BRPI0309665B1 - Método para analisar uma preparação de alfagalactosidase a - Google Patents

Abstract

"tratamento de deficiência de alfagalactosidase a". a invenção provê métodos de tratamento de deficiência de <244>-galactosidase a. formas de dosagem, métodos de administração e métodos de análise de <244>-galactosidase a humana são também incluídos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODO PARA ANALISAR UMA PREPARAÇÃO DE ALFAGALACTOSIDASE A.

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados [001] O presente pedido reivindica prioridade do Pedido de Patente Provisório U.S. Número de Série 60/375.584, depositado em 25 de abril, 2002, cujos conteúdos são aqui incorporados a título de referência em sua totalidade.

Campo da Invenção [002] A presente invenção refere-se a composições de αgalactosidase A aperfeiçoadas para o tratamento de deficiências de αgalactosidase A incluindo doença de Fabry.

Antecedentes da Invenção [003] A doença de Fabry é uma doença de armazenamento de lisossoma hereditária ligada ao X caracterizada por dano renal grave, angioqueratomas, e/ou anormalidades cardiovasculares, incluindo aumento ventricular e insuficiência da válvula mitral. A doença de Fabry também afeta o sistema nervoso periférico, causando episódios de grande dor, de queimação, nas extremidades.

[004] A doença de Fabry é causada por uma deficiência na enzima α-galactosidase A (α-Gal A). A patofisiologia da doença de Fabry é bem estabelecida: devido à falta da enzima α-galactosidase A (α-Gal A) lisossômica, há um acúmulo de globotriaosilceramida (Gb3) no corpo.

[005] Devido ao padrão hereditário ligado ao X da doença, a maioria dos pacientes com doença de Fabry é homem. Heterozigotos fêmeas severamente afetadas são muitos vezes observadas, embora heterozigotos fêmeas possam se tornar sintomáticas mais tarde na

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2/73 vida. Uma variante da doença de Fabry se refere à hipertrofia ventricular esquerda e doença cardíaca. Nakano e outros, New England J. Med., 333:288-293 (1995). O cDNA e o gene codificando α-Gal A humana foram isolados e sequenciados. α-Gal A humana é expressa como um polipeptídeo de 429 aminoácidos, dos quais os 31 aminoácidos N-terminais são o peptídeo de sinal. A enzima humana foi expressa em células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) (Desnick e outros, Patente U.S. 5.356.804; Ioannou e outros, J. Cell Biol., 119:1137 (1992)); células de inseto (Calhoun e outros, WO 90/11353); e células humanas (Selden e outros, Patentes U.S. N°s 6.083.725 e 6.458.574B1). A terapia de substituição de enzima é um método atualmente usado de tratamento para doença de Fabry.

Sumário da Invenção [006] Ao compreender a farmacocinética e o perfil de modificação (por exemplo, modificação de carboidrato, fosfato ou sialilação) da αGal A humana, foram desenvolvidas novas composições farmacêuticas de α-Gal A, kits para o tratamento de deficiência de α-Gal A, métodos de seleção de uma dose apropriada de α-Gal A para um paciente, e métodos de tratamento de deficiência de α-Gal A usando tais composições. São também providos métodos de avaliação de preparações de α-Gal A, amostras, bateladas e similar, por exemplo, métodos de controle de qualidade e determinação de bioequivalência, por exemplo, com referência às composições de α-Gal A descritas aqui.

[007] A dosagem e estratégias de administração de α-Gal A descritas aqui reduzem a quantidade e custo de α-Gal A requerida para a terapia de substituição de α-Gal A e também reduzem o número necessário de administrações de dose.

[008] Desse modo, em um aspecto, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica que inclui uma preparação de αGalactosidase A (α-Gal A) humana. Em doses abaixo dos níveis de

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3/73 saturação de remoção do soro ou plasma, a remoção da preparação de α-Gal A do soro da circulação é de preferência menos do que 4 mL/min/kg na porção linear de AUC vs. curva de dose, com mais preferência menos do que cerca de 3,5, 3 ou 2,5 mL/min/kg na porção linear de AUC vs. curva de dose. A preparação de α-Gal A pode ter um exponente b para a equação de escala alométrica para remoção da circulação (soro ou plasma) em mamíferos, Y = a (BW)^b, de pelo menos 0,85, onde Y é a taxa de remoção de α-Gal A (ml/min), a é uma constante não-específica, e BW é peso do corpo. O exponente b é de preferência pelo menos 0,88, com mais preferência pelo menos 0,90, e com mais preferência pelo menos 0,92 ou pelo menos 0,94.

[009] Em uma modalidade, a α-Gal A é produzida a partir de células humanas, por exemplo, células humanas primárias, por exemplo, fibroblastos humanos primários ou um tipo de célula humana linear. As células e/ou a preparação de α-Gal A isolada das células podem ser modificadas para prover uma preparação de α-Gal A com características de glicosilação, fosforilação ou sialilação desejáveis.

[0010] Em uma outra modalidade, a α-Gal A é produzida a partir de células não-humanas, por exemplo, células de CHO. As células e/ou a preparação de α-Gal A isolada das células podem ser modificadas para prover uma preparação de α-Gal A com características de glicosilação, fosforilação ou sialilação desejáveis.

[0011] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um kit para o tratamento de deficiência de α-Gal A. O kit inclui (a) uma preparação de glicoproteína de α-Gal A humana, onde em doses abaixo dos níveis de saturação de remoção do soro ou plasma, a remoção da preparação de α-Gal A da circulação é de preferência menos do que 4 mL/min/kg na porção linear da área-sob-a-curva (AUC) vs. curva de dose, com mais preferência menos do que cerca de 3,5, 3 ou 2,5 mL/min/kg, na porção linear de AUC vs. curva de dose e (b) instruções

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4/73 para administração da preparação a um indivíduo com necessidade dela.

[0012] O kit pode também incluir instruções para administrar uma dose unitária da preparação de α-Gal A entre cerca de 0,05 mg e 2,0 mg por quilograma de peso do corpo do indivíduo (mg/kg). Em algumas modalidades, o kit inclui instruções para administrar uma dose unitária da preparação de α-Gal A entre 0,05 e 2,0 mg/kg, de preferência entre cerca de 0,05 e 1,0 mg/kg, com mais preferência entre cerca de 0,05 e 0,5 mg/kg, por exemplo, e entre 0,05 e menos do que 0,3 mg/kg. Em uma modalidade, a dose unitária é menos do que 0,3 mg/kg. Por exemplo, o kit pode incluir instruções para administrar uma dose unitária da preparação de α-Gal A de cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1,0 mg por quilograma de peso do corpo.

[0013] Em outras modalidades, o kit inclui instruções para administração de uma dose unitária da preparação de α-Gal A entre cerca de 0,1 X 10⁶ U/kg e 10 X 10⁶ U/kg. Em algumas modalidades, o kit inclui instruções para administrar uma dose unitária da preparação de α-Gal A entre 0,1 X 10⁶ U/kg e 5 X 10⁶ U/kg, de preferência entre cerca de 0,1 X 10⁶ U/kg e 3 X 10⁶ U/kg. Por exemplo, o kit pode incluir instruções para administrar uma dose unitária da preparação de α-Gal A de cerca de 0,1,0,2, 0,3, 0,5, 1, 2, 3, 5 ou até 10 X 10⁶ U/kg.

[0014] Em algumas modalidades, o kit pode também incluir instruções para administrar a dose unitária não mais do que uma vez a cada 7 dias. Por exemplo, as instruções podem incluir instruções para administrar a dose unitária não mais do que uma vez a cada 7 dias, 10 dias, 14 dias, 21 dias, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas ou 10 semanas.

[0015] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um kit para o tratamento de deficiência de α-Gal A. O kit inclui uma preparação de glicoproteína de α-Gal A humana e uma ou mais das instruções que

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5/73 seguem: (a) instruções para administrar a preparação a um indivíduo com necessidade em uma dose unitária entre 0,05 e 2,0 mg/kg, de preferência entre cerca de 0,05 e 1,0 mg/kg, com mais preferência entre cerca de 0,05 e 0,5 mg/kg, por exemplo, entre 0,05 e menos do que 0,3 mg/kg; (b) instruções para administrar uma dose unitária da preparação de α-Gal A entre 0,1 X 10⁶ U/kg e 10 X 10⁶ U/kg, por exemplo, entre 0,1 X 10⁶ U/kg e 5 X 10⁶ U/kg, de preferência entre cerca de 0,1 X 10⁶ U/kg e 3 X 10⁶ U/kg; ou (c) instruções para administrar a preparação não mais do que cerca de uma vez a cada 8 semanas, 6 semanas, 4 semanas, 21 dias, 14 dias, 10 dias ou 7 dias.

[0016] Os reagentes de um kit descrito aqui podem ser embalados em recipientes em quantidades predeterminadas. Um kit concretizando as modalidades da presente invenção, geralmente designado pelo numeral 21, é ilustrado na Figura 16. O Kit 2 é compreendido dos elementos principais que seguem: embalagem 4, uma preparação de αGal A descrita aqui 6 e instruções 8. Opcionalmente, o kit pode incluir um agente adicional 10. O agente adicional pode ser, por exemplo, tampão ou solução farmacêutica, por exemplo, para dissolução ou diluição da preparação 6 de α-Gal A. As instruções 8 podem ser, por exemplo, material impresso sobre como administrar a preparação 6 e podem incluir informação sobre dose adequada. Instruções preferidas compreendem instruções para administrar a preparação de α-Gal A 6 em uma dose unitária descrita aqui. A embalagem 4 é uma estrutura do tipo caixa para comportar um frasco (ou vários frascos) contendo uma preparação de α-Gal A da invenção 6, instruções 8, e, opcionalmente, um frasco (ou vários frascos) contendo um agente 10. Um versado na técnica individual pode modificar prontamente a embalagem 4 para se adequar a necessidades individuais.

[0017] A invenção também refere-se a um método de seleção de uma faixa de dose unitária de α-Gal A para tratamento de um indivíduo

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6/73 tendo uma deficiência de α-Gal A. O método inclui: provisão do peso do corpo de um indivíduo, por exemplo, pesando o indivíduo ou obtendo-se o peso do corpo do indivíduo a partir do indivíduo, de um provedor de cuidado da saúde de um indivíduo, ou de um banco de dados; e determinação do valor da faixa entre 0,05 mg e 2 mg (por exemplo, entre 0,05 e 0,5 mg ou entre 0,05 e menos do que 0,3 mg) de α-Gal A por quilograma de peso do corpo do indivíduo. A faixa de dose unitária selecionada pode ser usada para selecionar um regime de terapia de substituição de α-Gal A para o indivíduo. O método pode também incluir avaliação do indivíduo quanto a um ou mais de: níveis de α-Gal A de base, por exemplo, concentração de α-Gal A no soro; função cardiovascular; função renal; função do fígado, idade, sexo.

[0018] Em uma modalidade preferida, a dose unitária satura a absorção do fígado da α-Gal A ao ter C_max (concentração de soro máxima seguindo a infusão da droga) maior do que 2 x 10^-9 M.

[0019] Em um outro aspecto, a invenção refere-se também a um método de tratamento de um indivíduo tendo ou sob risco de ter deficiência de α-Gal A. O método inclui administração a um indivíduo com necessidade de uma preparação de glicoproteína de α-Gal A humana, onde em doses abaixo dos níveis de saturação de remoção do soro ou plasma, a remoção do soro da preparação de α-Gal A seguindo infusão intravenosa da circulação é de preferência menos do que 4 mL/min/kg na porção linear de AUC vs. curva de dose, com mais preferência menos do que cerca de 3,5, 3 ou 2,5 mL/min/kg, na porção linear da AUC vs. curva de dose, por exemplo, uma preparação de glicoproteína de α-Gal A humana descrita aqui acima. Conforme descrito em um outro lugar aqui a dose unitária administrada de preferência satura a absorção pelo fígado da α-Gal A.

[0020] Em uma modalidade preferida, a preparação é administrada intravenosamente, embora ela possa ser formulada para administraPetição 870170056455, de 07/08/2017, pág. 13/126

7/73 ção subcutânea, ou intratecal, conforme descrito em um outro lugar aqui.

[0021] Em um outro aspecto, a invenção inclui um método de tratamento de um indivíduo tendo ou sob risco de ter deficiência de α-Gal A. O método inclui um ou mais de (a)-(c): (a) administração a um indivíduo com necessidade de uma preparação de glicoproteína de α-Gal A em uma dose unitária entre cerca de 0,05 e 2,0 mg/kg por quilograma de peso do corpo, de preferência entre 0,05 e 1,0 mg/kg ou entre 0,05 e 0,5 mg/kg, por exemplo, entre 0,05 e menos do que 0,3 mg/kg, por exemplo, cerca de 0,25, 0,20, 0,15 ou 0,1 mg por quilograma de peso do corpo do indivíduo; (b) administração a um indivíduo com necessidade de uma preparação de glicoproteína de α-Gal A humana em uma dose unitária da preparação de α-Gal A entre 0,1 X 10⁶ U/kg e 10 X 10⁶ U/kg, por exemplo, entre 0,1 X 10⁶ U/kg e 5 X 10⁶ U/kg, de preferência entre cerca de 0,1 X 10⁶ U/kg e 3 X 10⁶ U/kg; (c) administração a um indivíduo com necessidade uma preparação de glicoproteína de α-Gal A humana não mais do que uma vez a cada 7 dias, por exemplo, não mais do que uma vez a cada 10 dias, 14 dias, 21 dias, 4 semanas, 6 semanas ou 8 semanas. Em algumas modalidades, há pelo menos 7, 10, 14, 21, 30 ou 60 dias entre cada administração. Em algumas modalidades, a preparação é administrada durante um período de pelo menos 8, 16, 24, 36, 48, semanas ou mais, por exemplo, pelo menos 1,2 ou 3 anos.

[0022] Em uma modalidade, a preparação de glicoproteína α-Gal A humana é administrada pelo menos duas vezes, de preferência 3, 4, 5, 6 vezes ou mais, mas não mais do que uma vez a cada 7 dias, de preferência 10 dias, com mais preferência 14 dias ou mais, por exemplo, 21 dias, 4 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas ou mais.

[0023] Em uma modalidade preferida, a dose unitária satura a absorção pelo fígado da α-Gal A, de modo a permitir que a α-Gal A ad

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8/73 ministrada ultrapasse o fígado e esteja disponível para os outros tecidos no corpo.

[0024] Em uma modalidade preferida, a preparação é administrada intravenosamente.

[0025] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a uma dose unitária de α-Gal A humana descrita aqui embalada em um recipiente, por exemplo, um recipiente de vidro ou plástico ou dispositivo de aplicação, por exemplo, uma seringa. A dose unitária é equivalente a entre 0,05 e 2 mg/kg, por exemplo, entre 0,05 e 1,0 mg/kg, de preferência entre 0,05 e 0,5 mg/kg, com mais preferência entre 0,05 e menos do que 0,3 mg/kg de peso do corpo do indivíduo para o qual ela é pretendida. A atividade da preparação de α-Gal A é geralmente entre cerca de 2,0 e 4,5 x 10⁶ U/mg. Por exemplo, o recipiente ou dispositivo de aplicação pode incluir entre 2,0 e 32,0 mg de α-Gal A humana conforme descrito para uma dose unitária de adulto, por exemplo, o recipiente ou dispositivo de aplicação pode incluir cerca de 2, 4, 6, 8, 14, 16, 18, 20, 25 ou 30 mg de α-Gal A para uma dose de adulto.

[0026] Embora não ligado a nenhuma teoria, é acreditado que as preparações de α-Gal A descritas aqui podem ser predominantemente removidas do sangue através de receptores de manose-6-fosfato (M6P). Em modalidades preferidas, menos de 25%, 20%, 16%, 14% (conforme medido entre 40 horas e 50 horas, por exemplo, aproximadamente 44 horas, após a dosagem) ou menos da preparação de αGal A, por exemplo, uma preparação descrita aqui, são absorvidos no fígado quando da administração a um indivíduo. Em doses abaixo dos níveis de saturação de remoção do soro ou plasma, a remoção do soro da preparação de α-Gal A da circulação é de preferência menos do que 4 mL/min/kg na porção linear de AUC vs. curva de dose, com mais preferência menos do que cerca de 3,5, 3 ou 2,5 mL/min/kg, na porção linear da AUV vs. curva de dose. Uma preparação de α-Gal A descrita

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9/73 aqui exibe uma curva de saturação de fígado como segue: mg de α-Gal A/fígado = 2,1 mg (1 - e^-Dose/4,7), onde dose é a dose total (em mg) administrada a um paciente de 7 kg típico. O coeficiente de variação (CV) pode ser, por exemplo, cerca de 0,40. (Doses e quantidades devem ser ajustadas apropriadamente para pacientes maiores ou menores).

[0027] Em algumas modalidades, a preparação de α-Gal A das composições, métodos e kits descritos aqui é isolada de células humanas geneticamente construídas para produzirem α-Gal A. Em outras modalidades, a preparação de α-Gal A pode ser isolada de células não-humanas (por exemplo, células de CHO), onde a célula foi geneticamente construída para produzir α-Gal A. Em algumas modalidades, um ou mais de: a construção de expressão de α-Gal A, as células humanas e não-humanas, ou a α-Gal A isolada de células humanas ou não-humanas podem ser modificados para proverem uma preparação de α-Gal A com glicosilação alterada, por exemplo, estruturas de glicano, sialilação ou fosfato alteradas. Por exemplo, uma célula nãohumana geneticamente construída para produzir uma α-Gal A humana (ou a α-Gal A purificada) pode ser modificada para imitar as características de glicosilação de α-Gal A produzida em células humanas. Em uma modalidade, as células podem ser modificadas, por exemplo, geneticamente construídas, para expressarem uma ou mais enzima de modificação α-Gal A exógena, por exemplo, uma glicosidase, glicosil transferase, fosforil transferase ou sialil transferase. Em uma modalidade, a sequência de codificação de α-Gal A pode ser modificada para ter mais ou menos (de preferência mais) locais de glicosilação. Em uma outra modalidade, as células podem ser expostas a um ou mais inibidor ou outro modulador de enzimas de glicosilação, por exemplo, kifunensina ou swainsonina. Em ainda uma outra modalidade, a α-Gal A, uma vez isolada das células, pode ser modificada, por exemplo, cli

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10/73 vada ou quimicamente modificada (por exemplo, mudando o número de moles ácido siálico e/ou manose-6-fosfato por mol de α-Gal A), por exemplo, com um inibidor de fosfatase, cinase, glicosidase, glicosil transferase, fosforil transferase ou sialil transferase.

[0028] Em modalidades preferidas, uma preparação de α-Gal A descrita aqui é enriquecida em estruturas de glicano neutras, monosialiladas e di-sialiladas (combinadas) com relação a estruturas mais altamente sialiladas tal como estruturas tri-sialiladas e tetra-sialiladas. Por exemplo, uma preparação de α-Gal A preferida tem um ou mais de: (a) pelo menos cerca de 22% de glicanos neutros, por exemplo, pelo menos cerca de 25% ou 30% de glicanos neutros; (b) pelo menos cerca de 15%, 20% ou 25% glicanos mono-sialilados; (c) pelo menos cerca de 35%, de preferência pelo menos cerca de 40%, 45% ou 50% de glicanos neutros e mono- e di-sialilados combinados; e (e) menos do que cerca de 35%, de preferência menos do que cerca de 25%, 20%, 18% ou cerca de 15% de estruturas de glicano tri- e tetrasialilados combinados.

[0029] Em modalidades preferidas, uma preparação de α-Gal A descrita aqui tem, em média, mais de um glicano complexo por monômero, de preferência pelo menos 50% de glicanos complexos por monômero, por exemplo, uma média de 1,5 glicano complexo ou mais por monômero.

[0030] Em modalidades preferidas, uma preparação de α-Gal A descrita aqui tem pelo menos 5%, de preferência pelo menos 7%, 10% ou 15% de glicanos neutros.

[0031] Em modalidades preferidas, uma preparação de α-Gal A descrita aqui tem menos do que 45% de glicanos fosforilados. Por exemplo, a preparação tem menos do que cerca de 355, 30%, 25% ou 20% de glicanos fosforilados.

[0032] Em modalidades preferidas, uma preparação de α-Gal A

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11/73 descrita aqui tem uma proporção total de glicanos sialilados maior do que cerca de 45%, por exemplo, mais do que 50% ou 55%.

[0033] Em uma modalidade preferida, a razão de ácido salicílico para manose-6-fosfato na preparação de α-Gal A (em uma base mol por mol) é maior do que 1,5 para 1, de preferência maior do que 2 para 1, com mais preferência maior do que 3 para 1; com mais preferência maior do que 3,5 para 1 ou mais.

[0034] Em uma modalidade, a razão percentual de glicanos sialilados para glicanos fosforilados é maior do que 1, de preferência maior do que 1,5, com mais preferência maior do que 2, por exemplo, maior do que cerca de 2,5 ou 3.

[0035] As composições de α-Gal A e métodos descritos aqui são úteis para tratamento de indivíduo com deficiência de α-Gal A. As composições de α-Gal A e métodos descritos aqui provêem tratamentos que são de custo eficaz e minimizam a dose requerida e frequência de administrações de α-Gal A.

[0036] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a vários métodos de avaliação, por exemplo, análise, seleção ou classificação de uma preparação, amostra, batelada ou outra composição de α-Gal A. Os métodos podem ser usados para determinar os parâmetros estruturais e/ou biológicos (por exemplo, a composição de carboidrato, perfil de fosfato, perfil de sialilação, distribuição de tecido ou características de remoção do soro) da preparação ou amostra. A título de um exemplo não-limitante, os métodos são usados para determinar se a preparação ou amostra tem uma ou mais propriedade física ou funcional de uma α-Gal A descrita aqui. Por exemplo, uma pessoa pode comparar uma amostra da composição de α-Gal A com uma composição de αGal A de referência, por exemplo, uma composição de α-Gal A humana conforme aqui descrito, por exemplo, uma α-Gal A humana tendo propriedades farmacocinéticas ou biológicas desejadas, tal como α

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Gal A humana preparada a partir de células humanas, por exemplo, fibroblastos humanos. Os métodos são úteis, inter alia, para controle de qualidade e/ou estudos de bioequivalência de preparações de αGal A.

[0037] Em um aspecto, o método inclui obtenção ou provisão de uma preparação de α-Gal A de teste e determinação de se a preparação tem pelo menos uma (de preferência pelo menos duas, com mais preferência pelo menos três ou mais, por exemplo, pelo menos quatro, cinco, seis ou sete) das características estruturais que seguem: (1) é enriquecida em estruturas glicano neutras, mono-sialiladas e disialiladas (combinadas) relativas a estruturas mais altamente sialiladas, por exemplo, tem (i) pelo menos cerca de 22% de glicanos neutros, por exemplo, pelo menos cerca de 25% ou 30% de glicanos neutros, (ii) pelo menos cerca de 15%, 20% ou 25% de glicanos monosialilados, (iii) pelo menos cerca de 35%, de preferência pelo menos cerca de 40%, 45% ou 50% de glicanos neutros e mono-sialilados combinados e/ou (iv) pelo menos cerca de 75%, 76%, 78% ou mais de glicanos neutros, mono- e di-sialilados combinados; (2) tem menos do que cerca de 35%, de preferência menos do que cerca de 25%, 20%, 18% ou cerca de 15% de estruturas glicano tri- e tetra-sialiladas combinadas; (3) tem pelo menos 50%, de preferência pelo menos 67% de glicanos complexos; (4) tem pelo menos cerca de 45% de glicanos fosforilados, de preferência menos do que cerca de 35%, com mais preferência menos do que cerca de 30%, 25% ou 20% de glicanos fosforilados; (5) tem mais do que cerca de 45%, de preferência mais do que cerca de 50 ou 55% de glicanos sialilados; (6) tem uma razão de ácido siálico para manose-6-fosfato em uma base mol por mol maior do que

1,5 para 1, de preferência maior do que cerca de 2 para 1, com mais preferência maior do que cerca de 3 para 1 ou 3,5 para 1; e (7) tem uma razão de glicanos sialilados para glicanos fosforilados maior do

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13/73 que 1, de preferência maior do que 1,5, com mais preferência maior do que cerca de 2, 2,5 ou 3; e/ou tem uma ou mais das características biológicas ou farmacocinéticas que seguem: (a) a remoção do soro da circulação humana é menos do que 4 mL/min/kg na porção linear da AUC vs. curva de dose, com mais preferência menos do que cerca de 3,5, 3 ou 2,5 mL/min/kg, na porção linear da AUC vs. curva de dose; (b) a preparação é de preferência direcionada para células capilares/endoteliais vasculares, células epiteliais glomerulares renais (podócitos) e células mesangiais glomerulares, células endoteliais renais, miócitos cardíacos, células endoteliais de fígado, células sinusoidais de fígado, células pulmonares e/ou células neurais; e (c) não é absorvida pelos hepatócitos do fígado.

[0038] Uma preparação de teste que tem uma ou mais das características mencionadas acima pode ser selecionada, classificada, formulada, embalada ou passada para um outro processamento a jusante. Por exemplo, tal preparação pode ser selecionada para um uso farmacêutico particular. A posse pela preparação de teste de um ou mais (de preferência pelo menos dois, com mais preferência pelo menos três ou mais, por exemplo, pelo menos quatro, cinco, seis ou sete) dos parâmetros estruturais acima mencionados (1)-(7) está positivamente relacionada com (e pode então ser usada para prever) parâmetros farmacocinéticos ou atividade biológica desejáveis, por exemplo, uma ou mais das características biológica ou farmacocinética (a)-(c). A informação de relação ou previsão pode ser usada, por exemplo, para produzir uma preparação terapêutica de α-Gal A para um paciente específico ou uma variante específica de doença de Fabry (por exemplo, doença de Fabry variante renal ou doença de Fabry variante cardíaca). A informação de relação ou previsão pode ser registrada (por exemplo, em um meio de impressão ou de leitura por computador).

[0039] Em algumas modalidades, um parâmetro de atividade bioPetição 870170056455, de 07/08/2017, pág. 20/126

14/73 lógica ou farmacocinético da preparação de α-Gal A de teste ou amostra é previsto a partir de seu sinal de carboidrato. Em outras modalidades, um parâmetro de atividade biológica ou farmacocinético da preparação ou amostra é determinado experimentalmente.

[0040] O resultado da determinação (que pode ser, por exemplo, um valor para qualquer um de: a quantidade de glicanos neutros, mono-, di-, tri- ou tetra-sialilados ou combinação deles; a quantidade de glicanos complexos; a quantidade de glicanos fosforilados; a quantidade de glicanos sialilados; a razão de ácido siálico para manose-6fosfato em uma base mol por mol, ou a razão de glicanos sialilados para glicanos fosforilados) é de preferência inserido em um registro, por exemplo, uma impressora ou registro lido por computador, tal como um registro de laboratório ou conjunto de dados. O registro pode incluir outras informações, tal como identificador de amostra específico para a preparação, uma data, um operador do método, ou informação sobre a atividade enzimática, fonte, método de purificação ou atividade biológica da preparação. O registro pode ser usado para armazenar ou prover informação sobre a preparação de teste. Por exemplo, o registro pode ser usado para prover informação (por exemplo, para o governo, um provedor de cuidado de saúde, companhia de seguro ou paciente) relacionada com a preparação de α-Gal A ou seu uso, por exemplo, na forma de material informacional, de marketing ou instrucional, por exemplo, material impresso ou material lido por computador (por exemplo, um rótulo). O registro ou informação derivado do registro pode ser usado, por exemplo, para identificar a preparação de teste como adequada ou inadequada para uso farmacêutico ou terapêutico. Por exemplo, uma preparação de α-Gal A de teste determinada ter um ou mais dos parâmetros estruturais (1)-(7) acima mencionados pode ser identificada como tendo parâmetros farmacocinéticos ou de atividade biológica desejados (por exemplo, os parâmetros (a)-(c) acima

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15/73 mencionados).

[0041] Os métodos descritos aqui podem ser também usados para comparar variação batelada-para-batelada de uma preparação de αGal A. Nesse caso, qualquer um dos parâmetros estruturais ou farmacocinéticos descritos acima pode ser avaliado para uma pluralidade de bateladas de α-Gal A, por exemplo, bateladas diferentes feitas a partir do mesmo protocolo de purificação. Em uma modalidade preferida, o método inclui seleção de uma batelada com menos do que uma faixa pré-selecionada de variação (por exemplo, menos do que 10%, de preferência menos do que 55, com mais preferência menos do que 2,5% ou variação menor) de um ou mais dos parâmetros estruturais ou biológicos acima mencionados (1)-(7) ou (a)-(c). Quando preparações múltiplas são analisadas (por exemplo, bateladas diferentes de uma preparação de α-Gal A), a entrada do resultado da determinação em um registro pode incluir geração de um conjunto de dados das determinações, por exemplo, um conjunto de dados impresso ou lido por computador. O conjunto de dados pode incluir uma correlação de uma característica estrutural determinada com um parâmetro de atividade biológica ou farmacocinético previsto ou experimentalmente avaliado.

[0042] A amostra de α-Gal A a ser testada pode ser derivada de qualquer célula, mas de preferência é derivada de uma célula de mamífero, por exemplo, uma célula humana ou não-humana, tal como uma célula de CHO. Em algumas modalidades, o sinal de carboidrato da amostra foi modificado, por exemplo, através de métodos reconhecidos na técnica, antes da etapa de determinação ser realizada, por exemplo, através de glicoengenharia, por exemplo, conforme aqui descrito, através de tratamento com uma enzima de glicosilação tal como glicosiltransferase ou glicosidase, ou tratamento da célula ou preparação com uma fosforil transferase, sialil transferase, inibidor de fosfatase, cinase, ou inibidor de glicosilação, ou através de co

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16/73 expressão na célula (por exemplo, através de co-transfecção) de um DNA codificando qualquer uma das enzimas acima ou outras enzimas de modificação de carboidrato.

[0043] O sinal de carboidrato da amostra pode ser obtido através de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, através de cromatografia de troca de íon, cromatografia de troca de ânion de alto desempenho (HPAE), cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) ou espectroscopia de massa. Avaliação do sinal de carboidrato pode incluir avaliação da composição, carga, fosforilação e/ou sialilação dos glicanos da preparação.

[0044] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um método de produção de uma preparação de α-Gal A humana (por exemplo, uma preparação de α-Gal A aperfeiçoada). O método inclui provisão de uma preparação de α-Gal A humana coletada de uma célula; e modificação da estrutura glicano da preparação de α-Gal A para combinar com um ou mais (de preferência pelo menos dois, com mais preferência pelo menos três ou mais, por exemplo, pelo menos quatro, cinco, seis ou sete) dos parâmetros que seguem: (1) enriquecimento em estruturas glicano neutras, mono-sialiladas e di-sialiladas (combinadas) com relação a estruturas mais altamente sialiladas, por exemplo, tem (i) pelo menos cerca de 22% de glicanos neutros, por exemplo, pelo menos cerca de 25% ou 30% de glicanos neutros; (ii) pelo menos cerca de 15%, 20 ou 25% de glicanos mono-sialilados, (iii) pelo menos cerca de 35%, de preferência pelo menos cerca de 40%, 45% ou 50% de glicanos neutros e mono-sialilados combinados, e/ou (iv) pelo menos cerca de 75%, 76%, 78% ou mais de glicanos neutros, mono- e disialilados combinados; (2) pelo menos cerca de 35%, de preferência menos do que cerca de 25%, 20%, 18% ou cerca de 15% de estruturas glicano tri- e tetra-sialilados combinados; (3) pelo menos 50%, de preferência pelo menos 67% de glicanos complexos; (4) menos do que

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17/73 cerca de 45% de glicanos fosforilados, de preferência menos do que cerca de 35%, com mais preferência menos do que cerca de 30%, 25% ou 20% de glicanos fosforilados; (5) mais do que cerca de 45%, de preferência mais do que cerca de 50 a 55% de glicanos sialilados; (6) uma razão de ácido siálico para manose-6-fosfato em uma base mol por mol maior do que 1,5 para 1, de preferência maior do que cerca de 2 para 1, com mais preferência maior do que cerca de 3 para 1 ou 3,5 para 1; e (7) uma razão de glicanos sialilados para glicanos fosforilados maior do que 1, de preferência maior do que 1,5, com mais preferência maior do que cerca de 1, 2,5 ou 3. A estrutura do glicano pode ser modificada através de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, através de glicoengenharia (por exemplo, construindo geneticamente a célula para produzir uma α-Gal A humana tendo um local de glicosilação de ocorrência não-natural; e/ou construindo geneticamente a célula para produzir uma glicosidase, glicosil transferase, fosforil transferase, fosfatase ou sialil transferase); através de isolamento seletivo de glicoformas durante o processo de purificação de α-Gal A; através de tratamento da célula ou preparação com uma enzima de modificação de carboidrato; ou tratamento da célula ou preparação com um inibidor de glicosilação, por exemplo, quifunensina, e/ou através de co-expressão na célula (por exemplo, através de cotransfecção) de um DNA codificando qualquer uma das enzimas acima ou outras enzimas de modificação de carboidrato.

[0045] Em uma modalidade preferida, o método inclui a etapa de análise (por exemplo, ensaio) de um ou mais dos parâmetros do sinal de carboidrato, parâmetro de atividade biológica ou farmacocinético da preparação de α-Gal A após modificação.

[0046] A invenção refere-se também a um método de tratamento de um indivíduo, por exemplo, um humano. O método inclui: provisão ou obtenção de um painel de duas ou mais preparações de α-Gal A

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18/73 tendo características de glicano diferentes; e seleção de uma preparação de α-Gal A tendo um sinal de carboidrato que se encaixa em um ou mais (de preferência pelo menos dois, com mais preferência pelo menos três ou mais, por exemplo, pelo menos quatro, cinco, seis ou sete) dos parâmetros (1)-(7) acima mencionados e/ou (a)-(c) para tratamento do indivíduo.

[0047] O método pode também incluir administração de uma ou mais doses de uma quantidade terapeuticamente eficaz da preparação de α-Gal A selecionada ao indivíduo. O indivíduo pode ser avaliado antes, durante e/ou após a administração. Por exemplo, a distribuição no tecido ou remoção do soro da preparação de α-Gal A pode ser avaliada no indivíduo, por exemplo, avaliada repetidamente com o tempo. A dose da preparação pode ser então ajustada de acordo com o resultado da avaliação. O indivíduo pode também ser avaliado ou monitorado quanto ao estado, por exemplo, estado clínico, em resposta à administração da preparação de α-Gal A.

[0048] Sinais de carboidrato diferentes, por exemplo, cada parâmetro (1) a (7) ou combinações de parâmetros (1)-(7) diferentes, podem estar relacionados a ter propriedades farmacocinéticas ou outras biológicas desejáveis para populações diferentes, por exemplo, populações que diferem pelo estágio ou tipo de doença (por exemplo, doença de Fabry do tipo cardíaca vs. renal), idade, sexo, formação étnica ou genótipo.

[0049] Por deficiência de α-Gal A se quer dizer qualquer deficiência na quantidade ou atividade desta enzima em um paciente, resultando em acúmulos anormais de glicolipídeos neutros (por exemplo, globotriaosilceramida) principalmente em células endoteliais capilares, células epiteliais glomerulares renais (podócitos) e células mesangiais glomerulares e/ou miócitos cardíacos. Os depósitos deste material podem resultar em dor neuropática severa (por exemplo, acroparastesia

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19/73 e dor lacerativa), doença renal e cardiovascular séria e/ou derrame. O acúmulo de glicolipídeo pode induzir sintomas severos conforme tipicamente observado em homens que estão sofrendo de doença de Febry. Alternativamente, o acúmulo pode induzir sintomas relativamente suaves, como pode ser algumas vezes visto em algumas fêmeas heterozigotas que carregam o gene defeituoso. Indivíduos afetados têm uma expectativa de vida muito menor; a morte geralmente resulta de complicações renais, cardíacas e/ou cerebrovasculares aproximadamente nas quarta e quinta décadas na vida.

[0050] Um sinal de carboidrato de uma preparação de α-Gal A é uma ou mais características de identificação da estrutura glicano de uma dada preparação ou amostra de α-Gal A. O sinal de carboidrato pode ser qualitativo ou quantitativo. Por exemplo, um sinal de carboidrato de uma preparação de α-Gal A pode incluir uma ou mais das características de identificação que seguem: (a) o nível relativo, faixa de porcentagem ou valor específico de glicanos complexos vs. de manose superior ou híbridos; (b) o nível relativo, faixa de porcentagem ou valor específico de estrutura de glicano neutro ou sialilado, por exemplo, mono-sialilado, di-sialilado, tri-sialilado e tetra-sialilado; (c) o nível relativo, a faixa de porcentagem ou valor específico de glicanos fosforilados ou não-fosforilados; (d) o nível relativo, faixa de porcentagem ou valor específico de glicanos sialilados; (e) o perfil de carga relativo ou específico dos glicanos da preparação; (f) a razão relativa ou específica de um tipo de monossacarídeo carregado para um outro, por exemplo, a razão de ácido siálico para manose-6-fosfato; ou a razão de glicanos sialilados para glicanos fosforilados.

Breve Descrição dos Desenhos [0051] A Figura 1 é uma representação da sequência de cDNA de α-Gal A incluindo a sequência que codifica o peptídeo de sinal (SEQ ID NO: 1).

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20/73 [0052] A Figura 2 é uma representação da sequência de aminoácido de α-Gal A humana (SEQ ID NO: 2).

[0053] A Figura 3 é um mapa esquemático de pGA213C. A Figura 3B é uma representação diagramática da construção alvo, pGA213C, e recombinação homóloga com o local de α-Gal A endógena. pGA213C é mostrado como sequências alvo alinhadas acima das sequências correspondentes no local de α-Gal A cromossômica-X. Posições relativas para o códon de iniciação de metionina, ATG, são indicadas pelos números acima dos mapas lineares. A unidade de ativação contendo sequências dhfr de murino, neo bacterianas, e de promotor de CMV/íntron de aldolase é mostrada acima da posição (-221) na qual elas foram inseridas através de clonagem de DNA. Sequências de codificação de α-Gal A são indicadas pelas caixas escuras. Sequências genômicas de não-codificação de α-Gal A são indicadas pelas caixas cheias com luz. Setas grandes indicam a direção de transcrição para expressão de dhfr e neo.

[0054] A Figura 4 é um cromatógrafo mostrando glicanos liberados de uma α-Gal A feita em células humanas (Replagal®) vs. α-Gal A feita em células de CHO (Fabrazyme®). Ambas preparações foram analisadas usando HPAE-PAD em um Dionex BioLC Carbohydrate System. Os perfis de glicano indicam que há diferenças significantes nas cadeias de glicano de Replagal® (parte superior) e Fabrazyme® (parte inferior). Fabrazyme® é enriquecido em estruturas fosforiladas (picos eluindo a 65-69 minutos) e estruturas mais altamente sialiladas (estruturas tetra-sialiladas eluindo a 50-60 minutos e estruturas tri-sialiladas eluindo a 51-55 minutos) conforme comparado com Replagal®. Replagal® é enriquecido em estruturas neutras (picos a 33-36 minutos), mono-sialiladas (picos a 39-44 minutos) e di-sialiladas (picos a 45-49 minutos).

[0055] A Figura 5 é um gráfico mostrando a internalização de αPetição 870170056455, de 07/08/2017, pág. 27/126

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Gal A feita em células humanas (Replagal®) e α-Gal A feita em células de CHO (Fabrazyme®) em células. Fibroblastos humanos normais foram incubados em placas de cultura de multicavidade por 6 horas na ausência (controle, não mostrado) ou presença de Replagal® ou Fabrazyme®. Esta internalização pode ser inibida com manose-6-fosfato, indicando que a internalização é predominantemente através de receptores de manose-6-fosfato. Os resultados indicam que Replagal® ou Fabrazyme® não é internalizado comparativamente com os fibroblastos. Fabrazyme® é removido mais rapidamente do que Replagal® pela internalização mediada pelo receptor de manose-6-fosfato.

[0056] A Figura 6 mostra as massas moleculares de α-Gal A feita em células humanas (Replagal®) (parte superior) e α-Gal A feita em células de CHO (Fabrazyme®) (parte inferior) conforme determinado através de espectroscopia de massa MALDI-TOF. O máximo do pico mais amplo é em 50.755 e 50.705 Da, respectivamente, de acordo com o peso molecular esperado do monômero glicosilado. Um ressalto principal em aproximadamente 48.071 Da e 47.667 Da está presente, representando as glicoformas de peso molecular mais baixo para Replagal® e Fabrazyme®, respectivamente. O ressalto principal, correspondendo às glicoformas de peso molecular mais baixo, é muito mais diferente no espectro de Fabrazyme®.

[0057] A Figura 7 é um perfil de carga dos glicanos liberados de αGal A feita em células humanas (Replagal®) (parte inferior) e α-Gal A feita em células de CHO (Fabrazyme®) parte superior). Glicanos foram derivados com uma sonda fluorescente e comparados através de cromatografia de troca de íon em uma coluna GlycoSep. Os resultados mostram que Replagal® tem uma proporção maior de glicanos neutros e mono-carregados, e Fabrazyme® tem uma proporção maior de glicanos tri-carregados.

[0058] A Figura 8 é um cromatograma de Fabrazyme® (parte suPetição 870170056455, de 07/08/2017, pág. 28/126

22/73 perior) e Replagal® (parte inferior) conforme analisado através de HPLC de fase reversa usando uma coluna de fase reversa C4 (Vydac). Cromatogramas obtidos em 214 nm são mostrados. O ressalto principal, correspondendo às glicoformas de peso molecular mais baixo, é muito mais acentuado em Fabrazyme®.

[0059] A Figura 9 é um gráfico mostrando concentração no soro (U/ml) de α-Gal (Replagal®) feita em células humanas de Macacos Cinomólogos dosados IV a 1 mg/kg.

[0060] A Figura 10 é um gráfico mostrando a proporcionalidade de dose de C_max em modelos de animais de α-Gal (Replagal®) feita em células humanas.

[0061] A Figura 11 é um gráfico mostrando a concentração no plasma de Replagal® (U/ml) seguindo infusão a 0,2 mg/kg em um indivíduo humano.

[0062] A Figura 12 é um gráfico mostrando proporcionalidade de dose em humanos vs. macaco de α-Gal A (Replagal®) feita em células humanas.

[0063] A Figura 13 é um gráfico mostrando proporcionalidade de dose de área sob a curva (AUC) em animais e humanos para α-Gal A (Replagal®) feita em células humanas.

[0064] A Figura 14 é um gráfico mostrando distribuição no fígado vs. dose em humanos de uma preparação de α-Gal A (Replagal®) feita em células humanas.

[0065] A Figura 15 é um gráfico mostrando concentração no plasma de Replagal® (U/ml) seguindo a infusão a 0,2 mg/kg em um indivíduo masculino e um feminino.

[0066] A Figura 16 é um desenho esquemático de um kit contendo uma preparação de α-Gal A descrita aqui embalada em um frasco e instruções para administração da preparação.

Descrição Detalhada da Invenção

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Introdução [0067] Foi verificado que a α-Gal A humana pode ser feita tendo modificações (por exemplo, na estrutura do carboidrato, por exemplo, modificações de glicano, fosfato ou sialilação) que resultam em preparação de α-Gal A humana tendo propriedades farmacocinéticas que são desejáveis para terapia de substituição de enzima para deficiência de α-Gal A. Por exemplo, uma preparação de α-Gal A humana produzida a partir de células humanas geneticamente construídas para produzir α-Gal A humana tem um exponente b para a equação de escala alométrica para remoção da circulação em humanos, Y=a(BW)^b, de pelo menos 0,85 (de preferência até 0,92), onde Y é a taxa de remoção de α-Gal A (ml/min), a é uma constante não-específica e BW é o peso do corpo. Tal preparação de α-Gal A, conforme aqui descrito, pode ser predominantemente absorvida pelos receptores de M6P e tem uma remoção do soro menos rápida do que aquela de α-Gal A humana produzida em células não-humanas, por exemplo, células de CHO. Desse modo, composições farmacêuticas e kits para tratamento de deficiências de α-Gal A descritas aqui incluem preparações de tal αGal A que são administradas em uma dose unitária substancialmente menor do que a que é atualmente usada na técnica. Por exemplo, em algumas modalidades, as preparações de α-Gal A descritas aqui são administradas em uma dose unitária entre 0,05 mg e 2,0 mg por quilograma de peso do corpo (mg/kg), de preferência entre 0,05 e 5 mg/kg, com mais preferência entre 0,05 e 0,3 mg/kg (por exemplo, cerca de 0,1, 0,2, 0,25, 0,3, 0,4 ou 0,5 mg/kg). A dose unitária pode ser, por exemplo, entre 0,1 x 10⁶ U/kg e 10 X 10⁶ U/kg. Em algumas modalidades, a dose unitária de preparação de α-Gal A é entre 0,1 X 10⁶ U/kg e 5 X 10⁶ U/kg, de preferência entre cerca de 0,1 X 10⁶ U/kg e 3 X 10⁶ U/kg. Em outras modalidades, as preparações de α-Gal A descritas aqui são administradas não mais do que uma vez a cada 7 dias, por

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24/73 exemplo, uma vez a cada 10 dias, 14 dias ou 21 dias, ou uma vez a cada 4, 5, 6, 7 ou 8 semanas. Para alguns pacientes, dosagem até mesmo menos frequente pode ser possível, por exemplo, uma vez a cada 9, 10, 11, 12 semanas ou mais.

[0068] É acreditado que a farmacocinética desejável resulte pelo menos em parte dos padrões de glicosilação da preparação de α-Gal A. Os padrões de glicosilação requeridos para a farmacocinética desejável de α-Gal A humana (por exemplo, pelo menos 50% de glicanos complexos por monômero de α-Gal A, em média; uma razão de ácido siálico para manose-6-fosfato (em uma base mol por mol) maior do que 1,5 para 1, de preferência maior do que 2 para 1, com mais preferência maior do que 3 para 1, com mais preferência maior do que 3,5 para 1 ou mais) podem ser atingidos através de vários métodos conhecidos na técnica. Certas modalidades representativas são resumidas e descritas em mais detalhes abaixo.

[0069] As preparações de α-Gal A descritas aqui podem ser produzidas em qualquer célula (uma célula de produção de α-Gal A) para o tratamento de doença de Fabry. Em algumas modalidades, as composições e métodos descritos aqui usam α-Gal A humana produzida usando técnicas de engenharia genética padrão (com base na introdução do gene ou cDNA de α-Gal A em uma célula hospedeiro), ou ativação de gene, descritas em mais detalhes abaixo. A α-Gal A humana pode ser produzida em células humanas, que provêem as modificações de carboidrato que são importantes para a atividade farmacocinética da enzima.

[0070] No entanto, α-Gal A humana pode ser também produzida em células não-humanas, por exemplo, células de CHO. Se a α-Gal A for produzida em células não-humanas, um ou mais de: a construção de expressão de α-Gal A, as células não-humanas ou a α-Gal A isolada das células não-humanas podem ser modificados, por exemplo,

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25/73 conforme descrito aqui abaixo, para prover preparações de α-Gal A tendo um perfil de glicosilação que resulta em propriedades farmacocinéticas desejáveis.

Células Adequadas para Produção de α-Gal A Humana [0071] α-Gal A humana purificada pode ser obtida de células cultivadas, de preferência células geneticamente modificadas, por exemplo, células humanas geneticamente modificadas ou outras células de mamíferos, por exemplo, células de CHO. Células de inseto podem ser também usadas.

[0072] Quando as células tiverem que ser geneticamente modificadas para os propósitos de tratamento de doença de Fabry, as células podem ser modificadas através de métodos de engenharia genética ou através de ativação de gene.

[0073] De acordo com métodos convencionais, uma molécula de DNA que contém um cDNA ou sequência de DNA genômico de α-Gal A pode estar contida dentro de uma construção de expressão e transfectada em células primárias, secundárias ou imortalizadas através de métodos padrão incluindo, mas não limitado a, transfecção mediada por -lipossoma, -polibreno ou -DEAE dextrano, eletroforação, precipitação de fosfato de cálcio, microinjeção ou microprojéteis dirigidos por velocidade (vide, por exemplo, Patente U.S. N° 6.048.729, incorporada aqui a título de referência).

[0074] Alternativamente, uma pessoa pode usar um sistema que libera a informação genética através do vetor viral. Vírus sabidos serem úteis para transferência de gene incluem adenovírus, vírus adeno associado, herpes vírus, vírus da caxumba, polovírus, retrovírus, vírus Sindbis e vírus vaccínia tal como vírus canary pox.

[0075] Alternativamente, as células podem ser modificadas usando uma abordagem de ativação de gene (GA), por exemplo, conforme descrito na Patente U.S. N° 5.641.670; Patente U.S. N° 5.733.761; PaPetição 870170056455, de 07/08/2017, pág. 32/126

26/73 tente U.S. N° 5.968.502; Patente U.S. N° 6.200.778; Patente U.S. N° 6.214.622; Patente U.S. N° 6.063.630; Patente U.S. N° 6.187.305; Patente U.S. N° 6.270.989; e Patente U.S. N° 6.242.218, cada uma aqui incorporada a título de referência. α-Gal A feita através de ativação de gene é referida aqui como GA-GAL (Selden e outros, Patentes U.S. N°s 6.083.725 e 6.458.574B1).

[0076] Desse modo, o termo geneticamente modificado conforme aqui usado na referência a células pretende compreender células que expressam um produto de gene particular seguindo introdução de uma molécula de DNA codificando o produto de gene e/ou incluindo elementos de regulagem que controlam a expressão de uma sequência de codificação para o produto de gene. A molécula de DNA pode ser introduzida através de direcionamento de gene ou recombinação homóloga, isto é, introdução da molécula de DNA em um local genômico particular. recombinação homóloga pode ser usada para substituir o próprio gene defeituoso (o gene de α-Gal A defeituoso ou uma porção dele poderia ser substituída nas células de um paciente com doença de Fabry com o gene integral ou uma porção dele).

[0077] Conforme aqui usado, o termo célula primária inclui células presentes em uma suspensão de células isoladas de uma fonte de tecido vertebrado (antes delas serem postas em placa, isto é, ligadas a um substrato de cultura de tecido tal como um disco ou frasco), células presentes em um explante derivado de tecido, ambos tipos anteriores de células postos em placa pela primeira vez e as suspensões celulares derivadas dessas células em placa.

[0078] Células secundárias referem-se a células em todas as etapas subsequentes em cultura. Isto é, a primeira vez que uma célula primária em placa é removida do substrato de cultura e novamente posta em placa (passada) é referida como uma célula secundária, como são as células em passagens subsequentes.

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27/73 [0079] Uma cepa de célula consiste em células secundárias que foram passadas uma ou mais vezes; exibem um número finito de duplicações de população médias em cultura; exibem as propriedades de crescimento dependente de ancoragem, inibido por contato (exceto pelas células propagadas em cultura de suspensão); e não são imortalizadas.

[0080] Por célula imortalizada ou tipo de célula contínuo se quer dizer uma célula de um tipo de célula estabelecido que exibe um tempo de vida aparentemente ilimitado em cultura.

[0081] Exemplos de células primárias ou secundárias incluem fibroblastos, células epiteliais incluindo células epiteliais mamárias e intestinais, células endoteliais, elementos formados no sangue incluindo linfócitos e células de medula óssea, células gliais, hepatócitos, queratinócitos, células musculares, células neurais, ou os precursores desses tipos celulares. Exemplos de tipos de célula humana imortalizados úteis nos presentes métodos incluem, mas não estão limitados a, células de Melanoma de Bowes (N° de acesso no ATCC CRL 9607), células Daudi (N° de acesso no ATCC CCL 213), células HeLa e derivados de células HeLa (N°s de Acesso no ATCC CCL2, CCL2,1 e CCL 2,2), células HL-60 (N° de acesso no ATCC CCL 240), células HT1080 (N° de acesso no ATCC CCL 121), células Jurkat (N° de acesso no TIB 152), células de carcinoma KB (N° de acesso no ATCC CCL 17), células de leucemia K-562 (N° de acesso no ATCC CCL 243), células de câncer de mama MCF-7 (N° de acesso no ATCC BTH 22), células MOLT-4 (N° de acesso no ATCC 1582), células Namalwa (N° de acesso no ATCC CRL 1432), células Raji (N° de acesso no ATCC CCL 86), células RPMI 8226 (N° de acesso no ATCC CCL 155), células U937 (N° de acesso no ATCC CRL 15 93), células 2R4 de subtipo WI-3 8VAI 3 (N° de acesso no ATCC CLL 75,1), células CCRF-CEM (N° de acesso no ATCC CCL 119) e células de carcinoma de ovário 2780AD

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28/73 (Van der Blick e outros, Cancer Res., 48:5927-5932, 1988), bem como células heteroibridomas produzidas através de fusão de células humanas e células de outra espécie.

[0082] Seguindo a modificação genética de células humanas para produzir uma célula que secreta α-Gal A, uma cepa de célula clonal consistindo essencialmente em uma pluralidade de células humanas primárias cultivadas geneticamente idênticas ou, onde as células forem imortalizadas, um tipo de célula clonal consistindo essencialmente em uma pluralidade de células humanas imortalizadas idênticas geneticamente modificadas, pode ser gerada. Em uma modalidade, as células da cepa de célula clonal ou tipo de célula clonal são fibroblastos. Em uma modalidade preferida, as células são fibroblastos humanos secundários, por exemplo, células BRS-11. O Exemplo 1 provê guia adicional sobre a produção de células geneticamente construídas para produzir α-Gal A humana.

[0083] Após modificação genética, as células são cultivadas sob condições que permitem a produção e secreção de α-Gal A. A proteína é isolada das células cultivadas através de coleta do meio onde as células são cultivadas e/ou lise das células para liberar seus conteúdos, e então aplicação de técnicas de purificação de proteína.

Meia-vida de Circulação Maior, Absorção Celular e/ou Direcionamento de α-Gal A para Tecidos Apropriados [0084] Os dados descritos aqui mostram que α-Gal A humana pode ser feita tendo modificações (por exemplo, modificações de carboidrato, fosfato ou sialilação) que resultam em propriedades farmacocinéticas da enzima que são desejáveis para uso em terapia de substituição de enzima para deficiência de α-Gal A. Um método de fabricação de tais preparações de α-Gal A humana é produzir α-Gal A humana a partir de células humanas.

[0085] Há diferenças nas características de glicosilação de células

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29/73 humanas e não-humanas (por exemplo, células de CHO) de modo que a produção de α-Gal A (ou na verdade, de qualquer glicoproteína) de células humanas necessariamente resulta em uma proteína estruturalmente diferente daquela produzida em células de CHO. Embora não ligado à teoria, essas diferenças são imaginadas serem importantes para a farmacocinética desejável de preparações de α-Gal A humana nas composições e métodos descritos aqui. No entanto, preparações de α-Gal A descritas aqui podem ser também produzidas a partir de células não-humanas, onde ou as células, a sequência de codificação de α-Gal A e/ou a α-Gal A purificada são modificadas. Por exemplo, células não-humanas cujo mecanismo de glicosilação difere do humano (por exemplo, células de CHO) podem ser geneticamente modificadas para expressar uma enzima de metabolismo de carboidrato, por exemplo, α-2,6-sialiltransferase, que está presente em humanos mas não em células de CHO.

[0086] Em um outro exemplo, as células podem ser geneticamente construídas para expressar uma proteína de α-Gal A que tem um ou mais locais de glicosilação modificados, por exemplo, uma célula humana ou não-humana pode ser geneticamente construída para expressar uma sequência de codificação de α-Gal A onde um ou mais locais de glicosilação ligados a N adicionais foram adicionados ou deletados. Os locais de glicosilação adicionais podem ser glicosilados através do mecanismo celular na célula, por exemplo, a célula de CHO, onde a sequência de codificação de α-Gal A modificada é expressa, desse modo provendo uma preparação de α-Gal A que tem uma meia-vida circulatória grande, absorção celular e/ou direcionamento aperfeiçoados para coração, rim ou outros tecidos apropriados comparados com a α-Gal A não-modificada, por exemplo, quando expressa em células não-humanas.

[0087] α-Gal A pode ser também modificada (por exemplo, após

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30/73 isolamento a partir de uma célula não-humana geneticamente construída) para lembrar α-Gal A produzida em células humanas. Por exemplo, uma preparação de α-Gal A humana isolada de uma célula nãohumana pode ser modificada, por exemplo, fosforilada ou clivada (por exemplo, neuraminidase ou fosfatase) antes da administração a um indivíduo.

[0088] A meia-vida de circulação, absorção celular e/ou direcionamento de tecido pode ser também modificada, inter alia, através de (i) modulação da fosforilação de α-Gal A; (ii) modulação do conteúdo de ácido siálico de α-Gal A; e/ou (iii) remoção sequencial do ácido siálico e resíduos de galactose terminais, ou remoção de resíduos de galactose terminais, nas cadeias oligossacarídeo em α-Gal A. Sialilação alterada de preparações de α-Gal A pode aumentar a meia-vida de circulação, absorção celular e/ou direcionamento a tecido de α-Gal A exógena. Uma mudança na razão de moles de manose-6-fosfato por mol de ácido siálico por molécula de α-Gal A pode também resultar em absorção celular aperfeiçoada, relativa àquela de hepatócitos, em nãohepatócitos tal como células endoteliais do fígado, células sinusoidais do fígado, células endoteliais capilares/vasculares, células epiteliais glomerulares renais (podócitos) e células mesangiais glomerulares, células endoteliais renais, células pulmonares, células renais, células neurais e/ou miócitos cardíacos. Por exemplo, uma razão preferida de ácido siálico para manose-6-fosfato na preparação de α-Gal A (em uma base mol por mol) é maior do que 1,5 para 1, de preferência maior do que 2 para 1, com mais preferência maior do que 3 para 1, com mais preferência maior do que 3,5 para 1 ou mais.

Remodelagem de Glicano [0089] Modificação de glicoproteína (por exemplo, quando α-Gal A é produzida em células não-humanas) pode aumentar a absorção da enzima em tecidos específicos outros que não o fígado e macrófago,

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31/73 por exemplo, absorção maior em células endoteliais capilares/vasculares, células epiteliais glomerulares renais (podócitos) e células mesangiais glomerulares, células endoteliais renais, células pulmonares, células renais, células neurais e/ou miócitos cardíacos. Usando métodos de modificação de glicoproteína, preparações de αGal A glicosilada podem ser obtidas, onde entre 35% e 85% dos oligossacarídeos, de preferência pelo menos 50%, são carregados.

[0090] A N-glicosilação de proteína funciona modificando os resíduos de asparagina apropriados de proteínas com estruturas de oligossacarídeo, desse modo influenciando suas propriedades e bioatividades (Kukuruzinska & Lennon, Crit. Rev. Oral. Biol. Med., 9:415-48 (1998)). Uma preparação de α-Gal A descrita aqui pode ter uma alta porcentagem dos oligossacarídeos sendo negativamente carregados, principalmente através da adição de um a quatro resíduos de ácido siálico em glicanos complexos, ou de uma a duas porções fosfato em glicanos com muita manose, ou de um fosfato simples e um ácido siálico simples em glicanos híbridos. Quantidades menores de glicanos complexos sulfatados podem estar presentes. Uma alta proporção de estruturas carregadas serve para duas funções principais. Primeiro, capeamento dos penúltimos resíduos de galactose em ácido siálico 2,3 ou 2,6 ligado previne a remoção prematura da circulação pelo receptor de asialoglicoproteína presente em hepatócitos. Este receptor reconhece glicoproteínas com resíduos galactose terminais.

[0091] Modificação do padrão de glicosilação de α-Gal A produzida em células não-humanas, por exemplo, lembra o padrão produzido em células humanas, dá a órgãos alvo importantes tal como coração e rim a oportunidade de endocitose de quantidades maiores de enzima do plasma seguindo a infusão de enzima. Segundo, a presença de Man-

6-fosfato em glicanos com muita manose ou híbridos provê uma oportunidade para absorção mediada por receptor pelo receptor de Man-6

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32/73 fosfato independente de cátion (CI-MPR). Esta absorção mediada por receptor acontece na superfície de muitas células, incluindo células endoteliais vasculares, que são um local de armazenamento principal de Gb3 em pacientes com Fabry. As moléculas de enzima com resíduos de Man-6-fosfato têm uma afinidade maior para CI-MPR do que aqueles com um Man-6-fosfato único.

[0092] A complexidade de N-glicosilação é aumentada pelo fato de que resíduos de asparagina diferentes dentro do mesmo polipeptídeo podem ser modificados com estruturas de oligossacarídeo diferentes, e várias proteínas são distinguidas umas das outras pelas características de suas porções de carboidrato.

[0093] Várias abordagens são providas aqui para remodelagem de carboidrato em uma proteína contendo cadeias de glicano N-ligadas. Primeiro, uma pessoa pode construir geneticamente uma célula, por exemplo, uma célula não-humana, para produzir uma α-Gal A humana tendo um local de glicosilação de ocorrência não-natural, por exemplo, uma pessoa pode construir uma sequência de codificação de α-Gal A para produzir uma proteína de α-Gal A tendo um ou mais locais de glicosilação adicionais. Os locais de glicosilação adicionais podem ser glicosilados (por exemplo, com glicanos complexos) através do mecanismo celular na célula, por exemplo, a célula de CHO, onde a sequência de codificação de α-Gal A modificada é expressa, desse modo provendo uma preparação de α-Gal A que tem meia-vida circulatória, absorção celular e/ou direcionamento de tecido aperfeiçoados comparado com α-Gal A não-modificada, por exemplo, quando expressa em células não-humanas.

[0094] Segundo, a proporção de α-Gal A carregada pode ser aumentada através de isolamento seletivo de glicoformas durante o processo de purificação. A presente invenção provê aumento da proporção de glicoformas de α-Gal A altamente carregada e de peso molecu

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33/73 lar mais alto através de fracionamento da espécie de α-Gal A em resinas de coluna de cromatografia e/ou após o processo de purificação. A espécie de glicoforma mais altamente carregada de α-Gal A contém mais ácido siálico e/ou mais fosfato, e as glicoformas de peso molecular mais alto também conteriam a espécie completamente glicosilada, mais altamente ramificada e altamente carregada. Seleção da espécie carregada, ou remoção da espécie não-glicosilada, pobremente glicosilada ou pobremente sialilada e/ou fosforilada resultaria em uma população de glicoformas de α-Gal A com mais ácido siálico e/ou uma razão de ácido siálico para fosfato mais desejável na preparação, desse modo provendo uma preparação de α-Gal A com melhor meia-vida, absorção celular e/ou direcionamento de tecido, desse modo tendo melhor eficiência terapêutica.

[0095] Este processo de fracionamento pode acontecer em, mas não está limitado a, resinas de coluna cromatográfica adequadas utilizadas para purificar ou isolar α-Gal A. Por exemplo, fracionamento pode acontecer em, mas não está limitado a, resinas de troca de cátion (tal como SP-SepharoseG), resinas de troca de ânion (QSepharoseG), resinas de afinidade (colunas de Heparina Sepharose-b, lecitina), colunas de exclusão de tamanho (Superdex 200) e colunas de interação hidrofóbicas (Butyl Sepharose) e outras resinas de coluna cromatográfica conhecidas na técnica.

[0096] Uma vez que α-Gal A é produzida em células como uma mistura heterogênea de glicoformas que diferem em peso molecular e carga, α-Gal A tende a eluir em picos relativamente grandes a partir das resinas cromatográficas. Dentro dessas eluições, as glicoformas são distribuídas de uma maneira particular dependendo da natureza da resina sendo utilizada. Por exemplo, em cromatografia de exclusão de tamanho, as glicoformas maiores vão tender a eluir mais cedo no perfil de eluição do que as glicoformas menores. Em cromatografia de

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34/73 troca de íon, as glicoformas mais negativamente carregadas vão tender a se ligar a uma resina positivamente carregada (tal como QSepharose) com afinidade maior do que as glicoformas menos negativamente carregadas, e vão então tender a eluir mais tarde no perfil de eluição. Em contraste, essas glicoformas mais altamente carregadas negativamente podem se ligar menos fortemente a uma resina negativamente carregada, tal como SP Sepharose8, do que a espécie menos negativamente carregada, ou podem não se ligar.

[0097] Fracionamento e seleção de glicoformas altamente carregadas e/ou de peso molecular mais alto de α-Gal A podem ser realizados em qualquer preparação de α-Gal A, tal como aquela derivada de células geneticamente modificadas tal como células, por exemplo, células humanas ou não-humanas, modificadas através de métodos de engenharia genética convencionais ou através de ativação de gene (GA). Eles podem ser realizados em tipos de célula cultivados em sistemas otimizados para prover sialilação e fosforilação alteradas conforme aqui descrito, por exemplo, para prover uma preparação com uma razão de ácido siálico para manose-6-fosfato (em uma base mol por mol) maior do que 1,5 para 1, de preferência maior do que 2 para 1, com mais preferência maior do que 3 para 1, com mais preferência maior do que 3,5 para 1 ou mais.

[0098] Uma terceira abordagem para remodelagem de carboidrato pode envolver modificação de certas glicoformas na α-Gal A purificada através de ligação de um resíduo de açúcar terminal adicional usando uma glicosil transferase purificada e o doador de açúcar de nucleotídeo apropriado. Este tratamento afeta apenas as glicoformas que têm um resíduo de açúcar terminal livre apropriado para agir como um aceitador para a glicosil transferase sendo usada. Por exemplo, α 2,6sialiltransferase adiciona ácido siálico em uma ligação α-2,6 ao aceitador Galp1,4GlcNAc-R terminal, usando CMP-ácido siálico como o doPetição 870170056455, de 07/08/2017, pág. 41/126

35/73 ador de açúcar de nucleotídeo. Enzimas comercialmente disponíveis e sua espécie de origem incluem: flucose α 1,3 transferase III, V e VI (humanos); Galactose α 1,3 transferase (porco); Galactose β 1,4 transferase (bovino); Manose α 1,2 transferase (levedura); α 2,3 transferase de ácido siálico (rato); e α 2,6 transferase de ácido siálico (rato). Após a reação estar completa, a glicosil transferase pode ser removida da mistura de reação através de uma coluna de afinidade específica de glicosil transferase consistindo no nucleotídeo apropriado ligado a um gel através de um espaçador de carbono 6 através de uma ligação pirofosfato (GDP, UDP) ou fosfato (CMP) ou através de outros métodos cromatográficos conhecidos na técnica. Das glicosil transferase listadas acima, a sialil transferase é particularmente útil para modificação de enzimas, tal como α-Gal A, para terapia de substituição de enzima em pacientes humanos. Uso ou de sialil transferase com CMP-ácido fluoresceinil-neuramínico como o doador de açúcar de nucleotídeo dá uma glicoproteína fluorescentemente marcada cuja absorção e localização no tecido podem ser imediatamente monitoradas.

[0099] Uma quarta abordagem para remodelagem de carboidrato envolve glico- construção, por exemplo, introdução de genes que afetam os mecanismos de glicosilação da célula, da célula de produção de α-Gal A para modificar o processamento pós-traducional no aparelho Golgi é uma abordagem preferida.

[00100] Uma quinta abordagem para remodelagem de carboidrato envolve tratamento de α-Gal A com glicosidases apropriadas para reduzir o número de glicoformas diferentes presentes. Por exemplo, tratamento sequencial de cadeias glicano complexas com neuraminidase, β-galactosidase e β-hexosaminidase cliva o oligossacarídeo para o núcleo de trimanose.

[00101] Uma sexta abordagem para remodelagem de glicano envolve o uso de inibidores de glicosilação, por exemplo, quifunensina

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36/73 (um inibidor de manosidase I), swainsonine ou similar. Tais inibidores podem ser adicionados às células cultivadas expressando uma α-Gal A humana. Esses inibidores são absorvidos nas células e inibem enzimas de glicosilação, tal como glicosil transferase e glicosidases, provendo moléculas de α-Gal A com estruturas de açúcar alteradas. Alternativamente, uma célula geneticamente construída para produzir αGal A humana pode ser transfectada com enzimas de glicosilação tal como glicosil transferase e glicosidases.

[00102] Uma sétima abordagem envolve uso de enzimas de glicosilação (por exemplo, glicosil transferase ou glicosidases) para remodelar as estruturas de carboidrato in vitro, por exemplo, em uma α-Gal A que foi isolada de uma célula geneticamente construída, conforme aqui descrito.

[00103] Outras abordagens para remodelagem de glicano são conhecidas na técnica.

Alteração de Meia-vida e/ou Absorção Celular de α-Gal através de Alteração de Sialilação [00104] A sialilação afeta a meia-vida circulatória e a biodistribuição de proteínas. Proteínas com ácido siálico mínimo ou nenhum são prontamente internalizadas pelo receptor de asialoglicoproteína (receptor Ashwell) em hepatócitos através de resíduos de galactose expostos na proteína. A meia-vida circulatória de α-Gal A terminada em galactose pode ser alterada através de sequencialmente (1) remoção de ácido siálico através de contato de α-Gal A com neuraminidase (sialidase), desse modo deixando as porções galactose terminais expostas, e (2) remoção dos resíduos de galactosídeo terminais através de contato da α-Gal A desialilada com β-galactosidase. A preparação de α-Gal A resultante tem um número reduzido de ácido siálico terminal e/ou resíduos de galactosídeo terminais nas cadeias oligossacarídeo comparado com preparações de α-Gal A não-sequencialmente

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37/73 contatadas com neuraminidase e β-galactosidase. Alternativamente, a meia-vida circulatória da α-Gal A terminada em galactose pode ser aumentada apenas removendo os resíduos de galactosídeo terminais através de contato da α-Gal A desialilada com β-galactosidase. A preparação de α-Gal A resultante tem um número reduzido de resíduos de galactosídeo terminais nas cadeias oligossacarídeo comparado com preparações de α-Gal A não contatadas com β-galactosidase. Em uma modalidade preferida, seguindo contato sequencial com neuraminidase e β-galactosidase, as preparações de α-Gal A resultantes são subsequentemente contatadas com β-hexosaminidase, desse modo clivando o oligossacarídeo para o núcleo trimanose.

[00105] O conteúdo de ácido siálico de preparações de α-Gal A pode ser aumentado através de (i) isolamento das glicoformas de α-Gal A altamente carregadas e/ou de peso molecular alto durante ou após o processo de purificação; (ii) adição dos resíduos de ácido siálico usando células geneticamente modificadas (ou através de métodos de engenharia genética convencionais ou ativação de gene) para expressar um gene ou cDNA de sialil transferase; ou (iii) fermentação ou crescimento de células expressando a enzima em um ambiente com pouco amônio.

Alteração da Meia-vida e/ou Absorção Celular através da Alteração de Fosforilação [00106] Alteração da fosforilação de uma preparação de α-Gal A descrita aqui pode alterar a meia-vida circulatória e a absorção celular da preparação em tecidos desejados. Em modalidades preferidas, uma preparação de α-Gal A tem menos do que 45% de glicanos fosforilados. Por exemplo, a preparação tem menos do que cerca de 35%, 30%, 25% ou 20% de glicanos fosforilados. Uma razão desejável de ácido siático:manose-6-fosfato na preparação de α-Gal A (em uma base mol por mol) é uma razão maior do que 1,5 para 1, de preferência

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38/73 maior do que 2 para 1, com mais preferência maior do que 3 para 1, com mais preferência maior do que 3,5 para 1 ou mais.

[00107] A fosforilação de preparações de α-Gal A pode ser modificada, por exemplo, aumentada ou diminuída, através de (i) adição ou remoção de resíduos de fosfato usando células geneticamente modificadas (ou através de métodos de engenharia genética convencionais ou ativação de gene) para expressar uma fosforil transferase ou gene ou cDNA de fosfatase; (ii) adição de fosfatases, cinases, ou seus inibidores a células cultivadas; ou (iii) adição de fosfatases, cinases ou seus inibidores a uma preparação de α-Gal A purificada produzida a partir de uma célula geneticamente construída conforme aqui descrito. [00108] As ações combinadas de duas enzimas de Golgi ligadas à membrana são necessárias para gerar um marcador de reconhecimento de Man-6-fosfato em uma pró-enzima lisossômica. A primeira, UDP-N acetilglucosamina; glicoproteína N-acetilglicosamina-1fosfotransferase (GIcNAc fosfotransferase), requer um determinante de reconhecimento de proteína em enzimas lisossômicas que consiste em dois resíduos de lisina 34 A separados e na relação espacial correta para uma cadeia de manose alta. A segunda, N-acetilglicosamina-1fosfodiéster a-N-acetilglicosaminidase (fosfodiéster α-GlcNAcase), hidrolisa a ligação α-GlcNAc-fosfato expondo o local de reconhecimento de Man-6-fosfato. As enzimas podem ser induzidas ou inibidas através de métodos conhecidos na técnica para prover uma preparação de αGal A com características de fosforilação (por exemplo, com uma razão desejável de glicanos sialilados para fosforilados).

[00109] Em uma modalidade, uma preparação de α-Gal A com fosforilação alterada é obtida primeiro introduzindo em uma célula de produção de α-Gal A um polinucleotídeo que codifica para fosforil transferase, ou através de introdução de uma sequência reguladora através de recombinação homóloga que regula a expressão de um gene de

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39/73 fosforil transferase endógeno. A célula de produção de α-Gal é então cultivada sob condições de cultura que resultam na expressão de αGal A e fosforil transferase. A preparação de α-Gal A com fosforilação maior comparada com a α-Gal A produzida em uma célula sem o polinucleotídeo é então isolada.

[00110] Em ainda uma outra modalidade, uma preparação de α-Gal A glicosilada com fosforilação alterada é obtida através da adição de um inibidor de fosfatase, por exemplo, bromotetramisol, ou inibidor de cinase, ou células cultivadas.

[00111] Usando os métodos descritos aqui, preparações de α-Gal A são obtidas, onde as doses abaixo dos níveis de saturação de remoção do soro ou plasma, remoção do soro da preparação de α-Gal A da circulação é de preferência menos do que 4 mL/min/kg na porção linear da AUC vs. curva de dose, com mais preferência menos do que cerca de 3,5, 3 ou 2,5 mL/min/kg, na porção linear da AUC vs. curva de dose. A preparação de α-Gal A tem um exponente b para a equação de escala alométrica para remoção da circulação em animais, Y = (BW)^b, de pelo menos 0,85, onde Y é remoção de α-Gal A da circulação (ml/min), a é uma constante não-específica e BW é peso do corpo. O exponente b é de preferência pelo menos 0,88, com mais preferência pelo menos 0,90, e com mais preferência pelo menos 0,92, 0,94 ou mais.

[00112] Em modalidades preferidas, uma preparação de α-Gal A descrita aqui é enriquecida em estruturas de glicano neutras, monosialiladas e di-sialiladas (combinadas) relativas a estruturas mais altamente sialiladas tal como estruturas tri-sialiladas e tetra-sialiladas. Por exemplo, uma preparação de α-Gal A preferida tem um ou mais de: (a) pelo menos cerca de 22% de glicanos neutros, por exemplo, pelo menos cerca de 25% ou 30% de glicanos neutros; (b) pelo menos cerca de 15%, 20% ou 25% de glicanos mono-sialilados; (c) pelo menos cer

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40/73 ca de 35%, de preferência pelo menos cerca de 40%, 45% ou 50% de glicanos neutros e mono-sialilados combinados; (d) pelo menos cerca de 75%, 76%, 78% ou mais glicanos neutros, mono- e di-sialilados; e (c) menos do que cerca de 35%, de preferência menos do que cerca de 25%, 20%, 18% ou cerca de 15% de estruturas glicano tri- e tetrasialilados combinadas.

[00113] Em modalidades preferidas, uma preparação de α-Gal A descrita aqui tem, em média, mais de um glicano complexo por monômero, de preferência pelo menos 50% de glicanos complexos por monômero, por exemplo, 2 glicanos complexos ou mais por monômero.

[00114] Em modalidades preferidas, uma preparação de α-Gal A descrita aqui tem pelo menos 5%, de preferência pelo menos 7%, 10% ou 15% de glicanos neutros.

[00115] Em modalidades preferidas, uma preparação de α-Gal A descrita aqui tem menos do que 45% de glicanos fosforilados. Por exemplo, a preparação tem menos do que cerca de 35%, 30%, 25% ou 20% de glicanos fosforilados.

[00116] Em modalidades preferidas, uma preparação de α-Gal A descrita aqui tem uma proporção total de glicanos sialilados maior do que cerca de 45%, por exemplo, maior do que 50% ou 55%.

[00117] Em uma modalidade preferida, a razão de ácido siálico para manose-6-fosfato na preparação de α-Gal A (em uma base mol por mol) é maior do que 1,5 para 1, de preferência maior do que 2 para 1, com mais preferência maior do que 3 para 1, com mais preferência maior do que 3,5 para 1 ou mais.

[00118] Em uma modalidade, a razão percentual de glicanos sialilados para glicanos fosforilados é maior do que 1, de preferência maior do que 1,5, com mais preferência maior do que 2, por exemplo, maior do que cerca de 2,5 ou 3.

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PEGuilação [00119] Em outras modalidades, a meia-vida circulatória de uma preparação de α-Gal A humana é aumentada através de complexação de α-Gal A com polietileno glicol (PEG). Em uma modalidade preferida, a preparação de α-Gal A é complexada usando PEG de monometóxi de tresila (TMPEG) para formar uma α-Gal A PEGuilada. A α-Gal A PEGuilada é então purificada para prover uma preparação de α-Gal A PEGuilada, isolada. PEGuilação de α-Gal A aumenta a meia-vida circulatória, absorção celular e/ou distribuição no tecido da proteína. Purificação de α-Gal A a partir do Meio Condicionado de Células Estavelmente Transfectadas [00120] α-Gal A pode ser purificada para quase homogeneidade a partir de cepas de célula cultivadas e/ou meio condicionado das cepas de célula cultivadas que foram estavelmente transfectadas para produzir a enzima. α-Gal A pode ser isolada de um meio contendo α-Gal A usando etapas cromatográficas. Por exemplo, 1 ou mais, por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou mais etapas cromatográficas podem ser usadas. As etapas diferentes de cromatografia utilizam vários princípios de separação que levam vantagem de propriedades físicas diferentes da enzima para separar α-Gal A de material contaminante. Por exemplo, as etapas podem incluir: cromatografia de interação hidrofógica em butil Sepharose, interação iônica em hidroxiapatita, cromatografia de troca de ânion em Q Sepharose e cromatografia de exclusão de tamanho em Superdex 200. Cromatografia de exclusão de tamanho pode servir como um meio eficaz para trocar a proteína purificada para um tampão compatível com a formulação.

[00121] Um processo de purificação pode incluir o uso de cromatografia butil sepharose® como uma primeira etapa em purificação. Outras resinas de interação hidrofóbicas, tal como Source Iso (Pharmacia), Macro-Prep® Methyl Support (Bio-Rad), TSK Butyl (Tosohaas) ou

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Phenyl Sepharose® (Pharmacia) podem ser também usadas. A coluna pode ser equilibrada em uma concentração relativamente alta de um sal, por exemplo, sulfato de amônio 1M ou cloreto de sódio 2M, por exemplo, em um tampão de pH 5,6. A amostra a ser purificada pode ser preparada ajustando o pH e a concentração de sal para aquelas do tampão equilibrado. A amostra é aplicada à coluna e a coluna é lavada com tampão de equilibração para remover material não-ligado. A α-Gal A é eluída a partir da coluna com um tampão de resistência iônica menor, água, ou solvente orgânico em água, por exemplo, etanol a 20% ou propileno glicol a 50%. Alternativamente, a α-Gal A pode ser feita para fluir através da coluna usando uma concentração menor de sal no tampão de equilibração e na amostra ou usando um pH diferente. Outras proteínas podem se ligar à coluna, resultando em purificação da amostra contendo α-Gal A que não se liga à coluna.

[00122] Uma etapa alternativa de purificação pode usar uma resina de tronca de cátion, por exemplo, SP Sepharose® 6 Fast Flow (Pharmacia), Source 30S (Pharmacia), CM Sepharose® Fast Flow (Pharmacia), Macro-Prep® CM Support (Bio-Rad) ou Macro-Prep® High S Support (Bio-Rad), para purificar α-Gal A. A primeira etapa de cromatografia é a primeira aplicação de uma amostra a uma coluna de cromatografia (todas as etapas associadas com a preparação da amostra são excluídas). A α-Gal A pode se ligar à coluna em pH de 4,4. Um tampão, tal como acetato de sódio 10 mM, pH 4,4, citrato de sódio 10 mM, pH 4,4, ou outro tampão com capacidade de tamponamento adequada em pH de aproximadamente 4,4, pode ser usado para equilibrar a coluna. A amostra a ser purificada é ajustada para o pH e resistência iônica do tampão de equilibração. A amostra é aplicada à coluna e a coluna é lavada após a carga para remover material não-ligado. Um sal, tal como cloreto de sódio ou cloreto de potássio, pode ser usado para eluir a α-Gal A a partir da coluna. Alternativamente, a α-Gal A po

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43/73 de ser eluída a partir da coluna com um tampão de pH maior ou uma combinação de concentração de sal maior e pH maior. A α-Gal A pode ser também feita para fluir através da coluna durante carregamento aumentando a concentração de sal no tampão de equilibração e na carga de amostra, ao operar a coluna em um pH mais alto, ou através de uma combinação de ambos mais sal e pH mais alto.

[00123] Uma outra etapa de purificação pode usar uma Q Sepharose® 6 Fast Flow para a purificação de α-Gal A. Q Sepharose® 6 Fast Flow é um resina de troca de ânion relativamente forte. Uma resina de troca de ânion mais fraca tal como DEAE Sepharose® 6 Fast Flow (Pharmacia) ou Macro-Prep® DEAB (Bio-Rad) pode ser também usada pra purificar α-Gal A. A coluna é equilibrada em um tampão, por exemplo, fosfato de sódio 10 mM, pH 6. O pH da amostra é ajustado para pH 6, e resistência iônica baixa é obtida através de diluição ou diafiltragem da amostra. A amostra é aplicada à coluna sob condições que ligam α-Gal A. A coluna é lavada com tampão de equilibração para remover material não-ligado. A α-Gal A é eluída com aplicação de sal, por exemplo, cloreto de sódio ou cloreto de potássio, ou aplicação de um tampão de pH menor, ou uma combinação de mais sal ou pH menor. A α-Gal A pode ser também feita para fluir através da coluna durante carregamento aumentando a concentração de sal na carga ou operando a coluna em um pH menor, ou através de uma combinação de ambos mais sal e pH menor.

[00124] Uma outra etapa de purificação pode usar uma cromatografia de exclusão de tamanho Superdex® 200 (Pharmacia) para purificação de α-Gal A. Outras resinas de cromatografia de exclusão de tamanho tal como Sephacryl® S-200 HR ou Bio-Gel® A-1,5 m podem ser também usadas para purificar α-Gal A. O tampão preferido para cromatografia de exclusão de tamanho é fosfato de sódio 25 mm, pH 6,0, contendo cloreto de sódio 0,15 M. Outros tampões compatíveis com a

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44/73 formulação podem ser usados, por exemplo, citrato de sódio ou potássio 10 mM. O pH do tampão pode estar entre pH 5 e pH 7 e deve conter um sal, por exemplo, cloreto de sódio ou uma mistura de cloreto de sódio e cloreto de potássio.

[00125] Uma outra etapa de purificação pode usar uma resina de cromatofocalização tal como Polybuffer Exchanger PBE 94 (Pharmacia) para purificar α-Gal A. A coluna é equilibrada em pH relativamente alto (por exemplo, pH 7 ou acima), o pH da amostra a ser purificada é ajustado para o mesmo pH, e a amostra é aplicada à coluna. Proteínas são eluídas com um gradiente de pH menor para pH tal como pH 4, usando um sistema de tampão, por exemplo, Polybuffer 74 (Pharmacia), que foi ajustado para pH 4.

[00126] Alternativamente, cromatografia de imunoafinidade pode ser usada para purificar α-Gal A. Um anticorpo policlonal ou monoclonal apropriado para α-Gal A (gerado através de imunização com α-Gal A ou com um peptídeo derivado da sequência de α-Gal A usando técnicas padrão) pode ser imobilizado em uma resina de acoplamento ativada, por exemplo, Sepharose® 4 Fast Flow ativada com NHS (Pharmacia) ou Sepharose® 4 Fast Flow ativada com CNBr (Pharmacia). A amostra a ser purificada pode ser aplicada ao anticorpo imobilizado em pH de cerca de 6 ou pH 7. A coluna é lavada para remover material não-ligado. α-Gal A é eluída da coluna com reagentes típicos utilizados para eluição de coluna de afinidade tal como pH baixo, por exemplo, pH 3, desnaturante, por exemplo, HCl de guanidina ou tiocianato, ou solvente orgânico, por exemplo, propileno glicol a 50% em um tampão de pH 6. O procedimento de purificação pode também usar uma resina de afinidade de quelato de metal, por exemplo, Chelating Sepharose® Fast Flow (Pharmacia), para purificar α-Gal A. A coluna é pré-carregada com íons de metal, por exemplo, Cu⁺², Zn⁺², Ca⁺², Mg⁺² ou Cd⁺². A amostra a ser purificada é aplicada à coluna em um pH

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45/73 apropriado, por exemplo, pH 6 a 7,5, e a coluna é lavada para remover proteínas não-ligadas. As proteínas ligadas são eluídas através de eluição competitiva com imidazol ou histidina ou diminuindo o pH usando citrato de sódio ou acetato de sódio para um pH de menos do que 6, ou introduzindo agentes de quelação, tal como EDTA ou EGTA. Dosagens para Administração de Preparação de α-Gal A [00127] As preparações de α-Gal A descritas aqui exibem uma meia-vida circulatória e distribuição em tecido desejáveis, por exemplo, para células endoteliais capilares, células epiteliais glomerulares renais (podócitos) e células mesangiais glomerulares e/ou miócitos cardíacos. Tais preparações podem ser administradas em doses relativamente baixas. Por exemplo, a dose unitária de administração pode estar entre 0,05-2,0 mg por quilograma de peso do corpo (mg/kg). Por exemplo, a dose unitária pode estar entre 0,05 e 1,0 mg, entre 0,5 e 0,5 mg/kg ou entre 0,5 e 0,3 mg/kg. As doses unitárias entre 0,05 e 0,29 mg/kg são preferidas, por exemplo, uma dose unitária de cerca de 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25 mg/kg. Supondo que uma atividade específica da preparação de α-Gal A entre 2 e 4,5 x 10⁶ U/mg, esses valores correspondem a cerca de 0,1 x 10⁶ a 1,3 x 10⁶ U/kg. Uma dose unitária preferida satura a absorção pelo fígado da α-Gal A.

[00128] Doses regularmente repetidas da proteína são necessárias durante um período de tempo, por exemplo, por um período de vários meses ou 1, 2, 3 anos ou mais, mesmo durante a vida do paciente. No entanto, a meia-vida circulatória e distribuição no tecido desejáveis das preparações de α-Gal A descritas aqui permitem a administração da dose unitária a um paciente em intervalos relativamente longos. Por exemplo, uma dose unitária pode ser administrada não mais do que uma vez a cada 7 dias, 10 dias, 14 dias, 21 dias, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas, 10 semanas ou 12 semanas. Uma frequência de dosagem preferida é bissemanalmente, mensalmente ou bimensalmente.

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46/73 [00129] Durante o tempo de terapia, um paciente pode ser monitorado clinicamente para avaliar o estado da doença dele ou dela. Melhora clínica medida através de, por exemplo, melhora na função renal ou cardíaca ou bem-estar geral do paciente (por exemplo, dor), e melhora de laboratório medida através de, por exemplo, reduções dos níveis de Gb₃ na urina, plasma ou tecido, pode ser usada para avaliar o estado de saúde do paciente. No caso de melhora clínica ser observada após um período de tratamento e monitoramento, a frequência de administração de α-Gal A pode ser reduzida. Por exemplo, um paciente recebendo injeções semanais de preparação de α-Gal A pode trocar para administração bissemanalmente; um paciente recebendo injeções bissemanalmente de uma preparação de α-Gal A pode trocar para administração mensalmente; um paciente recebendo injeções mensais de uma preparação de α-Gal A pode trocar para injeções bimensalmente. Seguindo tal troca na frequência de dosagem, o paciente deve ser monitorado por um outro período de tempo, por exemplo, vários anos, por exemplo, um período de três anos, a fim de avaliar as medições clínicas e de laboratório relacionadas à doença de Fabry. Em uma modalidade preferida, a dose administrada não muda se uma mudança na frequência de dosagem for feita. Isso assegura que certos parâmetros farmacocinéticos (por exemplo, concentração no plasma máxima [C_max], tempo para concentração no plasma máxima [t_max], plasma, meia-vida [t1/2] e exposição conforme medido através da área sob a curva [AUC]) permaneçam relativamente constantes seguindo cada dose administrada. Manutenção desses parâmetros farmacocinéticos vai resultar em níveis relativamente constantes de absorção mediada por receptor de α-Gal A nos tecidos com mudança das frequências de dose.

[00130] Em algumas modalidades, um paciente é clinicamente avaliado entre as doses e uma determinação pode ser feita quando da

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47/73 avaliação sobre o momento oportuno da próxima dose.

[00131] Injeções subcutâneas podem ser usadas para manter exposição a prazo mais longo à droga. Doses das preparações de α-Gal A que são administradas através de injeções intramusculares podem ser iguais ou diferentes daquelas injetadas subcutaneamente. Em uma modalidade preferida, dosagens intramusculares são menores e administradas com menos frequência. A preparação de α-Gal A é de preferência administrada intravenosamente, por exemplo, em uma injeção de bolo intravenosa, em uma injeção intravenosa de pressionamento lento ou através de injeção intravenosa contínua. Infusão IV contínua (por exemplo, mais de 2-6 horas) permite a manutenção de níveis específicos no sangue.

[00132] Um paciente com variante atípica de doença de Fabry, por exemplo, exibindo anormalidades predominantemente cardiovasculares ou envolvimentos renais, pode ser tratado com esses mesmos regimes de dosagem conforme aqui descrito. A dose é ajustada conforme necessário. Por exemplo, um paciente com o fenótipo de variante cardíaca que é tratado com uma terapia de substituição de enzima αGal A terá uma mudança na composição de seu coração e função cardíaca melhorada seguindo a terapia. Esta mudança pode ser medida com ecocardiografia padrão que é capaz de detectar espessura da parede ventricular esquerda maior em pacientes com doença de Fabry (Goldman e outros, J. Am. Coll. Cardiol., 7:1157-1161 (1986)). Medições ecocardiográficas seriais da espessura da parede ventricular esquerda podem ser conduzidas durante a terapia, e uma diminuição no tamanho da parede ventricular é indicativa de uma resposta terapêutica. Pacientes sofrendo terapia de substituição da enzima α-Gal A podem ser também seguidos com imagem de ressonância magnética cardíaca (MRI). MRI tem a capacidade de avaliar a composição relativa de um dado tecido. Por exemplo, MRI cardíaca em pacientes com

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48/73 doença de Fabry revela lipídeo depositado dentro do miocárdio comparado com pacientes de controle (Matsui e outros, Ani. Heart. J., 117:472-474 (1989)). Avaliações de MRI cardíacas em série em um paciente sofrendo terapia de substituição de enzima podem revelar uma mudança na deposição de lipídeo dentro do coração de um paciente. Pacientes com o fenótipo variante podem também ter benefício de uma terapia de substituição de enzima α-Gal A.

[00133] O efeito de terapia pode ser medido através de testes padrão de função renal, tal como nível de proteína na urina de 24, remoção de creatinina e taxa de filtragem glomerular.

Composições Farmacêuticas [00134] As preparações de α-Gal A descritas aqui são substancialmente livres de proteínas não-a-Gal A, tal como albumina, proteínas não-a-Gal A produzidas pela célula hospedeiro, ou proteínas isoladas de tecido ou fluido animal. A preparação compreende de preferência parte de uma suspensão ou solução de fluido aquosa ou fisiologicamente compatível. O carreador ou veículo é fisiologicamente compatível de modo que, em adição à aplicação da preparação desejada ao paciente, ele não afeta de modo adverso o equilíbrio de eletrólito e/ou volume do paciente. Soluções úteis para administração parenteral podem ser preparadas através de qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica farmacêutica (vide, por exemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Gennaro, A., Ed. Mack Pub., 1990).

[00135] Formulações não-parenterais, tal como formulações supositório e orais, podem ser também usadas. De preferência, a formulação contém um excipiente. Excipientes farmaceuticamente aceitáveis para α-Gal A que podem ser incluídos na formulação são tampões tal como tampão de citrato, tampão de fosfato, tampão de acetato, e tampão de bicarbonato, aminoácidos, uréia, álcoois, ácido ascórbico, fosfolipídeos; proteínas, tal como albumina do soro, colágeno e gelatina; sais

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49/73 tal como EDTA ou EGTA e cloreto de sódio; lipossomas; polivinilpirrolidona; açúcares, tal como dextrano, manitol, sorbitol e glicerol; propileno glicol e polietileno glicol (PEG); glicerol; glicina ou outros aminoácidos; e lipídeos. Excipientes preferidos incluem manitol, sorbitol, glicerol, aminoácidos, lipídeos, EDTA, EGTA, cloreto de sódio, polietileno glicol, polivinilpirrolidona, dextrano ou combinações de qualquer um desses excipientes.

[00136] Em uma outra modalidade, a formulação compreende ainda um detergente não-iônico. Detergentes não-iônicos preferidos incluem Polysorbato 20, Polysorbato 80, Triton X-100®, Triton X-114®, Nonidet P-40®, Octil α-glicosídeo, Octil β-glicosideo, Brij 35, Pluroni®, Poloxamer 188 (a.k.a. Poloxalkol) e Tween 20®. Em uma modalidade preferida, o detergente não-iônico compreende Polysorbato 20 ou Polysorbato 80.

[00137] Uma formulação preferida compreende ainda solução salina tamponada com fosfato, por exemplo, em pH 6. Sistemas de tampão para uso com preparações de α-Gal A incluem tampões de citrato; acetato; bicarbonato; e fosfato (todos disponíveis da Sigma). Tampão de fosfato é uma modalidade preferida. Uma faixa de pH preferida para preparações de α-Gal A é pH 4,5-7,4.

[00138] Para liofilização de preparações de α-Gal A, a concentração de proteína pode ser 0,1-10 mg/mL. Agentes de massa, tal como glicina, manitol, albumina e dextrano, podem ser adicionados à mistura de liofilização. Ainda, crioprotetores possíveis, tal como dissacarídeos, aminoácidos e PEG, podem ser adicionados à mistura de liofilização. Qualquer um dos tampões, excipientes e detergentes listados acima pode ser também adicionado.

[00139] Formulações para administração podem incluir glicerol e outras composições de alta viscosidade para ajudar a manter o agente no local desejado. Polímeros biocompatíveis, de preferência polímeros

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50/73 biorressorvíveis, biocompatíveis (incluindo, por exemplo, polímeros de ácido hialurônico, colágeno, polibutirato, lactídeo e glicolídeo e copolímeros de lactídeo/glicolídeo) podem ser excipientes úteis para controlar a liberação do agente in vivo. Formulações para administração parenteral podem incluir glicocolato para administração bucal, metoxisalicilato para administração retal ou ácido cutnico para administração vaginal. Supositórios para administração retal podem ser preparados através de mistura de uma preparação de α-Gal A da invenção com um excipiente não-irritante tal como manteiga de cacau ou outras composições que são sólidas em temperatura ambiente e líquidas em temperaturas corporais.

[00140] Formulações para administração através de inalação podem conter lactose ou outros excipientes, ou podem ser soluções aquosas que podem conter polioxietileno-9-lauril éter, glicocolato ou desoxicocolato. Um aerossol de inalação preferido é caracterizado por ter partículas de densidade de massa pequena e tamanho grande. Partículas com densidades de massa de menos do que 0,4 grama por centímetro cúbico e diâmetro médio excedendo 5 pm eficientemente liberam terapêuticos inalados na circulação sistêmica. Tais partículas são inspiradas fundo nos pulmões e escapam dos mecanismos de remoção naturais dos pulmões até que as partículas inaladas liberem sua carga terapêutica. (Edwards e outros, Science, 276:1868-1872 (1997)). Preparações de α-Gal A da presente invenção podem ser administradas em forma aerossolizada, por exemplo, usando métodos de preparação e formulações conforme descrito nas Patentes U.S. N°s 5.654.007, 5.780.014 e 5.814.607, cada uma aqui incorporada a título de referência.

[00141] Formulação para administração intranasal pode incluir soluções oleosas para administração na forma de gotas nasais, ou como gel a ser aplicado intranasalmente.

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51/73 [00142] Formulações para administração tópica à superfície da pele podem ser preparadas dispersando a preparação de α-Gal A com um carreador dermatologicamente aceitável tal como uma loção, unguento ou sabão. Particularmente úteis são carreadores capazes de formação de uma película ou camada sobre a pele para localizar a aplicação e inibição remoção. Para administração tópica a superfícies de tecido interno, a preparação de α-Gal A pode ser dispersa em um adesivo de tecido líquido ou outra substâncias sabida aumentar a adsorção a uma superfície de tecido. Por exemplo, vários adesivos de mucosa e comprimidos bucais foram descritos para aplicação de droga transmucosal, tal como nas Patentes 4.740.365, 4.764.378 e 5.780.045, cada uma aqui incorporada a título de referência, [00143] Soluções de hidroxipropilcelulose ou fibrinogênio/trombina podem ser também incorporadas. Alternativamente, soluções de revestimento de tecido, tal como formulações contendo pectina, podem ser usadas.

[00144] As preparações da invenção podem ser providas em recipientes adequados para manutenção da esterilidade, proteção da atividade dos ingredientes ativos durante distribuição e armazenamento apropriados, e provisão de acessibilidade conveniente e eficaz da preparação para administração a um paciente. Uma formulação injetável de um preparação de α-Gal A pode ser fornecida em um frasco tampado adequado para retirada dos conteúdos usando uma agulha ou seringa. O frasco deve ser pretendido ou para uso único ou usos múltiplos. A preparação pode ser também fornecida como uma seringa pré-enchida. Em alguns casos, os conteúdos seriam fornecidos em formulação líquida, enquanto em outros eles seriam fornecidos em um estado seco ou liofilizado, que em alguns casos poderia requere reconstituição com diluente padrão ou um fornecido para um estado líquido. Onde a preparação é fornecida como um líquido para adminisPetição 870170056455, de 07/08/2017, pág. 58/126

52/73 tração intravenosa, ela seria provida em uma bolsa ou recipiente estéril adequado para conexão a uma linha ou cateter de administração intravenosa. Em modalidades preferidas, as preparações da invenção são fornecidas em formulações líquidas ou em pó em dispositivos que convenientemente administram uma dose predeterminada da preparação; exemplos de tais dispositivos incluem um injetor sem agulha para injeção subcutânea ou intramuscular, e um dispositivo de aplicação aerossol medido. Em outros casos, a preparação pode ser fornecida em uma forma adequada para liberação prolongada, tal como em um emplastro ou curativo a ser aplicado à pele para administração transdermal, ou através de dispositivos erodíveis para administração transmucosal. Em casos onde a preparação é oralmente administrada na forma de comprimido ou pílula, a preparação seria fornecida em uma garrafa com uma cobertura removível. Os recipientes podem ser rotulados com informação tal como o tipo de preparação, o nome do fabricante ou distribuidor, a indicação, a dose sugerida, instruções para armazenamento apropriado ou instruções para administração.

Métodos de Administração de Preparação de α-Gal A [00145] As preparações de α-Gal A descritas aqui podem ser administradas através de qualquer via que seja compatível com a preparação de α-Gal A. A preparação de α-Gal A purificada pode ser administrada a indivíduos que produzem proteína α-Gal A insuficiente ou defeituosa ou que podem ter benefício da terapia de α-Gal A. Preparações terapêuticas da presente invenção pode ser providas a um indivíduo através de qualquer meio adequado, diretamente (por exemplo, localmente, como através de injeção, implante ou administração tópica a um local de tecido) ou sistemicamente (por exemplo, oralmente ou parenteralmente).

[00146] A via de administração preferida é intravenosa. Outras vias de administração podem ser oral ou parenteral, incluindo subcutânea,

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53/73 intra-arterial, intraperitoneal, oftálmica, intramuscular, bucal, retal, vaginal, intraorbital, intracerebral, intradermal, intracraniana, intraespinhal, intraventricular, intratecal, intracistemal, intracapsular, intrapulmonar, intranasal, transmucosal, transdermal ou através de inalação. Métodos de aplicação intrapulmonar, aparelhos e preparação de droga são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. N°s 5.785.049, 5.780.019 e 5.775.320, cada uma aqui incorporada a título de referência. Um método preferido de aplicação intradermal é através de aplicação intraforética através de emplastros; um exemplo de tal aplicação é ensinado na Patente U.S. N° 5.843.015, que é aqui incorporada a título de referência.

[00147] Uma via de administração particularmente útil é através de injeção subcutânea. Uma preparação de α-Gal A da presente invenção é formulada de modo que a dose requerida total pode ser administrada em uma injeção única de um a dois mililitros. A fim de permitir um volume de injeção de um a dois mililitros, uma preparação de α-Gal A da presente invenção pode ser formulada em uma concentração onde a dose preferida é aplicada em um volume de um a dois mililitros, ou a preparação de α-Gal A pode ser formulada em uma forma liofilizada, que é reconstituída em água ou um tampão fisiologicamente compatível antes da administração. Injeções subcutâneas de preparações de α-Gal A têm as vantagens de serem convenientes para o paciente, em particular permitindo auto-administração, enquanto também resultando em uma meia-vida prolongada no plasma conforme comparado com, por exemplo, administração intravenosa. Uma prolongação da meiavida no plasma resulta na manutenção dos níveis de α-Gal A no plasma eficazes durante de períodos de tempo mais longos, cujo benefício é aumentar a exposição dos tecidos clinicamente afetados à α-Gal A e, como resultado, pode aumentar a absorção de α-Gal A em tais tecidos. Isso permite um efeito mais benéfico ao paciente e/ou redução na

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54/73 frequência de administração. Ainda, uma variedade de dispositivos projetados para conveniência do paciente, tal como canetas de injeção recarregáveis e dispositivos de injeção sem agulha, pode ser usada com as preparações de α-Gal A da presente invenção conforme aqui discutido.

[00148] A administração pode ser através de injeções periódicas de um bolo da preparação, ou pode ser administrada através de administração intravenosa ou intraperitoneal a partir de um reservatório que é externo (por exemplo, uma bolsa IV) ou interno (por exemplo, um implante biodegradável, um órgão bioartificial ou uma população de células de produção de α-Gal A implantadas). Vide, por exemplo, Patentes U.S. N°s 4.407.957 e 5.798.113, cada uma aqui incorporada a título de referência. Métodos e aparelhos de aplicação intrapulmonar são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. N°s 5.645.007, 5.780.014 e 5.814.607, cada uma aqui incorporada a título de referência. Outros sistemas de aplicação parenteral úteis incluem partículas de copolímero de etileno-acetato de vinila, bombas osmóticas, sistemas de infusão implantáveis, aplicação de bomba, aplicação de célula encapsulada, aplicação de lipossoma, injeção aplicada com agulha, injeção sem agulha, nebulizador, aerossolizador, eletroforação e emplastro transdérmico. Dispositivos injetores sem agulha são descritos nas Patentes U.S. N°s 5.879.327; 5.520.639; 5.846.233 e 5.704.911, cujas especificações são aqui incorporadas a título de referência. Qualquer uma das preparações de α-Gal A descritas acima pode ser administrada nesses métodos.

[00149] A via de administração e a quantidade de proteína aplicada podem ser determinadas através de fatores que estão dentro da habilidade dos versados na técnica em avaliar. Ainda, os versados na técnica têm consciência de que a via de administração e dosagem de uma proteína terapêutica podem ser variadas para um dado paciente

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55/73 até que um nível de dosagem terapêutico seja obtido. [00150] Todas as patentes e publicações citadas neste pedido são incorporadas aqui a título de referência.

Exemplos

Exemplo 1: Preparação e Uso de Construções Produzidas para Aplicar e Expressar α-Gal A

1.1 Preparação de α-Gal A Ativada com Gene (GA-GAL) [00151] Produção de α-Gal A ativada com gene (GA-GAL) que acontece através de inserção de sequências de DNA reguladoras e estruturais a montante da sequência de codificação de α-Gal A humana, usando a tecnologia de GA substancialmente conforme descrito na Patente U.S. N° 5.773.761, aqui incorporada a título de referência. A inserção precisa da sequência de ativação de gene acontece como um resultado de recombinação homóloga entre DNA presente em um fragmento de DNA transfectado e sequências de DNA genômico a montante do local de α-Gal A em uma célula humana. A própria sequência de ativação de gene contém sequência de codificação de α-Gal A até, mas não incluindo, o local de clivagem de peptídeo de sinal. Células contendo um local de α-Gal A ativada foram isoladas e submetidas à seleção de droga para isolar células com produção de GA-GAL maior. [00152] Um fragmento de DNA alvo contendo uma sequência de ativação de gene apropriada foi introduzido em tipos de célula humana hospedeiro através de eletroforação. Um de tal tipo de célula é HT1080, um tipo de célula certificado disponível da ATCC (Manassas, VA). O plasmídeo de ativação de gene (construção alvo) pGA213C contendo tal fragmento de DNA é mostrado na Figura 3A. Este plasmídeo contém sequências produzidas para ativar uma porção do local de α-Gal A endógeno no tipo de célula hospedeiro, e contém sequências codificando o peptídeo de sinal, mas não α-Gal A humana. Uma construção alvo também contém cassetes de expressão para os genes

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56/73 neo bacteriano e dhfr de camundongo. Esses permitem a seleção de fragmentos alvo estavelmente integrados (através do gene neo) e para seleção subsequente do gene dhfr usando seleção de metotrexato em etapas (MTX).

[00153] Ainda, pGA213C contém sequências produzidas para direcionar sequências cromossômicas a montante do local de α-Gal A endógena através de recombinação homóloga. Recombinação homóloga entre o local de α-Gal A endógena e o fragmento de DNA de 9,6 kb de pGA213C é mostrada na Figura 3B.

[00154] pGA213C foi construído para deletar 962 pb de sequências genômicas se estendendo das posições -1183 a -222 relativas ao códon de iniciação de metionina de α-Gal A, quando da recombinação homóloga do fragmento de pGA213C com local de α-Gal A cromossômica X. Ativação transcripcional do local de α-Gal A acontece através de direcionamento preciso das sequências de regulagem exógenas a montante da região de codificação de α-Gal A. O local de GAGAL resultante causa a transcrição para iniciar a partir do promotor CMV e para prosseguir através do éxon 1 de CMV, o íntron de aldolase e os sete éxons e seis íntrons da sequência de codificação de αGal A. Junção do mRNA de precursor grande une o éxon de CMV exógeno (inserido através de direcionamento) com o primeiro éxon completamente endógeno do transcrito de α-Gal. Tradução do mRNA de GA-GAL resulta em pré-GA-GAL com um peptídeo de sinal de trinta e um aminoácidos. Quando da secreção a partir da célula hospedeiro, o peptídeo de sinal é removido. Os tipos de célula corretamente direcionados são primeiro identificados através de avaliação de reação de cadeia de polimerase quanto à presença do mRNA de GA-GAL. Clones produzindo o mRNA de GA-GAL são também verificados secretar α-Gal A enzimaticamente ativa no meio de cultura. Confirmação subsequente de casos de direcionamento é realizada através de digestão

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57/73 de enzima de restrição e análise de hibridização Southern blot de DNA genômico.

[00155] As células foram expostas à seleção de metotrexato (MTX) em etapas. Seguindo seleção em 0,05 pM de MTX, um clone de células foi isolado e submetido à seleção com 0,1 pM de MTX. A partir deste processo, um grupo de células resistente a 0,1 pm de MTX foi isolado (tipo de célula RAG001) e expandido em cultura.

1.2 Preparação de Outras Construções para Expressar αGal A [00156] Dois outros plasmídeos de expressão, pXAG-16 e pXAG28, foram construídos. Esses plasmídeos contêm cDNA de α-Gal A humana codificando os 398 aminoácidos da enzima α-Gal A (sem o peptídeo de sinal de α-Gal A); a sequência de DNA genômico de peptídeo de sinal (hGh) hon-none de crescimento humano, que é interrompida pelo primeiro íntron do gene de hGh; e a sequência nãotraduzida (UTS) do gene de hGH, que contém um sinal para poliadenilação. O plasmídeo pXAG-16 tem o promotor imediato-precoce de citomegalovírus (CMV IE) humano e primeiro íntron (flanqueado pelas sequências de éxon de não-codificação), enquanto que pXAG-28 é dirigido pelo promotor ta2 de colágeno e éxon 1, e também contém a 5'UTS de genes de β-actina, que contém o primeiro íntron do gene de β-actina.

[00157] A fim de expressar α-Gal A em fibroblastos, fibroblastos secundários foram cultivados e transfectados de acordo com procedimentos publicados (Selden e outros, Wo 93/09222). Os plasmídeos pXAG-13, pXAG-16 e pXAG-28 foram transfectados através de eletroforação em fibroblastos de foresquina humanos para gerar cepas de célula clonais estavelmente transfectadas, e os níveis de expressão de α-Gal A resultantes foram monitorados. A secreção de α-Gal A através de fibroblastos de foresquina normais está na faixa de 2-10 unida

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58/73 des/10⁶ células/24 horas. Em contraste, os fibroblastos transfectados mostraram níveis de expressão médios conforme mostrado na tabela abaixo.

Níveis de Expressão de α-Gal A Médios (desvio ± padrão) pXAG-13: 420 ± 344 U/10⁶ células/dia

N=26 cepas clonais (faixa 3-1133 U/10⁶ células/dia) pXAG-16: 2,051 ± 1253 U/10⁶ células/dia

N=24 cepas clonais (faixa 422-5200 U/10⁶ células/dia) pXAG-28: 141 ± 131 U/10⁶ células/dia

N=38 cepas clonais (faixa 20-616 U/10⁶ células/dia) [00158] Esses dados mostram que todos as construções de expressão são capazes de aumentar a expressão de α-Gal A muitas vezes aquela de fibroblastos não-transfectados. Expressão através de fibroblastos estavelmente transfectados com pXAG-13, que codifica αGal A ligada ao peptídeo de sinal de α-Gal A, foi substancialmente menor do que a expressão por fibroblastos transfectados com pXAG16, que difere apenas que o peptídeo de sinal é o peptídeo de sinal de hGH, cuja sequência de codificação é interrompida pelo primeiro íntron do gene de hGH.

[00159] Cepas de célula adequadas para terapia de gene ou para uso na geração de material para purificação de α-Gal A devem mostrar crescimento e expressão estáveis em várias passagens. Dados de cepas de célula que foram substancialmente transfectadas com a construção de expressão de α-Gal A mostraram que a expressão de α-Gal A é estavelmente mantida durante passagem serial.

Exemplo 2: Comparação Estrutural de α-Gal A produzida em células humanas vs. células de CHO

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59/73 [00160] Este exemplo compara a estrutura de Replagal®, uma preparação de α-Gal A produzida em células humanas vs. Fabrazyme e preparação de α-Gal A produzida em células de CHO. As preparações foram comparadas com relação ao ponto isoelétrico, peso molecular, e perfil de carboidrato, fosforilação e sialilação.

Ponto Isoelétrico [00161] Replagal® e Fabrazyme® foram analisados através de focalização isoelétrica de desnaturação (géis 5%, faixa de pH 3 a 7, uréia 6M) seguido por Western blotting. As preparações foram também analisadas através de focalização isoelétrica nativa (Novex géis a 5%, pH na faixa de 3 a 7) seguido por tingimento com Coomassie Blue. A faixa de pI geral das 2 preparações era similar, embora as intensidades relativas dos padrões de faixa fossem diferentes. Isso indica que as glicoformas presentes em cada preparação diferem na distribuição de carga, com Fabrazyme® contendo uma proporção maior de glicoformas de pI menor (mais negativamente carregada) do que Replagal®.

Peso Molecular [00162] Replagal® e Fabrazyme® foram analisados através de SDS-PAGE (8-16% de gel de poliacrilamida, amostras reduzidas) seguido por tingimento com Coomassie Blue. Os pesos moleculares das preparações eram similares. No entanto, a glicoforma menor (aproximadamente 45 kD) de Fabrazyme® é mais distinta comparada com aquela de Replagal®, enquanto Replagal® exige uma distribuição de tamanho mais ampla.

[00163] Na Figura 6, as massas moleculares de Replagal® (parte superior) e Fabrazyme® (parte inferior) foram determinadas através de espectroscopia de massa MALDI-TOF. O máximo do pico mais amplo é a 50.755 e 50.705 Da, respectivamente, de acordo com o peso molecular esperado do monômero glicosilado. Um ressalto guia em aproPetição 870170056455, de 07/08/2017, pág. 66/126

60/73 ximadamente 48.071 Da e 47.667 Da está presente, representando as glicoformas de peso molecular menores para Replagal® e Fabrazyme®, respectivamente. O ressalto guia, correspondendo às glicoformas de peso molecular menor, é muito mais distinto no espectro de Fabrazyme^®.

[00164] A Figura 8 mostra Fabrazyme® (parte superior) e Replagal® (parte inferior) conforme analisado através de HPLC de fase reversa usando uma coluna de fase revertida C4 (Vydac). Cromatogramas obtidos a 214 nm são mostrados. O ressalto guia, correspondendo às glicoformas de peso molecular menor, é muito mais pronunciado em Fabrazyme®.

Internalização Celular [00165] Fibroblastos humanos normais foram incubados em placas de cultura de multicavidade por 6 horas na ausência (controle, não mostrado) ou presença de Replagal® ou Fabrazyme®. A internalização pode ser inibida por manose-6-fosfato, indicando que a internalização é predominantemente através de receptores de manose-6fosfato. Os resultados indicam que Replagal® e Fabrazyme® não são internalizados comparavelmente pelos fibroblastos. Fabrazyme® é internalizado mais rapidamente do que Replagal® pela internalização mediada pelo receptor de manose-6-fosfato (vide Figura 5).

Composição e Caracterização de Glicano [00166] A Figura 7 mostra perfis dos glicanos liberados de Replagal® (parte inferior) e Fabrazyme® (parte superior). Os glicanos foram derivados com uma sonda fluorescente e comparados através de cromatografia de troca de íon em uma coluna GlycoSep®. Os resultados mostram que Replagal® tem uma proporção maior de glicanos neutros e mono-carregados e Fabrazyme® tem uma proporção maior de glicanos tri-carregados.

[00167] A Tabela 1 mostra uma comparação de área de pico de gliPetição 870170056455, de 07/08/2017, pág. 67/126

61/73 cano. Glicanos liberados de Replagal® e Fabrazyme® foram analisados usando HPAE-PAD conforme mostrado na Figura 4. Integração de picos foi realizada para quantificar as porcentagens dos vários grupos de pico. Os dados tabulados demonstram uma proporção maior de glicanos fosforilados em Fabrazyme® e uma proporção maior de glicanos neutros e uma proporção total maior de glicanos sialilados em Replagal®, [00168] A Tabela 2 mostra resultados de perfil de carga. Perfis de carga de glicanos liberados de Replagal® e Fabrazyme® foram derivatizados e separados conforme descrito na Figura 7. CK-022 e CK-006 são preparações de Replagal® diferentes, enquanto CK-JL12502 é uma preparação de Fabrazyme®. Glicanos de cada produto foram ensaiados em duplicata. Conforme mostrado na Tabela, as preparações de Replagal® têm proporções maiores de glicanos que são neutros ou carregam 1 carga, enquanto Fabrazyme® contém glicanos em uma proporção maior com 2 ou 3 cargas.

[00169] A Tabela 3 mostra os resultados de perfil desialilado. Perfis de carga de glicanos liberados de Replagal® e Fabrazyme® foram desialilados, seguido por derivatização e separação conforme descrito na Figura 7. CK-022 e CK-006 são 2 preparações de Replagal® diferentes, enquanto que CK-JL012502 é uma preparação de Fabrazyme®. glicanos de cada produto foram ensaiados em duplicata. Conforme mostrado na Tabela, as preparações de Replagal® têm proporções menores de glicanos carregados residuais após desialilação, indicando que Fabrazyme® tem uma proporção maior de glicanos fosforilados (resistente à sialidase).

Exemplo 3: Proporção Interespécies de Farmacocinética de α-Gal A (Replagal®) feita em células humanas [00170] O propósito deste exemplo era comparar os parâmetros farmacocinéticos derivados de modelos animais com resultados farPetição 870170056455, de 07/08/2017, pág. 68/126

62/73 macocinéticos humanos.

[00171] Animais (camundongos, ratos, cachorros, coelhos e macacos) receberam injeções de bolo intravenosas únicas de Raplagal®. Amostras de sangue foram coletadas durante um período de 24 horas, processas para soro e analisadas quanto à atividade de enzima de αGal A usando um ensaio de fluorescência in vitro. Perfis de concentração no soro foram analisados usando ou um modelo de 2 compartimentos ou um modelo de não compartimento para estimar os parâmetros farmacocinéticos.

[00172] Amostras sanguíneas foram coletadas de pacientes de Fabry recebendo sua infusão por 40 minutos inicial de Replagal®. Amostras sanguíneas foram processadas ou para plasma ou soro e analisadas quanto à atividade de enzima α-Gal A. Perfis de concentração no soro foram analisados usando um modelo de não-compartimento para estimular parâmetros farmacocinéticos.

[00173] Biópsias do fígado foram realizadas 44 horas após dosagem de pacientes de Fabry masculinos no teste de Fase I. Amostras de tecido foram processadas e analisadas quanto à concentração de α-Gal A administrada conforme anteriormente descrito (Schiffman e Brady e outros (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:365-370). A quantidade de dose administrada recuperada no fígado de cada paciente foi calculada usando a concentração de α-Gal A em cada biópsia de fígado e no peso do fígado estimado de cada paciente.

[00174] Replagal® tinha um perfil de eliminação de soro bifásico seguindo uma dose IV única em ratos, coelhos e macacos (a Figura 9 ilustra o perfil em macacos cinomólogos). Cmax era proporcional à dose para essas três espécies de animal (Figura 10). Replagal® também tinha um perfil de eliminação de soro bifásico em paciente de Fabry seguindo uma infusão de 40 minutos (Figura 11). Cmax era também proporcional à dose em humanos (Figura 12). Replagal® foi eliminado

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63/73 em aproximadamente 24 horas após dosagem em todas as espécies. A AUC (área sob a curva) aumentou linearmente com a dose em animais e humanos em uma faixa de dose de 0,017 a 3,2 X 10⁶ U/kg (Figura 13). A faixa de dose em U/Kg corresponde a uma faixa de 0,007 a 0,2 mg/kg em humanos e 0,0625 a 1 mg/kg em animais.

[00175] Parâmetros fisiológicos em mamíferos seguem equações de proporção alométricas baseadas no peso do corpo, Y = a (BW)^b (Tabela 4). O exponente na equação de proporção pode ser próximo a 1,0 (por exemplo, volume de sangue) mas varia entre 0,6 e 0,8 para remoção de droga ou proteína.

[00176] A equação de proporção alométrica de Replagal® (mL/min) era baseada em estudos farmacocinéticos em camundongos, ratos, coelhos, macacos cinomólogos grandes e pequenos e pacientes de Fabry. A remoção do soro seguiu a equação de proporção alométrica com um exponente de 0,92 (Tabela 5). O exponente maior para remoção do soro de Replagal® em comparação com outros produtos de droga ou proteínas proveu apoio para remoção de receptor M6P de Replagal®.

[00177] A porcentagem de Replagal® administrado encontrada no fígado dos pacientes diminuiu conforme a dose aumentou em uma base mg/kg (Tabela 6). Nas duas doses mais baixas, 0,007 e 0,014 mg/kg, a porcentagem de Replagal® recuperada no fígado 44 horas após dosagem era aproximadamente 25 a 30%. Em contraste, a 0,11 mg/kg, apenas 14% do Replagal® administrado foram encontrados no fígado. Saturação da absorção no fígado de Replagal® aconteceu quando concentrações de produto de droga máximas (C^max) excederam o Kd para o receptor de M6P (2 X 10^-9 M). Com base nesses resultados, a quantidade estimada da dose comercial de Replagal® (0,2 mg/kg) absorvida no fígado é de aproximadamente 2 mg para um paciente de 75 mg (Figura 14). O restante da dose (13 mg) estaria então

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64/73 disponível para absorção em tecidos outros que não o fígado.

[00178] Desse modo, farmacocinética de dose única em modelos animais proveu uma boa previsão da farmacocinética de Replagal® em pacientes de Fabry. O mecanismo de remoção de Replagal® do sangue é predominantemente através dos receptores de M6P que são encontrados em tecidos em todo o corpo. O exponente para a equação de proporção alométrica para remoção do solo ou plasma de Replagal®, 0,92, é maior do que aquele observado para os produtos de droga ou proteínas. O exponente maior provê apoio para a remoção do receptor de M6P de Replagal®. Saturação de receptores no fígado humano foi observada quando C_max excedeu o Kd do receptor de M6P (doses de 0,0556 mg/kg e mais altas).

Exemplo 4: Farmacocinética de Replagal® em Pacientes de Fabry Masculinos e Femininos [00179] O propósito primário desta avaliação era comparar as propriedades farmacocinéticas de Replagal® em pacientes de Fabry masculinos e femininos. Um segundo objetivo era comparar as propriedades farmacocinéticas entre pacientes tratados com Replagal® e Fabrazyme®.

[00180] Amostras sanguíneas foram coletadas de pacientes de Fabry masculinos e femininos recebendo sua infusão de 40 minutos inicial de Replagal® de TKT006 (NIH), TKT007 (UK) e TKT014 (ALEMANHA). As amostras de sangue foram processadas para soro (amostras TKT007 e TKT014) ou plasma (amostras TKT006) e analisadas quanto à atividade da enzima α-galactosidase A em TKT usando um ensaio de fluorescência in vitro. Perfis de concentração no soro/plasma foram analisados usando um modelo de não-compartimento para estimar os parâmetros farmacocinéticos.

[00181] A atividade da enzima de pré-dose era em média 1,2 U/ml em homens e 6,5 U/ml em mulheres, o que reflete que o estado carrePetição 870170056455, de 07/08/2017, pág. 71/126

65/73 ador de pacientes mulheres (Tabela 7).

[00182] Replagal® tinha um perfil de eliminação de soro bifásico seguindo uma infusão intravenosa única em ambos pacientes de Fabry masculino e feminino e foi eliminado da maioria dos pacientes em aproximadamente 24 horas após a dosagem (Figura 15). Conforme esperado, C_max coincidia com o final do período de infusão de 40 minutos.

[00183] Parâmetros farmacocinéticos médios eram similares entre pacientes masculinos e femininos (Tabela 8). A AUC (área sob a curva) normalizada para a dose era levemente maior em mulheres (razão de 0,51) mas não era estatisticamente diferente da razão do homem (0,43). Remoção de soro absoluta de Replagal® era menor em mulheres (140 comparado com 177 mL/min); mas quando normalizada para o peso do corpo, a remoção do soro não era estatisticamente diferente (2,10 versus 2,52 mL/min/kg). A diferença estatisticamente diferente na meia-vida de eliminação terminal (89 minutos em mulheres versus 112 minutos em homens) não era devido a uma diferença na eliminação de Replagal® de mulheres. Pelo contrário, a atividade de enzima de base maior em mulheres tornou difícil detectar Replagal® administrado além de 8 horas (Túltimo).

[00184] Remoção de Replagal® da circulação de pacientes de Fabry era mais rápida do que a remoção de GFR ou creatinina de paciente individual que está de acordo com seu mecanismo de remoção (Tabela 9). Replagal® é principalmente removido da circulação através da absorção em tecidos através de receptores de manose-6-fosfato (M6P) e minimamente através de degradação de proteína e eliminação pelo fígado.

[00185] Foi feita uma análise para confirmar que as mudanças na função renal não afetarão a remoção de Replagal® da circulação (Tabela 10). A maior parte dos pacientes de Fabry sofrendo análise farPetição 870170056455, de 07/08/2017, pág. 72/126

66/73 macocinética de primeira dose estava ou na faixa normal (>80 mL/min de remoção de creatinina) ou tinha dano renal suave (50-80 mL/min de remoção de creatinina) quando eles receberam sua primeira dose de Replagal®. Embora apenas 5 pacientes estivessem na categoria de moderado ou severo, a remoção de Replagal® do soro para esses pacientes estava dentro da faixa estabelecida pelas 2 categorias de função renal superiores. Esses dados sugerem que Replagal® não é excretado pelo fígado. Não havia diferenças entre homens e mulheres nesta análise.

[00186] A remoção de Fabrazyme® do soro de pacientes de Fabry era significantemente mais rápida comparado com aquela observada com Replagal® (Tabela 11). Em doses quase iguais em pacientes masculinos (0,2 e 0,3 mg/kg para Replagal® e Fabrazyme®, respectivamente), a remoção de Fabrazyme® do soro era 4 mL/min/kg comparado com 2,5 mL/min/kg para Replagal®. Esta diferença na remoção do soro em doses quase equivalentes é devido ao padrão de glicosilação diferente de Fabrazyme® (fabricado em células de CHO) comparado com o padrão de glicosilação humano de Replagal®. Em doses mais altas de Fabrazyme® (1 e 3 mg/kg), a remoção do soro foi significantemente reduzida para aproximadamente 2,7 e 1 mL/min/kg uma vez que mecanismos de remoção ficaram saturados para Fabrazyme®.

[00187] Desse modo, os parâmetros farmacocinéticos eram similares em pacientes masculinos e femininos dosados com Replagal®. A remoção de Replagal® do soro excedeu significantemente a função renal (mL/min), de acordo com a absorção mediada por M6P de Replagal® em tecidos e células em todo o corpo. Conforme esperado, análise preliminar indicou que Replagal® não é excretado pelo fígado. Em doses abaixo dos níveis de saturação de remoção, a remoção de Fabrazyme® do soro era significantemente mais rápida comparado

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67/73 com Replagal® e reflete diferenças em padrões de glicosilação entre os dois produtos de droga.

Tabela 1

	Replagal	Febrazyme
Neutro	15,6%	4,6%
1 Ácido siálico	29,5%	8,9%
Desconhecido	4,6%	1,8%
2 Ácido siálico	20,1%	11,3%
1 Fosfato	13,0%	27,1%
Desconhecido	4,0%	4,6%
3 Ácido siálico	1,9%	8,5%
4 Ácido siálico	5,9%	15,1%
2 Fosfato	5,4%	18,0%

Tabela 2

ID da Amostra	% de Neutros	% de Cargas 1	% de Cargas 2	% de Cargas 3	% de Cargas 4
CK-022 frasco 1	32,76	26,97	25,64	9,78	4,85
CK-022 frasco 2	33,61	26,37	25,16	9,92	4,93
CK-006 frasco 1	29,73	26,61	27,12	11,85	5,70
CK-006 frasco 2	29,33	26,69	27,14	11,47	5,37
CK-JL012502 Frasco 1	21,88	12,59	38,44	21,94	5,15
CK-JL012502 Frasco 2	21,60	12,61	39,35	21,44	5,00

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Tabela 3

ID da amostra	% de Neutros	% de Cargas 1	% de Cargas 2
Inj 1 de CK-022	94,45	2,73	2,82
Inj 2 de CK-022	94,39	2,68	2,93
Inj 1 de CK-006	93,18	2,57	4,25
Inj 2 de CK-006	93,34	2,24	4,42
Inj 1 de CK-JL012502	88,52	4,37	7,11
Inj 2 de CK-JL012502	88,08	4,41	7,51

Tabela 4 [00188] Proporção de Alometria de Parâmetros Fisiológicos e Anatômicos (função do peso do corpo BW)

Equação: Y = a(BW)^b

Parâmetro (Y)	Exponente (b)
Área de superfície do corpo	0,67
Volume de sangue (mL)	0,99
Peso do pulmão (g)	0,99
Produção de urina (mL/h)	0,82
Remoção de insulina (mL/h)	0,77
Peso do rim (g)	0,85
Remoção de droga do plasma	0,6-0,8
Remoção de proteína do plasma	0,65-0,84
Remoção de receptor de M6P	?

[00189] Chappell and Mordenti (1991) Extrapolation of Toxicological and Pharmacological Data from Animals to Humans. Em B. Testa (ed.) Advances in Drug Research, Vol. 20, pp. 1-116.

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Tabela 5

Proporção Alométrica de Parâmetros Farmacocinéticos - Exponentes

Produto de Droga	Cl (mL/min)
Moléculas pequenas*	0,6-0,8
Proteínas publicadas*	0,65-0,84
Rt-PA	0,84
Relaxin	0,80
CD4-IgG	0,74
rhGH	0,71
RCD4	0,65
Replagal®	0,92

*Mordenti e outros (1991) Interspecies Scaling of Clearance and Voume Distribution Data for Five Therapeutic Proteins. Pharmaceutical Research 8:1351-1359.

Tabela 6

Porcentagem de Dose Administrada de Replagal em Fígado Humano

Dose (mg/kg)	Tempo de Infusão	Cmax (x10-9M)	Porcentagem de Dose Administrada no Fígado
44 horas (medida)	Tmax (2 horas) Calculada usando T1/2 de 3 dias
0,007	20 min	0,4	25,0%	38%
0,014	20 min	1,1	28,7%	43%
0,028	20 min	2,5	16,8%	25%
0,056	20 min	5,0	19,4%	29%
0,11	20 min	7,8	13,7%	21%
0,2	40 min	11,6	Não determinada	8%-18% (estimada)

------------------------Q---------------------------------------------------------Kd do receptor M6P é 2 x 10 M (Kornfeld Ann. Rev. Biochem. 61:307303, 1992)

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Meias-vida de α-galactosidase A:

dias em fibroblastos de Fabry (Mayers e outros, Am. J.

Genet. 34:602-610, 1982) dias em fígado de camundongo (Ioannou e outros, Am. J.

Hum. Genet. 68:14-25, 2001)

Tabela 7

Valores de Base da Atividade da Enzima a-galactosidase A

N° do Estudo	N° de Pacientes	Valor de Base Médio (U/mL)
TKT006 e TKT007 (NIH e UK)	39 homens	1,2* (faixa 0,4-9)
TKT014 (Alemanha)	15 mulheres	6,5 (faixa 2-12)

*exclui um paciente homem com valor de base de aproximadamente 15 U/mL

Unidade (U) é definida como a hidrólise de um nanomol de 4metilumbeliferil-a-D-galactopiranosídeo por hora a 37° C.

Tabela 8

Comparação Farmacocinética entre Pacientes de Fabry Masculinos e Femininos Seguindo 1^a Dose de Replagal

Estudo Clínico	N°	Dose Média (U/kg x 106)	Peso do Corpo (kg)	AUC/ Dose	Cl (mL/ min)	Cl (mL/min/kg)	T1/2 (λχ) (min)	Média (T última)	Vss (% de BW)
TKT006 TKT007	18 homens	0,61	72,9 (16,1)	0,43 (0,12)	177 (43)	2,52 (0,74)	112 (25)	12 horas	16,0% (4,3%)
TKT014	15 homens	0,66	68,0 (13,8)	0,51 (0,13)	140 (38)	2,10 (0,62)	89 (28)	8 horas	16,5% (4,3%)
Teste t	0,057	0,015	0,10	0,02	NA	NS

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71/73 ( ) Desvio padrão

NA, não-aplicável

NS, não-significante

Tlast, tempo da última enzima Replagal detectável

AUC normalizada tem unidades de (min*U/mL)/(U/kg)

Tabela 9

Remoção de Replagal do Soro de Pacientes Masculinos e Femininos

N° do estudo	Avaliação Farmacocinética	GFR* média (mL/min)	Remoção de Replagal Média (mL/min)
TKT006 (NIH)	10 homens	78 (24)	193 (47)
TKT005 (UK)	8 homens	115 (63)	157 (29)
Combinado	18 homens	95 (48)	177 (43)
TKT014 (Alemanha)	15 mulheres	70 (20) t	140 (38)

( ) Desvio padrão

N, número de pacientes avaliados quanto a parâmetros farmacocinéticos seguindo a primeira dose de Replagal * GFR, taxa de filtragem glomerular, medida 2-3 semanas antes da primeira dose de Replagal t remoção de creatinina medida em mulheres

Tabela 10

Comparação da Função Renal e Remoção de Replagal do Soro

N° do Estudo	Avaliação Farmacocinética (N)	Categoria da Função Renal*	Faixa de Remoção de Replagal (mL/min/kg)
TKT006 (NIH) e TKT007 (UK)	10 homens	Faixa Normal (>80 mL/min)	1,7-3,4

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	6 homens	Suave (50-80 mL/min)	2,0-4,4
	1 homem	Moderada (30-50 mL/min)	3,5
	1 homem	Severa (<30 mL/50 mL/min)	1,6
TKT014 (Alemanha)	5 mulheres	Faixa Normal (>80 mL/min)	2,2-3,0
	7 mulheres	Suave (50-80 mL/min)	1,4-3,6
	2 mulheres	Moderada (30-50 mL/min)	1,5-1,6
	1 mulher	Severa (<30 mL/min)	1,8

* Categorias da FDA com base em remoção de creatinina estimada

Tabela 11

Remoção do Soro em Pacientes de Fabry Dosados com Replagal ou

Fabrazyme

Dose (mg/kg)	Remoça do Soro (mL/min/kg)
	Homens com Fabrazyme	Raplagal
	Homens	Mulheres
0,2		2,5	2,1
0,3	4
1,0	~2,7 t
3,0	~1 t

*Eng e outros (2001) A Phase I/II Clinical Trial of Enzymes Replacement in Fabry Disease. Am. J. Hum. Genet. 68:711-722 t saturada em remoção do soro

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Equivalentes [00190] Aqueles versados na técnica vão reconhecer, ou serão capazes de averiguar usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes para as modalidades específica da invenção aqui descrita. Tais equivalentes pretendem ser compreendidos pelas reivindicações que seguem.

[00191] Todas as referências descritas aqui são incorporadas a título de referência em sua totalidade. O que é reivindicado é apresentado abaixo e é seguido por uma listagem e sequência.

Claims (28)

1. (1) tem pelo menos 75% de glicanos neutros, mono- e di-sialilados combinados;

   1. Método para analisar uma preparação de α-Gal A, caracterizado pelo fato de que compreende:

   obter ou prover uma primeira preparação de α-Gal A de teste; e determinar, através de um ou mais métodos escolhidos do grupo consistindo em cromatografia de troca de íon, cromatografia de troca de ânion de alto desempenho (HPAE), cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), espectroscopia de massa, se a primeira preparação de α-Gal A de teste tem uma ou mais das características (1)-(7):
2. 2/5 pelo fato de que a etapa de determinação compreende determinar se a preparação de α-Gal A de teste tem menos do que 35% de glicanos trie tetra-sialilados combinados.

   2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de determinação compreende determinar se a preparação de α-Gal A de teste tem pelo menos 75% de glicanos neutros, mono- e di-sialilados combinados.

   (2) tem menos do que 35% de glicanos tri- e tetra-sialilados combinados;
3. 3/5

   3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado

   Petição 870190011815, de 04/02/2019, pág. 4/27

   (3) tem mais do que 50% de glicanos complexos;
4. 4/5 teste foi modificado através do tratamento com um inibidor de glicosilação.

   4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de determinação compreende determinar se a preparação de α-Gal A de teste tem mais do que 50% de glicanos complexos.

   (4) tem menos do que 45% de glicanos fosforilados;
5. 5/5 biológica da preparação de α-Gal A de teste.

   5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de determinação compreende determinar se a preparação de α-Gal A de teste tem menos do que 45% de glicanos fosforilados.

   (5) tem mais do que 45% de glicanos sialilados;
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de determinação compreende determinar se a preparação de α-Gal A de teste tem mais do que 45% de glicanos sialilados.

   (6) tem uma proporção de ácido siálico para manose-6-fosfato em uma base de mol por mol maior do que 1,5 para 1; e (7) tem uma proporção de glicanos sialilados para glicanos fosforilados maior do que 1, e selecionar a preparação de α-Gal A teste se tiver uma o mais das características (1)-(7), desse modo analisando uma preparação de α-Gal A.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de determinação compreende determinar se a preparação de α-Gal A de teste tem uma proporção de ácido siálico para manose-6-fosfato em uma base de mol por mol maior do que 1,5 para 1.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de determinação compreende determinar se a preparação de α-Gal A de teste tem uma proporção de glicanos sialilados para glicanos fosforilados maior do que 1.
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda a etapa de inserir o resultado da determinação em um registro.
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método compreende determinar se a preparação de α-Gal A de teste tem duas ou mais das características (1)-(7).

    Petição 870190011815, de 04/02/2019, pág. 5/27
11. 11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra de α-Gal A é coletada de uma célula de mamífero.
12. 12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a célula de mamífero é uma célula humana.
13. 13. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a célula de mamífero é uma célula de não-humano.
14. 14. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a célula de mamífero é uma célula de CHO.
15. 15. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sinal de carboidrato da preparação de teste foi modificado antes da etapa de determinação ser realizada.
16. 16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o sinal de carboidrato da preparação de teste foi modificado através de tratamento com uma enzima.
17. 17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a enzima é uma glicosidase, glicosil transferase, fosforil transferase, cinase ou sialil transferase.
18. 18. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o sinal de carboidrato da preparação de teste foi modificado através de tratamento com um inibidor de fosfatase.
19. 19. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o sinal de carboidrato da preparação de teste foi modificado através da glicoconstrução.
20. 20. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o sinal de carboidrato da preparação de

    Petição 870190011815, de 04/02/2019, pág. 6/27
21. 21. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de comparação da preparação de α-Gal A humana de teste com uma preparação de αGal A de referência.
22. 22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a preparação de α-Gal A de referência é uma preparação de α-Gal A humana feita em células humanas.
23. 23. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda as etapas de:

    obtenção ou provisão de uma segunda preparação de αGal A de teste;

    determinação de se a segunda preparação tem uma ou mais das características (1)-(7); e inserção do resultado de cada determinação em um registro, em que as primeira e segunda preparações são primeira e segunda bateladas de uma preparação de α-Gal A farmacêutica.
24. 24. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda e etapa de:

    previsão de um parâmetro farmacocinético ou atividade biológica da preparação de α-Gal A de teste, com base na determinação se a preparação de α-Gal A tem uma ou mais das características (1)-(7), o referido parâmetro farmacocinético ou atividade biológica selecionado do grupo que consiste em absorção pelo fígado, absorção renal e absorção cardiovascular
25. 25. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda as etapas de:

    avaliação de um parâmetro farmacocinético ou atividade

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26. 26. Método de acordo com a reivindicação 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que o parâmetro farmacocinético ou atividade biológica é direcionamento de tecido a pelo menos uma de: células endoteliais do fígado, células sinusoidais do fígado, células endoteliais capilares/vasculares, células epiteliais glomerulares renais (podócitos), células mesangiais glomerulares, células endoteliais renais, células pulmonares, células renais, células neurais, ou miócitos cardíacos.
27. 27. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de uso da previsão para planejar uma preparação terapêutica de α-Gal A para um paciente específico ou uma variante específica de doença de Fabry.
28. 28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a variante específica de doença de Fabry é doença de Fabry de variante renal ou doença de Fabry de variante cardíaca.