BG67706B1 - Бактериален щам bacillus thuringiensis subsp. galleriae btg с пестицидно действие срещу вредители от разредите lepidoptera, coleoptera, diptera, hemiptera и клас gastropoda - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася към областта селско стопанство и по-специално за растителна защита и за борба с вредителите по културните растения. Бактериалният щам Bacillus thuringiensis subsp. galleriae BTG служи като биопестицид с инсектицидна активност срещу насекоми от различни таксономични групи: разредите Lepidoptera (Пеперуди), Coleoptera (Бръмбари, Твърдокрили), Diptera (Двукрили) и Hemiptera (Полутвърдокрили). Щамът съдържа и гени за токсини, поразяващи охлювите от клас Gastropoda. Пестицидната активност на B. thuringiensis subsp. galleriae щам BTG се дължи на синтезата на седем различни кристални токсина (Сry). Бактериалният щам B. thuringiensis subsp. galleriae BTG е изолиран от почва от района на град Пловдив, България. Щамът е депозиран в Националната банка за промишлени микроорганизми и клетъчни култури, България, под номер NBIMCC 9095 като средство за борба с вредители от разредите Lepidoptera, Coleoptera, Diptera, Hemiptera и клас Gastropoda.

Description

Изобретението се отнася към областта селско стопанство и по-специално за растителна защита и за борба с вредителите по културните растения. Бактериалният щам Bacillus thuringiensis subsp. gallerias BTG служи като биопестицид с инсектицидна активност срещу насекоми от различни таксономични групи: разредите Lepidoptera (Пеперуди), Coleoptera (Бръмбари, Твърдокрили), Diptera (Двукрили) и Hemiptera (Полутвърдокрили). Щамът съдържа и гени за токсини, поразяващи охлювите от клас Gastropoda. Пестицидната активност на В. thuringiensis subsp. galleriae щам BTG се дължи на синтезата на седем различни кристални токсина (Cry).

Предшестващо състояние на техниката

Според данни на ООН от 2021 г., над 40% от реколтата в растениевъдството всяка година бива изгубена поради болести и вредители. Десет хиляди вида насекоми атакуват културните растения, хранят се с техните надземни и подземни части и фатално унищожават реколтата. Повечето щети по растенията са причинени от насекоми и техните ларви (молци, нощенки, белокрилки, бръмбари, трипс), нематоди и охлюви, които се хранят с надземни и подземни растителни части и изсмукват хранителните вещества от растенията. В научната литература се е наложило мнението, че прилагането на микроорганизми от вида Bacillus thuringiensis, като биопестицид е един от най-ефективните подходи за борба с вредителите. Бацилните пестициди се прилагат, като спорова суспензия или като гранулирани препарати за растителна защита.

Bacillus thuringiensis (ВТ) е изолиран за първи път през 1901 г. от японския биолог Ishiwata Shigetane, като бактерия-причинител на заболяване, засягащо копринените буби. Малко по-късно е открит и от немският учен Berliner през 1911 г. в средиземноморския брашен молец Anagasta kuehniella. Най-ранното търговско производство на препарати, съдържащи ВТ започва във Франция през 1938 г. под името Sporeine. Повишеният интерес към ВТ се приписва на Едуард Щайнхаус, който получава чисти култури през 1942 г. и привлича вниманието към потенциала на вида, а през 1956 г. Angus демонстрира, че кристалните протеинови включвания, образувани в хода на спорообразуването, са отговорни за инсектицидното действие. До началото на 80-те години на миналия век вече е ясно, че много от гените, кодиращи кристалните протеини, са локализирани върху плазмиди, a Schnepf и Whiteley (1998) първи клонират и характеризират гените, кодиращи кристални протеини, които имат токсичност спрямо ларвите на тютюневия червей, от плазмидна ДНК на ВТ ssp. kurstaki HD-1. Това първо клониране е последвано от клонирането на много други гени за токсини и в крайна сметка е довело до развитието на трансгенни растения. Памук, съдържащ токсин на ВТ се произвежда и продава от 1996 г. Днес следните фирми произвеждат препарати за растителна защита, основани на различни щамове ВТ: Valent Bioscience Co., препарат, съдържащ ВТ ssp. kurstaki, вкл. Dipel, Becker Microbial Products, Ecogen Inc., Certis (САЩ).

B. thuringiensis е Грам-положителна, каталазо-положителна, оксидаза-отрицателна, строго аеробна, подвижна бактерия с перитрихиални флагели. Обикновено се среща в почвите, но също така присъства във водата, насекомите и околната среда. ВТ се развива в два жизнени цикъла: вегетативен растеж и спорулация. Токсигенни щамове от вида В. thuringiensis са добре известни със своя пестициден потенциал, тъй като съдържат гени, които кодират δ-ендотоксини, известни още като Cry, или кристални, поради тяхната способност за автокристализация in vivo. В процеса на образуване на ендоспори, клетките на В. thuringiensis секретират Cry про-токсини. Развитието на спорите и кристалните токсини включват седем различни етапа: фаза I: образуване на аксиална нишка; фаза II: образуване на преградата на пред-спората; фаза III: параспорални кристали и образуване на пре-спора; фази IV-VI: образуване на екзоспори, развитие на първичната клетъчна стена и трансформация на споровите нуклеоиди; фаза VII: узряване на спорите и клетъчен лизис.

Кристалните токсини се синтезират след втория етап на спорулацията и се натрупват в клетката, където те могат да достигнат до 30% от сухото тегло на спорулиралите клетки. Формите на кристалите могат да бъдат дипирамидална, пирамидална, кубична, ромбовидна, сферична и правоъгълна. Най-често срещаната форма е дипирамидалната. Кристалите могат да включват един или повече ендотоксини с молекулно тегло между 30 kDa и 140 kDa. При поглъщане от насекомото или неговите ларви, кристалните про-токсини се разтварят и биват активирани от протеазите в храносмилателната система. Активните токсини се свързват със специфични рецептори на клетките на средното черво, нарушават транспорта на веществата и водят до смърт на насекомото или неговите ларви след 2 до 48 часа.

Досега са открити повече от 731 различни cry гена (Palma et al., 2014), а според аминокиселинната им последователност, Cry-токсините са класифицирани в 16 групи с 272 холотипа (Crickmore et al., 2021). Задължително условие за принадлежността на даден токсин към Cry-семейството е наличието на три консервативни района в молекулата: домейните pfam03945, pfam00555 и cd04085, наречени съответно перфориращ домейн, централен домейн за взаимодействие с рецептора и галактозо -свързващ домейн за образуване на порите в клетъчната мембрана. Различните класове токсини на В. thuringiensis се свързват с различни рецептори и затова биоинсектицидните препарати, които съдържат щамове В. thuringiensis имат специфична токсичност спрямо определени групи вредители. Така например, известно е, че В. thuringiensis subsp. kurstaki и В. thuringiensis subsp. aizawai съдържат токсини, поразяващи насекоми от разред Lepidoptera, В. thuringiensis subsp. tenebrionis се използва за биоконтрол на Coleoptera, а В. thuringiensis subsp. israelensis спира развитието на ларвите на комарите и мухите (Diptera).

Съществуват множество патенти, описващи щамове В. thuringiensis с инсектицидна активност и техните характеристики. В някои патенти в САЩ е защитен щам (WO 2016115476 А1, WO 1996028031 A1); в други откриването на нови Cry протеини (US 2008020967, US 2008040827, US 2007245430, US 2008016596, US 2008020968), техните белтъчни секвенции, или клонирането на отговорните гени в трансгенни растения. Съществуват и патенти, които описват нови хибридни инсектицидни токсини и тяхната продукция (US 5593881, US 5932209 (Cry1A, CrylC), US 6962705, US 7250501, US 2004093637, WO 0114562, WO 0214517, US 6156573 (Cry1C, Cry1A, Cry1F), US 7214788 (Cry23A, Cry37A), US 7019197 (Cry1A), US 6320100 (Cry1A, Cry1B), AU 2001285900 B (Cry1A, Cry1C), US 2007208168 (Cry23A, Cry37A), WO 0134811 (Cry 3А, Cry1I, Cry1B), US 2004033523 (СгуЗА, СгуЗВ, Cry3Q, US 6780408 (Cry1A, Cry1C, Cry1E, CrylG), US 2008047034 (Cry1A, Cry1F), US 6780408 (CryIC, CryIE, CryIA, CryIG).

Засега в патентната литература не са описани щамове, които да проявяват комбинирана инсектицидна активност срещу различни класове насекоми и охлюви. Наскоро беше установено, че щам Bacillus thuringiensis subsp. galleriae (SDS-502), регистриран в САЩ и Канада, произвежда токсина Cry8Da, ефективен срещу различни бръмбари - скарабеи, напр. Popillia japonica (Redmond, 2020). Има публикации, които докладват, че щамът SDS-502 може да се използва за биологичен контрол и върху развитието на люцерновата дървеница (Shrestha et al., 2018), но за него няма данни за инсектицидна активност срещу молците от разред Lepidoptera. Няма данни и за въздействие върху охлюви.

Техническа същност на изобретението

Бактериалният щам В. thuringiensis subsp. galleriae BTG е изолиран от почва от района на град Пловдив, България. Щамът е депозиран в Националната банка за промишлени микроорганизми и клетъчни култури, България, под номер NB1MCC 9095.

Изолирането на щам В. thuringiensis subsp. galleriae BTG е осъществено, като почвената проба е взета от местност, която не е била третирана с пестициди или биопестициди, от чернозем, от дълбочина 5 cm. Почвата е поставена в стерилна епруветка и съхранявана при 4°С до нейната обработка. Методът на изолиране се основава на принципа на третиране с термичен шок и последващо селективно развитие на ендоспорите на бактериите от род Bacillus. Един грам от почвената проба се поставя в 10 ml физиологичен разтвор в стерилна колба и се инкубира в роторен инкубатор при скорост на разбъркване 200 об./мин. за 4 часа при 30°C. Аликвотни части от 1 ml от суспензията се подлагат на топлинен шок при 80°C за 20 мин. и след това се поставят в лед за 5 мин. Термично обработените проби се разреждат серийно във физиологичен разтвор и аликвоти от 100 мкл от всяко разреждане се разпределят върху петриеви блюда, съдържащи агаризирана среда Nutrient Broth. Петриевите блюда се инкубират при 37°C за 24 - 72 часа. Колониите, с типична за Bacillus spp. морфология се суб-култивират бульон Nutrient Broth при 37°C за 24 часа и се съхраняват при 4°C за последваща идентификация. Дълготрайното съхранение на щама е в течна среда с добавен 20% v/v глицерол при -70°C, или на щрих на полегат агар в стерилна епруветка, запушена със стерилна гумена тапа в хладилник при 4 -12°C.

Клетките на щам BTG са пръчковидни, колониите са светло бежови, кремави с неравен ръб. Оптималната температура на растеж е 30 - 37°C. Подходящи среди за развитието му са Nutrient broth и Luria-Bertani с pH 7. Спорите са елипсовидни. В. thuringiensis subsp. galleriae BTG е Грам-положителна бактерия, каталазоположителна, метаболизира захарите глюкоза, галактоза, рибоза, малтоза и синтезира ацетоин (положителна реакция на теста Фогес-Проскауер).

Идентифицирането на щам В. thuringiensis subsp. galleriae BTG е осъществено въз основа на генетични методи: сравнение на секвенцията на 16S рибозомален ген с бази данни и секвениране на целия геном.

За изолирането на ДНК са използвани 24-часова култура на щам BTG. Намножаването на гена, кодиращ 16S рибозомалната РНК е осъществено с универсална праймерна двойка 27F и 1492R при следния температурен режим: начална денатурация 94°C - 3.30 мин., 35 цикъла: 94°C - 1 мин., 58°C - 45 сек., 72°C - 2 мин. и финална елонгация 72°C - 7 мин. След визуализирането на фрагменти от около 1600 нуклеотидни двойки в 1% агарозен гел, фрагментите са секвенирани.

Генетични подходи за доказване на гени за кристални токсини cry

Наличието на гени за кристални токсини е осъществено чрез дизайн на праймерни двойки, разпознаващи специфично подбрани токсини, изолиране и пречистване на геномна ДНК от всеки изследван щам, провеждане на полимеразно-верижна реакция с матрица геномна ДНК от щам BTG с праймери, разпознаващи специфично ген за токсин, анализ на получените фрагменти чрез разделяне в агарозен гел, секвениране на фрагмента, бионформатичен анализ на секвенцията: сравнение с базата данни на NCBI (Национален център за биотехнологична информация на САЩ).

Окончателна информация за наличните гени за токсини дава секвенцията на пълния геном на щама. Геномът на щама представлява кръгова хромозома с големина 6 275 416 базови двойки, с Г+Ц съдържание 35.11%. Не са открити плазмиди. Сравнението на генома на BTG с базата данни на NCBI показва 94.77% хомология с геномите на бактериите от род Bacillus и 5.23% хомология с род Pseudomonas. Щам BTG притежава в генома си 7 гена, кодиращи кристални токсини с инсектицидно действие: Cryl АЬ35, Cry1Db, Cry1Fb, Cry8Ea1,

Cryllb, Cry2Ab и Cry9Ba. Тази комбинация от гени за токсини е уникална за щам BTG и не се среща при други щамове. Освен тях, в генома на щама присъства ген, кодиращ протеин с рицинов домейн.

Определени участъци от генома са хомоложни на геномите на щамовете с инсектицидна активност В. thuringiensis ABTS-1857 (СР083156.1) и В. thuringiensis serovar kurstaki YBT-1520 (CP004858.1). За разлика от тях обаче, щам BTG съдържа гени за други делта токсини. Например, ABTS-1857 (който е активната съставка на DiPei) и YBT-1520 (патентно-защитен в Китай), съдържат гени за токсините CrylAa и Сгу2Аа, а щам BTG не съдържа такива гени.

Тъй като В. thuringiensis щам BTG принадлежи към no galleriae, е направено сравнение между неговия геном и този на друг щам с известна инсектицидна активност, В. thuringiensis serovar galleriae щам HD-29 (Zhu et al., 2015). Подобието между геномите е 90%, с най-съществени разлики в кодираните кристални токсини. Щам HD-29 съдържа плазмидно-кодирани crylAa, crylAc, crylCa, crylDa, crylla, cry2Ab, cry9Ea и vip3Aa, които липсват в щам BTG. Ген за токсин, който присъства в геномите на двата щама е сгу2АЬ, но нуклеотидните последователности на сгу2АЬ при двата щама не са еднакви (99.6% хомология). Токсинът има 100% подобие с Сгу2АЬ на щамовете В. thuringiensis FB (JN226103.1) и В. thuringiensis LBIT-418 (OL899343.1).

Уникални за щам BTG са хромозомално-кодираните CrylAb35, CrylDb, CrylFb, Cryllb и Cry8Eal. Нуклеотидната секвенция на cry 1АЬ35 на BTG е 100% идентична на тази на щам В. thuringiensis GS36 (Zhang et al., 2017). Токсинът е 99.97% идентичен с плазмидно-кодиран токсин на Pseudomonas synxantha щам 27 (NCBI СР074079), което предполага плазмиден генетичен трансфер между видовете.

Таблица 1. Гени, кодиращи кристални токсини в В. thuringiensis subsp. galleriae BTG.

CRY ГЕН crylAbSS

Размер Секвенция (на.) ( ’) atggataacaalccgaacatcaatgaatgcattccttataattgtttaagtaaccc tgaagtagaagtattaggiggagaaagaaiagaaacigguacaccccaatcg atatttccttgtcgctaaegeaatnctntgaglgaatttgttcccgglgctggattt gtgltaggactagttgatataatalggggaatttltggtecctctcaatgggacg catttcttgtacaaattgaacagttaaltaaccaaagaatagaagaattcgctag gaaccaagccatttctagattagaaggaclaagcaatcntatcaaaulacgca gaatcttttagagagtgggaagcagatcctactaatccagcattaagagaaga gatgcgtatieaallcaaigaeatgaacagtgcccttacaaccgctatlcctcttt ttgcagttcaaaattatcaagitKtctUtatcagtalatgttcaagctgcaaaitt acatttatcagttttgagagatgttteagtgtttggacaaagglggggatltgatg ccgcgactatcaatagtcgttataatgatttaactaggcttatlggcaaclalaca gatcatgclgtacgctggtacaatacgggatlagagcglgtatggggaccgg astctagagattggataagatataalcaatttagaagagaattaacactaactgta ttagatatcgtttctctafflccgaactatgatagtagaacgtaWcaaHcgaaca gtncccaattaacaagagaaalttatacaaacccagtattagaaaattttgatgg tagtttlcgaggctcggctcagggcatagaaggaagtattaggagtccacaitt gatggatatacltaacagtataaccatctatacggatgctcatagaggagaatat taKgglcagggcatcaaataatggcnctcctgtagggttttcggggccagaal tcacKttccgc!a(atggaactatgggaaatgcagc,ccacaacaacgtattgt tgcicaactagglcagggcgtgtatagaacattatcgtccactttatatagaaga ccttttaatatagggaiaaataaicaacaaciatctgttcttgacgggacagaait tgcttaiggaacctcctcaaatttgccatccgctgiatacagaaaaagcggaae

M6 ggtagattcgctggatgaaataccgccacagaataacaacgigccacctagg caaggatttagtcatcgattaagccatgtttcaatgtttcgttcaggctltagtaat agiagtgtaagiaiaaiaagagctcclalgttctcttggatacatcgtagtgctga atttaaiaatataattccttcatcacaaattacacaaatacctttaacaaaalctact aalcnggctctggaacttctgtcgttaaaggaccaggatttacaggaggagat aUcttcgaagaactlcacctggceagatttcaaccttaagagtaaatattactgc aecattatcaeaaagatatcgggtaagaattcgctacgcttctaccacaaaina caattccatacatcaattgacggaagacctattaatcaggggaalitncagcaa ctatgagtagtgggagtaatttacagtccggaagctttaggactgtagguttac tactccgtttaacttncaaatggatcaagtgtatttacgttaag(gc!catgtcttc aattcaggcaatgaagtttalatagatcgaattgaatttgttccggcagaagtaa cctttgaggcagaatatgatttagaaagagcacaaaaggcggtgaalgagct gtliacncitccaatcaaatcgggttaaaaacagalgtgacggattatcatattg atcaagtatccaaHtagttgugigtttatctgatgaattttgtctggatgaaaaaa aagaaltgtccgagaaagicaaacatgcgaagcgacllagtgatgagcggaa tttacttcaagatccaaactttagagggatcaatagacaactagaccgtggcig gagaggaagtacggatattaccatccaaggaggcgatgacgtatlcaaagag aattacgtlacgctangggtacctttgatgagtgctatccaacgtatttatatcaa aaaatagatgaglcgaaanaaaagcctatacccgttaccaattaagagggiat atcgaagatagicaagactiagaaatctatttaaKcgctacaatgccaaacacg aaacagtaaatgtgecaggtacgggttccttatggccgctttcagccccaagtc caatcggaaaalgtggagaaccgaatcgatgegcaccacaactlgaaiggaa tccagatctagattgttcetgcagagacggagaaaaatgtgcccalcattccca <catttctecitggaca«galg!tggatgtacagacttaaatgaggacttagg1g ,, ... Секвенция (брои

MDNNPNINECIPYNCLSNPEVEVLG GER IETG YTPI DIS LSLTQFLLSEFVP GAGFVLGLVD1IWGIFGPSQWDAFL VQTEQLINQRIEF.FARNQAISRLEGL SN LYQIY AESFRE WE ADPTNP ALRE EMRIQFNDMNSALTTAIPLFAVQNY QVPLLSVYVQAANLHLSVLRDVSV FGQRWGFDAATINSRYNDITRLIG

NYTDHAVRWYNTGLERVWGPDSR DWIR YNQFRRE LTLT V LDIVSLF PN YDSRTYPIRTVSQLTREIYTNPVLEN FDGSFRGSAQGIEGSIRSPHLMDILN S1T1YTDAHRGEYYWSGHQIMASPV GFSGPEFTFPLYGTMGNAAPQQRIV AQLGQGVYRTLSSTLYRRPFN1GIN NQQLSVLDGTEFAYGTSSNLPSAV YRKSGTVDSLDEIPPQNNNVPPRQG FSHRLSHVSMFRSGFSNSSVS1IRAP MFSWIHRSAEFNN1IPSSQITQIPLTK STNLGSGTSVVKGPGFTGGD1LRRT SPGQISTLRVNITAPLSQRYRVRIRY ASTTN LQFHTSIDGRPINQGNFSAT MSSGSNLQSGSFRTVGFTTPFNFSN GSSVFTLSAHVFNSGNEVYIDRIEFV P AE VTFE AEYDLER AQKA VNE LFTS SNQIGLKTDVTDYHIDQVSNLVECL SDEFCLDEKKELSEKVKHAKRLSD ERNLLQDPN FRGINRQLDRG WRGS TD1TIQGGDDVFKENYVTLLGTFDE CYPTYLYQKIDESKLKAYTRYQLR GYIEDSQDLEIYLIRYNAKHETVNV PGTGSLWPLSAPSPIGKCGEPNRCA PQLEWNPDLDCSCRDGEKCAHHSH HFSLD1DVGCTDLNEDLGVWV1FKI KTQ DGH AR LGN LE FLEEKPLVGF. A LARVKRAEKKWRDKREKLEWETN IVY KE AKES VD ALFVNSQYDRLQA DTNIAMIHAADKRVHSIREAYLPEL SVIPGVNAA1FEELEGRIFTAFSLYD ARNVIKNGDFNNGLSCWNVKGHV DVEEQNNHRSVLVVPEWEAEVSQE VRVCPGRGYILRVTAYKEGYGEGC VT1HE1ENNTDELKFSNCVEEEVYP NNTVTCND YTATQE EY EGTYTSRN RGYDGAYESNSSVPADYASAYEEK AYTDGRRDNPCESNRGYGDYTPLP cryl Db talgggtgatetteaagattaagacgcaagatggccatgcaagactaggaaat ctagaatttctcgaagagaaaccattaglaggagaagcactagetcgtgtgaa aagagcggagaaaaaatggagagacaaacgtgaaaaatiggaatgggaaa caaatatlgntaiaaagaggcaaaagaatctgtagaigetttatttgtaaactctc aataigatagattacaagcggataccaacalcgcgalgattcatgcggcagat aaacgcgttcatagcancgagaagcttalctgcetgagetgtctgtgattccgg gtgtcaalgcggctatttttgaagaattagaagggcgtattttcactgcattclcc ctatalgatgcgagaaatglcattaaaaatggtgattttaalaatggcHatcctg ctggaacgtgaaagggcaigtagatgtagaagaacaaaacaaccaccgitcg glccttgttgttccggaatgggaagcagaagtgicacaagaagttcgtglctgl ccggglcgtggctaiatccttcgtgtcacagcgtacaaggagggatatggaga aggttgcgtaaccattcalgagatcgagaacaatacagacgaactgaagttta gcaactgtgtagaagaggaagtatatccaaaeaacaeggiaacglgiaatgat tatactgcgacicaagaagaatatgagggtacgtacacttctcgtaaicgagga talgacggagcctatgaaagcaattcttctgtaccagctgattatgcatcagcct atgaagaaaaagcatatacagatggacgaagagacaatccttgigaatctaac agaggatatggggatucacaccactaccagctggctatgtgacaaaagaatt agagtacttcccagaaaccgataagglalggattgagatcggagaaacggaa ggaacancattgtggatagcgtggaattaclccrtatggaggaatag atggatataaatcatcaaaatcaatgtataccctacaangttlaagtaaiccigai gcgatattaciagatgcggaaaggciagaaacaggaaacaccgtagcagac atttcattagggcttattaacittctatattclaatttigtaccaggcggagggtttat agiaggtttactagaatiaatatgggggtltgtggggccctcgcaatgggagat nttttagctcaaatagagcaattgattagtcaaagaatagaagaatttgctagga accaagcaattictagattagaaggaiiaagcaamanatgagatltataeaga aacgtttcgggcgtgggaaaaggatccgtctaatcctgcattgagagaagag atgcgtacccaantaatgtcatgaatagtgcictcatagcagctattcctcttlta agagttcgtaattatgaagttgctcctttatccgtttaigttcaggcagcaaatltac acL’tatctgtgttaagagatgtttcagtttacgglcagagalggggctttgaccc agcgactgtcaatagtcgttatagcgatttaactaggcuattcatgtnatactga tcattgtgtggatacgtataatgatgggtlaaaaaatttagagggatctcgattg! cagattgggltgtatataatcgcincgaagacgattaacaatUctgtattagata ttalagcttttttcccaaattatgataiagaagcgtatccaatacaaacagciagtc aattgacacgagaagtciatctggattlaccttttgttaatgaaactctatcccctc cagcaagctatccaaciitctcagctgctgaaagtgctataattagaagtcctca tttaglagactttttaaatagctttaccaittatacagatagtciggcaagtlatgca UltggggagggcacttggUaattcmccgcacaggaactactaciaatllga taagatcccctctatatggaagggaaggaaatacagagcgtcccgtaactatit ccgcateacctagcgTaccaalatttagaacacutcatatittaciggWttaaca ataataatccigtagctggaatcgagggagtggaattccaaaatactataagta gaagtatctatcgtaaaagcgglccaaiagattcttttagtgaatlaccacctcaa gatgtcagtgtaictcctgcaattgggtatagtcatcgtttalgccalgcaacaltt ttagaacggattagtggaccaagaatagcaggcaccgtattttcttggacacac cgtagtgctaglcclaHaatgaagtaagtccatciagaaitacacaaaUccatg ggtaaaggcgcatactcttgcgtctggtgectetgtcattaaaggtcctggattt acaggcggagatattctgactaggaatagtatgggcgacctgggggccttac

3483 gagtaacctttacaggaagattaccacaaagttatlaiatacgtttccgttatgctt cggtagcaaaiaggagtggtacatttagatattcacagccaccttcgtatggaa tttcatttccaaaaactatggacgcaggtgaagcactaacatcicgttcgttcgc tcatacaacactcttcactccaataacctltlcacgagelcaagaagaatttgatc tatacatccaatcggglgtttatatagatcgaattgaatttataccggtagatgca acttttgaatcagaaanaatttagaaagagcgcaaaaggcggtgaatgccctg tttacttctacaaaccaactagggcttaaaacagatgigacggattatcatattga tcaggtatccaatctagttgaatgtttalcggatgaattttg'tctggatgaaaaga gagaangiccgagaaagttaaacaigcgaagcgactcagtgaigagcggaa tttacilcaagatccaaacncagagggatcaaUgacaaccagaccgtggct ggagaggaagtacggaUtlaceatccaaggaggagatgacgtattcaaaga gaattacgtcacactaacaggtacctttgatgagtgttatccaacgtatttatatc aaaaaatagaigagtcaaaattaaaagcctacactcgttatcaattaagagggt acatcgaagatagtcaagacttagaaatctatttgatccgttacaatgcaaaaca cgaaatagtaaatgtgccaggcacgggticcttatggccgctticagtccaaa gtccaatcggaaagtgtggagaaccgaatcgctgcgcgccacaccttgaatg gaatcctgatctagattgttcctgcagagacgaggaaaaatgtgcccatcattc gcatcatttctccttggacattgatgttggatgtacagacltaaatgaggacttag gtgtatgggtgatattcaagattaagacgcaagaigggcacgcaagactagg gaatciagagtttctcgaagagaaaccattagtaggagaagcactagctcgtg igaaaagagcggagaaaaaatggagagacaaacgtgaaaaattggaangg aaacaaaiatcgtttataaagaggcaaaagaatctgtagatgctttatttgtaaac tctcaatatgatcaanacaagcggatacgaatattgccatgatlcatgcggcag ataaacgtgitcatagcattcgagaagcgtatcttccagagttatctgtaaitecg ggtgtaaatgcgggcatttttgaagaattagagggacgtattttcacagcctact ctctatalgatgcgagaaatgtcattaaaaatggtgatticaataatggctlatcal gctggaacglgaaagggcatgtagaigtagaagaacaaaacaaccaccgttc ggtccttgttgnccggaatgggaagcagaagtgtcacaagaagttcgtgtctg tccgggtcgtggctatatccttcgtglcacagcgtacaaagagggatatggag

1160

AGYVTKELEYFPETDKVW1E1GETE GTHVDSVELLLMEE

MDINHQNQCIPYNCLSNPDA1LLDA ERLETGNTVADISLGLINFLYSNFVP GGGFIVGLLELIWGFVGPSQWEIFL AQIEQLISQRIEEFARNQAISRLEGLS NNYEIYTETFRAWEKDPSNPALREE MRTQFNVMNSALIAAIPLLRVRNY EVALLSVYVQAANLHLSVLRDVSV YGQRWGFDPATVNSRYSDLTRLIH VYTDHCVDTYNDGLKNLEGSRLSD

WVVYNRFRRRLTISVLDHAFFPNY DIEAYPIQTASQLTREVYLDLPFVN ETLSPPASYPTFSAAESAIIRSPHLVD FLNSFT1YTDSLASYAYWGGHLVNS FRTGTTTNLIRSPLYGREGNTERPV TISASPSVPIFRTLSYFTGLNNNNPV AGIEGVEFQNTISRSIYRKSGPIDSFS ELPPQDVSVSPAIGYSHRLCHATFL ERISGPRIAGTVFSWTHRSASPTNEV SPSRITQIPWVKAHTLASGASV1KGP GFTGGD1LTRNSMGDLGALRVTFT GRLPQSYYIRFRYASVANRSGTFRY SQPPSYGISFPKTMDAGEALTSRSF AHTTLFTPITFSRAQEEFDLYIQSGV YIDRIEFIPVDATFESEINLERAQKA VNALFTSTNQLGLKTDVTDYHIDQ VSNLVECLSDEFCLDEKRELSEKVK HAKRLSDERNLLQDPNFRGINRQPD RGWKGSTDITIQGGDDVFKENYVT LTGTFDECYPTYLYQKiDESKLKAY TRYQLRGYIEDSQDLEIYLIRWAK HEIVNVPGTGSLWPLSVQSP1GKCG EPNRCAPHLEWNPDLDCSCRDEEK CAHHSHHFSLD1DVGCTDLNEDLG VWVIFKIKTQDGHARLGNLEFLEEK PLVGEALARVKRAEKKWRDKREK LELETNIVYKEAKESVDALFVNSQY DQI.Q ADTNIAMTH AADKRVHSIR E AYLPELSVIPGVNAGIFEELEGR1FT AYSLYDARNVIKNGDFNNGLSCWN VKGHVDVEEQNNHRSVLWPEWE AEVSQEVRVCPGRGYILRVTAYKE GYGEGCVT1HEVDNNTDELKFSNC EKEQVYPGNTVACNDYNKNUGAN ACSSRNRGYDESYESNSS IPAD YAP VYEEEAYTDGQRGNPCEFNRGHTP LPAGYVTAELEYFPETDTVWVEIGE

TEGTFIVDSVELLLMEE cryl Fb aaggctgcgtaactattcatgaagtcgataaiaatacagacgaattgaagttta gcaactgigagaaagaacaagtatatccaggiaatacggtagcatgtaatgatt ataalaagaatcacggtgcgaatgcatgtagttctcgtaatcgiggatatgacg aatcttaigaaagtaattctlccataccagctgaitatgcaceggtttatgaagaa gaagcgtatacagatggacaaagagggaatcctigtgaattiaacagagggc atacaccattaccagctggttatgtgacagcagagttagagtacltcccagaaa cggatacagtatgggttgagaitggagaaacggaaggaacatttatcgtggac _____________________agtgtggaattactccttatggaggaatag_____________ atgaagaataacancaaaatcaatgcgtaccttacaattgtttaagtaatcctga agtagaaalattaaglgaagaaagaagtactggcagattaccgttagatatatc cttgtcgcttacacgtttcettttgaglgaatttgttccaggigtgggagttgcgtli ggattatttgatnaatalggggtlttataaclccltclgaaiggagttiatnctttta cagattgaacaacigattgaacaaagaattgaaacaltggaaaggaaccggg caattactacattacgagggttagcggatagclatgaagtttaccttgaggcact aagagagtgggaagaaaatcctaaiaatgcacaattaagggaagatglgcgi attcgatttgctaatacagacgacgctttaataacagcaataaataattttacactt acaagttttgaaatccctcttttatcggtctatgttcaagcggcgaalclacattta tcactattaagagatgctgtatcgtttgggcagggttgggggctggatatagcl actgttaataatcattataatagattaataaatcttattcatagatatacggaacatt gtttggacacalacaalcaaggattagaaaacitaagaggtaciaalactcgac aatggtcaagaucaatcagtnaggagagagttaacattgactgtattagatatc gttgctctttttccgaactacgatgctagagcatatccaattcaaacgtcatccca aitaacaagggaaattiaiacaagttcagtaattgaagaitctccagtttctgcta atatacctaatggtniaatagagcggaatttggagtlagaccgccccatcttatg gactttalgaaUctttglttgiaactgcagagactgtiagaaglcaaacLgtgtg gggaggacacitagttagttcacgaaatacggctggtaaccctataaattlccc tattlalgggatcttcaalcctggtggcgccattiggaltgcagatgaggalcca cgtcctttttatcggacattatcagatcctgtttltgtccgaggaggatttgggaat cctcattatgtacttgggcttaggggagtagcatttcaacaaactggtacgaac cacacccgaacatttagaaataglgggaccatagaitctctagatgaaaiceca ectcaggataatagtggggcaccltggaatgattatagteatgtattaaatcatg ttacattlgtaaggtggcctggtgagallgcaggaagtgattcatggagagcgc caatgintcttggacacaccgtagtgcagatcgtacaaatatcattaatccaaal ataattacacaaataccigctgtaaaageacacaatcticattcgggttctacgg Ugttagaggaecegggtttacaggtgglgalclcttacgaagaacgaatactg gtacatttgcagatataagagtaaatattactgggccatfatctcaaagatatcgt gtaagaattcgctaigcttctacgacagatttacaatttttcacgagaatcaatgg aacttctgtaaatcaaggtaatttccaaagaactatgaatagagggggtaattta gaalctggaaactttaggactgcaggatttagtacgccttttagtttttcaaalgc gcaaagtacattcacaitgggtactcaggctttttcaaatcaggaagtttatatag

3525 atcgaattgaattigtcecggcagaagtaacatlcgaggcagaaicigatttag aaagagcgcaaaaggcggtgaatgccctgtttacttctacaagccaactagg gctaaaaacaaatgtaacgggttaccatattgatcaagtgtccaatttagttgcg tgtnatcggatgaaitttgtctggaigaaaagagagaaitgtccgagaaagtia aacatgcgaagcgactcaglgalaagcggaatttacttcaagatccaaacttca gagggatcaataggcaaccagaccatggctggagaggaagtacggatatta ctatccaaggaggagatgacgtattcaaagagaattacgltacgctaccgggt actittgatgagtgctaiccaacgtatnaiatcaaaaaatagatgagEcgaaatt aaaagcctatacccgttatcaattaagagggtataicgaagatagtcaagactt agaaatetatttaattcgnacaattcaaaacacgaaatagtaaatgtaccaggt acagggagntatggccictitcigiagaaaaicaaaitggaccttgtggagaae cgaatcgatgcgcgccacaccttgaatggaatcctgatttacactgttcctgca gagacggggaaaaatgtgtgcatcattctcalcatucicntggacattgalgtc ggatgtacagatUaaatgaggacctaggtgUtggtigatattcaagattaaga cgcaagatggccacgcaagactagggaatctagagtttctcgaagaggaac cgltattaggcgaagcgttagcacgtgtgaagagagcggagaagaagtgga gagacaaacgcgagaaactgcagtlggaaacaaalatlgtctataaagaggc aaaagaatccgtagatgctttatttglaaaclclcaatatgatagattacaagcgg atacgaacatcgcgatgattcatgcggcagataaacgcgttcatagaalccgg gaagcglalclgccagagltglctgtgaitccaggtgtcaalgcggccattttcg aagaattagagggacglainttacagcgtattccttatatgatgcgagaaatgtt attaaaaatggcaatttcaataatggcttattalgclggaacglgaaagggcalg tagatgtagaagagcaaaacaaccaccgttcggtccttgttatcccagaatgg gaagcagaagtgtcacaaaaagttcgtgtctgtccaggtcgtggttatatccttc gtgttacagcgtacaaagagggatatggagaaggngcgtaacgatccatga gatcgaagacaatacagacgaattaaagtttagcaactgtgtagaagaaggat atccaaacaacacggtaacgtgiaatgagtatactatgaatcaaggggtagga gagtgtacggatgcatgtaatgtccgtaatcgtggaialgaggaigcatalgga cacaatccttcaacgcctgtlcattacacaacgccgtacgaagaagaaacgta tacagatgaacgaagagagaatccitgtgaagctaacaaagggtatgtgaan acacgccactaccagttggttatgtgacaaaagaattagaatacttcccagaaa ccgacacagtatggattgaaatiggagaaacggaaggaacattcattgiggac agcglggaattactccttatggaggaatag

MKNNIQNQCVPYNCLSNPEVE1LSE ERSTGRLPLD1SLSLTRFLLSEFVPG VGVAFGLFDLIWGFITPSEWSLFLL QIEQLIEQRfETLERNRAITTLRGLA DSYEVYLEALREWEENPNNAQLRE DVR1RFANTDDALITAINNFTLTSFE 1PLLSVYVQAANLHLSLLRDAVSFG QGWGLD1ATVNNHYNRLINL1HRY TEHCLDTYNQGLEN LRGTNTRQWS RFNQFRRELTLTVLD1VALFPNYDA RAYPIQTSSQLTREIYTSSVIEDSPVS AN1PNGFNRAEFGVRPPHLMDFMN SLFVTAETVRSQTV WGGH LVSSRN TAGNPINFPIYGIFNPGGAtWIADED PRPFYRTLSDPVFVRGGFGNPHYVL GLRGVAFQQTGTNHTRTFRNSGTID SLDE1PPQDNSGAPWNDYSHVLNH VTFVRWPGEIAGSDSWRAPMFSWT HRSADRTNIINPNIITQIPAVKAHNL HSGSTWRGPGFTGGDLLRRTNTG TFADIRVNITGPLSQRYRVR1RYAST TDLQFFTRINGTSVNQGNFQRTMN RGGNLESGNFRTAGFSTPFSFSNAQ STFTLGTQAFSNQEVY1DRIEFVPAE VTFEAESDLERAQKAVNALFTSTSQ LGLKTNVTGYHIDQVSNLVACLSD EFCLDEKRELSEKVK.HAKRLSDKR NLLQDPNFRGINRQPDHGWRGSTDI TIQGGDDVFKENYVTLPGTFDECYP TYLYQKIDESKLKAYTRYQLRGYIE DSQDLEIYL1RYNSKHEIVNVPGTGS LWPLS VENQTGPCGEPNRCAPHL E

WNPDLHCSCRDGEKCVHHSHHFSL DIDVGCTDLNEDLGVWLIFKIKTQD GHARLGNLEFLEEEPLLGEALARV KRAEKKWRDKREKLQLETNIVYKE AKESVDALFVNSQYDRLQADTNIA MJHAADKRVHRIREAYLPELSVIPG VNAAIFEELEGRIFTAYSLYDARNVI KNGNFNNGLLCWNVKGHVDVEEQ NNHRSVLViPEWEAEVSQKVRVCP GRGYILRVTAYKEGYGEGCVT1HE1 EDNTDELKFSNCVEEGYPNNTVTC NEYTMNQGVGECTDACNVRNRGY EDAYGHNPSTPVHYTTPYEEETYT DER.RENPCEANKGYVNYTPLPVGY VTKELEYFPETDTVWIEIGETEGTFI VDSVELLLMEE crySEal cryllb atggagataagtgaccagaatcaatacatcccctataactgtttgaataatcctg aaagtgagatatttaaigctagaaattccaatttcggactggtltctcaagtcagc tcgggacnacgcgttltcUctagaggcagcigtcccagaggctggttttgcac nggcciancgatatcatttggggcgctctaggcgttgatcaatggagcctattt citaggcagattgagcaauaaiacgacaagaaataacagagttagaaaggaa tagagcgaclgcaatattaactggactatcgtcaagciataatetatatgttgag gcgttaagagaatgggaaaatgatcctaataatccagcctcacaagaaagagl acglacacgttttcgtcUacggacgacgctatagtaacaggtttacclactttg gcaartcggaatcitgaggtagtgaatuatcagtetatactcaagcagcaaalc lacactlalcltigttaagagatgccgtttactttggagaaagatggggattaaca caagcaaataugaagalctgtacacaagactcacgagtaatatccaagaatat tcagaccatigtgcaagatggtaiaatcaaggtitaaatgagattggagggata agtaggagaiatttggacitccaaagagalttaacaatttcigtcttagatatlgtc gcccttncccaaatlacgatatccgaacatatcciaitccgacaqaaagtcaatt aacaagggagat«ataccTCtce<:gtcgttgcaggtaatataaattttggtttaa gtatagcgaatgtatlgagagcccctcatctgatggactttattgatcgaatagt cattiatacaaaitcagttagaagtactccatattgggeagggcatgaagtcata tcgagaagaaeagggcaagggcaaggaaalgagaiaagatticctttatatg gagtggctgcaaatgcagaaccaecagtlactataagacctacaggalttact gatgagcaacgacaatggtatagagcgcgatcgcgtgttgtctcgtttagaag ricaggicaagactHagtttggtagatgccgtaggattccttactatatttagcgc tgtttcaatctatagaaaiggctttggatttaacactgatactattgalgaaattcc aattgagggaaccgatccattcaciggatatagccaccgattatgccatgtgg gctttcttgcgtcatctccaitcaicaglcagtalgcaagggctcctaEattttcitg gacgcaccgtagtgcaaccettacaaatacaattgctccagatgtcattaccca aataccgitagtaaaggcttlcaatcttcattcaggtgccacgattgttaaagga ccaggttttacaggtggggatatecttcgaagaacgaatgttggCagcltTgga gaiatgcgtgtaaacattactgcaccaclalcacaaagatatcgcgiaaggati cgtlalgcttctacgaeagatttacaattctatacgaatattaatggaactactatt aalattggtaatttctcgagcaclalggacagiggggatgattiacagtacgga agattcagggttgcaggitttactactccatltacctittcagatgcaaacagcac actΰacaataggtgcШЗggcrtctLt£caaacaacgaagшal·atagaιcgaa 350 ί ngaatrtgtcccggcagaagtaacatttgaggcagaatatgatltagagaaag cteagaaagcggtgaatgcgctgtttacttctfccaatcaaaTcgggttaaaaac agalgtgacggactatcatattgataaagtatccaatctagltgagtglltatcag atgaattttgtctagatgaaaagcgagaattgtccgagaaagtcaaacatgcga agcgactcagtgatgagcggaaittacticaagatccaaacttcagaggcatc aatagacaaccagaccgtggttggagaggaagtacggatattaccatccaag gaggagatgacgtattcaaagagaattacgttacgctaccgggtacctttgatg ggtgctacccaacgtatttatatcaaaaaatagatgagtcgaaattaaaagtciai actcgttatcaattaagagggiatategaggataglcaagacttagaaatctattt aattegctacaatgcaaaacacgaaacagtaaaiglgceaggtacgggttcct tatggccgcineagcccaaaglccaalcggaaagtgtggagagccgaatcg atgcgcgccacaccttgaatggaatcctgacnagatlgttcgtgtaggaaigg agaaaagtgtgcccatcaKcgcatcatttclccttagacattgatgttggatgta cagaiciaaatgaggacctaggtgtatgggtgatcttlaagattaagacgcaag atggtcatgcaagattaggaaatciagagutcKgaagagaaaccattartag gggaagcactagctcgtglgaaaagagcggagaaaaaatggagagacaaa cgigaaaaattggaattggaaacaaataugTttataaagaggcaaaagaatct gtagatgctttatttgtaaaclclcaatatgatcaattacaagcggaiacgaatai cgcgatgaticalgcggcagalaaacgcgttcatagcattcgagaagcgtatc tgccggagctgtctgtgattccgggtgtcaatgcggcgatttttgaagaartag aagggcgtattttcactgcattctccctatatgaigcgagaaaigtcattaaaaat ggcgatttcaataatggcttatcatgctggaacgtgaaagggcatgtagatgla gaagaacagaacaaccatcgttcggtccttgttgttccagaatgggaagcaga aglgtcacaagaagttcgtgtttgtccgggtcgtggtlatatccttcgtgtcaca gcgtacaaggagggatalggagaaggttgcgtaaccattcatgagatcgaga acaatacagacgaactgaaattcagcaactgcgtagaagaggaagtatatcc aaacaacacggtaacgtgtaatgattatactgcaaatcaagaagaaiacaaag gtgcgiacacttctcataatcgaggatatgacgaagcclatggaaafaaccclt ccgtaccagcagatlatacgccagtctaigaagaaaaagcgtatacagatgga cgaagagagaatccttgEgaatctaacagagggtatggggattacacgccact accagctggKatgtgacgaaggaattagagtacttcccagaaaccgaiaagg tatggattgagattggagaaacggaaggaacatttaicgtggagagcgtgga _________________________aHactccttatggaggaatag_________________ aigaaactaaagaatccagalaagcatcaaagcttgtCEagcaatgcgaaagi agataaaategctacggattcaciaaaaaatgaaacagataiagaattgaaaa ataEgaataatgaagattatttgagaatgictgagcatgagagiattgatccgtti gttagtgcatcaacaatlcaaacgggtattggaattgctggtaagattcttggta

2160 ctctagglgttccttttgctggacaaatagctagcctctaiagttttatcttaggcg agctttggccraaagggaaaagtcaatgggaaatctttatggaacatgtagaa gagatiaitaaicaaaaaatattaacttaigcaagaaataaagcactttcagactl gagaggattaggtgatgctiugccgictaccatgaatcgcttgaaagttgggtr gaaaatcgtaataacactcgagcgaggagtgtagtcaagaaccaataiaicge altagaactgalgtngticaaaaactaccncmtgcagtatctggtgaggaagt

MEISDQNQYIPYNCLNNTESEIFNA RNSNFGLVSQVSSGLTRFLLEAAVP EAGFALGLFDIIWGALGVDQWSLF LRQEQLIRQEITELERNRATAILTG LSSSYNLYVEALREWENDPNNPAS QERVRTRFRLTDDAIVTGLPTLAIR NLEWNLSVYTQAANLHLSLLRDA VYFGER WGLTQANIEDL VTRLTSNI QEYSDHCARWYNQGLNEIGG1SRR YLDFQRDLTISVLDIVALFPNYDIRT YPIPTQSQLTREIYTSPVVAGN1NFG LSIANVLRAPIILMDFIDRIViYTNSV RSTPYWAGHEV1SRRTGQGQGNEIR FPLYGVAANAEPPVTIRPTGFTDEQ RQWYRARSRWSFRSSGQDFSLVD AVGFLT1FSAVSIYRNGFGFNTDT1D EIPIEGTDPFTGYSHRLCHVGFLASS PFISQYARAP1FSWTHRSATLTNTIA PDVITQIPLYTCAFNLHSGATIVKGPG FTGGDILRRTNVGSFGDMRVNITAP LSQR Y R VRIRY ASTTDLQ F YTN ING TTIN1GNFSSTMDSGDDLQYGRFRV AGFTTPFTFSDANSTFT1G A FGFSPN 1166 NEVYIDRIEFVPAEVTFEAEYDLEK

AQKAVNALFTSSNQIGLKTDVTDY HIDKVSNL VECLSDEFCLDEKRELS Е K VKH AKRLSDERN LLQDPN FRGI

NRQPDRGWRGSTD1TIQGGDDVFK ENYVTLPGTFDGCYPTYLYQKIDES KLKVYTRYQLRGYIEDSQDLEIYL1 RYNAKHETVNVPGTGSLWPI.SAQS PiGKCGEPNRCAPHLEWNPDLDCSC RNGEKCAHHSHHFSLDIDVGCTDL NEDLGVWV1FKIKTQDGHARLGNL EFLEEKPLLGEALARVKRAEKKWR DKREKLELETNIVYKEAKESVDALF VNSQYDQLQADTN1AMIHAADKRV HSIREAYLPELSVIPGWAAIFEELE GRIFTAFSLYDARNVIKNGDFNNGL SCWNVKGHVDVEEQNNHRSVLVV PE WE AE VSQE VR VCPGRGYILRVT AY KEGYGEGC VTIHEIENNTDEL K F SNCVEEEVYPNNTVTCNDYTANQE EYKGAYTSHNRGYDEAYGNNPSVP ADYTPVYEEKAYTDGRRENPCESN RGYGDYTPLPAGYVTKELEYFPET dkvwieigetegtfivesvelllmee

MKLKNPDKHQSLSSNAKVDK1ATD SLKNETDIELKNMNNEDYLRMSEH ESIDPFVSASTIQTGIGIAGKILGTLG VPFAGQ1ASLYSFILGELWPKGK.SQ WEJFMEHVEEIINQKILTYARNKAL 719 SDLRGLGDALAVYHESLESWVENR

NNTRARSWKNQYIALELMFVQKL PSFAVSGEEVPLLPIYAQAANLHLL LLRDASIFGKEWGLSASEISTFYNR QVERTRDYSDHCIKWYNTGLNNLR сгу2АЬ acvanartaeciiatd'a’gcccaagctgcfadtliacdtngtlgtldtcaagaga igcatctaiititggaaaagaatggggaitatcagcUeagaaailtcaacaittia taaccglcaaglcgaacgaacaagagaltatlccgaccattgtataaaalggta iaatacaggcclaaataacllgaggggtacaaa(gccaaaagttgggttcgtta taatcaaittcgtaaagatatgacauaaiggtauagauiagngcgciaitccc aagctatgatacacttgtatatcctattaaaaccacttcacaacttacaagagaa gtatatacagacgcaattgggaccgtgcatccgaatcaagcttttgcaagtacg acnggtalaataataatgcaccltcgticletgccaiagaggctgctgttatccg aagtccacacctacttgaltttclagaaaaagttacaatttacagcttattaagtcg glggagtaalaclcagtatatgaalatgtggggaggacalagactlgaatcccg cccaataggaggggcatlaaatacctcaacacaaggatciaccaaladtcga ttaatccagtaacattacagttcacgtctcgagacgtttataggactgaatcatg ggcagggctgaaHtatttttaactcaacctgnaatggagtacctagagttgaftt ccattggaaatttcccacgctaccaaiagcatctgaiaatttttattatctagggia tgctggagttggtacgcaatlacaagattcagaaaatgaattaccacctgaaac aacaggacagccaaatlatgaalcatatagtcaiagaltalcccatataggactc attlcagcalcccacgtgaaagcatiggtatattcttggacacaicgtagtgcag atcgtacaaatacaattgagccaaaiagcahacacaaataccattagtaaaag cgttcaalctgtcttcaggtgccgclgtagtgagaggaccaggatttacaggtg gggatatccttcgaagaacgaaiactggtacatttggggatatacgagiaaaia tlaalccaccatttgcacaaagatalcgcgtgaggattcgctatgcttctactaca gatttacaattccatacgtcaatiaacggtaaagctattaatcaaggiaatttttca gcaactatgaatagaggagaggacttagaciaiaaaacctttagaactgtagg ctltaccactccalltagcttttcagatgtacaaagtacallcacaataggtgcttg gaacttctcttcaggtaacgaagtttatatagalcgaattgaatttgttccggtag aagiaacaiatgaggcagaatatgattngaaaaagcgcaagagaaggttact gcactgtttacatctacgaatccaagaggattaaaaacagatgtaaaggatiat catattgaccaggtatcaaatttagtagagtctctatcagatgaattciatcngat gaaaagagagaaaatrcgagatagitaaaiacgcgaagcaaaiccatattga gegtaacatglag atgaatagtgtattgaatagcggaagaactactatttgtgatgcgtaiaatgtag cggctcatgatccatttagtttlcaacacaaatcattagataccgiacaaaagga alggacggaglggaaaaaaaataatcatagrtlalacctagalcclattgClgga aclgtggclagttttL'IgttaaagaaaglggggagtcItgttggaaaaaggatac taagtgagttacggaatttaalaltlcctagtggtagtacaaatctaatgcaagai atUlaagagagacagaaaaattcctgaalcaaagactlaatacagacactgll gcccgtgtaaatgcggaattgacagggctgcaagcaaatgtagaagagttia atcgacaagtagataatttttgaaccctaaccgaaacgctgttcctttatcaata acttcucagitaatacaatgcaacaattatnctaaatagattaccccaguccag aigcaaggataccaactgttattattacctttatttgcacaggcagccaatttaca tctticituaitagagatglianctaaatgcagatgaatggggaaiticagcagc aacatlacglacglalcgagatlacttgaaaaattatacaagagattactctaact attgtataaatacgtatcaaaglgcgtttaaaggtttaaacactcgtttacacgat algttagaalttagaacatatatgtunaaatgtatttgaalalgtatctatctgglc gtlgtttaaatatcaaaglcttctaglatcttccggtgctaatttatatgcaagtggt agtggaccacagcagacccaalcat1lacltcacaagaciggccaU1tiaiait clcttttccaagttaattcaaatlaigtgttaaatggatttagCggtgctaggctttct aalaccttccctaatatagttggtttacctggttctactacaactcacgcattgctt gctgcaagggtlaattacagtggaggaalitcgtctggtgatataggtgcatcic cgtttaatcaaaattuaaitgtagcacatticiccccccattgitaacgccaittgtt aggagttggctagaltcaggttcagatcgggagggcgttgccaccgttacaaa ttggcaaacagaatcclttgagacaactrtagggttaaggagtggtgctttlaca gctcgcggtatttcaaactatttcccagattattttattcgtaatatttciggagticc tttagtLgttagaaatgaagatliaagaagaccgtiacactataatgaaataaga aalatagcaagtccttcaggaacacctgglggagcacgagcttatatgglatct gtgcataacagaaaaaalaatatccatgccgttcatgaaaatggttctaigaltc atttagcgccaaatgactatacaggatttactatttcgcegatacatgcaaetea agtgaataatcaaacacgaacattlatttctgaaaaatttggaaatcaaggtgatt ccttaaggtltgaacaaaataacacgacagctcgttatacgcttagagggaatg gaaatagHacaatctttatttaagagtltcttcaaiaggaaattccaciattcgagt taclataaacggtaggglatalactgctacaaatgtlaatactaclacaaataac gatggagttaalgataacggagctcgtltttcagatattaatalcggtaatglagt agcaagtagtaattctgatgtaccattagatetaaatglaacaltaaactccggta ctc^ttgatcttatgaatattatgcltgtaccaactaatatttcaccactttattaa

GTNAKSWVRYNQFRKDMTLMVLD LVALFPSYDTLVYPIKTTSQLTREV YTDA1GTVHPNQAFASTTWYNNNA PSFSAIEAAV1RSPHLLDFLEKVTIYS LLSRWSNTQYMNMWGGHRLESRP1 GGALNTSTQGSTNTS1NPVTLQFTS RDVYRTESWAGLNLFLTQPVNGVP RVDFHWKFPTLPIASDNFYYLGYA GVGTQLQDSENELPPETTGQPNYES YSHRLSHJGLISASHVKALVYSWTH RSADRTNTIEPNSITQ1PLVKAFNLS

SGAAVVRGPGFTGGDILRRTNTGTF GDIRVNINPPFAQRYRVRIRYASTT DLQFHTSINGKAINQGNFSATMNR GED LDY KTFRTVGFTTPFSFSDVQS TFTiGAWNFSSGNEVYIDRIEFVPVE VTYEAEYDFEKAQEKVTALFTSTN PRGLKTDVKDYHIDQVSNLVESLS DEFYLDEKRELFEIVKYAKQ1HIER

NM

MNSVLNSGRTTICDAYNVAAHDPF SFQHKSLDTVQKEWTEWKKNNHS LYLDPIVGTVASFLLKKVGSLVGKR ILSELRNLIFPSGSTNLMQDILRETE KFLNQRLNTDTVARVNAELTGLQA NVEEFNRQVDNFLNPNRNAVPLS1T SSVNTMQQLFLNRLPQFQMQGYQL LLLPLFAQAANLHLSFIRDVILNAD EWGISAATLRTYRDYLKNYTRDYS NYCINTYQS AFKGLNTRLHDM LE F RTYMFLNVFEYVS1WSLFKYQSLLV SSGANLYASGSGPQQTQSFTSQDW PFLYSLFQVNSNYVLNGFSGARLSN TFPN1VGLPGSTTTHALLAARVNYS GGISSGDIGASPFNQNFNCSTFLPPL LTPFVRSWLDSGSDREGVATVTNW QTESFETTLGLR.SGAFTARGISNYFP DYFIRNISGVPLVVRNEDLRRPLHY NEIRN1ASPSGTPGGARAYMVSVHN RKNNIHAVHENGSMIHLAPNDYTG FTISPIH ATQ VNNQTRTFISEKFGNQ GDSLRFEQNNTTARYTLRGNGNSY NLYLRVSSIGNST1RVTINGRVYTAT NVNTTTNNDGVNDNGARFSDIN1G NVVASSNSDVPLDINVTLNSGTQFD LMNIMLVPTN1SPLY

		atgtccgaaggagaclalaiagaclcgtatataaatcctggaaatgttagaact ggaclacaaactggaattgatattgttgcagtagtaglagglgctttaggtggac cagttggiggcatactcactggttttctttciactctttttggttttctttggccatcta		MSEGDY1DSYINPGNVRTGLQTG1D IVAVVVGALGGPVGGILTGFLSTLF GFL WPSNDQ A V WE AFIEQM EE LI E
		atgatcaagcaglatgggaagcttttatagaacaaalggaagaactgattgaac		QRISDQVVRTALDDLTGIQNYYNQ
		aaaggaiatcagatcaagiagtaaggaccgcacicgatgacctaaeiggaaiic		YLIALKEWEERPNGVRANLVLQRF
		aaaattattataatcaatatctaatagcattaaaggaalgggaggaaagaccaa		EILHALF VSSMPS FGSGPGSQRFQ A

acggcgtaagugcaaacttagttttgcaaagatttgaaatcttgcacgcgctatt IgtaagtagtatgccaagttttggtagtggccctggaagtcaaagglltcaggC acaaHgltggtigtttatgcgcaagcagcaaaicltcattiactattaiiagctgal gctgaaaagtatggggcaagatggggactccgtgaatcccagatagaaltat altttaatgaactacaaactcgtactcgagattacaceaaccattglgtaaacgc gtataataacgggttagcvgggltacgaggaacgagcgctgaaagttggttaa agiaccatcaaticegcagagaagcaaccttaatggcaatggatttgalagcttt attlccataftalaacacccggcgatatccaatcgcagtaaatcctcagcttaca cgtgaggtatatacagatccattaggcgttccttctgaagaatcaagltlaUtcc agaatigagatgcttaagaiggcaagagacttctgccatgacUtttcaaatttg gaaaatgcaataattcgtccaccacaiciatttgacacaataaacaatnaatgat ttataccggttcttttcgcltcadaacaatcaattaattgaagggtggattggac attctgtaactaglagntgttggccagtggaccaacaacagtaglgagaagaa atiacggtagcacgacatctattgtaaaclaintagltttaalgatcgtgatgltia tcagattaatacgagatcacatactgggttgggattccagaacgcacctttatti ggaatcaciagagctcaaitttacccagglgggacttattcagtaactcaacga aatgcattaacatgtgaacaaaaitataatlcaattgatgagttaccgagcctag acccaaatgaacctatcagtagaaguatagtcatagattatctcatattacctcc latitgcatcgtglaltgactattgatgglanaaiataiaucaggaaatctcccta cttatgtatggacccatcgcgatgiggaccttacaaacacgatiaccgcagata gaattacacaaciaccatiggtaaagteatitgaaatacctgcgggtactactgt cgtaagaggaceaggtttlacaggaggggatatactccgaagaacaggggtl ggtacatttggaacaataagggtaaggactactgcccccttaacacaaagata tcgcataagattccgtttcgctictaccacaaatttgttcattggtataagagitgg igalagacaagtaaattattttgacttcggaagaacaatgaacagaggagatga altaaggiacgaatcilltgctacaagggagttiactactgattttaattttagaca acctcaagaattaatctcagtgtttgcaaatgcatttagcgetggtcaagaagttt atlKgatagaattgagattatccecgttaatcccgcacgagaggcgaaagag gatctagaagcagcaaagaaagcggtggcgagcttglttacacgcacaagg gacggattacaagtaaatglgaaagatiaicaagtcgatcaageggcaaattta gtgtcatgcllalcagatgaacaaiatgggtatgacaaaaagatgtlaltggaag cggtacgcgcggcaaaacgcctcagccgagaacgtaacttacttcaggatcc agattttaatacaatcaalagtacagaagaaaalggatggaaagcaagiaacg gcgttactattagtgagggcgglccanctataaaggccgtgcactlcagctag caagtgcacgagaaaauatccaaeatacaKtatcaaaaagtagatgcatcgg agttaaaaccttatacacgatatagactagatgggttcgtgaagagtagtcaag atttagaaattgatctcattcaccatcataaagtccatcllglgaaaaatgtacca galaatttagtatctgatacllacccagalgattcttgtagtggaatcaatcgatgt caggaacaacagatggtaaatgcgcaactggaaacagagcaicatcatccg atggattgcigigaagcagctcaaacacatgagttKcttcctatattgatacagg ggattlaaattcgagtgtagaccagggaatctgggcgatctttaaagttcgaac aaccgatgguatgcgacgtlaggaaatcttgaanggtagaggtcggaccgtl atcgggtgaatctttagaacgtgaacaaagggutaatacaaaalggagtgcag agctaggaagaaagcgtgcagaaacagatcgcgtgtatcaagatgccaaac aaiccatcaatcatttalttglggattalcaagatcaacaattaaatccagaaata gggalggcagatattatggacgctcaaaatcttgtcgcatcaalttcagatgtat atagcgaigccgtacigcaaaiccctggaattaaclatgagaittacaeagagc tgtccaatcgcttacaacaagcatcglatctgtatacgtctcgaaatgcggtgca aaatggggactiiaacaacgggctagatagctggaalgcaacagcgggtgca teggtacaacaggaiggcaatacgcatttcttagttctttctcatlgggalgcaca aguictcaacaatttagagtgcagccgaattgtaaatatglaKacglglaacag cagagaaagtaggcggcggagacggatacgtgactatcegggatggtgctc atcatacagaaacgcuacatttaalgcatglgattaigalataaalggcacglac glgactgataatacgtalclaacaaaagaagtgataitctaitcacatacagaac acatgtgggtagaggtaaatgaaacagaaggtgcatttcalatagatagtatlg aattcgttgaaacagaaaagtaa

QLLVVYAQAANLHLLLLADAEKY GARWGLRESQ1ELYFNELQTRTRD YTN1ICVN AYNNGLAGLRGTSAES WLKYHQFRREATLMAMDL1ALFPY YNTRRYPIAVNPQLTREVYTDPLGV PSEESSLFPELRCLRWQETSAMTFS NLEN AIIRPPH LFDTTNN LMIYTGS F RFTNNQLIEGWLGHSVTSSLLASGP TTVVRRNYGSTTSIVNYFSFNDRDV YQINTRSHTGLGFQNAPLFGITRAQ FYPGGTYS VTQRN ALTCEQN Y N SID ELPSLDPNEPISRSYSHRLSHITSYLH RVLTOGINIYSGNLPTYVWTHRDV DLTNTJTADRITQLPLVKSFEIPAGT TVVRGPGFTGGDILRRTGVGTFGTl R\^rRTTAPLTQRYRIRFRFASTTNLFl GIRVGDRQVNYFDFGRTMNRGDEL RYESFATREFTTDFNFRQPQELISVF ANAFSAGQEVYFDRIEUPVNPAREA KEDLEAAKKAVASLFTRTRDGLQV NVKDYQVDQAANLVSCLSDEQYG YDKKMLLEAVRAAKRLSRERNLLQ DPDFNTINSTEENGWKASNGVTISE GGPFYKGRALQLASAREKYPTYIY QKVDASELKPYTRYRLDGFVKSSQ DLEIDL1HHHKVHLVKNVPDNLVS dtypddscsginrcqeqqmvnaql ETEHHHPMDCCEAAQTHEFSSYIDT GDLNSSVDQGIWAIFKVRTTDGYA TLGNLELVEVGPLSGESLEREQRDN TKWSAELGRK.RAETDRVYQDAKQ SINHLFVDYQDQQLNPE1GMADIM DAQNLVAS1SDVYSDAVLQIPGINY EIYTELSN RLQQAS YL YTSRNAVQN GDFNNGLDSWNATAGASVQQDGN TH FL VLSH WD AQVSWFR VQPNC K

YVLRVTAEKVGGGDGYVTIRDGA HHTETLTFN ACDYDINGT Y VTDNT YLTKEVIFYSHTEHMWVEVNETEG AFHIDSIEFVETEK

Фратенти от токсини

сгу9Аа	276	gtgcagccgaattgtaaataigtattacgtgtaacagcagagaaagtaggcgg	91	MQPNCKYVLRVTAEKVGGGDGYV
		cggagacggatacgtgaclalccgggatgatgctcaicatacagaaacgctta catttaatgcatgtgattatgatataaatggcacgtacgtgactgataatacgtat ctaacaaaagaagtggtattccatccggagacacaacacaigtgggiagagg laaatgaaacagaaggtgcatttcatatagatagtattgaaUcgltgaaacaga aaagtaa		TIR DD AHI 1TETLTFN ACDYDINGTY VTDNTYLTK.EVVFHPETQHMWVE VNETEGAFHIDSIEFVETEK
cry 1 Ас	135	atggagagaccaacacgaaaaattacatttgtaaactcccgatatgatagtlta caaatggatacgaaeattgcaatgauiaiacggccgataaacgcgttcataga aaecgagaagcgtalctttcagagtga	44	MERPTRKITFVNSRYDSLQMDTNIA MIYTADKRVHRNREAYLSE

Уникалната комбинация от токсини в щам BTG осигурява широк спектър на пестицидна активност. Например, Сгу1АЬ35 е активен срещу множество представители на Lepidcptera, а едно от най-важните му приложения е за борба е вредителя Царевичен стъблопробивач - Ostrinia nubilalis (Hubner), сем. Pyralidae. Срещу това насекомо засега, като успешен биопестицид се използват единствено ендофитните гъби от вида Beauveria bassiana. Сгу1АЬ35 е токсин, който поразява представителите на Gastropoda - различни видове охлюви.

Сгу1АЬ35 и CrylFb са ефективни в борбата срещу Spodcptera frugiperda (армейски червей / есенен легионер), който причинява сериозни щети на културите в световен мащаб (Ingber et al., 2018; Gomez et al., 2020) и много често развива резистентност към пестицидите (Paredes-Sanchez, 2021).

CrylFb е токсичен за неприятелите от сем. Нощенки (Noctuidae), към което спадат Spodcptera omithogalli (жълто-раирана нощенка) и Heliothis virescens (тютюнев пъпков червей), които поразяват тютюн, памук, люцерна, тютюн, фасул, соя, царевица, памук, зеле, салата, а също и украсни видове като здравец, хибискус, пеларгониум, хризантема (Da Silva et al., 2020). Известно е също така, че токсинът Cryllb е активен срещу ларвите на зелевия молец Plutella xylostella (Shin et al., 1995), вредител по кръстоцветните култури, който нанася щети на стойност 2.7 милиарда USD годишно в световен мащаб (Zalucki et al., 2012).

Cry2Ab е ефективен срещу два от космополитните вредители, памуковата нощенка Helicoveipa armigera (Liu et al., 2020) и зелевия червей Trichcplusia ni (Yang et al., 2019), поразяващи над 180 различни растителни вида и способни да развиват забележителна устойчивост към химическите пестициди (Silva et al., 2020). Cry2Ab е токсин с широк спектър на действие, като е доказано, че той унищожава и ларвите на миридите Apolygus lucorum (Hemiptera, Miridae) (Zhao et al., 2018), а даже и ларвите на тигровия комар Aedes aegypti (Diptera, Culicidae), (Ricoldi et al., 2018). Токсините от семейството Cry9 са токсични за големия восъчен молец Galleria mellonella (Shah, 2017), неприятел на медоносните пчели (Kwadha et al., 2017) и за цвекловия червей, неприятели, срещу които до момента няма ефективни биопестициди (Hafeez et al., 2022). Сгу9Ва (описан за първи път при В. thuringiensis subsp. galleriae HD29) е токсичен за цвекловия червей Spodcptera exigua и зелевия червей Trichcplusia ni (Kalman et al., 1993).

Токсините от тип Сгу8 са инсектицидни за редица твърдокрили вредители, особено за определени видове скарабеи (Yamaguchi et al., 2013). Протеинът Cry8Eal, кодиран от гена cry8Eal от китайския изолат В. thuringiensis Btl85 е специфично токсичен срещу ларвите на Holotrichia parallela (Scarabaeidae), която унищожава подземните части на някои земеделски растения, причинявайки големи и необратими икономически загуби. Има данни за активност на този протеин срещу колорадски бръмбар и неговите ларви.

Таблица 2. Пестицидна активност на кристалните токсини, присъстващи в генома на В. thuringiensis subsp. galleriae BTG.

1	Cry-токсин cry I Ab35	Токсично действие cpemj вредители(тривиално наименование) Царевичен листен червей (Есенен легионер} Европейски царевичен пробиван / Царевичен стьблоиробнвач Азиатски оризов червей Охлюви Голи охлюви	Токсично действие срещу вредители (научно наименование) Spodoptera frugiperda Oslrinia nubdahs (Httbner) Chilo suppressaiis Helix pomatia Deroceras lueve	Разред Lepidoptera Gastropoda
2	crylDb	Светлокафяв ябълков молец	Epiphyas poshnttana	Lepidoptera
3	crylFb	Картофена вечерница Тютюнев молец Царевичен листен червей (Есенен легионер)	Manduca л ел/л Heliothis virescens Spodoptera frugiperda	Lepidoptera
4	crySEal	Скарабеи Колорадски бръмбар	Holotrichia parallela Leptinotarsa deeendineala	Coleoptera
5	cryllb	Диамантен молец (зелев молец)	Plutella xylosiella	Lepidoptera
6	cry2Ab	Памукова нощенка Зелев червей Мирили Тигров комар	Helicoverpa armigera Trichcplusia ni Apolygus lucorum Aedes aegypti	Lepidoptera Lepidoptera Hemiptera Diptera
7	сгу9Ва	Цвеклов червей	Spodoptera exigua	Lepidoptera

Примери за изпълнение на изобретението

Пестицидните препарати, съдържащи щам В. thuringiensis supsp. galleriae BTG, могат да бъдат под формата на суспензия, дисперсия, водна емулсия, прах за разпрашаване, диспергируем прах, емулгируем концентрат, аерозол или микро или макрокапсулирани гранули или всяка друга формулировка, която дава контролирано освобождаване на Bacillus thuringiensis. Такива състави могат да бъдат получени чрез добавяне на повърхностно активен агент, например, диспергиращ агент, емулгиращ агент или омокрящ агент, или инертен носител или друг компонент за улесняване на манипулирането и прилагането за конкретни целеви вредители.

Пример 1 - за получаване на течен биопрепарат на базата на бактериалния щам В. thuringiensis supsp. galleriae BTG

Предварителна култура

За получаването на жизнеспособна култура от бактериалния щам В. thuringiensis supsp. galleriae BTG, е използвана течна хранителна среда Luria-Bertani (10 g/L триптон, 5 g/L дрождев екстракт, 10 g/L NaCl). Бульонът се разпределя по 50 ml в обемни колби „Ерленмайер“ 500 ml и се стерилизира 30 min при 1 atm. След това хранителната среда в колбите се инокулира с 0.1 - 0.2 g биомаса от щама В. thuringiensis supsp. galleriae BTG, развит върху полегат arap в епруветка или петри. Колбите се поставят в клатачка (180 об./min) и се култивират за 48 - 72 часа при температура 30 - 37°С. По този начин в колбите се получава култура В. thuringiensis supsp. galleriae BTG в титър бактерии около 1 х 109 CFU/ml, която може да се съхранява в хладилник до 1 месец при температура 4 - 6°С за последващо посяване в биореактори.

Работна култура

Работната култура от бактериалния щам В. thuringiensis supsp. galleriae BTG за производствено култивиране, се получава в биореактори на среда, съдържаща соев шрот или соев протеин. Стандартната инокулация с първоначална култура е 1-3%, продължителността на култивиране е 72 часа при температура 30 37°C. Получената бактериална суспензия на базата на щам В. thuringiensis supsp. galleriae BTG се разрежда със стерилна вода в съотношение 1:10 или 1:20 в зависимост от бактериалния титър до 1 х 109 CFU/ml.

Получената течна форма престоява 3 - 5 дни при температура 20 - 25°С до получаването на спорова култура с минимален титър 1 х 109 CFU/ml спори. Микробният препарат е готов за използване в селското стопанство. Течният препарат се налива при стерилни условия в пластмасови бутилки или туби. Срокът на съхранение на получения препарат е най-малко 24 месеца.

Пример 2 - Третиране на растения и площи с биологичен инсектицид В. thuringiensis subsp. galleriae BTG, предназначен за борба с листогризещи гъсеници от разред Lepidoptera (Пеперуди)

Пестицидният препарат, съдържащ щам В. thuringiensis BTG, може да бъде под формата суспензия, дисперсия, водна емулсия, прах за разпрашаване, диспергируем прах, емулгируем концентрат, аерозол или микро или макрокапсулирани гранули или всяка друга формулировка, която дава контролирано освобождаване на Bacillus thuringiensis. В сместа може да бъде добавен повърхностно активен агент (диспергиращ, емулгиращ или омокрящ агент), или инертен носител или друг компонент за улесняване на манипулирането и прилагането за конкретни целеви вредители.

Препаратът, съдържащ щам BTG е с концентрация на спори най -малко 106 в милилитър, а суспензията за нанасяне върху растенията трябва да съдържа 3 - 5 милилитра от изходния препарат, разреден в 1 литър вода. Разреденият препарат се използва за пръскане върху или под листата на растенията, или върху почвата за отглеждане на растения на открито, в оранжерии, в градини, паркове и други.

Предпочитаният начин на приложение е чрез листно пръскане. Като цяло е важно да се постигне добър контрол на вредителите в ранните етапи на растеж на растението, тъй като това е времето, когато растението може да бъде най-сериозно увредено. Спреят или прахът могат удобно да съдържат друг инсектицид или пестицид, например фунгицид, хербицид за трева или тор, ако това се смята за необходимо. В предпочитано изпълнение, съставът от изобретението се прилага директно върху растението.

Културните растения, които биологичният инсектицид, съдържащ В. thuringiensis subsp. galleriae BTG ефективно предпазва от вредителите от разред Lepidoptera са следните: зърнени култури (пшеница, ечемик, ръж, овес, ориз, сорго и сродни култури), цвекло (захарно цвекло и кръмно цвекло), костилкови растения, семкови растения и меки плодове (ябълки, круши, сливи, праскови, бадеми, череши, ягоди, малини и къпини, домати), бобови растения (боб, леща, грах, соя), маслодайни растения (рапица, горчица, мак, маслини, слънчоглед, кокосови орехи, растения с рициново масло, какаови зърна, фъстъци), краставици (краставица, тиквички, пъпеши), влакнодайни растения (памук, лен, коноп, юта), цитрусови плодове (портокали, лимони, грейпфрут, мандарини), зеленчуци (спанак, марули, аспержи, зеле, моркови, лук, картофи, червен пипер), лаврови (авокадо, канела, камфор), широколистни и иглолистни дървета (липи, тисове, дъбове, елши, тополи, бреза, ели, лиственици, борове) или технически култури като царевица, тютюн, ядки, кафе, захарна тръстика, чай, лозя, хмел, банани, както и декоративни растения.

Вредителите от разред Lepidoptera, срещу които В. thuringiensis subsp. galleriae BTG има най-вероятно действие са следните: Achroia grisella, Acleris gloverana, Acleris variana, Adoxophyes orana, Agrotis ipsilon, Alabama argillacea, Alsophila pometaria, Amyelois transitella, Anagasta kuehniella, Anarsia lineatelia, Anisota senatoria, Antheraea pemyi, Anticarsia gemmatalis, Archips sp., Argyrotaenia sp., Athetis mindara, Bombyx mori, Bucculatrix thurberiella, Cadra cautella, Choristoneura sp., Cochylis hospes, Colias eurytheme, Corcyra cephalonica, Cydia latiferreanus, Cydia pomonella, Datana integerrima, Dendrolimus sibericus, Desmiafuneralis, Diaphania hyalinata, Diaphania nitidalis, Diatraea grandiosella, Diatraea saccharalis, Ennomos subsignaria, Eoreuma loftini, Ephestia elutella, Erannis tiliaria, Estigmene acrea, Eulia salubricola, Eupocoellia ambiguella, Eupoecilia ambiguella, Euproctis chrysorrhoea, Euxoa messoria, Galleria mellonella, Grapholita molesta, Harrisina americana, Helicoverpa subflexa, Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Hemileuca oliviae, Homoeosoma electellum, Hyphantria cunea, Keiferia lycopersicella, Lambdina fiscellaria fiscellaria, Lambdina fiscellaria lugubrosa, Leucoma salicis, Lobesia botrana, Loxostege sticticalis, Lymantria dispar, Macalla thyrsisalis, Malacosoma sp., Mamestra brassicae, Mamestra configurata, Manduca quinquemaculata, Manduca sexta, Maraca testulalis, Melanchra picta, Operophtera brunata, Orgyia sp., Ostrinia nubilalis, Paleacrita vemata, Papilio cresphontes, Pectinophora gossypiella, Phryganidia califomica, Phyllonorycter blancardella, Pieris napi, Pieris rapae, Plathypena scabra, Platynota flouendana, Platynota sultana, Platyptilia carduidactyla, Plodia interpunctella, Plutella xylostella, Pontia protodice, Pseudaletia unipuncta, Pseudoplusia includens, Sabulodes aegrotata, Schizura concinna, Sitotroga cerealella, Spilonota ocellana, Spodoptera sp., Syngrapha falcifera, Thaumstopoea pityocampa, Tineola bisselliella, Trichoplusia ni, Udea rubigalis, Xylomyges curialis, Yponomeuta padella.

Пример 3 - Третиране на картофови култури и площи за картофови насаждения с биологичния инсектицид, съдържащ В. thuringiensis subsp. galleriae BTG

Пестицидният препарат, съдържащ щам В. thuringiensis subsp. galleriae BTG, може да бъде под формата суспензия, дисперсия, водна емулсия, прах за разпрашаване, диспергируем прах, емулгируем концентрат, или аерозол се нанася по подходящия начин върху листата и стеблата на картофовите растения, или върху почвата, върху която се отглеждат насажденията. Препаратът, съдържащ щам BTG е с концентрация на спори най -малко 106 в милилитър, а суспензията за нанасяне върху растенията трябва да съдържа 3 - 5 ml от изходния препарат, разреден в 1 литър вода.

Пестицидният препарат, съдържащ щам BTG е ефективен срещу вредителите от разред Coleoptera, към който принадлежи колорадския бръмбар. Растения, заразени с яйца на колорадски бръмбар се напръскват от долната страна на листата. Ларвите спират да се хранят няколко часа след напръскването с препарата и измират напълно до 72 часа.

Пестицидният препарат, съдържащ щам BTG е ефективен срещу вредителите от разред Coleoptera, видовете: Leptinotarsa sp., Acanthoscelides obtectus, Callosobruchus chinensis, Epilachna varivestis, Pyrrhalta luteola, Cylas formicarius elegantulus, Listronotus oregonensis, Sitophilus sp., Cyclocephala borealis, Cyclocephala immaculata, Macrodactylus subspinosus, Popillia japonica, Rhizotrogus majalis, Alphitobius diaperinus, Palorus ratzeburgi, Tenebrio molitor, Tenebrio obscurus, Tribolium castaneum, Tribolium confusum, Tribolius destructor.

Пример 4 - Третиране на водни басейни и площи, заразени с комари и мухи.

Пестицидният препарат, съдържащ щам В. thuringiensis subsp. galleriae BTG под формата на прах за разпрашаване или аерозол се разпръсква върху заразените с комари и мухи водни басейни или градини. Концентрацията на спорите е същата, както в предишните примери.

Щам В. thuringiensis subsp. galleriae BTG в състава на препарата проявява вероятна активност срещу следните представители на разред Diptera: Aedes sp., Andes vittatus, Anastrepha ludens, Anastrepha suspensa, Anopheles barberi, Anopheles quadrimaculatus, Armigeres subalbatus, Calliphora stygian, Calliphora vicina, Ceratitis capitata, Chironomus tentans, Chrysomya rufifacies, Cochliomyia macellaria, Culex sp., Culiseta inomata, Dacus oleae, Delia antiqua, Delia platura, Delia radicum, Drosophila melanogaster, Eupeodes corollae, Glossina austeni, Glossina brevipalpis, Glossina fuscipes, Glossina morsitans centralis, Glossina morsitans morsitans, Glossina morsitans submorsitans, Glossina pallidipes, Glossina palpalis gambiensis, Glossina palpalis palpalis, Glossina tachinoides, Haemagogus equinus, Haematobia irritans, Hypoderma bovis, Hypoderma lineatum, Leucopis ninae, Lucilia cuprina, Lucilia sericata, Lutzomyia longlpaipis, Lutzomyia shannoni, Lycoriella mali, Mayetiola destructor, Musca autumnalis, Musca domestica, Neobellieria sp., Nephrotoma suturalis, Ophyra aenescens, Phaenicla sericata, Phlebotomus sp., Phormia regina, Sabethes cyaneus, Sarcophaga bullata, Scatophaga stercorarla, Stomaxys calcitrans, Toxorhynchites amboinensis, Tripteroides bambusa.

Пример 5 - Третиране на растения и почви за противодействие на вредители от клас Gastropoda (охлюви и голи охлюви)

Пестицидният препарат, съдържащ щам В. thuringiensis BTG, под формата суспензия или прах, съдържащ спори най-малко 106 в милилитър, се разрежда в съотношение 3-5 милилитра, разреден в 1 литър вода. Разреденият препарат се използва за пръскане на растенията или върху почвата, атакувана от вредителите.

Claims (1)

1. Бактериален щам Bacillus thuringiensis subsp. galleriae BTG, депозиран на 18.10.2022 г. в Националната банка за промишлени микроорганизми и клетъчни култури, България, под номер NBIMCC 9095, като средство за борба с вредители от разредите Lepidoptera, Colecptera, Diptera, Hemiptera и клас Gastropoda.