг обект на настоящото изобретение е осигуряването на конюгаги във фактически чиста форма с цел те да са подходящи за използване като фармацевтични препарати като активна съставка за лечение, диагностика или прогнозиране на бактериални или вирусни инфекции, както и на автоимунни, възпалителни заболявания или тумори. Такъв фармацевтичен препарат представлява друг обект на настоящото изобретение.
Неограничаващи примери на гореспоменатите заболявания включват: септичен щок, СПИН, ревматоиден артрит, лупус, еритроматоза и множествена склероза.
Други методи и преимущества на изобретението са очевидни от следното описание.
Метод на изобретението е прилагането на фармакологично активно количество от конюгатите от изобретението на обекти изложени на риск от развиването на някое от гореспоменатите заболявания или на обекти вече показали такава патология.
Може да бъде използван всеки начин на прилагане на препарата, съвместим с активния принцип. Предпочитано е парентерално прилагане като подкожно, интрамускулно или венозно инжектиране. Дозата на активната съставка, която трябва да бъде приложена, зависи от основата на медицинското предписание в съответствие с възраст, тегло и индивидуален отговор на пациента.
Дозата може да бъде между 10 pg и 1 mg дневно за средно телесно тегло от 75 kg, и предпочитаната дневна доза е между 20 gg и 200 gg.
Фармацевтичният препарат за парентерално прилагане може да бъде приготвен в инжекционна форма, включвайки активна съставка и подходящ носител. Носителите за парентерално прилагане са добре известни в съществуващото ниво на техниката и включват например вода, физиологичен разтвор, разтвор Рингер, и/или глюкоза. Носителят може да съдържа малки количества ексципиенти с цел поддържане стабилността и изотоничностга на фармацевтичния препарат. Приготвянето на разтворите може да бъде направено съгласно традиционните начини.
Настоящото изобретение беше описано с цитати към специфични методи, но съдържанието на описанието включва всички модификации и замествания, които могат да бъдат проведени от всеки с опит в съществуващото ниво на техниката, без да се разпростира извън значението и целите на патентните претенции.
Изобретението ще бъде сега описано с помощта на следните примери, които по никакъв начин не трябва да се тълкуват ограничаващи настоящото изобретение.
Пример 1. Получаване на ΠΕΓ-ΠΤΊ-β конюгат
Модифициране на IFN-β с тПЕГ^-OPSS
За получаването на ΠΕΓ-ΙΕΝ-β-конюгат беше използван рекомбинантен човешки IFN-β, стабилен при концентрация от 0.37 mg/ml в 50 тМ натриево-ацетатен буфер, pH 3.6. Към 2 ml разтвор на IFN-β с концентрация 0.37 mg/ml (0.74 mg, 3.7 х l·8 mol), беше прибавен 1.0 ml 6 Μ урея. mIIEr5k-OPSS беше прибавен в моларен излишък от 50 mol към един mol IFN-β и двете вещества бяха оставени да реагират в полипропиленова фиолка както за 2 h при 37°С, така и за 1 h при 50°С. Реакционната смес беше анализирана с капилярна електрофореза (КЕ) за определяне степента на образуване на ПЕГ-IFN-βконюгат чрез ПЕГилираща реакция, преди каквото и да е пречистване (Фиг. 1). Типичен добив за тази реакция е 50 % nET-IFN-β. Реакционните продукти бяха филтрувани от реакционната смес през 0.22 mm филтър за спринцовка и филтруваният разтвор беше след това нанесен на колона за гел проникваща хроматография (или Супероза 12 или Супердекс 75, Фармация) и елуиран с буфер 50 тМ натриев фосфат, 150 тМ
NaCl, pH 7.0. Фиг. 2 показва профилът на елуиране от пречистването на ΠΕΓ-ΙΡΝ-β-конюгат на хроматографска колона за гел проникваща хроматография Супероза 12. Пиковете бяха събрани и анализирани със SDS-ПААГЕ (Фиг. 3). Фракциите, съдържащи ПЕГ-IFN-3-конюгат бяха обединени и концентратът беше отново нанесен на същата колона за гел проникваща хроматография за допълнително пречистване на ПЕГ-IFNβ-конюгата, поради близкото положение с “нативния” IFN-β пик (Фиг. 2 Б). Тази процедура беше повторена (трети цикъл), с цел да се осигури чистота (Фиг. 2В). Фиг. 4 и фиг. 5 показват съответно графиките от капилярна електрофореза и MALDI-MS спектъра на пречистения ПЕГΙΈΝ-β-конюгат.
Модифициране на IFN-β с mlIEr,0k-OPSS Беше осигурен рекомбинантен човешки IFN-β, стабилен при концентрация от 0.36 mg/ml в 50 тМ натриево-ацетатен буфер, pH 3.6. Към 3 ml разтвор на IFN-β с концентрация 0.36 mg/ ml (1.08 mg, 4.9 х IO'8 mol) беше прибавен 36 mg тПЕГ^-OPSS в 3 ml дейонизирана вода и двете вещества бяха оставени да реагират в полипропиленова фиолка за 2 h при 50°С. Реакционната смес беше анализирана с капилярна електрофореза (КЕ) за определяне степента на модификация. Типични добиви за тази реакция са < 30 %. След това разтворът беше нанесен на колона за гел проникваща хроматография (Супероза 12, Фармация) и елуиран с буфер 50 тМ натриев фосфат, 150 mM NaCl, pH 7.0. Пиковете бяха събрани и анализирани с SDS-ПААГЕ за съдържанието им.
Пример 2. Биологична активност на ПЕГΙΡΝ-β-конюгат
За оценка влиянието на ПЕГилирането върху антивирусната активност на човешки рекомбинантен IFN-β, човешки WISH амниотични клетки бяха предварително инкубирани както с прясно получен IFN-β (същата партида, използвана за ПЕГилиране), така и с nET-IFN-β-κοнюгат. Опосредстваната от IFN-β антивирусна активност, измерена чрез WISH-VSV цитопатичен анализ, беше определена съгласно антивирусният WISH биоанализ, разработен на основата на протокола на Novick et al., J. Immunol., 129:2244-2247 (1982). Материалите използвани при този WISH анализ са както следва:
Клетки WISH (АТСС CCL 25)
Везикулярен стоматитен вирус (ATCC V520-001-522), съхраняван при -70°С.
Човешки рекомбинантен IFN-β, ИнтерФарм Лабораторис ООД (тип 32,075, партида #205035), 82 х 106 IU/ml, специфична активност 222 х 106 IU/mg.
ΠΕΓ-ΙΡΝ-β-κοΗΚΗΤίτ получен съгласно пример 1 и съхраняван в PBS, pH 7.4
Хранителна среда за култивиране на WISH (МЕМ с високо съдържание на глюкоза със соли на Earl + 10 % PBS + 1.0 % L-глутамин + пеницилин / Стрептомицин (100 U/ml, 100 pg/ml)
Среда за анализ на WISH (МЕМ с високо съдържание на глюкоза със соли на Earl + 5 % PBS + 1.0 % L-глугамин + пеницилин / стрептомицин (100 U/ml, 100 g/ml).
МТТ с концентрация 5 mg/ml в PBS, съхраняван при -70°С.
Протоколът за WISH анализа е както следва: 20
Разредете пробата на IFN-β два пъти от началната концентрация с WISH среда за анализ.
Направете трикратни разреждания на пробите на IFN-β в среда за анализ WISH в плоска 96-гнездова плака, така че всяко гнездо да съ- 25 държа 50 μΐ от разредената проба на IFN-β (в някои контролни гнезда се поставят само 50 μΐ от WISH среда за анализ).
Отделете WISH клетки в логаритмична фаза на растеж с разтвор на трипсин/EDTA, промийте ги в WISH среда за анализ и ги доведете 5 до крайна концентрация 0.8 х 106 клетки/ml.
Добавете 50 μΐ от WISH клетъчна суспензия (4 х 104 клетки/гнездо) към всяко гнездо. Сега крайната концентрация на IFN-β, експозиран на клетките е IX.
След инкубиране за 24 h в инкубатор, поддържащ влага и 5 % СО2, се добавят 50 μΐ от 1:10 разреждане (в среда за анализ WISH) от сток разтвор на VSV (доза, предварително определена да лизира 100 % WISH клетките за 48 15 h) към всички гнезда, освен към гнездата на вирусната контрола (в тях се нанасят само еквивалентен обем WISH среда за анализ).
След допълнителни 48 h, към всички гнезда се добавят 25 μΐ разтвор на МТТ, след което плаките се инкубират още 2 h в инкубатор.
Съдържанието на гнездата се отстранява чрез обръщане на плаката и към гнездата се добавя 200 μΐ 100 % етанол.
След 1 h, плаките се отчитат при 595 шп, използвайки софтуерна програма Soft max Pro и спектрофотометърна система Спектрамакс (Молекулярни апарати).
Таблица 1. Антивирусна Активност на Проби на ПЕГилиран и MockПЕГилиран IFN-β
Проба IFN-β* _
ΠΕΓ-ΙΡΝ-β-конюгат 3.9 + / - 0.7 pg/ml
IFN-β 16.4 + /- 1.0 pg/ml
* Сток концентрацията на IFN-β в пробите беше определена чрез аминокиселинен анализ ♦♦ ЕС50 (+ / - стандартно отклонение) беше определена чрез софтуеърна програма Microcal Origin 4.1.
Както е показано на фиг. 6 и таблица 1 погоре, ΠΕΓ-ΙΕΝ-β-конюгата, поддържа нива на антивирусна активност по-високи от прясно приготвената изходна партида на IFN-β. Наблюдението, че ΠΕΓ-ΙΕΝ-β-конюгата притежава приблизително 4 пъти по-висока биоактивност от прясно приготвения IFN-β може да бъде също така резултат от увеличената стабилност на ПЕГΙΕΝ-β-конюгата по отношение на “нативния” IFN-β след добавянето на WISH клетките в средата.
Пример 3. In vitro анализ на относителна9 та активност на проби ПЕГ-IFN-β
Относителната биоактивност на ПЕГ[30 kDaJ-IFN-P-KOHioraT и ПЕГ[2 х 20 kDaJ-IFN-βконюгат беше определена чрез WISH анализ, из ползвайки стандартния протокол, описан в пример 2 (таблица 2). Бяха проведени три независими анализа на три различни индивида в различно време.
Таблица 2. Относителна антивирусна активност на ΠΕΓ-ΙΓΝ-β
Относителна Активност на Интерферон* (от три изследвания)
Проба Анализ 1 Анализ 2 Анализ 3 Средно (С.О)
ПЕГ[30 kDaj-IFN-β 3.2 X по- 3.1 X по- 1.8 X по- 3.2Х(0.78)
високо високо високо по-високо
ПЕГ[20 X 20 kDaJ-IFN-β 4.2 X по- 1.3 X по- 0.85 X по- 3.2 X (1.8)
високо високо високо по-високо
* ЕС5о дози, сравнени със стандартен IFN-β, включен във всеки опит **Сравнение на основата на концентрация 330 pg/ml IFN-β. Сток концентрациите на ПЕГ[30 kDaJ-IFN-β (5.41 pg/ml) и ПЕГ[2 X 20 kDa]IFN-β (6.86 pg/ml) бяха определени чрез ААА.
Свързването на ΠΕΓ-ΙΡΝ-β с неговия рецептор върху клетките беше оценено в присъствието на фиксирани количества от l25I-IFN-a2a. ,25I-IFN-a2a беше радиографски белязан, използвайки хлорамин Т метод. Свързаният 125I с IFNа2а беше отстранен от свободния йод чрез елуиране на реагентите през колона със Сефадекс G25 и събиране на белтъка, съдържащ фракции (Фармация). ,25I-IFN-a2a беше количествено определен чрез IFN-a2a ELISA анализ (Биосорс, САЩ) и беше определена специфичната активност. Клетки Daudi, култивирани в експоненциална фаза бяха центрофугирани и 2 х 10б клетки бяха инкубирани с 0.5 пМ 125I-IFN-a2a за 3 h на стайна температура в присъствието на различни концентрации от ΠΕΓ-ΠΝ-β или IFN-a2a, разредени в буфер за анализ, който е RPMI 1640, съдържащ 2 % зародишен говежди серум и 0.1 % натриев азид. В края на инкубирането, клетките бяха центрофугирани през слой от фталатно масло и клетките свързани радиоактивно, отчетени с гама брояч. Нещо повече, свързването на
ПЕГ[30 kDaj-IFN-β и ПЕГ[2 х 20 kDaj-IFN-β към рецептора беше много подобно или близко на свързващата активност на IFN-β, както е показано на фиг. 7.
В допълнение, относителната активност беше определена в Daudi клетки (човешка В клетъчна лимфома) чрез антипролифериращ анализ (таблица 3). Всички интерферони бяха доведени до 2 х концентрация от 200 ng/ml. Пробите бяха разредени трикратно по дължината на плаката с краен обем от 100 μΐ, бяха добавени 1 х 10’ клетки/гнездо (100 μΐ) във всяко гнездо и инкубирани за общо 72 h при 37°С в инкубатор, поддържащ влага и СО2. След 48-ия час, беше добавен белязан с тритий (Ή) тимидин в концентрация 1 Ci/гнездо в 20 μΐ. След края на 72-часовото култивиране, плаката беше сепарирана чрез Томтек сепаратор за плаки. Резултатите посочени в таблица 3 показват, че не беше наблюдавана детектеруема загуба на активност на интерферон от ПЕГилирането. Всъщност, беше установено, че активността е по-висока от активността на сво10 бодния IFN-β. Това може би се дължи на образуването на неактивни агрегати в свободния интерферон или в разлики в методите на количест вен анализ (аминокиселинен анализ за ПЕГ-IFN пробите и RP-HPLC за IFN-β).
Таблица 3. Daudi Анти - Пролифериращ Анализ
1С50 доза* Пъти увеличение спрямо IFN
IFN-β (Плака 1) 1153.1
ПЕГ[30 kDa]-IFN (71 А) 695.6 1.6 X
IFN-β (Плака 2) 1005.8
ПЕГ[40 kDa]-IFN (71 Б) 629.4 1.7 X
*pg/ml
Пример 4. Фармакокинетични изследвания в мишки
Интравенозно прилагане
Мишките бяха инжектирани със 100 ng от IFN-β, ПЕГ[30 kDaJ-IFN-β и ПЕГ[2 х 20 kDa]IFN-β и след това през определени интервали бяха взети кръвни проби. Серумните концентрации на IFN-β бяха определени чрез специфичен за IFN-β ELISA анализ (Торей Индъстриз) и резултатите бяха показани на фиг. 8. Двадесет и осем женски мишки вид B6D2F1 (на възраст 68 седмици) (приблизително 20 g всяка) бяха разделени в четири групи както следва: Група 1 се състоеше от девет мишки инжектирани с 200 μΐ еднократна болус доза от 500 ng/ml човешки IFN-β (крайна доза от 100 ng/мишка); Група 2 (девет мишки) получиха 200 1 еквивалентно количество по маса ПЕГ[30 kDaJ-IFN-β; Група 3 получиха 200 μΐ еквивалентно количество по маса ПЕГ[2 х 20 kDaJ-IFN-β; и Група 4 е група от три неинжектирани мишки, използвана като негативна контрола. Бяха вземани кръвни проби (приблизително 200 μΙ/проба) в девет определени времена чрез разрушаване на ретро-орбиталната вена плексус с капилярна тръбичка. Кръв ните проби бяха оставени да се съсирят за около един час на стайна температура и микроцентрофугирани. Отделеният серум беше съхраняван при -70°С до тогава, докато бяха събрани всички проби. Серумите бяха анализирани за присъствие на биоактивен човешки IFN-β, използвайки Торей анализа. Резултатите показаха, че зоната под кривата (AUC) е значително усилена в пробите ПЕГ-IFN сравнени със свободен IFNβ и, ПЕГ-IFN пробите срещу свободен IFN-β и, че ПЕГ[2 х 20 kDaJ-IFN-β е по-добър от ПЕГ[30 kDaJ-IFN-β.
Подкожно прилагане
Мишки бяха подкожно инжектирани с IFN-β и ПЕГ-IFN (100 ng/мишка). Фигура 9 показва, че общата площ под кривата (AUC) е драматично увеличена за пробите ПЕГ-IFN, сравнени със свободен IFN-β. Фармакокинетичните данни бяха в съответствие с ПЕГ-IFN проби, притежаващи по-дълго време на полуживот и увеличен AUC.
Пример 5. Прикрепване на ПЕГ остатък с ниска молекулна маса към полипептид.
Прикачване на β-интерферон към OPSSПЕГ2к-хидразид
Белтък- SH
S-S- ΠΕΠκ-Ο-ΝΗ-ΝΗϊ
Беше осигурен рекомбинантен човешки βинтерферон в разтвор при концентрация 0.33 mg/ ml в 50 mM натриево-ацетатен буфер, pH 3.8.
Приблизително 3.6 mg (40 mol излишък към mol белтък) от хетеробифункционален ПЕГ реагент, OPSS-ПЕГ^-хидразид в 2 ml дейонизирана вода беше добавен към 3 ml от IFN-β с концентрация 0.33 mg/ml (0.99 mg) и двете съединения бяха оставени да реагират в полипропиленова фиолка за 1 h при температура 45°С. След това, реакционната смес беше анализирана с капилярна електрофореза за определяне степента на модификация. Типичните добиви варираха от 90-97 %, което зависеше от чистотата на IFN-β и ПЕГ реактива. След това разтворът беше нанесен на колона за гел проникваща хроматография (Супердекс 75, Фармация) и елуиран 5 с буфер 5 тМ натриев фосфат, 150 mM NaCl, pH 7.0. Пиковете бяха събрани и анализирани с SDS-ПААГЕ. Фракциите на моноПЕГилиран β-интерферон бяха обединени и използвани в следващия етап на модифициране с ПЕГ с висока 10 молекулна маса.
Прикачване на β-интерферон към (OPSS)2ПЕГ^оо
Белтък- SH
S-S^nEr^ooS-S
Белтък-Б-Б-ПЕГмоо
Беше осигурен рекомбинантен човешки βинтерферон в разтвор, при концентрация 0.33 mg/ ml в 50 mM натриево-ацетатен буфер, pH 3.8. Приблизително 6.1 mg (40 mol излишък към mol белтък) от хомобифункционален ПЕГ реагент, 25 (OPSS)2-nErj400 в 2 ml дейонизирана вода беше добавен към 3 ml от IFN-β с концентрация 0.33 mg/ml (0.99 mg) и двете съединения бяха оставени да реагират в полипропиленова фиолка за 2 h при температура 50°С. Реакцията беше прос- 3 0 ледена с нередуцираща SDS-ПААГЕ, и крайната реакционната смес беше анализирана с капилярна електрофореза за определяне степента на модификация. Типичните модификации за тази реакция с β-интерферон бяха > 95. След това разтворът беше нанесен на колона за гел проникваща хроматография (Супердекс 75, Фармация) и елуиран с буфер 5 тМ натриев фосфат, 150 тМ NaCl, pH 7.0. Пиковете бяха събрани и анализирани с SDS-ПААГЕ за съдържанието им. Фрак-
динени.
Пример 6. Прикрепване на втори ПЕГ ос татък към пегилиран полипептид с ниска моле кулна маса
Модифициране на IFN-S-S-ПЕГ^-хидразид с тПЕГ^-алдехид (АЛД)
BembK-S-S-nETiK —C-NH-NHj
Ϊ тПЕГ ~ СН2СН 2СН
BejrrbK-S-S-nEr?K-C-NH-№CH- «пП£гмк
Към обединените фракции на IFN-S-SПЕГ2к-хидразид от пример 5, беше добавен тПЕГ^-АЛД в 20 mol излишък към белтъка. 45 Реакцията беше проведена на стайна температура (25°С) за 4 h и беше нанесена проба на колона за гел проникваща хроматография (Супероза 6, Фармация) за определяне добива на модификацията. Добивът на модифициране на тази ре- 5 θ акция беше обикновено повече от 80 %, в зависимост от чистотата на ПЕГ реагента и условията на реакцията.
Сега, след като напълно описахме настоящото изобретение, всеки с познания в съществуващото ниво на техниката, ще оцени, че същото може да бъде проведено с широк диапазон от еквивалентни параметри, концентрации, и усло12 вия, без да се отдалечава от обхвата на изобретението и без необосновано експериментиране.
Докато това изобретение беше описано по отношение на негови специфични методи, може да се разбере, че са възможни следващи модификации. С тази заявка се възнамерява да се покрият всякакви вариации, употреби или адаптирания на изобретението, следвайки най-общо принципите на изобретението и включвайки такива отклонения от настоящото описание, ако те идват от известната или потребителска практика в съществуващото ниво на техниката, към което се отнася изобретението и може да бъде приложено към важни характеристики посочени тук по-горе, поставени както следва в обхвата на приложените патентни претенции.
Всичките литературни източници, цитирана тук, включително публикации в списания или резюмета, публикувани или непубликувани патентни заявки на САЩ или чуждестранни патентни заявки, издадени патенти на САЩ или чуждестранни патенти или всички други литературни източници, са напълно инкорпорирани тук като цитати, включително всички данни, таблици, фигури и текст, представени в цитираните източници. Допълнително, пълното съдържание на цитираните библиографски източници, в цитираната тук литература, са също така включени чрез цитат.
Цитати на известни етапи от методи, традиционни етапи на методи, известни методи или традиционни методи не са по никакъв начин приемане, че всеки аспект, описание или метод от настоящото изобретение са описани, преподавани или предполагани в съответното съществуващо ниво на техниката.
Горепосоченото описание на специфични методи ще разкрие напълно генералната природа на изобретението, което други могат чрез прилагане на познания в рамките на умения в съществуващото ниво на техниката (включително и съдържанието на цитираната тук литература) лесно да модифицират и/или адаптират за различни приложения като специфични методи, без безсмислено експериментиране, без да се отдалечават от генералната концепция на настоящото изобретение. Следователно такива адаптирания и модификации се възнамерява да се считат в обхвата на еквиваленти на описаните методи, основавайки се на материалът представен тук.
Трябва да се разбере, че фразеологията и терминологията тук е за целите на описанието, а не за ограничаване, по такъв начин, че терминология или фразеология от настоящата спесификация да се интерпретира от всеки с познания в съществуващото ниво на техниката в светлината на преподаване и практически ръководства, представени тук в комбинация с познания за всеки с обикновени познания в съществуващото ниво на техниката.

Claims (15)

1. Полиол-Р-интерферон конюгат, притежаващ полиолен остатък, ковалентно свързан с Cys17 от човешки Р-интерферон.
2. Полиол-З-интерферон конюгат, съгласно патентна претенция 1, характеризиращ се с това, че полиолният остатък е полиалкиленов гликолов остатък.
3. Полиол-β-интерферон конюгат, съгласно патентна претенция 2, характеризиращ се с това, че полиалкиленовият гликолов остатък е полиетиленгпиколов (ПЕГ) остатък.
4. Полиол-Р-интерферон конюгат, съгласно която и да е от патентните претенции от 1 до 3, характеризиращ се с това, че полиол-Р-интерферон конюгата притежава същата или по-висока Р-интерферон активност както и нативният човешки Р-интерферон.
5. Метод за получаване на полиол-Р-интерферон конюгат съгласно патентна претенция 1, характеризиращ се с етапи на:
реагиране на Р-интерферон с тиол-реактивоспособен полиолен агент на специфичен сайт и ковалентно прикрепване на полиолния остатък към Cys17 от човешки Р-интерферон за получаване на полиол-Р-интерферон конюгат; и изолиране на получения полиол-р-интерферон конюгат.
6. Метод съгласно патентна претенция 5, характеризиращ се с това, че тиол-реактивоспособният полиолен агент е тиол-реактивоспособен полиетиленгликолиращ агент.
7. Метод съгласно патентните претенции 5 или 6, характеризиращ се с това, че тиол-реактивоспособният полиолен агент е моно-метоксилиран.
8. Метод съгласно патентните претенции 5 или 6, характеризиращ се с това, че тиол-реак13 тивоспособния полиолен агент е бифункционален.
9. Метод съгласно патентните претенции 5 или 6, характеризиращ се с това, че тиол-реактивоспособният полиолен агент е полиолно производно, притежаващо функционална група, избрана от групата, състояща се от ортопиридил дисулфид, винил сулфон, малеимид и йодоацетимид.
10. Метод съгласно патентните претенции 5 или 6, характеризиращ се с това, че тиол-реактивоспособният полиолен агент е ортопиридил дисулфидно производно на моно-метоксилиран полиол.
11. Метод съгласно патентна претенция 5, характеризиращ се с това, че реакционните етапи се провеждат при кисело pH, където β-интерферонът е стабилен.
12. Фармацевтичен препарат, съдържащ като активна съставка полиолф-интерферон конюгат, съгласно която и да е от патентните претенции от 1 до 3, и фармацевтично приемлив но-
5 сител, ексципиент или допълнителен агент.
13. Използване на полиолф-интерферон конюгат съгласно претенциите от 1 до 4 за получаване на фармацевтичен състав за лечение на инфекции, тумори и автоимунни и възпалителни
10 заболявания.
14. Използване съгласно претенция 13, където заболяването е избрано от септичен шок, СПИН, ревматоиден артрит, лупус еритроматоза и множествена склероза.
15 15. Полиолф-интерферон конюгат, съг- ласно която и да е от патентните претенции от 1 до 4 за използване като лекарство.
BG104871A 1998-04-28 2000-10-17 Полиол - интерферон - бета конюгати BG64694B1 (bg)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8333998P 1998-04-28 1998-04-28

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG104871A BG104871A (bg) 2001-07-31
BG64694B1 true BG64694B1 (bg) 2005-12-30

Family

ID=22177687

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG109291A BG65046B1 (bg) 1998-04-28 2000-10-17 Метод за степенно прикрепване на полиетиленгликолкъм полипептид
BG104871A BG64694B1 (bg) 1998-04-28 2000-10-17 Полиол - интерферон - бета конюгати

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG109291A BG65046B1 (bg) 1998-04-28 2000-10-17 Метод за степенно прикрепване на полиетиленгликолкъм полипептид

Country Status (30)

Country Link
US (3) US6638500B1 (bg)
EP (2) EP1075281B1 (bg)
JP (2) JP4574007B2 (bg)
KR (1) KR100622796B1 (bg)
CN (2) CN1187094C (bg)
AR (1) AR020070A1 (bg)
AT (2) ATE365563T1 (bg)
AU (1) AU762621B2 (bg)
BG (2) BG65046B1 (bg)
BR (1) BR9910023A (bg)
CA (2) CA2330451A1 (bg)
CY (1) CY1108022T1 (bg)
CZ (2) CZ298579B6 (bg)
DE (2) DE69936409T2 (bg)
DK (2) DK1075281T3 (bg)
EA (2) EA200300382A1 (bg)
EE (1) EE05214B1 (bg)
ES (2) ES2285286T3 (bg)
HU (1) HUP0300548A3 (bg)
IL (1) IL139286A (bg)
NO (2) NO329749B1 (bg)
NZ (1) NZ507456A (bg)
PL (2) PL196533B1 (bg)
PT (2) PT1075281E (bg)
SI (2) SI1075281T1 (bg)
SK (2) SK286217B6 (bg)
TR (2) TR200003161T2 (bg)
TW (2) TWI266800B (bg)
UA (2) UA66857C2 (bg)
WO (1) WO1999055377A2 (bg)

Families Citing this family (82)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
IL121860A0 (en) 1997-08-14 1998-02-22 Yeda Res & Dev Interleukin-18 binding proteins their preparation and use
US7220717B2 (en) 1997-08-14 2007-05-22 Yeda Research And Development Company Ltd. Interleukin-18 binding proteins, their preparation and use
US7704944B2 (en) 1997-08-14 2010-04-27 Yeda Research And Development Company Ltd. Interleukin-18 binding proteins, their preparation and use for the treatment of sepsis
DK1121382T3 (da) * 1998-10-16 2006-11-13 Biogen Idec Inc Interferon-beta-fusionsproteiner og deres anvendelser
DK1656952T3 (da) * 1998-10-16 2014-01-20 Biogen Idec Inc Polyalkylenglycolkonjugater af interferon beta-1A og anvendelser deraf
US7303760B2 (en) * 1999-04-23 2007-12-04 Alza Corporation Method for treating multi-drug resistant tumors
KR100669053B1 (ko) * 1999-04-23 2007-01-15 알자 코포레이션 리포좀에 사용하기 위한 절단가능 결합을 갖는 콘쥬게이트
US7238368B2 (en) * 1999-04-23 2007-07-03 Alza Corporation Releasable linkage and compositions containing same
US6531122B1 (en) 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates
US7431921B2 (en) 1999-08-27 2008-10-07 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules
US7144574B2 (en) 1999-08-27 2006-12-05 Maxygen Aps Interferon β variants and conjugates
TR200101086A3 (bg) * 1999-10-15 2001-08-21
AU2223401A (en) 1999-12-24 2001-07-09 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Branched polyalkylene glycols
SK11672002A3 (sk) 2000-01-10 2002-12-03 Maxygen Holdings Ltd. Polypeptidový konjugát, spôsob jeho výroby, farmaceutický prostriedok s jeho obsahom a jeho použitie
DE60138364D1 (de) 2000-02-11 2009-05-28 Bayer Healthcare Llc Gerinnungsfaktor vii oder viia konjugate
WO2002060978A1 (en) 2001-01-30 2002-08-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Branched polyalkylene glycols
EP1234583A1 (en) * 2001-02-23 2002-08-28 F. Hoffmann-La Roche Ag PEG-conjugates of HGF-NK4
EP2080771A3 (en) 2001-02-27 2010-01-06 Maxygen Aps New interferon beta-like molecules
PL371781A1 (en) 2001-07-11 2005-06-27 Maxygen Holdings, Ltd. G-csf conjugates
EE05509B1 (et) 2002-01-18 2012-02-15 Biogen@Idec@Ma@Inc Aktiveeritud polalkleenglkoolpolmeer ja seda sisaldavad kompositsioonid
TWI334785B (en) 2002-06-03 2010-12-21 Serono Lab Use of recombinant ifn-β1a and pharmaceutical composition comprising recombinant ifn-β1a for the treatment of hcv infection in patients of asian race
AU2003254641A1 (en) * 2002-08-28 2004-03-19 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules for treatment of cancer
US8129330B2 (en) * 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
EA008866B1 (ru) 2002-12-26 2007-08-31 Маунтин Вью Фамэсьютикэлс, Инк. ПОЛИМЕРНЫЙ КОНЪЮГАТ МОДИФИКАЦИЙ ИНТЕРФЕРОНА-β, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ ПРОДУКТЫ НА ЕГО ОСНОВЕ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
NZ541122A (en) * 2002-12-26 2008-09-26 Mountain View Pharmaceuticals Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
DK1608745T3 (da) 2003-03-20 2009-06-15 Bayer Healthcare Llc FVII eller FVIIa-Varianter
TWI272948B (en) 2003-05-01 2007-02-11 Ares Trading Sa HSA-free stabilized interferon liquid formulations
GB0316294D0 (en) 2003-07-11 2003-08-13 Polytherics Ltd Conjugated biological molecules and their preparation
EP2633866A3 (en) 2003-10-17 2013-12-18 Novo Nordisk A/S Combination therapy
AU2008201682B2 (en) * 2004-02-02 2011-02-24 Ambrx, Inc. Modified human interferon polypeptides and their uses
EP2327724A3 (en) * 2004-02-02 2011-07-27 Ambrx, Inc. Modified human growth hormone polypeptides and their uses
EP1586334A1 (en) * 2004-04-15 2005-10-19 TRASTEC scpa G-CSF conjugates with peg
JP2007538048A (ja) 2004-05-17 2007-12-27 アレス トレーディング ソシエテ アノニム ヒドロゲル・インターフェロン製剤
EP1750750B1 (en) 2004-06-01 2012-02-01 Ares Trading S.A. Method of stabilizing proteins
UA92146C2 (ru) 2004-06-01 2010-10-11 Эйрэс Трейдинг С.А. Стабилизированная жидкая композиция, которая содержит интерферон
TW200633718A (en) * 2004-12-16 2006-10-01 Applied Research Systems Treatment of hepatitis c in the asian population
ATE494012T1 (de) † 2004-12-21 2011-01-15 Nektar Therapeutics Stabilisierte polymer-thiol-reagenzien
US7816320B2 (en) 2004-12-22 2010-10-19 Ambrx, Inc. Formulations of human growth hormone comprising a non-naturally encoded amino acid at position 35
JP2008525473A (ja) 2004-12-22 2008-07-17 アンブレツクス・インコーポレイテツド 修飾されたヒト成長ホルモン
GB2438760A (en) 2004-12-22 2007-12-05 Ambrx Inc Methods for expression and purification of recombinant human growth hormone
EP1893632B1 (en) 2005-06-17 2015-08-12 Novo Nordisk Health Care AG Selective reduction and derivatization of engineered factor vii proteins comprising at least one non-native cysteine
MX2008001706A (es) * 2005-08-04 2008-04-07 Nektar Therapeutics Al Corp Conjugados de una porcion g-csf y un polimero.
SG155183A1 (en) 2005-08-26 2009-09-30 Ares Trading Sa Process for the preparation of glycosylated interferon beta
JP2009507003A (ja) 2005-09-01 2009-02-19 アレス トレーディング ソシエテ アノニム 視神経炎の治療
US20070238656A1 (en) * 2006-04-10 2007-10-11 Eastman Kodak Company Functionalized poly(ethylene glycol)
US20080096819A1 (en) * 2006-05-02 2008-04-24 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
EP2444499A3 (en) * 2006-05-02 2012-05-09 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
AU2007253254B2 (en) 2006-05-24 2013-01-17 Merck Serono Sa Cladribine regimen for treating multiple sclerosis
KR20090013816A (ko) 2006-05-24 2009-02-05 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 연장된 생체내 반감기를 갖는 인자 ⅸ 유사체
MX2009011870A (es) 2007-05-02 2009-11-12 Ambrx Inc Polipeptidos de interferon beta modificados y usos de los mismos.
CA2707840A1 (en) * 2007-08-20 2009-02-26 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
BRPI0821029A2 (pt) * 2007-12-20 2015-06-16 Merck Serono Sa Fomulações de peg-interferon-beta
NZ586947A (en) 2008-02-08 2012-11-30 Ambrx Inc Modified leptin polypeptides and their uses
CN101525381B (zh) * 2008-03-04 2012-04-18 北京百川飞虹生物科技有限公司 一种重组复合干扰素及其表达载体的构建和表达
US20100112660A1 (en) * 2008-05-30 2010-05-06 Barofold, Inc. Method for Derivatization of Proteins Using Hydrostatic Pressure
US20110124614A1 (en) * 2008-10-25 2011-05-26 Halina Offner Methods And Compositions For The Treatment of Autoimmune Disorders
DE102009032179A1 (de) * 2009-07-07 2011-01-13 Biogenerix Ag Verfahren zur Reinigung von Interferon beta
ES2365343B1 (es) 2009-11-19 2012-07-10 Fundación Centro Nacional De Investigaciones Cardiovasculares Carlos Iii Uso de cd98 como marcador de receptividad endometrial.
US20130040888A1 (en) 2010-02-16 2013-02-14 Novo Nordisk A/S Factor VIII Molecules With Reduced VWF Binding
AR080993A1 (es) 2010-04-02 2012-05-30 Hanmi Holdings Co Ltd Formulacion de accion prolongada de interferon beta donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
EP2552967A4 (en) 2010-04-02 2014-10-08 Amunix Operating Inc BINDING FUSION PROTEINS, BINDING FUSION PROTEIN MEDICINAL CONJUGATES, XTEN MEDICAMENT CONJUGATES, AND METHOD FOR THEIR PREPARATION AND USE
EP2569331A1 (en) 2010-05-10 2013-03-20 Perseid Therapeutics LLC Polypeptide inhibitors of vla4
JP2013532176A (ja) 2010-07-15 2013-08-15 ノヴォ ノルディスク アー／エス 安定化させた第ｖｉｉｉ因子バリアント
EP2616486B1 (en) 2010-09-15 2019-01-02 Stichting Sanquin Bloedvoorziening Factor viii variants having a decreased cellular uptake
US9913880B2 (en) 2011-02-18 2018-03-13 Stemdr Inc. Method of treating sepsis or septic shock
EP2726502A1 (en) 2011-07-01 2014-05-07 Bayer Intellectual Property GmbH Relaxin fusion polypeptides and uses thereof
JP6153470B2 (ja) * 2011-10-01 2017-06-28 株式会社糖鎖工学研究所 糖鎖付加ポリペプチドおよび当該ポリペプチドを含む医薬組成物
CN117462693A (zh) 2012-02-27 2024-01-30 阿穆尼克斯运营公司 Xten缀合组合物和制造其的方法
WO2013129549A1 (ja) 2012-02-29 2013-09-06 東レ株式会社 体腔液貯留抑制剤
ES2687801T3 (es) 2013-03-29 2018-10-29 Glytech, Inc. Polipéptido presentando cadenas de azúcares sialiladas unidas al mismo
WO2016013697A1 (ko) * 2014-07-24 2016-01-28 에이비온 주식회사 인터페론-베타 변이체의 폴리에틸렌글리콜 배합체
WO2016013911A1 (ko) * 2014-07-24 2016-01-28 에이비온 주식회사 페길화된 인터페론 -베타 변이체
SI3183264T1 (sl) 2014-08-19 2021-03-31 Biogen Ma Inc. Metoda pegilacije
CN107530396B (zh) 2015-05-01 2022-08-26 雅利斯塔制药公司 用于治疗眼科疾病的脂联素拟肽
HRP20201489T1 (hr) * 2015-06-19 2020-12-11 Eisai R&D Management Co., Ltd. Imunoglobulini konjugirani s cys80
EP3373922B1 (en) 2015-11-09 2022-01-05 The Regents of The University of Colorado, A Body Corporate Compositions and methods for use in the treatment of homocystinuria
EP3612214A4 (en) * 2017-04-17 2021-01-20 The Regents of the University of Colorado, A Body Corporate ENZYME REPLACEMENT THERAPY OPTIMIZATION FOR THE TREATMENT OF HOMOCYSTINURIA
EP3713582A1 (en) 2017-11-24 2020-09-30 Merck Patent GmbH Cladribine regimen for use intreating progressive forms of multiple sclerosis
JPWO2020158691A1 (ja) 2019-01-28 2021-12-02 東レ株式会社 肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体
JPWO2020158690A1 (ja) 2019-01-28 2021-12-16 東レ株式会社 肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体
CA3194812A1 (en) 2020-09-10 2022-03-17 Merck Patent Gmbh Novel treatment regimen for the treatment of autoimmune disorders

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
DE3676670D1 (de) * 1985-06-26 1991-02-07 Cetus Corp Solubilisierung von proteinen fuer pharmazeutische zusammensetzungen mittels polymerkonjugierung.
US4917888A (en) 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5206344A (en) * 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US5208344A (en) * 1987-07-31 1993-05-04 American Home Products Corporation Naphthalenepropionic acid derivatives as anti-inflammatory/antiallergic agents
US5166322A (en) * 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
US5595732A (en) * 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
KR960705579A (ko) 1993-11-10 1996-11-08 에릭에스. 딕커 개선된 인터페론 중합체 결합체(Improved interferon polymer conjugates)
CN1229385C (zh) * 1994-03-31 2005-11-30 安姆根有限公司 刺激巨核细胞生长和分化的组合物及方法
ES2245780T3 (es) * 1994-05-18 2006-01-16 Nektar Therapeutics Metodos y composiciones para la formulacion de interferones como un polvo seco.
US5824784A (en) * 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
SE9503380D0 (sv) * 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
TW517067B (en) * 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
US5851984A (en) * 1996-08-16 1998-12-22 Genentech, Inc. Method of enhancing proliferation or differentiation of hematopoietic stem cells using Wnt polypeptides
KR0176625B1 (ko) 1996-11-05 1999-04-01 삼성전자주식회사 적외선 물체검출장치
DE69800640T2 (de) * 1997-01-29 2001-07-05 Polymasc Pharmaceuticals Plc, London Pegylationsverfahren
ATE375363T1 (de) * 1997-07-14 2007-10-15 Bolder Biotechnology Inc Derivate des wachstumshormons und verwandte proteine
US6307024B1 (en) * 1999-03-09 2001-10-23 Zymogenetics, Inc. Cytokine zalpha11 Ligand
US6531122B1 (en) * 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
EA200001111A1 (ru) 2001-04-23
PL196533B1 (pl) 2008-01-31
IL139286A0 (en) 2001-11-25
CN100335503C (zh) 2007-09-05
SK286654B6 (sk) 2009-03-05
EA005495B1 (ru) 2005-02-24
DE69936409T2 (de) 2008-04-17
WO1999055377A3 (en) 1999-12-29
CZ20003995A3 (en) 2001-06-13
CN1637020A (zh) 2005-07-13
NO329749B1 (no) 2010-12-13
JP2010184929A (ja) 2010-08-26
US7700314B2 (en) 2010-04-20
CZ298597B6 (cs) 2007-11-21
US6638500B1 (en) 2003-10-28
DE69936409D1 (de) 2007-08-09
SI1075281T1 (en) 2005-02-28
ES2224649T3 (es) 2005-03-01
KR20010071158A (ko) 2001-07-28
SI1421956T1 (sl) 2007-10-31
CA2565375A1 (en) 1999-11-04
BR9910023A (pt) 2000-12-26
DE69920002T2 (de) 2005-09-22
CZ298579B6 (cs) 2007-11-14
PL344490A1 (en) 2001-11-05
AR020070A1 (es) 2002-04-10
EA200300382A1 (ru) 2005-02-24
JP2002512983A (ja) 2002-05-08
ATE365563T1 (de) 2007-07-15
AU3767499A (en) 1999-11-16
EP1421956A1 (en) 2004-05-26
SK16222000A3 (sk) 2001-04-09
NO20005337D0 (no) 2000-10-23
KR100622796B1 (ko) 2006-09-13
PL193352B1 (pl) 2007-02-28
BG65046B1 (bg) 2007-01-31
WO1999055377A9 (en) 2000-03-02
HK1038194A1 (zh) 2002-03-08
SK286217B6 (sk) 2008-05-06
PT1075281E (pt) 2004-11-30
TR200101751T2 (tr) 2002-05-21
TWI232882B (en) 2005-05-21
TR200003161T2 (tr) 2001-01-22
NO20100324L (no) 2000-12-28
CN1187094C (zh) 2005-02-02
IL139286A (en) 2005-12-18
CN1302209A (zh) 2001-07-04
DE69920002D1 (de) 2004-10-14
HUP0300548A3 (en) 2005-07-28
NO20005337L (no) 2000-12-28
US20040043002A1 (en) 2004-03-04
CY1108022T1 (el) 2013-09-04
EP1421956B1 (en) 2007-06-27
TWI266800B (en) 2006-11-21
NO332224B1 (no) 2012-07-30
ATE275422T1 (de) 2004-09-15
HUP0300548A2 (hu) 2003-06-28
EA003789B1 (ru) 2003-10-30
UA66857C2 (uk) 2004-06-15
WO1999055377A2 (en) 1999-11-04
BG104871A (bg) 2001-07-31
US20070141620A1 (en) 2007-06-21
DK1075281T3 (da) 2005-01-03
JP4574007B2 (ja) 2010-11-04
PT1421956E (pt) 2007-07-13
CA2330451A1 (en) 1999-11-04
NZ507456A (en) 2003-10-31
DK1421956T3 (da) 2007-10-01
HK1076115A1 (zh) 2006-01-06
BG109291A (bg) 2006-04-28
AU762621B2 (en) 2003-07-03
UA79430C2 (en) 2007-06-25
EE05214B1 (et) 2009-10-15
EP1075281B1 (en) 2004-09-08
ES2285286T3 (es) 2007-11-16
EP1075281A2 (en) 2001-02-14
EE200000614A (et) 2002-04-15
US7357925B2 (en) 2008-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BG64694B1 (bg) Полиол - интерферон - бета конюгати
MXPA00010223A (en) Polyol-ifn-beta conjugates
HK1076115B (en) Polyol-ifn-beta conjugates
HK1038194B (en) Polyol-ifn-beta conjugates