BRPI0316282B1 - Anticorpo humano isolado monoclonal, composição, imunoconjugado, molécula biespecífica ou multiespecífica, método e conjunto de diagnóstico para detectar a presença de antígeno cd25 ou uma célula que expressa cd25, e, vetor de expressão - Google Patents

Anticorpo humano isolado monoclonal, composição, imunoconjugado, molécula biespecífica ou multiespecífica, método e conjunto de diagnóstico para detectar a presença de antígeno cd25 ou uma célula que expressa cd25, e, vetor de expressão Download PDF

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BRPI0316282B1 BRPI0316282-6A BR0316282A BRPI0316282B1 BR PI0316282 B1 BRPI0316282 B1 BR PI0316282B1 BR 0316282 A BR0316282 A BR 0316282A BR PI0316282 B1 BRPI0316282 B1 BR PI0316282B1
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Catharina Emanuele Gerarda Havenith
Paul Parren
Jan G. J. van de Winkel
Denise Leah Williams
Ole D. M. Sc. Baadsgaard
Jørgen Petersen
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Abstract

"anticorpo humano isolado, hibridoma, transfectoma, célula hospedeira eucariótica ou procariótica, animal não humano ou planta transgênica, método para produzir um anticorpo monoclonal humano, composição, imunoconjugado, molécula biespecífica ou multiespecífica, método para inibir o desenvolvimento e/ou a proliferação de uma célula que expressa cd25, método para eliminar uma célula que expressa cd25, método para tratar ou evitar um distúrbio que envolve as células que expressam cd25, método e conjunto de diagnóstico para detectar a presença de antígeno cd25 ou uma célula que expressa cd25, vetor de expressão, anticorpo anti-idiotípico, e, uso do mesmo". anticorpos monoclonais humanos isolados que liga-se à cd25 humana e a inibem e composições com base em anticorpos relacionadas e moléculas, são divulgados. os anticorpos humanos podem ser produzidos por um hibridoma, um transfectoma ou em um animal transgênico não humano, por exemplo, um camundongo transgênico, capaz de produzir isotipos múltiplos de anticorpos monoclonais humanos passando pela recombinação de v-d-j e mudança de isotipo. também são divulgadas composições farmacêuticas que compreendem os anticorpos humanos, animais transgênicos não humanos, hibridomas e transfectomas que produzem os anticorpos humanos e métodos terapêuticos e de diagnósticos para usar os anticorpos humanos.

Description

“ANTICORPO HUMANO ISOLADO MONOCLONAL, COMPOSIÇÃO, IMUNOCONJUGADO, MOLÉCULA BIESPECÍFICA OU MULTIESPECÍFICA, MÉTODO E CONJUNTO DE DIAGNÓSTICO PARA DETECTAR A PRESENÇA DE ANTÍGENO CD25 OU UMA CÉLULA QUE EXPRESSA CD25, E, VETOR DE EXPRESSÃO”
PEDIDOS RELACIONADOS
Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório U.S. N° 60/426,690, depositado em 15 de novembro de 2002, cujas divulgações totais são incorporadas neste por referência.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
O receptor de interleucina-2 de alta afinidade (IL-2R) é um receptor de superfície celular heterotrimérico composto de cadeias de α, β e Yc- polipeptídeo (Kd 10-11 M). A cadeia α de 55 kDa, também conhecida como IL-2Ra, CD25, p55 e antígeno Tac (ativação de célula T), é única para o IL2R. As cadeias (CD122; P75) e Yc (CD132) são parte de uma superfamília do receptor de citocina (receptores de hematopoietina) e são componentes funcionais de outros receptores de citocina, tais como IL-15R (Waldmann (1993) Imunol. Today 14 (6): 264-70; Ellery et al. (2002) Cytokine Growth Factor Rev. 13(1): 27-40). O receptor de afinidade intermediária é um dímero composto de uma cadeia β e de uma Yc (KD10-9 M) enquanto o receptor de afinidade baixa consiste de uma subunidade α monomérica que não tem
Segue a página 2.
Petição 870180125183, de 03/09/2018, pág. 9/18
nenhuma capacidade de transdução de sinal (KD10'8 M) (Waldmann (1993) Imunol. Today 14 (6): 264-70).
As células T restantes, as células B e os monócitos expressam poucas moléculas CD25. Entretanto, o receptor é rapidamente transcrito e expressado na ativação (Ellery et al. (2002) Cytokine Growth Factor Rev. 13(1): 27-40; Morris et al. (2000) Ann. Rheum. Dis. 59 (Suppl.l): 1109-14). As células que expressam o IL-2R de alta afinidade expressam CD25 (a subunidade CD25) em excesso que levam os perfis de ligação tanto de alta quanto de baixa afinidade (Waldmann et al. (1993) Blood 82 (6): 1701-12; de Jong et al. (1996) J.
Imunol. 156 (4): 1339-48). O CD25 é altamente expressado pelas células T em algumas doenças autoimunes, tais como artrite reumatóide, escleroderma e uveíte, bem como distúrbios de pele, por exemplo, psoríase e dermatite atópica e uma variedade de neoplasmas linfóides, por exemplo, leucemia de célula T e doença de Hodgkin (Waldmann (1993) Imunol. Today 14 (6): 264-70; Kuttler et al. (1999) J. Mol. Med. 77(1): 226-9). Além disso, a expressão de CD25 está associada com rejeição de aloenxerto e respostas de enxerto versus hospedeiro responses (Jones et al. (2002) J. Imunol. 168 (3): 1123-1130; Anasetti et al. (1994) Blood 84 (4): 1320-7).
Conseqüentemente, CD25 é um alvo importante para a terapia mediada por anticorpo, por exemplo, reduz a inflamação em doenças autoimunes, trata tumores e evita a rejeição a transplante. Entretanto, enquanto os resultados obtidos e a experiência clínica até hoje estabelecem o CD25 como um alvo útil para a imunoterapia, estes anticorpos de murinos e quiméricos correntemente disponíveis não constituem agentes terapêuticos ideais. Portanto, existe a necessidade quanto a outros anticorpos terapêuticos contra CD25 que são eficazes na prevenção e/ou tratamento de uma faixa de doenças na faixa de doenças que envolvem as células que expressam CD25.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO /°
A presente invenção fornece novos anticorpos terapêuticos para tratar e/ou prevenir doenças associadas com as células que expressam CD25, incluindo rejeição ao transplante de órgão, tecido e célula, incluindo rejeição a aloenxerto e a xenoenxerto, doença enxerto-versus-hospedeiro, 5 doenças autoimunes, distúrbios inflamatórios e hiperproliferativos de pele e neoplasmas linfóides, entre outros. Os anticorpos abrangidos pela invenção são melhorados em que estes são totalmente humanos e, desta maneira, são
potencialmente menos imunogênicos em pacientes. Os anticorpos também são vantajosos com base em suas propriedades funcionais superiores (por exemplo, terapêuticas).
Como mostrado neste, os anticorpos humanos da invenção ligam-se a CD25 quando testados por ELISA ou fluxo citométrico.
Os anticorpos humanos da invenção tipicamente, ligam-se ao
CD25 com uma constante de equilíbrio de dissociação (KD) de 15 aproximadamente IO'8 M ou menos, tal como 10‘9 M ou menos, IO-1 M ou menos ou IO’11 M ou ainda menos quando determinado pela tecnologia de ressonância de plasma de superfície (SPR) em um instrumento BIAcore 3000 usando-se IL-2Ra recombinante humano como o ligando e o anticorpo como
o analito. Tais anticorpos, tipicamente não reagem com os antígenos de superfície celular relacionados e, desta maneira, não inibem sua função.
Além disso, os anticorpos humanos da presente invenção inibem (por exemplo, bloqueiam) a interação de CD25 com seu ligando, IL-2. Por exemplo, a ligação pode ser inibida por pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100%.
Os exemplos de células que expressam CD25 e a função celular das quais, portanto, pode ser inibida pelos anticorpos humanos da presente invenção incluem, entre outros, as células T, células B e monócitos. Por exemplo, como mostrado neste, os anticorpos humanos da invenção podem inibir a ligação de IL-2 à CD25. Tal inibição da ligação de IL-2 à • · · · ··· · ··· · ···
CD25 inibe concomitantemente vários mecanismos celulares induzidos pela ligação de IL-2. Como também mostrado neste, os anticorpos humanos da invenção podem inibir a proliferação de célula T induzida pelo anticorpo anti CD3 de uma maneira dependente de dose. Como também mostrado neste, os 5 anticorpos humanos da invenção podem inibir a reação de linfócito misto (MLR) de uma maneira dependente de dose. A inibição da proliferação em tais experimentos pode ser monitorada por uma diminuição no acúmulo de massa celular como medido no ELISA ou por uma diminuição na
incorporação de BrdU no DNA celular.
Os anticorpos humanos da invenção incluem anticorpos IgGl (por exemplo, IgGl,K e IgGl,λ) e IgG4 (por exemplo, IgG4,K e IgG4,À).
Entretanto, outros isotipos de anticorpos também são abrangidos pela invenção, incluindo IgG2, IgG3, IgM, IgAl, IgA2, IgA secretor, IgD e IgE.
Estes anticorpos podem ser anticorpos totais ou fragmentos de ligação de antígeno destes que incluem, por exemplo, fragmentos Fab, Fab', F(ab)2,
F(ab')2, Fv, Fv(scFv) de cadeia simples ou anticorpos bi-específicos. Além disso, os fragmentos de ligação de antígeno incluem proteínas de fusão de imunoglobina de domínio de ligação que compreendem (i) um polipeptídeo
de domínio de ligação (tal como uma região variável de cadeia pesada ou uma região variável de cadeia leve) que é fundido a um polipeptídeo de região de fixação de imunoglobulina, (ii) uma região de constante CH2 de cadeia pesada de imunoglobulina fundida à região de fixação e (iii) uma região de constante CH3 de cadeia pesada de imunoglobulina fundida à região de constante CH2.
Tais proteínas de fusão de imunoglobulina de domínio de ligação ainda são divulgadas nos US2003/0118592 e US2003/0133939. Os anticorpos humanos particulares da presente invenção incluem aqueles referidos como AB1, AB7, AB11 e AB12, codificados pelos ácidos nucléicos de cadeia pesada humana e de cadeia leve capa humana que compreendem
sequências de nucleotídeo em suas regiões variáveis como apresentado na SEQ ID N°: 1, 5, 9 ou 13 e SEQ ID N°: 3, 7, 11 ou 15, respectivamente e suas modificações de sequência conservativas. Em uma outra forma de realização, os anticorpos humanos são caracterizados por terem regiões variáveis de cadeia pesada humana e de cadeia leve capa humana que compreendem as seqüências de aminoácido apresentadas nas SEQ ID N°: 2, 6, 10 ou 14 e SEQ ID N°: 4, 8, 12 ou 16, respectivamente e suas modificações de sequência conservadora.
Outros anticorpos humanos particulares da invenção incluem aqueles que compreendem CDR (região de determinação complementar) tendo um CDR1 de cadeia pesada e de cadeia leve humano, CDR2 de cadeia pesada e de cadeia leve humano e um CDR3 de cadeia pesada e de cadeia leve humano, em que (a) a cadeia pesada humana CDR1, CDR2 e CDR3 compreende uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo que consiste das seqüências de aminoácido CDR1, CDR2 e CDR3 mostradas nas figuras de 1 a 10 (SEQ ID N°: 17 a 19, 23 a 25, 29 a 31 ou 35 a 37) e suas modificações de seqüência conservadoras e (b) a cadeia leve humana CDR1, CDR2 e CDR3 compreende uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo que consiste das seqüências de aminoácido CDR1, CDR2 e CDR3 mostradas nas figuras 1 a 10 (SEQ ID N°: 20 a 22, 26 a 28, 32 a 34 ou 38 a 40) e suas modificações de seqüência conservadoras.
Em uma outra forma de realização, os anticorpos anti CD25 humanos da presente invenção podem ser caracterizados por uma ou mais das seguintes propriedades:
a) especificidade quanto a CD25 humano;
b) uma afinidade de ligação a CD25 que corresponde a um KD de aproximadamente 108 M ou menos, tal como 10‘9 M ou menos, IO’10 M ou menos ou 10'11 M ou ainda menos, quando determinados pela tecnologia de ressonância de plasma de superfície (SPR) em um instrumento BIAcore 3000
usando-se o IL-2R0! recombinante como o ligando e o anticorpo como o analito;
c) a capacidade de tolerar as células T;
d) a capacidade de bloquear interação de CD25 com seu ligando, IL-2;
e) a capacidade de eliminar as células T que expressam CD25;
f) a capacidade de inibir a proliferação de células T que expressam CD25;
g) a capacidade de inibir proliferação de célula T induzida por anticorpo anti-CD3 de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs);
h) a capacidade de bloquear a reação de linfócitos mista (MLR); e/ou
i) introversão de CD25 expressado em células T.
O termo tolerado, como usado neste, significa que as células T não são capazes de reagir a um antígeno após um recontestação com este antígeno.
Os anticorpos anti CD25 humanos da presente invenção podem ser derivados, ligados a ou co-expressados com outras especificidades de ligação. In uma forma de realização particular, os anticorpos são ligados a uma ou mais especificidades de ligação para um antígeno alvo diferente, tal como um antígeno em uma célula realizadora.
Conseqüentemente, a presente invenção também inclui moléculas biespecíficas e multiespecíficas que liga-se tanto ao CD25 humano quanto a um ou mais antígenos alvo diferentes, tais como CD3, CD4, IL-15R, TNF-O! ligado à membrana ou ligado ao receptor ou IL-15 ligado a membrana ou ligado ao receptor.
Em uma outra forma de realização, anticorpos anti CD25 humanos da invenção são derivados, ligados a ou co-expressados com uma outra molécula funcional, por exemplo, um outro peptídeo ou proteína (por * · « · · · · · · · · • · · · · · · · · · *·· exemplo, um fragmento Fab). Por exemplo, o anti-corpo pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, pela ligação química, fusão genética, associação não covalente ou de outra maneira) a uma ou mais outras entidades moleculares, tal como um outro anticorpo (por exemplo, para a produção de 5 um anticorpo biespecífico ou multiespecífico), uma citocina, ligando celular ou antígeno (por exemplo, para a produção de um imunoconjugado, tal como uma imunotoxina). O anticorpo também pode ser ligado a outras porções terapêuticas, por exemplo, um radioisótopo, um medicamento anticâncer de
molécula pequena, um agente anti-inflamatório ou um agente imunossupressor. Consequentemente, a presente invenção abrange uma grande variedade de conjugados de anticorpos, moléculas biespecíficas e multiespecíficas e proteínas de fusão, todas as quais ligam-se a células que expressam CD25 e que podem ser usadas para alvejar outras moléculas, tais como as células.
Os anticorpos humanos, imunoconjugados, moléculas e composições biespecíficas e multiespecíficas da presente invenção podem ser usados em uma variedade de métodos para inibir, matar, e/ou modular a atividade e/ou desenvolvimento (por exemplo, proliferação) de células que expressam CD25. Em uma forma de realização, o método inclui inibir a proliferação de células T que expressam CD25. Em uma outra forma de realização, o método inclui inibir respostas de enxerto versus hospedeiro, por exemplo, MLR. Anda, em uma outra forma de realização, o método inclui a morte de células que expressam CD25 (por exemplo, pela lise mediada por complemento ou pela ligação do anticorpo a uma citotoxina). As células são 25 preferivelmente mortas ou inibidas sem matar ou inibir a atividade de células que não expressam CD25 mas que podem, por exemplo, expressar um antígeno de superfície celular estruturalmente relacionado (isto é, sem reatividade cruzada com ao relacionado mas antígenos de superfície celular funcionalmente distintos). As células que expressam CD25 que podem ser inibidas ou mortas usando-se os anticorpos humanos da invenção incluem, por exemplo, linfócitos T ativados, linfócitos B, monócitos, macrófagos, células de Kuppfer do fígado e células de Langerhans da pele que expressam CD25.
Conseqüentemente, os anticorpos humanos da presente invenção podem ser usados para tratar e/ou evitar uma variedade de doenças e condições em que as células ativadas que expressam CD25 desempenham um papel ativo na patogênese pela administração dos anticorpos aos pacientes que
sofrem de tais doenças e condições. As doenças exemplares que podem ser tratadas (por exemplo, melhoradas) ou evitadas, incluem, mas não são limitadas a, rejeição ao transplante, incluindo rejeição ao aloenxerto e xenoenxerto, em pacientes que sofrem ou que sofreram transplante de órgão ou de tecido, tal como coração, pulmão, coração-pulmão combinados, traquéia, rim, fígado, pâncreas, esôfago, intestino, pele, membro, cordão umbilical, célula tronco, transplante de célula de ilhota, etc. Anticorpos da presente invenção, desta maneira, podem ser usados com profiláticos em rejeição a aloenxerto e xenoenxerto ou serem usados para reverter, tratar ou, de outra maneira melhorar episódios de rejeição a aloenxerto ou xenoenxerto
agudos.
Outras doenças que podem ser tratadas incluem a doença enxerto versus hospedeiro, por exemplo doença de enxerto versus hospedeiro na transfusão de sangue e doença de enxerto versus hospedeiro de medula óssea; doenças inflamatórias, imunes ou autoimunes, tais como artrite reumatóide, espondilite ancilosante, artrite psoriática, diabete do tipo 1, diabete do tipo 2 que requer insulina, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico, miastenia grave, doença inflamatória do intestino, doença de
Crohn, colite ulcerativa, dermato-polimiosite, síndrome de Sjõren syndrome, arterites, incluindo arterite de célula gigante, anemia aplástica, asma, escleroderma e uveíte; distúrbios inflamatórios ou hiperproliferativos de pele,
por exemplo, psoríase, incluindo psoríases de placas, pustulose palmar e plantar (PPP), líquen plano erosivo, pênfigo bolhoso, epidermólise bolhoso, dermatite de contato e dermatite atópica e uma variedade de neoplasmas linfóides, por exemplo, leucemia de célula T, doença de Hodgkin, leucemia de célula capilar ou linfoma de célula T cutânea, incluindo micose fungóide e síndrome de Sezary.
Outras doenças que podem ser tratadas são malignidades, em que uma inibição da infiltração de células T reguladoras de CD25+ é benéfica, tais como gástrico, cânceres esofágicos, melanoma maligno, câncer colorretal, câncer de pâncreas, câncer de mama, câncer pulmonar de pequenas células, câncer pulmonar de células não pequenas, câncer cervical, câncer ovariano e carcinoma de célula renal;
distúrbios hematológicos, tais como leucemia de célula T adulta/linfoma, linfoma de célula grande anaplástico, leucemia linfocítica crônica (CLL)/linfoma linfocítico pequeno (SLL), linfoma de célula T periférica e amiloidose secundária;
distúrbios de pele, tais como pioderma gangrenoso, granuloma anular, dermatite alérgica de contato, pemfigóide cicatricial e herpes gestacional; distúrbios hepato-gastrointestinais, tais como colite de colágeno, colangite esclerosante, hepatite ativa crônica, hepatite lupóide, hepatite autoimune, hepatite alcoólica, panceratite crônica e pancreatite aguda;
distúrbios cardíacos, tais como, tais como miocardite e pericardite; distúrbios vasculares, tais como arteriosclerose, arterite de célula gigante/polimialgia reumática, arterite de Takayasu, poliarterite nodosa, síndrome de Kawasaki, granulomatose de Wegener, poliangite microscópica, síndrome de Churg-Strauss, angiite leucocitoclástica e vasculite leucocitoclástica secundária; distúrbios renais, tais como glomerulonefrite aguda, glomerulonefrite crônica, nefrite de mudança mínima e síndrome de Goodpasture;
/4 • · · · · *·· ··· • · ··· · ··· · ··· distúrbios pulmonares, tais como alveolite, bronquiolite obliterante, silicose e beriliose;
distúrbios neurológicos, tais como esclerose múltipla, doença de Alzheimer, miastenia grave, polineuropatia de desmielinação crônica e poliradiculite incluindo a síndrome de Guillain-Barr;
distúrbios conectivos de tecido, tais como policondrite recorrente, sarcoidose, lúpus sinstêmico eritematoso, lúpus do CNS, lúpus discóide, nefrite de lúpus, síndrome da fadiga crônica e fibromialgia;
distúrbios endocrinológicos, tais como doença de Graves, tiroidite de Hashimoto e tiroidite subaguda e infecções virais, tais como paraparese tópica espástica.
Em uma forma de realização particular da invenção, o paciente sendo administrado com o anticorpo é adicionalmente tratado com um ou mais outros agentes terapêuticos, tais como agentes imunossupressores, agentes anti-inflamatórios, agentes quimioterápicos, agentes citotóxicos ou outros agentes que servem para intensificar o efeito terapêutico do anticorpo.
Ainda em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método para a detecção in vitro ou in vivo da presença de CD25 em uma
amostra ou indivíduo, por exemplo, para o diagnóstico de uma doença relacionada com CD25, preferivelmente em um estágio precoce. Isto também pode ser útil para o monitoramento da doença e do efeito do tratamento com um anticorpo anti-CD25 e para a determinação e para o ajuste da dose do anticorpo a ser administrado. Em uma forma de realização, a detecção da presença de CD25 em uma amostra é atingida pelo contato com uma amostra 25 a ser testada, opcionalmente junto com uma amostra de controle, com um anticorpo monoclonal humano da invenção sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo e o CD25. A formação do complexo é então detectada (por exemplo, usando-se ELISA, citometria de fluxo ou fingimento de Western). Quando usa-se uma amostra de controle
junto com a amostra de teste, o complexo é detectado em ambas amostras e quaisquer diferenças estatisticamente significantes na formação de complexos entre as amostras é indicativo da presença de CD25 na amostra de teste. O método in vivo pode ser realizado usando-se a técnica de formação de imagem, tal como PET (tomografia de emissão de pósitron) ou SPECT (tomografia computadorizada de emissão de próton simples).
Em um outro aspecto, a invenção diz respeito a anticorpos anti-idiotípicos que ligam-se aos anticorpos monoclonais humanos da invenção. Estes anticorpos anti-idiotípicos podem ser usados como uma ferramenta de imunodiagnóstico para detectar e quantificar os níveis de anticorpos monoclonais humanos contra CD25 em amostras de laboratório ou de pacientes. Isto pode ser útil para exames farmacocinéticos do anticorpo anti-CD25 ou para a determinação e ajuste da dosagem do anticorpo antiCD25 e para o monitoramento da doença e do efeito de tratamento em um paciente.
Os anti-corpos de camundongos anti-idiotípicos podem ser fabricados, por exemplo, pela imunização de camundongos Balb/C com os anticorpos monoclonais humanos de acordo com a invenção e que geram hibridomas a partir dos baços destes camundongos por infusão com células de mieloma, tais como NS1 usando-se técnicas padrão.
Ainda, em um outro aspecto, a invenção fornece um animal não humano transgênico, tal como um camundongo transgênico, que expressa anticorpos monoclonais humanos que ligam-se ao CD25. Em uma forma de realização particular, o animal não humano transgênico é um camundongo transgênico tendo um genoma que compreende um transgene humano de cadeia pesada ou transcromossomo e um transgene humano de cadeia leve ou transcromossomo que codifica todo ou uma parte de um anticorpo da invenção. O animal não humano transgênico pode ser imunizado com uma preparação purificada ou enriquecida de antígeno CD25 e/ou células que expressam CD25. Preferivelmente, o animal não humano transgênico, por exemplo, o camundongo transgênico, é capaz de produzir isotipos múltiplos de anticorpos monoclonais humanos para CD25 (por exemplo, IgG, IgA e/ou IgM) passando pela recombinação de V-D-J e troca de isotipo. A troca de 5 isotipo pode ocorrer, por exemplo, pela troca de isotipo clássica ou não clássica.
Consequentemente, ainda em um outro aspecto, a invenção fornece células B isoladas a partir de um animal não humano transgênico
como descrito acima, por exemplo, um camundongo transgênico, que expressa anticorpos anti-CD25 humanos. As células B isoladas podem ser então imortalizadas pela fusão a uma célula imortalizada para fornecer uma fonte (por exemplo, um hibridoma) de anticorpos anti-CD25 humanos. Tais hibridomas (isto é, que produzem anticorpos anti-CD25 humanos) também estão incluídos dentro do escopo da invenção.
Como exemplificado neste, os anticorpos humanos da invenção podem ser obtidos de maneira direta a partir dos hibridomas que expressa o anticorpo ou podem ser clonados (por exemplo, a partir de hibridomas ou fago que apresenta porções de ligação de antígeno dos anticorpos) e expressados de maneira recombinante em uma célula hospedeira (por exemplo, uma célula de CHO (Ovário de Hamster Chinês) ou uma célula
NS/0). Outros exemplos de células hospedeiras são microorganismos, tais como E. coli e fungos, tais como levedura. Altemativamente, estes podem ser produzidos de maneira recombinante em um animal não humano transgênico ou vegetal. Consequentemente, em um outro aspecto, a presente invenção 25 fornece os métodos para a produção de anticorpos monoclonais humanos que ligam-se ao CD25 humano. Em uma forma de realização, o método inclui imunizar um animal não humano transgênico, por exemplo, um camundongo transgênico, como previamente descrito (por exemplo, tendo um genoma que compreende um transgene humano de cadeia pesada e um transgene humano
de cadeia leve que codifica todo ou uma porção de um anticorpo anti-CD25), com uma preparação enriquecida ou purificada de antígeno CD25 humano e/ou células que expressam CD25 humano. As células B (por exemplo, células B esplênicas) do animal são então obtidas e fundidas com as células de mieloma para a forma imortal, células de hibridoma que secretam anticorpos monoclonais humanos contra CD25.
Ainda em um outro aspecto, a invenção fornece moléculas de ácido nucléico que codificam os anticorpos anti CD25 humanos (por exemplo, regiões variáveis destes), bem como os vetores de expressão recombinante que incluem os ácidos nucléicos da invenção e células hospedeiras transfectadas com tais vetores. Os métodos para a produção dos anticorpos pelo cultivo destas células hospedeiras também são abrangidos pela invenção. Os ácidos nucléicos particulares fornecidos pela invenção compreendem as seqüências de nucleotídeo mostradas na SEQ ID N°: 1, 5, 9 ou 13 e SEQ ID N°: 3, 7, 11 ou 15 que codifica as cadeias pesadas e leves, respectivamente de anticorpos anti CD25 humanos AB1, AB7, AB11 e AB12.
Outras características e vantagens da presente invenção estarão evidentes a partir do relatório descritivo detalhado e reivindicações seguintes. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A figura 1 mostra as seqüências de aminoácido das regiões VJ de cadeia leve (capa) de anticorpos monoclonais humanos AB1, AB7, AB11 e AB12 (SEQ ID N°: 4, 8, 12 e 16, respectivamente) com CDRs designados.
A figura 2 mostra as seqüências de aminoácido das regiões VDJ de cadeia pesada de anticorpos monoclonais humanos AB1, AB7, AB11 e AB12 (SEQ ID N°: 2, 6, 10 e 14, respectivamente) com CDRs designados.
A figura 3 mostra a seqüência de aminoácido (SEQ ID N°: 2) e a seqüência de nucleotídeo correspondente (SEQ ID N°: 1) da região VDJ de cadeia pesada de anticorpo monoclonal humano AB1 com CDRs designados.
A figura 4 mostra a seqüência de aminoácido (SEQ ID N°: 4) e /11
a sequência de nucleotídeo correspondente (SEQ ID N°: 3) da região VJ de cadeia leve (capa) de anticorpo monoclonal humano AB1 com CDRs designados.
A figura 5 mostra a seqüência de aminoácido (SEQ ID N°: 6) e a seqüência de nucleotídeo correspondente (SEQ ID N°: 5) da região VDJ de cadeia pesada de anticorpo monoclonal humano AB7 com CDRs designados.
A figura 6 mostra a seqüência de aminoácido (SEQ ID N°: 8) e a seqüência de nucleotídeo correspondente (SEQ ID N°: 7) da região VJ de cadeia leve (capa) de anticorpo monoclonal humano AB7 com CDRs designados.
A figura 7 mostra a seqüência de aminoácido (SEQ ID N°: 10) e a seqüência de nucleotídeo correspondente (SEQ ID N°: 9) da região VDJ de cadeia pesada de anticorpo monoclonal humano AB11 com CDRs designados.
A figura 8 mostra a seqüência de aminoácido (SEQ ID N°: 12) e a seqüência de nucleotídeo correspondente (SEQ ID N°: 11) da região VJ de cadeia leve (capa) de anticorpo monoclonal humano AB11 com CDRs designados.
A figura 9 mostra a seqüência de aminoácido (SEQ ID N°: 14) e a seqüência de nucleotídeo correspondente (SEQ ID N°: 13) da região VDJ de cadeia pesada de anticorpo monoclonal humano AB12 com CDRs designados.
A figura 10 mostra a seqüência de aminoácido (SEQ ID N°: 16) e a seqüência de nucleotídeo correspondente (SEQ ID N°: 15) da região VJ de cadeia leve (capa) de anticorpo monoclonal humano AB12 com CDRs designados.
A figura 11 é um gráfico que mostra a inibição de IL-2 que liga-se a seu receptor, CD25, por sobrenadantes de anticorpos monoclonais humanos AB1, AB7, AB11 e AB12, em comparação com a inibição da
ligação de IL-2 por Zenapax® (daclizumab, anticorpo anti-CD25 IgGl humanizado recombinante, Roche).
A figura 12 é um gráfico que mostra a inibição de Zenapax® que liga-se ao CD25 pelos anticorpos monoclonais humanos AB1, AB7, AB11 e AB12.
A figura 13 é um gráfico que mostra a inibição da proliferação de célula T induzida pelo anticorpo anti-CD3 (usando-se PBMCs) pelos anticorpos monoclonais humanos AB1, AB7, AB12, em comparação com a inibição por um anticorpo de controle (hIgGl/κ) e Zenapax®.
A figurai4 é um gráfico que mostra a inibição de MLR pelos anticorpos monoclonais humanos AB1, AB7, AB12 em comparação com a inibição por um anticorpo de controle (hIgGl/κ) e Zenapax®.
A figura 15 mostra fotografias que usam o filtro FITC que visualiza a introversão de CD25 pelo AB12 rotulado por FITC. A figura 15A mostras os resultados para blastos de célula T pré-incubados com AB12 rotulado com FITC após 18 horas de incubação a 37° C e A figura 15B mostras os resultados para blastos de célula T cultivados por 18 horas a 37° C na presença de AB12 rotulado com FITC. Para comparação, a figura 15C mostra os resultados para blastos de célula T cultivados por 18 horas a 37° C na presença do anticorpo de controle do isotipo rotulado por FITC (antiKHL).
A figura 16 mostra a introversão de CD25 pelo A12 rotulado por FITC como medido pela citometria de fluxo onde uma razão de intensidade de fluorescência média (MFI) acima de 1 indica que a introversão acontece. A figura 16A mostras os resultados para blastos de célula T préincubados com AB12 rotulado com FITC a 4o C e 37° C, respectivamente e a figura 16B mostra o resultado de blastos de célula T cultivados na presença de AB12 rotulado por FITCa 4o C e a 37° C, respectivamente.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO <93
A presente invenção fornece terapias com base em anticorpo para o tratamento e o diagnóstico de uma variedade de distúrbios que envolvem as células que expressam CD25. As terapias da invenção utilizam os anticorpos monoclonais humanos isolados que ligam-se especificamente a 5 um epítopo presente em CD25. Tais anticorpos incluem todos os isotipos conhecidos, por exemplo, anticorpos IgA, IgGl-4, IgE, IgM e IgD.
Em uma forma de realização o anticorpo é um anticorpo IgGl, mais particularmente um isotipo IgGl,K ou IgGl,λ. Em uma outra forma de
realização, o anticorpo é um anticorpo IgG3, mais particularmente um isotipo IgG3,K ou IgG3,X. Ainda em uma outra forma de realização, o anticorpo é um anticorpo IgG4, mais particularmente um isotipo IgG4,K ou IgG4,À. Ainda, em uma outra forma de realização o anticorpo é um anticorpo IgAl ou IgA2.
Ainda em uma outra forma de realização, o anticorpo é um anticorpo IgM.
Em uma forma de realização, os anticorpos humanos são produzidos em um animal transgênico não humano, por exemplo, um camundongo transgênico, capaz de produzir isotipos múltiplos de anticorpos monoclonais humanos ao CD25 passando pela recombinação de V-D-J e troca de isotipo. Tal animal transgênico também pode ser um coelho transgênico
para a produção de anticorpos monoclonais tais como divulgado no US 2003/0017534. Conseqüentemente, a invenção também abrange anticorpos policlonais humanos que ligam-se especificamente a CD25.
Conseqüentemente, os aspectos da invenção incluem, não apenas anticorpos, fragmentos de anticorpos e composições farmacêuticas destes, mas também animais transgênicos não humanos, células B, transfectomas e hibridomas de células hospedeiras que produzem anticorpos monoclonais.
Os métodos de usar os anticorpos da invenção para bloquear ou inibir as células que expressam CD25 também são fornecidos e são úteis no tratamento de distúrbios associados com CD25. Os métodos de usar os anticorpos da invenção para a detecção de uma célula que expressa CD25 são abrangidos pela invenção.
A fim de que a presente invenção possa ser mais facilmente entendida, certos termos são definidos primeiro. As definições adicionais são 5 apresentadas por todo o relatório descritivo detalhado.
Os termos “CD25” e “antígeno CD25” são usados de maneira intercambiável neste e incluem quaisquer variantes, isoformas espécies homólogas de CD25 humano que são expressados naturalmente pelas células
ou são expressados em células transfectadas com o gene CD25.
Os sinônimos de CD25, como são reconhecidos na técnica, incluem CD25, p55 e antígeno Tac (ativação de célula T). A ligação de um anticorpo da invenção ao antígeno CD25 inibe /ou bloqueia o CD25 que ligase a seu ligando, IL-2 e, concomitantemente, a função celular deste. Por exemplo, em uma forma de realização, os anticorpos humanos da invenção 15 inibem a proliferação de célula T induzida por anticorpo anti-CD3. Em uma outra forma de realização, os anticorpos monoclonais humanos inibem MLR.
Como usado neste, o termo “inibe o desenvolvimento” (por
exemplo, refere-se à células) é pretendido incluir qualquer diminuição mensurável no desenvolvimento celular quando colocado em contato com um anticorpo anti-CD25 em comparação com o desenvolvimento das mesmas células que não estão em contato com o anticorpo anti-CD25, por exemplo, a inibição do desenvolvimento de uma cultura celular por pelo menos cerca de
10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% ou 100%.
Como usado neste, os termos “inibe a ligação” e “bloqueia a 25 ligação” (por exemplo, refere-se à inibição/bloqueio de IL-2 a CD25) são usados de maneia intercambiável e abrange a inibição/bloqueio tanto parcial quanto completa. A inibição/bloqueio da ligação de IL-2 ao CD25 preferivelmente reduz ou altera o nível normal ou o tipo de sinalização celular que ocorre quando o IL-2 liga-se ao CD25 sem inibição ou bloqueio.
A inibição e o bloqueio também são pretendidos incluir qualquer diminuição mensurável na afinidade de ligação de IL-2 a CD25 quando em contato com o anticorpo anti-CD25 em comparação com o ligando que não está em contato com um anticorpo anti-CD25, por exemplo, o 5 bloqueio da ligação de IL-2 ao CD25 por pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% ou 100%.
O termo “anticorpo” com o referido neste inclui anticorpos intactos e qualquer fragmento de ligação de antígeno (isto é, “porção de
ligação de antígeno”) ou cadeia simples deste.
Um “anticorpo” refere-se a uma glicoproteína que compreende pelo menos duas cadeias (H) pesadas e duas cadeias (L) leves interconectadas por ligações de bissulfeto ou uma porção de ligação de antígeno destes. Cada cadeia pesada é compreendida de uma região variável de cadeia pesada (abreviado neste como VH) e uma região de constante de cadeia pesada. Cada cadeia leve é compreendida de uma região variável de cadeia leve (abreviado neste como VL) e uma região de constante de cadeia leve. As regiões de VH e
VL podem ser ainda sub-divididas em regiões de hipervariabilidade, regiões de determinação complementarmente denominadas (CDR), intercalados com
regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de armação (FR). Cada Vh e Vl é composto de três CDRs e de quatro FRs, dispostos a partir de terminal amino a terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2,
CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias leves e pesadas contém um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina aos 25 tecidos ou fatores hospedeiros, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, células realizadoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico.
O termo “porção de ligação de antígeno” de um anticorpo (ou simplesmente “porção do anticorpo”), como usado neste, refere-se a um ou
··♦·· ·· · · · ·· ··· ·· · • · ··· · ··· · ··· mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de ligar-se especificamente a um antígeno (por exemplo, CD25). Foi mostrado que a função de ligação de antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo intacto ou de comprimento total. Os exemplos de fragmentos de ligação abrangidos dentro do termo “porção de ligação de antígeno” de um anticorpo inclui (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste dos domínios VL, VH, CL e CHi; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de bissulfeto na região de articulação; (iii) um fragmento Fd que consiste dos domínios VH e Cri; (iv) um fragmento Fv que consiste de um domínio Vl e VH; (v) um fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544 a 546), que consiste de um domínio VH; (vi) uma região de determinação complementarmente isolada (CDR) e (vii) uma combinação de dois ou mais CDRs isolados que podem ser opcionalmente unidos por um ligador sintético. Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, são codificados pelos genes separados, estes podem ser unidos, usando-se métodos recombinantes, por um ligador sintético que o permite ser fabricado como uma cadeia de proteína simples em que o par de regiões Vl e VH formam moléculas monovalentes (conhecidas como Fv (scFv) de cadeia simples; ver por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423 a 426 e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5879-5883). Tais anticorpos de cadeia simples também são pretendidos estarem abrangidos pelo termo “porção de ligação de antígeno” de um anticorpo. Um outro exemplo são as proteínas de fusão de imunogiobulina do domínio de ligação que compreende 25 (i) um domínio de ligação de polipeptídeo que é fundido a um polipeptídeo de região de articulação de imunogiobulina, (ii) uma região de constante de CH2 de cadeia pesada de imunogiobulina fundida à região de articulação e (iii) uma região de constante de CH3 de cadeia pesada de imunogiobulina fundida à região de constante de CH2. O polipeptídeo de domínio de ligação pode ser
uma região variável de cadeia pesada ou uma região variável de cadeia pesada. As proteínas de fusão de imunoglobulina de domínio de ligação ainda são divulgadas no US 2003/0118592 e no US 2003/0133939. Estes fragmentos de anticorpo são obtidos usando-se técnicas convencionais conhecidas pela pessoa habilitada na técnica e os fragmentos são avaliados
quanto a utilidade da mesma maneira como são anticorpos intactos.
O termo “epítopo” significa uma proteína determinante capaz de ligação específica a um anticorpo. Os epítopos, usualmente consistem de agrupamentos de superfície quimicamente ativa de moléculas tais como aminoácidos ou cadeia secundárias de açúcar e usualmente têm características de estruturas tri-dimensionais específicas, bem como características de carga específicas.
Os epítopos conformacionais e não conformacionais são distinguidos em que a ligação ao formador mas não último é perdida pelo 15 tratamento com a desnaturação dos solventes.
O termo “molécula biespecífica” é pretendido incluir qualquer agente, por exemplo, uma proteína, peptídeo ou proteína ou complexo de peptídeo, que têm duas especificidades de ligação diferentes. Por exemplo, a
molécula pode ligar-se a ou interagir com, (a) um antígeno de superfície celular e (b) um receptor de Fc na superfície de uma célula realizadora.
O termo “molécula multiespecífica” ou molécula “heteroespecífica” é pretendida incluir qualquer agente, por exemplo, uma proteína, peptídeo ou complexo de proteína ou de peptídeo, que tem mais do que duas especificidades de ligação diferentes. Por exemplo, A molécula pode 25 ligar-se a ou interagir com, (a) um antígeno de superfície celular, (b) um receptor de Fc na superfície de uma célula realizadora e (c) pelo menos um outro componente. Conseqüentemente, a invenção inclui, mas não é limitada a, moléculas biespecífica, triespecífica, tetraespecífica e outras moléculas multiespecífica que são direcionadas ao CD25 e a outros alvos, tais como • ♦♦· ·»···· • * ··· · ······ ··· ♦♦· ·· · • · ·«··«··« * « · · · « · · · « 4 • * · « ♦ · ··· · *·« receptores de Fc nas células realizadoras.
O termo “anticorpos biespecíficos” também incluem diacorpos. Os diacorpos são anticorpos bivalentes, biespecíficos em que os domínios VH e Vl são expressados em uma cadeia de polipeptídeo simples, mas usando-se um ligador que é muito curto para permitir a união entre os dois domínios na mesma cadeia, forçando, desse modo que os domínios para união com os domínios complementares de uma outra cadeia e criem dois locais de ligação de antígeno (ver, por exemplo, Holliger, P., et al. (1993)
Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Stmcture 2:1121-1123).
O termo “derivados de anticorpo humano” referem-se a qualquer forma modificada do anticorpo, por exemplo, um conjugado do anticorpo e um outro agente ou anticorpo.
O termo “anticorpo humano”, como usado neste, é pretendido incluir anticorpos tendo regiões variáveis e constantes derivadas das seqüências de imunoglobulina de linhagem germinal humana. Os anticorpos humanos da invenção também podem incluir resíduos de aminoácido não codificados pelas seqüências de imunoglobulina de linhagem germinal
humana (por exemplo, as mutações introduzidas pela mutagênese aleatória ou específica do local in vitro ou pela mutação somática in vivo). Entretanto, o termo, “anticorpo humano”, como usado neste, não é pretendido incluir anticorpos em que as seqüências de CDR derivadas da linhagem germinal de uma outra espécie de mamífero, tal como um camundongo, foram enxertadas nas seqüências de armação humanas.
Os termos “ anticorpo monoclonal” ou “composição de anticorpo monoclonal” como usado neste refere-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular simples. Uma composição de anticorpo monoclonal apresenta uma especificidade e afinidade de ligação simples a um epítopo particular. Conseqüentemente, o termo “anticorpo
*·· · ·· α · • *· · « · · • ·r · • · · · ·5 • ♦ · « 9 ·« • ♦·· · ··< * monoclonal humano” refere-se a anticorpos que apresentam uma especificidade de ligação simples que tem regiões variáveis e constantes derivadas das seqüências de imunoglobulina de linhagem germinal humana. Em uma forma de realização, os anticorpos monoclonais humanos são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida a partir de um animal não humano transgênico ou transcromossônico, por exemplo, um camundongo transgênico, tendo um genoma que compreende um transgene de cadeia pesada e um transgene de cadeia leve humanos, fundidos a uma célula imortalizada.
O termo “anticorpo humano recombinante”, como usado neste, inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressados, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como (a) anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou transcromossômico para os genes de imunoglobulina humanos ou um hibridoma preparado a partir destes (descritos ainda na Seção I abaixo), (b) anticorpos isolados a partir de uma célula hospedeira transformados para expressar o anticorpo, por exemplo, a partir de um transfectoma, (c) anticorpos isolados a partir de uma biblioteca de anticorpo humano combinatório recombinante, e (d) anticorpos preparados, expressados, criados ou isolados por quaisquer outros meios que envolvem a divisão das seqüências de gene de imunoglobulina humanas a outras seqüências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis e constantes derivadas das seqüências de imunoglobulina de linhagem germinal humana. Em certas formas de realização, entretanto, tais anticorpos humanos recombinantes podem ser submetidos à mutagênese in vitro (ou quando um animal transgênico para as seqüências de Ig humanas é usado, mutagênese somática in vivo} e, desta maneira, as seqüências de aminoácido das regiões VH e Vl dos anticorpos recombinantes são seqüências que, enquanto derivadas de e relacionadas com as seqüências VH e VL da linhagem germinal humana, podem não existir naturalmente dentro do repertório da linhagem germinal de anticoipo humano in vivo.
O termo “transfectoma”, como usado neste, inclui célula hospedeira eucariótica recombinante que expressa o anticorpo, tal como 5 células CHO, células NS/O, células HEK293, células vegetais ou fungos, incluindo células de levedura.
Como usado neste, um “anticorpo heterólogo” é definido em relação ao organismo não humano transgênico que produz um tal anticorpo.
Este termo refere-se a um anticorpo tendo uma seqüência de aminoácido ou uma seqüência de ácido nucléico codificadora que corresponde àquela observada em um organismo que não consiste do animal não humano transgênico e no geral, de outras espécies que não aquelas do animal não humano transgênico.
Um “anticorpo isolado” como usado neste, é pretendido para referir-se a um anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos tendo especificidades antigênicas diferentes (por exemplo, um anticorpo isolado que liga-se especificamente ao CD25 é substancialmente livre de anticorpos que ligam especificamente os antígenos que não CD25). Um
anticorpo isolado que liga-se especificamente a um epítopo, isoforma ou variante de CD25 humano pode, entretanto, ter reatividade cruzada a outros antígenos relacionados, por exemplo, a partir de outras espécies (por exemplo, homólogos de espécie de CD25). Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente livre de outro material celular e/ou produtos químicos. Em uma forma de realização da invenção, uma combinação de anticorpos monoclonais “isolados” tendo especificidades diferentes são combinados em uma composição bem definida.
Como usado neste, “ligação específica” refere-se a uma ligação de anticorpo a um antígeno pré-determinado. Tipicamente, o anticorpo liga-se com uma afinidade que corresponde a um KD de cerca de
• · · · ··· · ··· · ···
ΙΟ’8 Μ ou menos, tal como cerca de IO’9 M ou menos, cerca de IO'1 M ou menos ou cerca de IO'11 M ou ainda menos quando determinado pela tecnologia de ressonância de plasma de superfície (SPR) em um instrumento BIAcore 3000 usando-se o IL-2Ra recombinante como o ligando e o anticorpo como o analito e liga-se ao antígeno predeterminado com uma afinidade que corresponde a um KD que é pelo menos dez vezes menor, preferivelmente pelo menos 100 vezes menor do que sua afinidade para a ligação a um antígeno não específico (por exemplo, BS A, caseína) que não o
antígeno predeterminado ou um antígeno intimamente relacionado. As frases “um anticorpo que reconhece um antígeno” e “um anticorpo específico para um antígeno” são usados de maneira intercambiável neste com o termo “um anticorpo que liga-se especifícamente a um antígeno”.
O termo ”kd” (seg-1), como usado neste, é pretendido referir-se à constante de razão de equilíbrio de dissociação de uma interação de antígeno de anticorpo particular. O dito valor também é referido como o valor koff·
O termo “ka” (M'1 x seg’1), como usado neste, é pretendido referir-se à constante de razão de equilíbrio associação de uma interação de
antígeno de anticorpo particular.
O termo “KD” (M), como usado neste, é pretendido referir-se à constante de equilíbrio de dissociação de uma interação de antígeno de anticorpo particular.
O termo “KA” (M'1), como usado neste, é pretendido referir-se à constante de equilíbrio de dissociação de uma interação de antígeno de 25 anticorpo particular e é obtido pela divisão do ka pelo kj.
Como usado neste, “isotipo” refere-se à classe de anticorpo (por exemplo, IgM ou IgGl) que é codificado pelos genes da região constante de cadeia pesada.
Como usado neste, “troca de isotipo” refere-se ao fenômeno pelo qual a classe ou isotipo de um anticorpo muda de uma classe Ig para um das outras classes de Ig.
Como usado neste, “isotipo não trocado” refere-se à classe isotípica de cadeia pesada que é produzido quando nenhuma troca de isotipo aconteceu; o gene CH que codifica o isotipo não trocado é tipicamente o primeiro gene CH imediatamente a jusante da funcionalidade de gene VDJ redisposta. A troca de isotipo foi classificada como troca de isotipo clássica ou não clássica. A troca de isotipo clássica ocorre pelos eventos de
recombinação que envolvem pelo menos uma região de sequência de troca no transgene. A troca de isotipo não clássica pode ocorrer, por exemplo, pela recombinação homóloga entre ο σμ humano e ο Σμ humano (anulação associada com δ). Os mecanismos de troca não clássicos alternativos, tais como recombinação intertransgene e/ou intercromossômica, entre outros, podem ocorrer e realizar a troca de isotipo.
Como usado neste, o termo “sequência de troca” refere-se àquelas seqüências de DNA responsáveis pela recombinação de troca. Uma seqüência de “doador de troca”, tipicamente uma região de troca μ, será 5’ (isto é, a montante) da região de construção a ser anulada durante a
recombinação de troca. A região “receptora de troca” estará entre região de construção a ser anulada e a região de constante de substituição (por exemplo, γ, e, etc.).
Como usado neste, o “padrão de glicosilação” é definido como o padrão de unidades de carboidrato que são covalentemente ligados a uma proteína, mais especificamente a uma proteína de imunoglobulina (anticorpo). 25 Um padrão de glicosilação de um anticorpo heterólogo pode ser caracterizado como sendo substancialmente similar aos padrões de glicosilação que ocorre naturalmente nos anticorpos produzidos pelas espécies do animal não humano transgênico, quando uma pessoa de habilidade comum na técnica deve reconhecer o padrão de glicosilação do anticorpo heterólogo como sendo mais
similar ao dito padrão de glicosilação nas espécies do animal transgênico não humano do que às espécies das quais os genes de CH do transgene foram derivados.
O termo “de ocorrência natural” como usado neste como aplicado a um objeto refere-se ao fato de que objeto pode ser observado em estado natural. Por exemplo, uma seqüência de polipeptídeo ou de polinucleotídeo que está presente em um organismo (incluindo vírus) que podem ser isolados a partir de uma fonte em estado natural e que não foi intencionalmente modificada pelo homem em laboratório é de ocorrência natural.
O termo “redisposto” como usado neste refere-se a uma configuração de um local de imunoglobulina de cadeia pesada ou de cadeia leve em que um segmento V está posicionado de maneira imediatamente adjacente a um segmento D-J ou J em uma conformação que codifica, essencialmente, um domínio de VH ou VL completo, respectivamente. Um local de gene de imunoglobulina (anticorpo) redisposto pode ser identificado pela comparação com o DNA da linhagem germinal; um local redisposto terá pelo menos um elemento de homologia de heptâmero/nonâmero recombinado.
O termo “não reagido” ou “configuração de linhagem germinal” como usado neste em referência a um segmento V refere-se à configuração em que o segmento V não é recombinado a fim de ser imediatamente adjacente a um segmento D ou J.
O termo “molécula de ácido nucléico”, como usado neste, é pretendido incluir moléculas de DNA e moléculas de RNA. Uma molécula de ácido nucléico pode ser de filamento simples ou de filamento duplo, mas é preferível o DNA de filamento duplo.
O termo “molécula de ácido nucléico isolada”, como usado neste em referência aos ácidos nucléicos que codificam os anticorpos totais ou
porções de anticorpo (por exemplo, VH, VL, CDR3) que ligam-se ao CD25, é pretendido referir-se a uma molécula de ácido nucléico em que as seqüências de nucleotídeo que codificam o anticorpo intacto ou a porção de anticorpo são isentas de seqüências de nucleotídeo que codificam os anticorpos totais ou 5 porções de anticorpos que liga os antígenos que não CD25, cujas outras seqüências podem flanquear naturalmente o ácido nucléico no DNA genômico humano. Em uma forma de realização, o anticorpo humano antiCD25 inclui as regiões de aminoácido variáveis de cadeia pesada (VH) e de
cadeia leve (VL) de AB1, AB7, AB11 ou AB12 codificadas pelas seqüências de nucleotídeo mostradas na SEQ ID N°: 1, 5, 9 ou 13 e SEQ ID N°: 3, 7, 11 ou 15, respectivamente.
Como divulgado e reivindicado neste, as seqüências apresentadas na SEQ ID N°: 1 a 40 incluem “modificações de seqüência conservadoras”, isto é, nucleotídeo e seqüência de modificações de 15 aminoácido que não afetam ou alteram significantemente as características de ligação do anticorpo codificado pela seqüência de nucleotídeo ou contendo a seqüência de aminoácido. Tais modificações de seqüência conservadoras incluem substituições, adições e anulações de nucleotídeo e de aminoácido.
As modificações podem ser introduzidas na SEQ ID N°: 1 a 40 pelas técnicas padrão conhecidas na técnica, tais como mutagênese direcionada ao local e mutagênese mediada por PCR. As substituições de aminoácido conservadoras incluem uns em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia secundária similar. As famílias de resíduo de aminoácido tendo as cadeias secundárias similares foram definidas na técnica.
Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias secundárias básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias secundárias ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias secundárias polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias secundárias não polares (por exemplo, alanina,
valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias secundárias beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias secundárias aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Desta maneira, um resíduo de aminoácido não essencial 5 predito em um anticorpo humano anti-CD25 é preferivelmente substituído por um outro resíduo de aminoácido a partir da mesma família de cadeia secundária.
A presente invenção também abrange “derivados” das
seqüências de aminoácido como apresentado na SEQ ID N°: 2, 4, 6, 8, 10, 12,
14, 16el7a40e suas modificações de seqüência conservadoras, em que um ou mais dos resíduos de aminoácido foram derivados, por exemplo por acilação ou glicosilação, sem afetar ou alterar as características de ligação do anticorpo ao CD25.
Além disso, a presente invenção compreende anticorpos em 15 que uma ou mais alterações foram feitas na região Fc a fim de mudar as propriedades funcionais ou farmacocinéticas dos anticorpos. Tais alterações podem resultar em uma diminuição ou aumento da ligação de Clq e ligação de CDC ou de FcyR e citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC).
As substituições podem ser, por exemplo, realizadas em um ou mais dos resíduos de aminoácido 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 e 322 da região de constante de cadeia pesada, causando, desse modo, a alteração em uma função realizadora enquanto mantêm-se a ligação ao antígeno em comparação com o anticorpo não modificado, conforme. US 5.624.821 e US 5.648.260. Referência adicional pode ser feita ao WO 00/42072 que divulga os 25 anticorpos com regiões de Fc alteradas que aumenta ADCC e o WO 94/29351 que divulga os anticorpos tendo mutações na região de terminal N do domínio de CH2 que altera a capacidade dos anticorpos ligarem-se ao FcRI e desse modo diminui a capacidade dos anticorpos de ligarem-se ao Clq que, por sua vez diminui a capacidade dos anticorpos fixarem complemento. Além disso,
3Ò
:· : : : ·. : :·.
• · ···· · ··· · fl • · · · ··· · ··· ·
Shields et al., J. Biol. Chem. (2001) 276: 6591-6604 explica as variantes de combinação, por exemplo, T256A/S298A, S298A/E333A e
S298A/E333A/K334A, que melhora a ligação de FcyRIII.
A vida média in vivo dos anticorpos também pode ser melhorada pela modificação do epítopo de receptor de salvamento do domínio constante de Ig ou o domínio constante semelhante a Ig, de modo que a molécula não compreenda um domínio de CH2 intacto ou uma região de Ig Fc, conforme US 6.121.022 e US 6.194.551. além disso, a vida média in vivo pode ser aumentada realizando-se mutações na região de Fc, por exemplo, pela substituição da treonina por leucina na posição 252, treonina por serina na posição 254 ou treonina por fenilalanina na posição 256, conforme US 6.277.375.
Além disso, o padrão de glicosilação dos anticorpos podem ser modificados a fim de mudar a função realizadora dos anticorpos. Por exemplo, os anticorpos podem ser expressados em um transfectoma que não adiciona a unidade de fucose normalmente ligada ao carboidrato ligado na posição 297 de Fc a fim de intensificar a afinidade de Fc para FcyRIII que, por sua vez, resultará em um ADCC aumentado dos anticorpos na presença de células NK, conforme Shield et al. (2002) J. Biol. Chem., 277: 26733. Além disso, a modificação da galactosilação pode ser realizada a fim de modificar CDC. Outras referências podem ser feitas à WO 99/54342 e Umana et al., Nat. Biotechnol. (1999) 17: 176 que divulga uma linha de célula CHO projetada para o GntIII resultante na expressão de anticorpos monoclonais com glicoformas alteradas e atividade de ADCC melhorada.
Além disso, os fragmentos de anticorpo, por exemplo, fragmentos Fab; da invenção podem ser peguilados para aumentar a vida média. Isto pode ser realizado pelas reações de peguilação conhecidas na técnica, como descrito, por exemplo, em Focus on Growth Factors (1992) 3: 4 a 10; EP 154 316 eEP 401 384.
Altemativamente, em uma outra forma de realização, as mutações podem se reintroduzidas aleatoriamente junto com todo ou com parte de um anticorpo anti-CD25 que codifica a sequência, tais como pela mutagênese de saturação e os anticorpos anti-CD25 modificados resultantes 5 podem ser avaliados quanto à atividade de ligação.
Consequentemente, os anticorpos codificados pelas sequências (região variável de cadeia pesada e leve) de nucleotídeo divulgados neste e/ou contendo as sequências de aminoácido (região variável de cadeia pesada e
leve) divulgadas neste (isto é, SEQ ID N°: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 e 17 a 40) incluem anticorpos substancialmente similares codificados por ou contendo seqüências similares que foram conservativamente modificadas. Outro debate de como tais anticorpos substancialmente similares podem ser gerados com base nas seqüências parciais (isto é, regiões variáveis de cadeia pesada e leve) divulgadas como SEQ ID N°: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 e 17 a 40 é fornecido abaixo.
Para as seqüências de nucleotídeo e de aminoácido, o termo “homologia” indica o grau de identidade entre duas seqüências de ácido ou de aminoácido quando otimamente alinhadas e comparadas com inserções ou
anulações apropriadas. Altemativamente, homologia substancial existe quando os segmentos e DNA se hibridizarão sob as condições de hibridização seletivas, ao complemento do filamento. A identidade percentual entre as duas seqüências é uma função do número de posições idênticas divididas pelas seqüências (isto é,% de homologia = # de posições idênticas/total # de posições x 100), levando-se em conta o número de aberturas e o comprimento de cada abertura, que necessita ser introduzida para o alinhamento ótimo das duas seqüências. A comparação das seqüências e a determinação da identidade percentual entre as duas seqüências pode ser realizada usando-se um algoritmo matemático, como descrito nos exemplos não limitantes abaixo.
A identidade percentual entre as duas seqüências de nucleotídeo podem ser determinadas usando-se o programa GAP no GCG software package (disponível em http://www.gcg.com), usando-se uma matriz NWSgapdna.CMP e um peso de abertura de 40, 50, 60, 70 ou 80 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. A identidade percentual entre as duas 5 seqüências de nucleotídeo ou aminoácido também pode ser determinada usando-se o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:
11-17 (1988)) que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), usandose uma tabela de resíduo de peso uma tabela de resíduo de peso PAM120,
uma penalidade de comprimento de abertura de 12 e uma penalidade de abertura de 4. Além disso, a identidade percentual entre as duas seqüências de aminoácido pode ser determinada usando-se o algoritmo de Needleman and
Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 444-453 (1970)) que foi incorporado no programa
GAP no GCG software package (disponível em http://www.gcg.com), usando-se uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250 e um peso de abertura de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.
As seqüências de ácido nucléico e de proteína da presente invenção ainda podem ser usadas como uma “seqüência duvidosa” para
realizar uma busca contra bancos de dados públicos, por exemplo, para identificar seqüências relacionadas. Tais buscas podem ser realizadas usandose os programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul, et al. (1990)
J. Mol. Biol. 215: 403-10. As pesquisas de nucleotídeos BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, escore = 100, comprimento de palavra = 12 para obter seqüências de nucleotídeo homologas às moléculas de ácido 25 nucléico da invenção. As pesquisas de proteína BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, escore = 50, comprimento de palavra = 3 para a obtenção de seqüências de aminoácido homólogas às moléculas de proteína da invenção. Para obter alinhamentos abertos para os propósitos de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul et
• · · · ··· · ··· · ··· al., (1997) NucleicAcids Res. 25 (17): 3389-3402. Quando utiliza-se os programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros de ausência dos programas respectivos (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados, ver http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Os ácidos nucléicos podem estar presentes em células totais, em um lisado de células ou em uma forma parcialmente purificada ou substancialmente pura. Um ácido nucléico é “isolado” ou “tomado substancialmente puro” quando purificado além dos outros componentes
celulares ou outros concomitantes, por exemplo, outros ácidos nucléicos celulares ou proteínas, por técnicas padrão, incluindo tratamento alcalino/SDS, ligação de CsCl, cromatografia de coluna, eletroforese em gel de agarose e outros bem conhecidos na técnica. Ver, F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley
Interscience, New York (1987).
As composições de ácido nucléico da presente invenção, enquanto ffeqüentemente em uma seqüência nativa (exceto para os locais de restrição modificados e outros), a partir de seu cDNA, genômico ou misturas destes, podem ser mutados de acordo com as técnicas padrão para melhorar as
seqüências genéticas. Para codificar as seqüências, estas mutações, podem afetar a seqüência de aminoácido como desejado. Em particular, as seqüências de DNA substancialmente homólogas a ou derivadas da constante de V, D, J, mudam e as outras seqüências descritas neste são abrangidas (onde “derivado” indica que uma seqüência é idêntica ou modificada a partir de outra seqüência).
Um ácido nucléico está “operavelmente ligado” quando ele é colocado em uma relação funcional com uma outra seqüência de ácido nucléico. Por exemplo, um promotor ou realçador está operavelmente ligado a uma seqüência codificadora se ele afeta a transcrição da seqüência. Com respeito à transcrição de seqüências reguladoras, operavelmente ligado
MO significa que as seqüências de DNA que estão ligadas são contíguas e, onde necessário unir duas regiões codificadoras de proteína, contíguas e na matriz de leitura. Para comutar seqüências, operavelmente ligado indica que as seqüências são capazes de efetuar a recombinação de comutação.
O termo “vetor,” como aqui usado, é intencionado a referir-se a uma molécula de ácido nucléico capaz de transportar um outro ácido nucléico ao qual ele foi ligado. Um tipo de vetor é um “plasmídeo”, que refere-se a uma alça de DNA de filamento duplo circular em que segmentos
de DNA adicionais podem ser ligados. Um outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem bacteriana de replicação e vetores de mamífero epissômicos). Outro vetores (por exemplo, vetores que não de mamífero 15 epissômicos) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira na introdução na célula hospedeira e deste modo são replicados junto com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais eles são operativamente ligados. Tais vetores
são aqui aludidos como “vetores de expressão recombinantes” (ou simplesmente, “vetores de expressão”). No geral, vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinantes estão freqüentemente na forma de plasmídeos. No presente relatório descritivo, “plasmídeo” e “vetor” podem ser usados intercambiavelmente visto que o plasmídeo é a forma mais comumente usada de vetor. Entretanto, a invenção é intencionada a incluir outras tais formas de vetores de expressão, tais como vetores virais (por exemplo, retrovírus defeituosos em replicação, adenovírus e vírus adenoassociados), que servem a funções equivalentes.
O termo “célula hospedeira recombinante” (ou simplesmente “célula hospedeira”), como aqui usado, é intencionado a referir-se a uma • ♦ ·>···· *·· · · • · · · · ·· · ··«··· • · ♦ · · *·* · · · célula na qual um vetor de expressão recombinante foi introduzido. Deve ser entendido que tais termos são intencionados a referir-se não apenas à célula objeto particular mas também à progênie de uma tal célula. Porque certas modificações podem ocorrer em gerações sucessivas devido à mutação ou 5 influências ambientais, tal progênie de fato pode não ser idêntica à célula precursora, mas estão ainda incluídas dentro do escopo do termo “célula hospedeira” como aqui usado. Células hospedeiras recombinantes incluem, por exemplo, transfectomas, tais como Células CHO e células NS/0.
Como aqui usado, o termo “paciente” inclui qualquer animal humano ou não humano. O termo “animal não humano” inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, ovelha, cão, vaca, galinhas, anfíbios, répteis, etc.
O termo “animal transgênico, não humano” refere-se a um animal não humano tendo um genoma que compreende um ou mais transgenes ou transcromossomas de cadeia pesada e/ou leve humana (integrados ou não integrados no DNA genômico natural do animal) e que é capaz de expressar anticorpos totalmente humanos. Por exemplo, um camundongo transgênico pode ter um transgene de cadeia leve humana e um
transgene de cadeia pesada humana ou transcromossoma de cadeia pesada humana, de modo que o camundongo produz anticorpos anti CD25 humanos quando imunizados com antígeno CD25 e/ou células que expressam CD25. O transgene e/ou transcromossoma de cadeia pesada e leve humana podem ser integrados no DNA cromossômico do camundongo ou mantido extracromossomicamente. Tais camundongos transgênicos e transcromossômicos (coletivamente aqui aludido como “camundongos transgênicos”) são capazes de produzir isotipos múltiplos de anticorpos monoclonais humanos ao CD25 (por exemplo, IgG, IgA, IgM, IgD e/ou IgE) passando pela recombinação VD-J e comutação de isotipo. Animal transgênico, não humano também pode ser usado para a produção de um
anticorpo anti-CD25 específico pela introdução de genes que codificam tal anticorpo anti-CD25 específico, por exemplo ligando-se operativamente os genes a um gene que seja expressado no leite do animal. Vários aspectos da invenção são descritos em mais detalhes nas seguintes subseções.
I. Produção de Anticorpos humanos para CD25
Anticorpos monoclonais humanos da invenção podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo metodologia de anticorpo monoclonal convencional, por exemplo, a técnica de hibridização
de célula somática padrão de Kohler e Milstein, Nature 256: 495 (1975). Embora os procedimentos de hibridização de célula somática sejam preferidos, em princípio, outras técnicas para a produção de anticorpo monoclonal podem ser utilizadas, por exemplo, transformação viral ou oncogênica de linfócitos B ou técnicas de demonstração de fago usando bibliotecas de genes de anticorpo humano.
O sistema de animal preferido para preparar hibridomas que secretem anticorpos monoclonais humanos é o sistema de murino. A produção de hibridoma no camundongo é um procedimento muito bem estabelecido. Os protocolos de imunização e as técnicas para a isolação de esplenócitos imunizados para a fusão são conhecidos na técnica. Os parceiros de fusão (por exemplo, células de mieloma de murino) e procedimentos de fusão também são conhecidos.
Em uma forma de realização preferida, anticorpos monoclonais humanos direcionados contra CD25 podem ser gerados usando camundongos transgênicos ou transcromossômicos que carregam partes do 25 sistema imune humano ao invés do sistema de camundongo. Estes camundongos transgênicos e transcromossômicos incluem camundongos aqui aludidos como camundongos HuMAb, por exemplo camundongos HCo7 e HCol2 e camundongos KM, respectivamente e são aqui coletivamente aludidos como “camundongos transgênicos.”
• · · ♦·· ··«··· • · · · · ·· * ······ • · · · · ··· · · · • · ··· · ··· · ···
O camundongo HuMAb contém um minilocal de gene da imunoglobulina humana que codifica as sequências de imunoglobulina de cadeia pesada (μ e γ) e leve κ humana não arranjadas, junto com mutações alvejadas que inativam os locais endógeno e de cadeia κ (Lonberg, N. et al. 5 (1994) Nature 368 (6474): 856 a 859). Conseqüentemente, os camundongos exibem expressão reduzida de IgM ou de cadeia leve κ de camundongo e em resposta à imunização, os transgenes de cadeia pesada e leve humana introduzidos, sofrem a comutação de classe e mutação somática para gerar
anticorpos monoclonais de IgG,K humanos de alta afinidade (Lonberg, N. et al. (1994), supra; revisado em Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental
Pharmacology 113: 49 a 101; Lonberg, N. e Huszar, D. (1995) Intem. Rev.
Immunol. Vol. 13: 65 a 93 e Harding, F. e Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y.
Acad. Sei 764: 536 a 546). A preparação de camundongos HuMAb está descrita em detalhes em Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:
6287 a 6295; Chen, J. et al (1993) Intemational Immunology 5: 647 a 656;
Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152: 2912 a 2920; Lonberg N. et al., (1994)
Nature 368 (6474): 856 a 859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental
Pharmacology 113: 49 a 101; Taylor, L. et al. (1994) Intemational
Immunology 6: 579 a 591; Lonberg, N. e Huszar, D. (1995) Intem. Rev.
Immunol. Vol. 13: 65 a 93; Harding, F. e Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y.
Acad. Sei 764: 536 a 546; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology
14: 845 a 851. ver ainda, US 5.545.806, US 5.569.825, US 5.625.126, US
5.633.425, US 5.789.650, US 5.877.397, US 5.661.016, US 5.814.318, US
5.874.299, e US 5.770.429; todas concedidas a Lonberg e Kay, assim como a
US 5.545.807 concedida a Surani et al.·, WO 98/24884, WO 94/25585, WO
93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 e WO 01/09187.
Os camundongos HCo7 têm um rompimento JKD em seus genes de cadeia leve (capa) endógenos (como descritos em Chen et al. (1993) EMBO J. 12: 821 a 830), um rompimento CMD nos seus genes de cadeia
·· · ···· · ·· · ♦ · : : .·’ • · · · ··· · ··· · ··· pesada endógenos (como descrito no Exemplo 1 da WO 01/14424), um transgene de cadeia leve capa humana KCo5 (como descrito em Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845 a 851) e um transgene de cadeia pesada humana HCo7 (como descrito na US 5.770.429).
Os camundongos HCol2 têm um rompimento JKD em seus genes de cadeia leve (capa) endógenos (como descrito em Chen et al. (1993) EMBO J. 12: 821 a 830), um rompimento CMD nos seus genes de cadeia pesada endógenos (como descrito no Exemplo 1 da WOO1/14424 por Korman
et al.), um transgene de cadeia leve capa humana KCo5 (como descrito em Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845 a 851) e um transgene de cadeia pesada humana HCol2 (como descrito no Exemplo 2 da WO 01/14424 por Korman et al.). Na cepa de camundongo KM, o gene de cadeia leve capa de camundongo endógena foi homozigoticamente rompido como descrito em
Chen et al. (1993) EMBO J. 12: 811 a 820 e o gene de cadeia pesada de camundongo endógeno foi homozigoticamente rompido como descrito no
Exemplo 1 da WO 01/09187. Esta cepa de camundongo carrega um transgene de cadeia leve capa humana, KCo5, como descrito em Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845 a 851. Esta cepa de camundongo também
carrega um transcromossoma de cadeia pesada humana composto do fragmento de cromossoma 14 hCF (SC20) como descrito na WO 02/43478.
Imunizações
Para gerar anticorpos monoclonais totalmente humanos para
CD25, camundongos transgênicos ou transcromossômicos contendo genes da imunoglobulina humana (por exemplo, camundongos HCol2, HCo7 ou KM) 25 podem ser imunizados com uma preparação enriquecida de antígeno CD25,
CD25 recombinante e/ou células que expressam CD25, como descritos, por exemplo, por Lonberg et al. (1994), supra; Fishwild et al. (1996), supra e na WO98/24884.
Altemativamente, camundongos podem ser imunizados com • · • · ·
DNA que codifica CD25 humano. Preferivelmente, os camundongos terão de 6 a 16 semanas de idade na primeira infusão. Por exemplo, uma preparação enriquecida do antígeno CD25 ou antígeno CD25 recombinante pode ser usada para imunizar os camundongos HuMAb intraperitonealmente. No 5 evento em que imunizações usando uma preparação purificada ou enriquecida do antígeno CD25 não resulta em anticorpos, os camundongos também podem ser imunizados com células que expressam CD25, por exemplo, uma linhagem de célula, para promover respostas imune.
Experiência acumulativa com vários antígenos tem mostrado que os camundongos transgênicos HuMAb respondem melhor quando inicialmente imunizados intraperitoneal (IP) ou subcutaneamente (SC) com células que expressam CD25 em adjuvante de Freund completo ou incompleto, seguido pelas imunizações IP (até um total de 10) com células que expressam CD25, por exemplo em solução salina tamponada com fosfato 15 (PBS). A resposta imune pode ser monitorada no curso do protocolo de imunização com amostras de soro sendo obtidas pelas sangrias retroorbitais.
O soro pode ser triado pela análise FACS (como descrito abaixo) e camundongos com títulos suficientes de imunoglobulina anti-CD25 humana
podem ser usados para as fusões. Camundongos podem ser reforçados intravenosamente com células que expressam CD25 antes, por exemplo 3 e 2 dias antes, do sacrifício e remoção do baço e linfônodo.
Geração de Hibridomas Que Produzam Anticorpos Monoclonais Humanos para CD25
Para gerar hibridomas que produzem anticorpos monoclonais 25 humanos para CD25 humano, esplenócitos e células de linfônodo de camundongos imunizados podem ser isolados e fundidos a uma linhagem de célula imortalizada apropriada, tal como uma linhagem de célula mieloma de camundongo.
Os hibridomas resultantes podem ser depois triados quanto à produção de anticorpos antígeno-específicos. Por exemplo, suspensões de célula única de linfócitos esplênicos de camundongos imunizados podem ser fundidas às células de mieloma SP2/0-Agl4 (ATCC, CRL 1581) com 50% de PEG (p/v). As células podem ser plaqueadas em aproximadamente 1 χ 105 por 5 reservatório em placa microtituladora de fundo chato, seguido por uma incubação de duas semanas em meio seletivo contendo além dos reagentes usuais 10% de soro de clone fetal, 5 Origen Hybridoma Cloning Factor (IGEN) e IX HAT (Sigma). Depois de aproximadamente duas semanas, as
células podem ser cultivadas em meio em que o HAT é recolocado com HT (Sigma). Os reservatórios individuais podem ser depois triados pelo ELISA quanto a anticorpos contendo a cadeia leve capa humana e pela análise FACS usando células que expressam CD25 quanto a especificidade de CD25. Uma vez que o desenvolvimento de hibridoma extensivo ocorre, os clones podem ser triados quanto a produção de IgG, usualmente depois de 7 a 10 dias. Os hibridomas que secretam anticorpo podem ser relacionados, mais uma vez triados e se ainda positivos quanto a IgG humana, anticorpos monoclonais anti-CD25 podem ser subclonados pelo menos duas vezes pela diluição de limitação. Os subclones estáveis podem ser depois cultivados in vitro para
gerar anticorpo em meio de cultura de tecido para a caracterização.
Geração de Transfectomas Que Produzem Anticorpos Monoclonais
Humanos para CD25
Os anticorpos humanos da invenção também podem ser produzidos em um transfectoma de célula hospedeira usando, por exemplo, uma combinação de técnicas de DNA recombinante e métodos de transfecção de gene como é bem conhecido na técnica (Morrison, S. (1985) Science 229:
1202).
Por exemplo, para expressar os anticorpos ou seus fragmentos de anticorpo, DNAs que codificam cadeias leve e pesada parciais ou de tamanho natural, podem ser obtidos pelas técnicas de biologia molecular padrão (por exemplo, amplificação por PCR, mutagênese direcionada ao sítio) e podem ser inseridos em vetores de expressão de modo que os genes sejam operativamente ligados às seqüências de controle transcricional e translacional. Neste contexto, o termo “operativamente ligado” é intencionado 5 a significar que um gene de anticorpo está ligado em um vetor de modo que as seqüências de controle transcricional e translacional dentro do vetor serve à sua função intencionada de regular a transcrição e a tradução do gene de anticorpo. O vetor de expressão e as seqüências de controle de expressão são
escolhidos para serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão usada. O gene de cadeia leve de anticorpo e o gene de cadeia pesada de anticorpo podem ser inseridos em vetores separados ou, mais tipicamente, ambos os genes são inseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes de anticorpo são inseridos no vetor de expressão pelos métodos padrão (por exemplo, ligação de sítios de restrição de complementaridade no fragmento e 15 vetor de gene de anticorpo ou ligação de extremidade abrupta se nenhum sítio de restrição estiver presente). As regiões variáveis de cadeia leve e pesada dos anticorpos aqui descritos podem ser usadas para criar genes de anticorpo de tamanho natural de qualquer isotipo de anticorpo inserindo-os em vetores de
expressão que já codificam as regiões constantes de cadeia pesada e constantes de cadeia leve do isotipo desejado de modo que o segmento Vr esteja operativamente ligado ao segmento(s) CH dentro do vetor e o segmento
VL esteja operativamente ligado ao segmento CL dentro do vetor. Adicional ou altemativamente, o vetor de expressão recombinante pode codificar um peptídeo de sinal que facilite a secreção da cadeia de anticorpo a partir de uma célula hospedeira.
O gene da cadeia de anticorpo pode ser clonado no vetor de modo que o peptídeo de sinal esteja ligado na estrutura em relação ao término amino do gene da cadeia de anticorpo. O peptídeo de sinal pode ser um peptídeo de sinal de imunoglobulina ou um peptídeo de sinal heterólogo (isto • · · • 10 é, um peptídeo de sinal de uma proteína que não a imunoglobulina).
Além dos genes de cadeia de anticorpo, os vetores de expressão recombinantes da invenção carregam seqüências reguladoras que controlam a expressão dos genes da cadeia de anticorpo em uma célula hospedeira. O termo “seqüência reguladora” é intencionada a incluir promotores, realçadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição ou tradução dos genes da cadeia de anticorpo. Tais seqüências reguladoras são descritas, por exemplo, em Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Será avaliado por aqueles habilitados na técnica que o planejamento do vetor de expressão, incluindo a seleção de seqüências reguladoras pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão da proteína desejada, etc. As seqüências reguladoras preferidas para a expressão da célula hospedeira de mamífero incluem elementos virais que direcionam altos níveis de expressão de proteína em células de mamífero, tais como promotores e/ou realçadores derivados de citomegalovírus (CMV), Vírus Símio 40 (SV40), adenovírus, (por exemplo, o promotor tardio principal de adenovírus (AdMLP)) e polioma. Altemativamente, seqüências reguladoras não virais podem ser usadas, tais como o promotor de ubiquitina ou promotor da β-globina.
Além dos genes de cadeia de anticorpo e seqüências reguladoras, os vetores de expressão recombinantes da invenção podem realizar seqüências adicionais, tais como seqüências que regulam a replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes marcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita a seleção de células hospedeiras em que o vetor foi introduzido (ver por exemplo, a Patente U.S. 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017, todas por Axel et al.). Por exemplo, tipicamente o gene marcador selecionável confere resistência aos 42 : : : : .·' .·’ • · · · · · · · · · · · ··· medicamentos, tais como G418, higromicina ou metotrexato, em uma célula hospedeira em que o vetor foi introduzido. Os genes marcadores selecionáveis preferidos incluem o gene da diidrofoliato reductase (DHFR) (para o uso em células hospedeiras dhfr com seleção/amplificação em metotrexato) e o gene 5 neo (para a seleção de G418).
Para a expressão das cadeias leve e pesada, o(s) vetor(es) de expressão que codifica(m) as cadeias pesada e leve é(são) transfectado(s) em uma célula hospedeira pelas técnicas padrão.
As várias formas do termo “transfecção” são intencionadas a abranger uma ampla variedade de técnicas habitualmente usadas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletroporação, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção com DEAE-dextrano e outros. Embora seja teoricamente possível expressar os anticorpos da invenção nas células hospedeiras procarióticas ou 15 eucarióticas, a expressão de anticorpos nas células eucarióticas e mais preferivelmente em célula hospedeiras de mamífero, é a mais preferida porque tais células eucarióticas e em particular células de mamífero, são mais prováveis do que as células procarióticas montar e secretar um anticorpo
apropriadamente dobrado e imunologicamente ativo.
As células hospedeiras de mamífero preferidas para a expressão dos anticorpos recombinantes da invenção incluem células CHO (incluindo células dhfr-CHO, descritos em Urlaub e Chasin, (1980) Proc.
Natl. Acad. Sei. USA 77: 4216 a 4220, usado com um marcador selecionável em DHFR, por exemplo, como descrito em R. J. Kaufman e P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601 a 621), células de mieloma NS/0, células COS, células HEK293 e células SP2.
Em particular para o uso com células de mieloma NS/0, um outro sistema de expressão preferido é o sistema de expressão de gene da GS (glutamina sintetase) divulgado na WO 87/04462, WO 89/01036 e EP
• · · · ··· · ··· ♦ ···
338841. Quando vetores de expressão recombinantes que codificam genes de anticorpo são introduzidos em células hospedeiras de mamífero, os anticorpos são produzidos cultivando-se as células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, 5 mais preferivelmente, a secreção do anticorpo no meio de cultura no qual as células hospedeiras são cultivadas. Os anticorpos podem ser recuperados do meio de cultura usando métodos de purificação de proteína padrão.
Outros Meios Recombinantes para Produzir Anticorpos Monoclonais
Humanos para CD25
Altemativamente os genes de anticorpo clonado podem ser expressados em outros sistemas de expressão, incluindo células procarióticas, tais como microorganismos, por exemplo E. coli para a produção de anticorpos scFv, algas, assim como células de inseto. Além disso, os anticorpos podem ser produzidos em animais transgênicos não humanos, tais 15 como no leite de ovelha e coelhos ou ovos de galinhas ou em plantas transgênicas. Ver por exemplo Verma, R., et al. (1998). Antibody engineering: Comparison of bacterial, yeast, insect and mammalian expression systems. J. Immunol. Meth. 216: 165 a 181; Pollock, et al. (1999).
Transgenic milk as a method for the production of recombinant antibodies. J.
Immunol. Meth. 231: 147 a 157; e Fischer, R., et al. (1999). Molecular farming of recombinant antibodies in plants. Biol. Chem. 380: 825 a 839.
Uso de Seqüências de Anticorpo Parcial para Expressar Anticorpos
Intactos
Os anticorpos interagem com antígenos alvo predominantemente através de resíduos de aminoácido que estão localizados nas seis CDRs de cadeia pesada e leve. Por esta razão, as seqüências de aminoácido dentro das CDRs são mais diversas entre anticorpos individuais do que as seqüências foram das CDRs. Porque as seqüências de CDR são responsáveis pela maior parte das interações anticorpo-antígeno, é possível
• · · ··· · ··· · ··· expressar anticorpos recombinantes que imitem as propriedades de anticorpos que ocorrem naturalmente específicos pela construção de vetores de expressão que incluem as seqüências de CDR do anticorpo que ocorrem naturalmente específicas enxertadas nas seqüências do esqueleto de um 5 anticorpo diferente com propriedades diferentes (ver, por exemplo,
Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332: 323 a 327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321: 522 a 525; e Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei..
U.S.A. 86: 10029 a 10033). Tais seqüências de esqueleto podem ser obtidas a
partir de base de dados de DNA públicas que incluem seqüências de gene de anticorpo da linhagem germinal. Estas seqüências de linhagem germinal diferirão das seqüências de gene de anticorpo maduras porque elas não incluirão genes variáveis completamente montados, que são formados pela união V (D) J durante a maturação da célula B. As seqüências de gene da linhagem germinal também diferirão das seqüências de um anticorpo de repertório secundário de alta afinidade que contém mutações por todo o gene variável mas tipicamente aglomerado nas CDRs. Por exemplo, mutações somáticas são relativamente não freqüentes na porção de terminal amino da região de esqueleto 1 e na porção de terminal carbóxi da região de esqueleto
4. Além disso, muitas mutações somáticas não alteram significantemente as propriedades de ligação do anticorpo. Por esta razão, não é necessário obter a seqüência de DNA inteira de um anticorpo particular de modo a recriar um anticorpo recombinante intacto tendo propriedades de ligação similares àquelas do anticorpo original (ver a WO 99/45962). A seqüência de cadeia pesada e leve parcial que transpõe as regiões CDR é tipicamente suficiente para este propósito. A seqüência parcial é usada para determinar qual variável de linhagem germinal e segmentos de gene de articulação contribuíram para os genes variáveis de anticorpo recombinado. A seqüência de linhagem germinal é depois usada para preencher em porções perdidas das regiões variáveis. As seqüências líder de cadeia pesada e leve são clivadas durante a
maturação da proteína e não contribuem para as propriedades do anticorpo final. Para adicionar seqüências perdidas, as seqüências de cDNA clonadas podem ser combinadas com oligonucleotídeos sintéticos pela ligação ou amplificação por PCR.
Altemativamente, a região variável inteira pode ser sintetizada como um conjunto de oligonucleotídeos curtos, sobrepostos e combinados pela amplificação de PCR para criar um clone de região variável totalmente sintético. Este processo tem certas vantagens tais como a eliminação ou
inclusão ou sítios de restrição particulares ou otimização de códons particulares.
As seqüências de nucleotídeo de transcritos de cadeia pesada e leve de hibridomas são usadas para planejar um conjunto de sobreposição de oligonucleotídeos sintéticos para criar seqüências V sintéticas com capacidades codificadoras de aminoácido idênticas como as seqüências 15 naturais. As seqüências de cadeia pesada e capa sintéticas podem diferir das seqüências naturais de três modos: filamentos de bases de nucleotídeo repetidas são interrompidas para facilitar a síntese de oligonucleotídeo e a amplificação por PCR; os sítios de início de tradução ótimos são incorporados
de acordo com as regras de Kozak (Kozak (1991) J. Biol. Chem. 266: 19867 a
19870); e sítios HindIII são engendrados a montante dos sítios de início de tradução.
Para as regiões variáveis tanto de cadeia pesada quanto leve, as seqüências de filamento codificador e não codificador correspondente otimizados são rompidas em 30 a 50 nucleotídeos aproximadamente no ponto 25 central do oligonucleotídeo não codificador correspondente. Assim, para cada cadeia, os oligonucleotídeos podem ser montados em conjuntos de filamento duplo sobrepostos que transpõe segmentos de 150 a 400 nucleotídeos. Os agrupamentos são depois usados como padrões para produzir produtos de amplificação pela PCR de 150 a 400 nucleotídeos. Tipicamente, um conjunto de oligonucleotídeo da região variável única será rompido em dois agrupamentos que são separadamente amplificados para gerar dois produtos de PCR sobrepostos. Estes produtos sobrepostos são depois combinados pela amplificação pela PCR para formar a região variável completa. Também pode ser desejável incluir um fragmento sobreposto da região constante de cadeia pesada ou leve (incluindo o sítio Bbsl da cadeia leve capa ou o sítio Agel da cadeia pesada gama) na amplificação pela PCR para gerar fragmentos que pode ser facilmente clonados nas construções do vetor de expressão.
As regiões variáveis de cadeia pesada e leve reconstruídas são depois combinadas com o promotor clonado, seqüência líder, seqüências de início de tradução, de região constante, 3’ não traduzida, de poliadenilação e de término de transcrição para formar construções de vetor de expressão. As construções de expressão da cadeia pesada e leve podem ser combinadas em um único vetor, co-transfectadas, transfectadas em série ou separadamente transfectadas em células hospedeiras que são depois fundidas para formar uma célula hospedeira que expresse ambas as cadeias.
Um procedimento similar pode ser seguido para enxertar novas especificidades de antígeno em um anticorpo maduro existente.
Preferivelmente, um anticorpo aceitador é escolhido que se origina do mesmo gene da linhagem germinal variável como o anticorpo doador de CDR. Uma ou mais CDRs do anticorpo doador são depois transferidos usando as técnicas descritas acima.
Os plasmídeos exemplares para o uso na construção de vetores de expressão para a IgGx humana são descritos abaixo. Os plasmídeos foram 25 construídos de modo que as seqüências de cDNA de cadeia pesada V e leve capa V amplificadas pela PCR puderam ser usadas para reconstruir minigenes de cadeia pesada e leve completos. Estes plasmídeos podem ser usados para expressar anticorpos IgGl,K ou IgG4,K completamente humanos. Os plasmídeos similares podem ser construídos para a expressão de outros • · • < · • · · · ··· · ··· · ··· isotipos de cadeia pesada ou para a expressão de anticorpos que compreendam cadeias leves lambda.
Consequentemente, em uma outra forma de realização, a invenção fornece vários métodos para preparar anticorpos anti-CD25 humanos. Em uma forma de realização, o método envolve:
preparar um anticorpo que compreende (1) regiões de esqueleto da cadeia pesada humana e CDRs da cadeia pesada humana, em que pelo menos um de uma CDR de cadeia pesada humana compreende uma
seqüência de aminoácido selecionada das seqüências de aminoácido das CDRs mostradas nas figuras de 1 a 10 (ou resíduos de aminoácido correspondentes nas SEQ ID NOs: 17 a 19, 23 a 25, 29 a 31 ou 35 a 37); e (2) regiões de esqueleto de cadeia leve humana e CDRs de cadeia leve humana, em que pelo menos um de uma CDR de cadeia leve humana compreende uma seqüência de aminoácido selecionada das seqüências de aminoácido das 15 CDRs mostradas nas figuras de 1 a 10 (ou resíduos de aminoácido correspondentes nas SEQ ID NOs: 20 a 22, 26 a 28, 32 a 34, ou 38 a 40); em que o anticorpo retém uma capacidade de ligar-se a CD25.
A capacidade do anticorpo para ligar a CD25 pode ser depois
determinada usando ensaios de ligação padrão, tais como aqueles apresentados nos Exemplos (por exemplo, uma análise FACS).
Visto que é bem conhecido na técnica que os domínios de
CDR3 da cadeia pesada e leve de anticorpo desempenham um papel particularmente importante na especificidade/afinidade de ligação de um anticorpo para um antígeno, os anticorpos recombinantes da invenção preparados como apresentados acima preferivelmente compreende as CDR3s de cadeia pesada e leve de AB1, AB7, AB11, ou AB12. Os anticorpos ainda podem compreender as CDR2s de AB1, AB7, AB11, ou AB12. Os anticorpos ainda podem compreender as CDRls de AB1, AB7, AB11 ou AB12. Conseqüentemente, a invenção ainda fornece anticorpos anti-CD25 que
• · ♦ ♦·· · ·· · · · • · · · · ·♦ · ··<··· • ···· » · · · · · • · · · · « ··· · *·· compreendem: (1) regiões de esqueleto da cadeia pesada humana, uma região
CDR1 de cadeia pesada humana, uma região CDR2 de cadeia pesada humana e uma região CDR3 de cadeia pesada humana, em que uma região CDR3 de cadeia pesada humana é a CDR3 de AB1, AB7, AB11 ou AB12 como 5 mostrado nas figuras de 1 a 10 (ou resíduos de aminoácido correspondentes como mostrado nas SEQ ID NOs: 19, 25, 31 ou 37); e (2) regiões de esqueleto de cadeia leve humana, uma região CDR1 de cadeia leve humana, uma região CDR2 de cadeia leve humana e uma região CDR3 de cadeia leve
humana, em que uma região CDR3 de cadeia leve humana é a CDR3 de AB1, AB7, AB11 ou AB12 como mostrado nas figuras de 1 a 10 (ou resíduos de aminoácido correspondentes como mostrado nas SEQ ID NOs: 22, 28, 34 ou
40), em que o anticorpo se liga a CD25. O anticorpo pode ainda compreender a cadeia pesada CDR2 e/ou a cadeia leve CDR2 de AB1, AB7, AB11 ou
AB12. O anticorpo pode ainda compreender a cadeia pesada CDR1 e/ou a 15 cadeia leve CDR1 de AB 1, AB7, AB 11 ou AB 12.
Preferivelmente, a CDR1, 2 e/ou 3 dos anticorpos engendrados descritos acima compreendem a(s) seqüência(s) de aminoácido exata(s) como aquela(s) de AB1, AB7, AB11 ou AB12 aqui divulgadas. Entretanto, o
técnico ordinariamente habilitado avaliará que algum desvio das seqüências de CDR exatas de AB1, AB7, AB11 ou AB12 pode ser possível embora ainda retenha a capacidade do anticorpo para ligar CD25 eficazmente (por exemplo, substituições conservativas). Conseqüentemente, em uma outra forma de realização, o anticorpo engendrado pode ser composto de uma ou mais CDRs que são, por exemplo, 90%, 95%, 98% ou 99,5% homólogas a uma ou mais
CDRs de AB1, AB7, AB11 ou AB12.
Além disso ou alternativa para ligar simplesmente CD25, os anticorpos engendrados tais como aqueles descritos acima podem ser selecionados quanto a sua retenção de outras propriedades funcionais de anticorpos da invenção, tais como:
• · · * ♦ 1 · · < · V · (1) ligação de alta afinidade para CD25;
(2) inibição ou bloqueio de ligação de CD25 a IL-2;
(3) eliminação de células T que expressam CD25;
(4) tolerização de células T;
(5) inibição da proliferação de células T que expressam CD25;
(6) inibição de proliferação de célula T induzida por anticorpo anti-CD3 de PBMCs;
(7) inibição de MLR; e/ou
(8) introversão de CD25 expressada em células T.
Caracterização da Ligação de Anticorpos Monoclonais Humanos para
CD25
Anticorpos anti CD25 humanos da invenção podem ser isolados e caracterizados em vários modos diferentes. Por exemplo, hibridomas selecionados podem ser cultivados em frascos adequados para a 15 purificação de anticorpo monoclonal. Os sobrenadantes podem ser depois filtrados e concentrados antes da cromatografia de afinidade com proteína Asepharose (para anticorpos isotipo IgGl) (Pharmacia, Piscataway, NJ) ou sepharose revestida com IgG anti-humana ou proteína G-sepharose no caso de
anticorpos do isotipo IgG3. As IgG eluídas podem ser checadas pela eletroforese em gel e cromatografia líquida de alto desempenho para garantir a pureza. A solução tampão podem ser mudada em PBS e a concentração pode ser determinada pela OD280 usando coeficiente de extinção de 1,43. Os anticorpos monoclonais podem ser aliquotados e armazenados a -80° C.
Para determinar se os anticorpos monoclonais anti-CD25 humanos selecionados se ligam aos epítopos únicos, a mutagênese direcionada ao sítio ou direcionada ao sítio múltiplo pode ser usada.
Para determinar o isotipo de anticorpos purificados, ELISAs de isotipo podem ser realizados. Os reservatórios de placas de microtítulo podem ser revestidas com 10 pg/ml de Ig anti-humana durante a noite a 4o C.
• · · »·· ···*»· • · * * ·*·· ······ • ·· ♦ · ·· V · · · • t Λ · · 4 · · · ··· • 'f e *·· · · · r 4 · t ·
Depois do bloqueio com 5% de BSA (albumina sérica bovina), as placas são reagidas com 10 pg/ml de anticorpos monoclonais ou controles de isotipo purificado, na temperatura ambiente durante duas horas. Os reservatórios podem ser depois reagidos com IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4, IgE, IgAl, IgA2 humanas ou sondas conjugadas a fosfatase alcalina específica de IgM humana. Depois da lavagem, as placas são desenvolvidas com substrato pNPP (1 mg/ml) e analisadas pela OD a 405 nm.
De modo a demonstrar a presença de anticorpos anti-CD25 nos soros de camundongos imunizados ou a ligação de anticorpos monoclonais às células vivas que expressam a CD25, a citometria de fluxo pode ser usada. Em resumo, as linhagens de célula que expressam CD25 (cultivadas em condições de cultivo padrão) são misturadas com várias concentrações de anticorpos monoclonais em PBS contendo 0,1% de BSA e 0,02% de azida de sódio e incubados a 4o C por 30 minutos. Depois da lavagem, as células são reagidas com anticorpo IgG anti-humano rotulado com fluoresceína sob as mesmas condições como o fingimento com anticorpo primário. As amostras podem ser analisadas pela citometria de fluxo com um citômetro de fluxo (por exemplo, Becton Dickinson FACS instrument) usando as propriedades de dispersão de luz e lateral para controlar células vivas únicas. Um ensaio alternativo usando a microscopia de fluorescência pode ser usado (além ou ao invés) do ensaio de citometria de fluxo. As células podem ser tingidas exatamente como descrito acima e examinadas pela microscopia de fluorescência. Este método permite a visualização de células individuais, mas pode ter a sensibilidade diminuída dependendo da densidade do antígeno.
As IgGs anti-CD25 humanas podem ser ainda testadas quanto a reatividade com antígeno CD25 pelo Western blotting. Em resumo, os extratos de célula de células que expressam CD25 podem ser preparados e submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio (SDS). Depois da eletroforese, os antígenos separados serão transferidos para membranas de nitrocelulose, bloqueados com 20% de leite desnatado e sondados com os anticorpos monoclonais a serem testados. A ligação de IgG humana pode ser detectada usando IgG anti-humana alcalino fosfatase e desenvolvidos com tabletes de substrato de BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St.
Louis, MO).
Inibição da Atividade de Células Que Expressam CD25
Além de se ligar especificamente a CD25, os anticorpos antiCD25 monoclonais humanos podem ser testados quanto a sua capacidade para
inibir várias atividades de células, tais como célula T e outros linfócitos, que expressam CD25. Por exemplo, os ensaios de proliferação de célula T podem ser realizados usando técnicas conhecidas. Em uma técnica, PBMCs humanas são diluídas em um meio adequado e depois estimuladas, por exemplo, com um anticorpo anti-CD3, antes de adicionar concentrações variáveis dos anticorpos experimentais para determinar o efeito que elas têm sobre a 15 proliferação de célula T. A proliferação de célula T de células T purificadas também pode ser avaliada na presença de anticorpos monoclonais anti-CD3 e anti-CD28.
Os ensaios para MLR também podem ser conduzidos usando
técnicas conhecidas. Por exemplo, PBMCs de um primeiro doador podem ser irradiadas e misturadas com PBMCs de um segundo doador. As concentrações variáveis de anticorpo podem ser depois adicionadas às células, seguidas pelas medições da resposta MLR.
II. Produção de Animais Não Humanos Transgênicos Que Geram Anticorpos
Anti-CD25 Monoclonais Humanos
Já em um outro aspecto, a invenção fornece animal não humanos transgênicos e transcromossômico, tais como camundongos transgênicos ou transcromossômicos, que são capazes de expressar anticorpos humanos que especificamente se ligam a CD25. Em uma forma de realização particular, a invenção fornece um camundongo transgênico ou
• · · · • · · · ·· · · transcromossômico tendo um genoma que compreende um transgene de cadeia pesada humana, de modo que o camundongo produz anticorpos anti CD25 humanos quando imunizados com células que expressam CD25. Um transgene de cadeia pesada humana pode ser integrado no DNA 5 cromossômico do camundongo, como é o case para transgênicos, por exemplo, camundongos HuMAb, como aqui descrito em detalhes e exemplificados. Altemativamente, um transgene de cadeia pesada humana pode ser mantido extracromossomicamente, como é o caso para camundongos
transcromossômicos (por exemplo, KM) como descrito na WO02/43478. Tais animais transgênicos e transcromossômicos são capazes de produzir isotipos múltiplos de anticorpos monoclonais humanos para CD25 (por exemplo, IgG, IgA e/ou IgE) passando pela recombinação V-D-J/V-J e comutação de isotipo. O planejamento de um animal não humano transgênico ou transcromossômico que responde ao estímulo de antígeno estranho com um 15 repertório de anticorpo heterólogo, requer que os transgenes de imunoglobulina heteróloga contidos dentro do animal transgênico funcione corretamente por todo o caminho do desenvolvimento de célula B. Isto inclui, por exemplo, a comutação de isotipo do transgene de cadeia pesada
heterólogo. Conseqüentemente, transgenes são construídos de modo que a comutação de isotipo possa ser induzida e uma ou mais das seguintes características de genes de anticorpo: (1) expressão de alto nível e específico do tipo de célula, (2) rearranjo de gene funcional, (3) ativação e resposta à exclusão alélica, (4) expressão de um repertório primário suficiente, (5) transdução de sinais, (6) hipermutação somática (7) domínio do local de 25 anticorpo de transgene durante a resposta imune.
Nem todos os critérios precedentes precisam ser atingidos. Por exemplo, nestas formas de realização em que os locais de imunoglobulina endógena do animal transgênico são funcionalmente rompidos, o transgene não precisa ativar a exclusão alélica. Além disso, nestas formas de realização • ··· · ··· · em que o transgene compreende um gene de imunoglobulina de cadeia pesada e/ou leve funcionalmente rearranjado, o segundo critério de rearranjo de gene funcional é desnecessário, pelo menos para aquele transgene que já é rearranjado.
Para os fundamentos sobre imunologia molecular, ver,
Fundamental Immunology, 2a edição (1989), Paul William E., ed. Raven
Press, N. Y.
Em certas formas de realização, os animais não humanos
transgênicos ou transcromossômicos usados para gerar os anticorpos monoclonais humanos da invenção contêm transgenes de imunoglobulina heterólogos de cadeia pesada e leve rearranjados, não rearranjados ou uma combinação de rearranjados e não rearranjados na linhagem germinal dos animais transgênicos. Cada um dos transgenes de cadeia pesada compreende pelo menos um gene CH. Além disso, o transgene de cadeia pesada pode 15 conter seqüências comutadoras de isotipo funcional, que são capazes de suportar a comutação de isotipo de um transgene heterólogo que codifica genes Ch múltiplos nas células B do animal transgênico. Tais seqüências comutadoras podem ser aquelas que ocorrem naturalmente no local de
imunoglobulina da linhagem germinal da espécie que serve como a fonte dos genes CH de transgene ou tais seqüências comutadoras podem ser derivadas daquelas que ocorrem na espécie que deva receber a construção de transgene (o animal transgênico). Por exemplo, uma construção de transgene humano que é usado para produzir um camundongo transgênico pode produzir uma ffeqüência mais alta de eventos de comutação de isotipo se ela incorpora 25 seqüências comutadoras similares àquelas que ocorrem naturalmente no local de cadeia pesada de camundongo, visto que presumivelmente as seqüências comutadoras de camundongo são otimizadas para funcionar com o sistema de enzima de recombinase comutador de camundongo, ao passo que as seqüências comutadoras humanas não o são.
As seqüências comutadoras podem ser isoladas e clonadas pelos métodos de clonagem convencionais ou podem ser sintetizadas de novo a partir de oligonucleotídeos sintéticos sobrepostos planejados com base na informação de seqüência publicada que diz respeito às seqüências da região 5 comutadora da imunoglobulina (Mills et al., Nucl. Acids Res. 15: 7305 a
7316 (1991); Sideras et al., Intl. Immunol. 1: 631 a 642 (1989)). Para cada um dos animais transgênicos precedentes, os transgenes da imunoglobulina de cadeia pesada e leve heterólogos funcionalmente rearranjados são encontrados em uma fração significante das células B do animal transgênico (pelo menos ® 10 10%).
Os transgenes usados para gerar os animais transgênicos não humanos da invenção incluem um transgene de cadeia pesada que compreende DNA que codifica pelo menos um segmento de gene variável, um segmento de gene de diversidade, um segmento de gene de união e pelo 15 menos um segmento de gene de região constante. O transgene de cadeia leve da imunoglobulina compreende DNA que codifica pelo menos um segmento de gene variável, um segmento de gene de união e pelo menos um segmento de gene de região constante. Os segmentos de gene que codificam os
segmentos de gene de cadeia leve e pesada são heterólogos ao animal transgênico em que eles são derivados dos segmentos de gene da cadeia pesada e leve da imunoglobulina que codificam DNA ou correspondem a eles, de uma espécie que não consiste do animal transgênico não humano. Em um aspecto da invenção, o transgene é construído de modo que os segmentos de gene individuais não sejam rearranjados, isto é, não rearranjados de modo a codificar uma cadeia leve ou pesada de imunoglobulina funcional. Tais transgenes não rearranjados suportam a recombinação dos segmentos de gene
V, D e J (rearranjo funcional) e preferivelmente suportam a incorporação de toda ou de uma porção de um segmento de gene da região D na cadeia pesada de imunoglobulina rearranjada resultante dentro do animal transgênico ··· · · · · · • · · · · · ·
quando exposto ao antígeno CD25.
Em uma forma de realização alternativa, os transgenes compreendem um “mini-local” não rearranjado. Tais transgenes tipicamente compreendem uma porção substancial dos segmentos C, D e J assim como um subconjunto dos segmentos de gene V. Em tais construções de transgene, as várias sequências reguladoras, por exemplo promotores, realçadores, regiões comutadoras de classe, seqüências doadoras de articulação e aceitadoras de articulação para o processamento de RNA, sinais de recombinação e outros, compreendem seqüências correspondentes derivadas do DNA heterólogo. Tais seqüências reguladoras podem ser incorporadas no transgene da mesma espécie ou de uma espécie relacionada do animal não humano usado na invenção. Por exemplo, segmentos de gene da imunoglobulina humana podem ser combinados em um transgene com uma seqüência realçadora da imunoglobulina de roedor para o uso em um camundongo transgênico. Altemativamente, seqüências reguladoras sintéticas podem ser incorporadas no transgene, em que tais seqüências reguladoras sintéticas não são homólogas a uma seqüência de DNA funcional que é conhecida ocorrer naturalmente nos genomas de mamíferos. As seqüências reguladoras sintéticas são planejadas de acordo com regras de consenso, tais como, por exemplo, aquelas que especificam as seqüências permissíveis de um sítio aceitador de articulação ou um motivo promotor/realçador. Por exemplo, um mini local compreende uma porção dos locais de imunoglobulina genômica tendo pelo menos uma supressão interna (isto é, não em um término da porção) de uma porção de DNA não essencial (por exemplo, seqüência interventora; intron ou porção desta) quando comparado com o local Ig da linhagem germinal que ocorre naturalmente.
Os animais não humanos transgênicos e transcromossômicos preferidos, por exemplo, camundongos, exibirão produção de imunoglobulina com um repertório significante, ideal e substancialmente similar àquele de um
ser humano depois de ajustar quanto ao volume.
O repertório idealmente aproximar-se-á daquele mostrado em um ser humano quando ajustado quanto ao volume, usualmente com uma diversidade pelo menos cerca de 10% tão grande, preferivelmente de 25 a 5 50% ou mais no geral, pelo menos cerca de mil imunoglobulinas diferentes (idealmente IgG), preferivelmente de 104 a 106 ou mais, será produzida, dependendo do número de regiões V, J e D diferentes introduzidas no genoma do camundongo e direcionado pela diversidade adicional gerada pelos
rearranjos de segmento de gene V (-D-) J e adições de nucleotídeo aleatório nas regiões de articulação. Tipicamente, as imunoglobulinas exibirão uma afinidade (KD) para antígenos pré selecionados abaixo de 10's M, tais como abaixo de ΙΟ'9 Μ, IO'10 M ou 10'11 M ou ainda mais baixo. Os animais não humanos transgênicos e transcromossômicos, por exemplo, camundongos, como descritos acima podem ser imunizados, por exemplo, com células que 15 expressam CD25. Altemativamente, os animais transgênicos podem ser imunizados com DNA que codificam CD25 humano. Os animais produzirão então células B que passarão pela comutação de classe por intermédio da recombinação comutadora (cis-comutação) e expressarão imunoglobulinas
reativas com CD25. As imunoglobulinas serão anticorpos humanos (também aludidos como “anticorpos de seqüência humana”), em que os polipeptídeos de cadeia pesada e leve são codificados pelas seqüências de transgene humano, que podem incluir seqüências derivadas pela mutação somática e juntas recombinatórias da região V, assim como seqüências codificadas pela linhagem germinal; estes anticorpos humanos podem ser aludidos como sendo 25 substancialmente idênticos a uma seqüência de polipeptídeo codificada por um segmento de gene VL e JL ou VH, DH e JH humanos, embora outras seqüências que não da linhagem germinal possam estar presentes como um resultado da mutação somática e juntas de recombinação V-J e V-D-J diferenciais. As regiões variáveis de cada cadeia de anticorpo são tipicamente ·· ·
pelo menos 80 porcento similares aos segmentos de gene V e J da linhagem germinal humana, e, no caso de cadeias pesadas, segmentos de gene V, D e J da linhagem germinal humana; freqüentemente pelo menos 85 por cento similares às seqüências de linhagem germinal humanas presentes no 5 transgene; freqüentemente 90 ou 95 por cento ou mais similares às seqüências de linhagem germinal humanas presentes no transgene. Entretanto, visto que as seqüências que não da linhagem germinal são introduzidas pela mutação somática e articulação VJ e VDJ, os anticorpos da seqüência humana
freqüentemente terá algumas seqüências da região variável que não são codificadas pelos segmentos de gene V, D ou J humanos como encontrado no(s) transgene(s) humano(s) na linhagem germinal dos camundongos. Tipicamente, tais seqüências que não da linhagem germinal (ou posições de nucleotídeo individuais) aglomerar-se-ão nas CDRs ou próximo a elas ou nas regiões onde as mutações somáticas são conhecidas por aglomerar.
Um outro aspecto da invenção inclui células B derivados de animais não humanos transgênicos ou transcromossômicos como descrito neste. As células B podem ser usadas para gerar anticorpos monoclonais humanos que expressam hibridomas que ligam-se com alta afinidade (por
exemplo, uma constante de equilíbrio de dissociação (KD) de menos do que 10'8 M) ao CD25 humano. Desta maneira, em uma outra forma de realização, a invenção fornece um hibridoma que produz um anticorpo humano que tem uma afinidade (KD) abaixo de 10’8 M, tal como abaixo de ΙΟ'9 Μ, 10’1 M ou 10’11 M ou mesmo inferior quando determinado pela análise scatchard de
CD25 que expressa células que usam um anticorpo monoclonal radioativamente rotulado ou pela determinação da concentração de ligação média-máxima que usa análise FACS ou, pela análise que usa ressonância de plasmônio de superfície como medida em um instrumento BIAcore.
Neste, o anticorpo monoclonal compreende uma cadeia leve de seqüência humana composta de (1) uma região variável de cadeia leve que β5 • ··· · ·· · · · • · · ··· ·· · tem uma seqüência de polipeptídeo que é substancialmente idêntica a uma seqüência de polipeptídeo codificada por um segmento de gene humano VL e um segmento humano JL e, (2) uma região constante de cadeia leve codificada por um segmento de gene CL humano; e uma cadeia pesada de 5 seqüência humana composta de um (1) uma região variável de cadeia pesada que tem uma seqüência de polipeptídeo que é substancialmente idêntica a uma seqüência de polipeptídeo codificada por um segmento de gene humano VH, uma região D e um segmento humano JH e, (2) uma região constante
codificada por um segmento de gene humano CH. Deve ser notado que os genes humanos D podem ser substancialmente alterados por recombinação e eventos de mutação somáticos de modo que a seqüência de linhagem germinal humana original não possa ser facilmente reconhecida.
O desenvolvimento de anticorpos monoclonais humanos de alta afinidade contra CD25 pode ser facilitado por um método para expandir o 15 repertório de segmentos de gene de região variável humano em um animal não humano transgênico que tem um genoma que compreende um transgene de imunoglobulina humano integrado, o dito método que compreende introduzir no genoma um transgene do gene V que compreende os segmentos
de gene da região V que não estão presentes no dito transgene de imunoglobulina humano integrado. Freqüentemente, o transgene da região V é um cromossomo artificial de levedura (YAC) que compreende uma porção de uma série de segmento de gene VH ou VL (VK) humano, como pode ocorrer naturalmente em um genoma humano ou como pode ser unidos separadamente por métodos recombinantes, que podem incluir segmentos de 25 gene V fora de ordem ou omitidos. Freqüentemente pelo menos cinco ou mais segmentos de gene V funcionais estão contidos no YAC. Nesta variação, é possível fabricar um animal transgênico produzido pelo método de expansão do repertório V, em que o animal expressa uma cadeia de imunoglobulina que compreende uma seqüência de região variável codificada por um segmento de
gene da região V presente no transgene da região V e uma região C codificada no transgene humano Ig. Por meio do método de expansão do repertório V, os animais transgênicos que têm pelo menos 5 genes V distintos podem ser gerados; assim os animais podem conter pelo menos cerca de 24 genes V ou mais. Alguns segmentos de gene V podem ser não funcionais (por exemplo, pseudogenes e outros); estes segmentos podem ser retidos ou podem ser seletivamente deletado por métodos recombinantes disponíveis ao artífice habilitado, se desejado.
Uma vez que a linhagem germinal do camundongo foi construída para conter um YAC funcional que tem um repertório de segmento
V expandido, substancialmente não presente no transgene humano Ig que contém os segmentos de gene J e C, o traço pode ser propagado e provocado em outras experiências genéticas, incluindo experiências onde o YAC funcional que tem um repertório de segmento V expandido é provocado em 15 uma linhagem germinal de animal não humano que tem um transgene humano
Ig diferente. Os YACs funcionais múltiplos que têm um repertório de segmento V expandido podem ser provocados em uma linhagem germinal
para trabalhar com um transgene humano Ig (ou transgenes humanos Ig múltiplos). Embora referido neste como transgenes YAC, tais transgenes quando integrados no genoma podem necessitar substancialmente de seqüências de levedura, tais como seqüências requeridas para resposta autônoma em levedura; tais seqüências podem ser opcionalmente removidas por engenharia genética (por exemplo, digestão de restrição e eletroforese em gel de campo pulsado ou outro método adequado) depois da resposta em 25 levedura não é mais necessário (isto é, antes da introdução em uma célula ES de camundongo ou prozigoto de camundongo). Os métodos de propagação do traço de expressão de imunoglobulina de seqüência humana, inclui produzir um animal transgênico que tem o(s) transgene(s) humano(s) Ig e, também opcionalmente, que tem um YAC funcional que tem um repertório de
;· ; ; ; ·. · *,* *·* • ········· !· * · · · ··· · ··· · segmento V expandido. Ambos segmentos de gene VH e VL podem estar presentes no YAC. O animal transgênico pode ser produzido em qualquer experiência desejada pelo médico, incluindo experiências que abrigam outros transgenes humanos, incluindo transgenes humanos Ig e/ou transgenes que codificam outras proteínas de linfócito humano. A invenção também fornece uma imunogiobulina de seqüência humana de alta afinidade produzida por um camundongo transgênico que tem um transgene de YAC de repertório de região V expandida. Embora o precedente descreva uma forma de realização preferida do animal transgênico da invenção, outras formas de realização são consideradas, as quais foram classificadas em três categorias:
I. Animais transgênicos que contém um transgene de imunogiobulina de cadeia pesada não rearranjada e de cadeia leve rearranjada;
II. Animais transgênicos que contêm um transgene de imunogiobulina de cadeia pesada não rearranjada e de cadeia leve não rearranjada; e
III. Animal transgênico que contém transgene de imunogiobulina de cadeia pesada rearranjada e de cadeia leve não rearranjada.
Destas categorias de animal transgênico, a ordem preferida de preferência é como segue II > I > III onde os genes de cadeia leve endógenos (ou pelo menos o gene K) foram nocauteados por recombinação homóloga (ou outro método) e I > II > III onde os genes de cadeia leve endógenos não foram nocauteados e devem ser dominados por exclusão alélica.
III. Moléculas Biespecíficas/Multiespecíficas que Ligam-se ao CD25
Ainda em uma outra forma de realização da invenção, os anticorpos monoclonais humanos para CD25 podem ser derivados ou ligados a uma outra molécula funcional, por exemplo, um outro peptídeo ou proteína (por exemplo, um fragmento Fab’) para gerar uma molécula biespecífica ou multiespecífica que liga-se aos locais de ligação múltiplos ou epítopos alvo.
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Por exemplo, um anticorpo da invenção pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, por ligação química, fusão genética, associação não covalente ou outro modo) a um ou mais outras moléculas de ligação, tais como um outro anticorpo, peptídeo ou mimético de ligação.
Conseqüentemente, a presente invenção inclui moléculas biespecíficas e multiespecíficas que compreendem pelo menos uma primeira especificidade de ligação para CD25 e um segunda especificidade de ligação para um segundo epítopo alvo. Em uma forma de realização particular da
invenção, o segundo epítopo alvo é CD3, CD4, IL-15R, TNF-α ligado por membrana ou ligado por receptor ou IL-15 ligado por membrana ou ligado por receptor. Em uma outra forma de realização, o segundo epítopo alvo é um receptor de Fc, por exemplo, receptor de FcyRI humano (CD64) ou de FcaRI (CD89) ou um de célula T. Portanto, a invenção inclui moléculas biespecíficas e multiespecíficas capazes de ligarem-se tanto a FcyR, FcocR quanto a FcsR que expressam células realizadoras(por exemplo, monócitos, macrófagos ou células polimorfonucleares (PMNs)), e para alvejar células que expressam CD25. Estas moléculas biespecíficas e multiespecíficas alvejam o
CD25 que expressa células à célula realizadora e, como os anticorpos
monoclonais humanos da invenção, disparam as atividades de célula realizadora mediadas pelo receptor de Fc, tais como a fagocitose de um CD25 que expressa células, ADCC, liberação de citocina ou geração de ânion de superóxido.
As moléculas biespecíficas e multiespecíficas da invenção ainda podem incluir uma terceira especificidade de ligação, além de uma especificidade de ligação anti-Fc e a especificidade de ligação anti-CD25. Em uma forma de realização, a terceira especificidade de ligação é uma porção de fator anti-intensificação (EF), por exemplo, uma molécula que liga-se a uma proteína de superfície envolvida na atividade citotóxica e desse modo aumenta a resposta imune contra a célula alvo. A “porção do fator anti62 ··· • · ·· • ·
intensificação” pode ser um anticorpo, um fragmento de anticorpo funcional ou um ligando que liga-se a uma dada molécula, por exemplo, um antígeno ou um receptor e, desse modo resulta em uma intensificação do efeito dos determinantes de ligação para o receptor de Fc ou antígemo celular alvo. A 5 “porção do fator anti-intensificação” podem ligar-se a um receptor de Fc ou a um antígeno de célula alvo. Altemativamente, a porção do fator antiintensificação pode ligar-se a uma entidade que é diferente da entidade à qual a primeira e a segunda especificidades de ligação ligam-se. Por exemplo, a
porção do fator anti-intensificação pode ligar-se a uma célula T citotóxica (por exemplo, por intermédio de CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40,
ICAM-1 ou outra célula imune que resulta em uma resposta imune aumentada contra a célula alvo).
Em uma forma de realização, as moléculas biespecíficas e multiespecíficas da invenção compreendem como uma especificidade de ligação pelo menos um anticorpo, incluindo, por exemplo, um Fab, Fab', F(ab')2, Fv, ou scFv. O anticorpo também pode ter um dímero de cadeia leve ou pesada ou qualquer fragmento mínimo deste, tal como um Fv ou uma construção de cadeia simples como descrito in Ladner et al. US 4.946.778. O
anticorpo também pode ser uma proteína de fusão de imunoglobulina de domínio de ligação como divulgado no US 2003/0118592 e US
2003/0133939.
Em uma forma de realização, a especificidade de ligação para um receptor de Receptor de Fc é fornecida por um anticorpo monoclonal humano, cuja ligação não é bloqueada pela imunoglobulina G (IgG) humana. 25 Como usado neste, o termo “receptor de IgG “ refere-se a qualquer um dos oito genes de cadeia γ localizados no cromossomo 1. Estes genes codificam um total de 12 isoformas de receptores transmembrana ou solúveis que são agrupados em três classes de receptor Fcy: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIH (CD 16). Em uma forma de realização preferida, o receptor de Fcy é
• · · · ··· · · · · · · · · um FcyRI humano de alta afinidade.
A produção e a caracterização destes anticorpos monoclonais preferidos são descritos por Fanger et al no WO 88/00052 e na US 4.954.617. Estes anticorpos ligam-se a um epítopo de FcyRI, FcyRII ou FcyRIH em um 5 local que é distinto do local de ligação de Fcy do receptor e, desta maneira, sua ligação não é substancialmente bloqueada pelos níveis fisiológicos de IgG. Os anticorpos específicos anti-FcyRI úteis nesta invenção são MAb 22, MAb 32, MAb 44, MAb 62 e MAb 197. Em outras formas de realização, o
anticorpo anti-FcyRI é uma forma humanizada de MAb 22 (H22). A produção e a caracterização do anticorpo H22 é descrita em Graziano, R. F. et al.
(1995) J Imunol. 155 (10): 4996 a 5002 e WO 94/10332. A linha celular que produz o anticorpo H22 foi depositado no American Type Culture Collection em 4 de novembro de 1992 sob a designação HA022CL1 e tem o N° de acessão CRL 11177.
Ainda, em outra forma de realização preferida, a especificidade de ligação for um Receptor de Fc é fornecido por um anticorpo que liga-se a um receptor de IgA humano, por exemplo, FcaRI (CD89), cuja ligação é preferivelmente não bloqueado por imunoglobulina humana A (IgA). O termo “receptor IgA” é pretendido incluir o produto de gene de um cc-gene (FcaRI) localizado no cromossomo 19. Este gene é conhecido por codificar diversas isoformas transmembrana altemativamente unidos de 55 a
110 kDa. FcaRI (CD89) é constitutivamente expressado em monócitos/macrófagos, eosinofílicos e granulócitos neutrofílicos, mas não em populações de células não realizadoras. O FcaRI tem uma afinidade média 25 tanto para IgAl e IgA2, que é aumentada na exposição às citocinas, tais como
G-CSF ou GM-CSF (Morton, H. C. et al. (1996) Criticai Reviews in Imunology 16: 423-440). Quatro anticorpos monoclonais específicos de
FcaRI, identificados como A3, A59, A62 e A77, que ligam-se a FcaRI fora do domínio de ligação do ligando IgA, foram descritos (Monteiro, R. C. et al.,
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1992, J. Imunol. 148: 1764).
O FcocRI e FcyRI são receptores de disparo preferidos para o uso na invenção porque são (1) expressados de maneira primária em células realizadoras imunes, por exemplo, monócitos, PMNs, macrófagos e células dendríticas; (2) expressados em altos níveis (por exemplo, 5.000 a 100.000 por célula); (3) mediadores de atividades de citotóxicas (por exemplo, ADCC, fagocitose) e (4) mediar a apresentação de antígeno intensificada de antígenos, incluindo auto-antígenos, alvejados a este.
Um “anticorpo específico de célula realizadora” como usado neste refere-se a um anticorpo ou fragmento de anticorpo funcional que ligase ao receptor de Fc das células realizadoras. Os anticorpos preferidos para o uso na invenção de objetivo ligam-se ao receptor de Fc das células realizadoras em um local que não é ligado pela imunoglobulina endógena.
Como usado neste, o termo “célula realizadora” refere-se a uma célula imune que é envolvida na fase realizadora de uma resposta imune, como oposto às fases cognitivas e de ativação de uma resposta imune. As células imunes exemplares incluem uma célula de uma origem mielóide ou linfóide, por exemplo, linfócitos (por exemplo, células B e células T incluindo células T citolíticas (CTLs)), células matadoras, células matadoras naturais, macrófagos, monócitos, eosinófilos, neutrófilos, células polimorfonucleares, granulócitos, mastócito e basófilos. Algumas células realizadoras expressam receptores de Fc específicos e carregam funções imunes específicas. Nas formas de realização preferidas, uma célula realizadora é capaz de induzir ADCC, por exemplo, um neutrófilo capaz de induzir ADCC. Por exemplo, monócitos, macrófagos, que expressa FcR são envolvidos na morte específica de células alvo e apresentam antígenos a outros componentes do sistema imune ou ligação a células que apresentam antígenos. Em outras formas de realização, uma célula realizadora pode fagocitar um antígeno alvo, célula alvo ou microorganismo. A expressão de um FcR particular em uma célula
realizadora pode ser regulada por fatores humorais, tais como citocinas. Por exemplo, a expressão de FcyRI foi observada ser super-regulada por interferon gama (IFN-γ). Esta expressão intensificada aumenta a atividade citotóxica de células que carregam FcyRI contra os alvos. Uma célula realizadora pode fagocitar ou lisar um antígeno alvo ou uma célula alvo.
A “célula alvo” deve significar qualquer célula em um
paciente (por exemplo, um ser humano ou animal) que podem ser alvejada por uma composição (por exemplo, um anticorpo monoclonal humano, um molécula biespecífica ou uma multiespecífica) da invenção. Nas formas de realização preferidas, a célula alvo é uma célula que expressa ou superexpressa CD25. As células que expressam CD25 tipicamente incluem células T ativadas, monócitos e células B.
As moléculas biespecíficas e multiespecíficas da presente invenção podem ser fabricadas usando-se técnicas químicas (ver por exemplo, D. M. Kranz et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 5807), técnicas de “polidoma” (ver US 4.474,893 concedida a Reading) ou técnicas de DNA recombinante.
Em particular, as moléculas biespecíficas e multiespecíficas da presente invenção podem ser preparadas pela conjugação das especificidades de ligação constituintes, por exemplo, as especificidades de ligação anti-FcR e anti-CD25, que usam métodos conhecidos na técnica e descritos nos exemplos fornecidos neste. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula biespecífica e multiespecífica pode ser gerada separadamente e depois conjugada a um outro. Quando as especificidades de ligação são proteínas ou peptídeos, uma variedade de agentes de ligação ou reticulação podem ser usadas para a conjugação covalente. Os exemplos de agentes de reticulação incluem a proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis-(ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB), ofenilenedimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3- 2-piridilditio) propionato
• · · ·»·· ··«··· 4 · · * * · · * ·«···· « · · · · · · · « « · • · · ······♦· ♦ · ♦ · · « ··· ·«· • · · · · · « · · · « ··« (SPDP), e sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-l-carboxilato (sulfo-SMCC) (ver por exemplo, Karpovsky et al. (1984) J Exp. Med. 160: 1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 8648). Outro métodos incluem aqueles descritos por Paulus, Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78,118-132; Brennan et al., Science (1985) 229: 81-83, e Glennie et al,. J: Imunol. (1987) 139: 2367-2375. Os agentes de conjugação preferidos são SATA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis da Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
Quando as especificidades de ligação são anticorpos, estes podem ser conjugados por intermédio da ligação de sulfidrila das regiões de articulação de terminal C das duas cadeias pesadas. Em uma forma de realização particularmente preferida, a região de articulação é modificada para conter um número impar de resíduos de sulfidrila, preferivelmente um, antes da conjugação.
Altemativamente, ambas as especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vetor e expressadas e montadas no mesmo hospedeiro. Este método é particularmente útil quando a molécula biespecífica e multiespecífica é uma proteína de fusão MAb x MAb, MAb x Fab, Fab x F(ab')2 ou ligando x Fab. Uma molécula biespecífica e multiespecífica da invenção, por exemplo, uma molécula biespecíficas pode ser uma molécula de cadeia simples, tal como um anticorpo biespecífico de cadeia simples, uma molécula biespecífica de cadeia simples que compreende um anticorpo de cadeia simples e um determinante de ligação ou uma molécula biespecífica de cadeia simples que compreende dois determinantes de ligação. As moléculas biespecíficas e multiespecíficas também podem ser moléculas de cadeia simples ou podem compreender pelo menos duas moléculas de cadeia simples. Os métodos para a preparação de tais moléculas bi e multiespecíficas são descritos, por exemplo, em US 5.260.203; US 5.455.030; US 4.881.175; US 5.132.405; US 5.091.513; US 5.476.786; US
5.013.653; US 5.258.498; e US 5.482.858.
A ligação das moléculas biespecíficas e multiespecíficas a seus alvos específicos pode ser confirmada pelo ensaio de imunossorvente ligado por enzima (ELISA), um radioimunoensaio (RIA), análise FACS, um 5 bioensaio (por exemplo, inibição de desenvolvimento), análise BIAcore ou um ensaio Western Blot. No geral, cada um destes ensaios detecta a presença de complexos de proteína-anticorpo de interesse particular para a utilização de um reagente rotulado (por exemplo, um anticorpo) específico para o
complexo de interesse. Por exemplo, os complexos de anticorpo FcR podem ser detectados usando-se, por exemplo, um anticorpo ligado por enzima ou um fragmento de anticorpo que reconhece e liga-se especificamente aos complexos de anticorpo de FcR. Altemativamente, os complexos podem ser detectados usando-se qualquer um de uma variedade de outros imunoensaios. Por exemplo, o anticorpo pode ser radioativamente rotulado e usado em um 15 radioimunoensaio (RIA) (ver, por exemplo, Weintraub, B., Principies of
Radioimunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay
Techniques, The Endocrine Society, March, 1986). O isótopo radioativo podem ser detectado por tais meios como o uso de um contador γ ou um
contador de cintilação ou por autoradiografia.
IV. Imunoconjugados
Em um outro aspecto da invenção, os anti-corpos humanos anti-CD25 são conjugados com uma porção terapêutica, tal como uma citotoxina, um medicamento (por exemplo, um imunosupressor) ou um radioisótopo. Tais conjugados são, referidos neste, como “imunoconjugados”. 25 Os imunoconjugados incluindo uma ou mais citotoxinas são referidos como “imunotoxinas. “Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que seja nocivo a (por exemplo, mata) células. Os exemplos incluem taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vinblastina, colquicina, doxorubicina, daunorubicina, diidróxi antracino diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glicocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol e puromicina e análogos ou homólogos destes.
Os agentes terapêuticos adequados para a formação de imunoconjugados da invenção incluem, mas não são limitados a, antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes de alquilação (por exemplo, mecloretamina, tioepa clorambucila, melfalan, carmustina (BSNU)
e lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C e cisplatina (cis-diclorodiamino platina (ID(DDP)), antraciclinas (por exemplo, daunorubicina (isto é daunomicina) e doxorubicina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina (isto é actinomicina), bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC)) e agentes antimitóticos (por exemplo, vincristina e vinblastina). Outros exemplos de citotoxinas 15 terapêuticas que podem ser conjugadas a um anticorpo da invenção incluem caliqueamicinas e duocarmicinas.
Os anticorpos da presente invenção também podem ser conjugados a um radioisótopo, por exemplo, iodo-131, ítrio-90 ou índio-111,
para gerar produtos radio-farmacêuticos citotóxicos para tratar um distúrbio relacionado com CD25, tal como um câncer. Os conjugados de anticorpo da invenção podem ser usados para a modificação de uma dada resposta biológica e a porção de medicamento não deve ser construída como limitada para agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a porção de medicamento pode ser uma proteína ou peptídeo que possui uma atividade biológica adequada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa ou fragmento ativo destes, tais como abrina, ricina A, pseudomonas exotoxina A, ou toxina da difteria ou um agente ativo na superfície celular, tais como enzimas de fosfolipase, por exemplo, fosfolipase
C.
As técnicas para a conjugação de tais porções terapêuticas a anticorpos são bem conhecidas, ver, por exemplo, Amon et al., “Monoclonal
Antibodies For Imunotargeting Of Drugs In Câncer Therapy”, em
Monoclonal Antibodies And Câncer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 2435 56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug
Delivery”, em Controlled Drug Delivery (2o Ed.), Robinson et al. (eds.), pp.
623-53 (Marcei Dekker, Inc. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic
Agents In Câncer Therapy: A Review”, em Monoclonal Antibodies '84:
Biological And Clinicai Applications, Pinchera et al. (eds. ), pp. 475-506 (1985); “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use
Of Radiolabeled Antibody In Câncer Therapy”, in Monoclonal Antibodies
For Câncer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds. ), pp. 303-16 (Academic Press 1985); e Thorpe et al., “The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugados”, Imunol. Rev., 62: 119-58 (1982).
Em uma outra forma de realização, os anticorpos monoclonais humanos de acordo com a invenção são ligados a um ligador-quelador, (por exemplo, tiuxetan), que permite ao anticorpo ser conjugado a um
radioisótopo.
V. Composições Farmacêuticas
Em um outro aspecto, a presente invenção fornece composições, incluindo, composições farmacêuticas, que contém um ou uma combinação de anticorpo monoclonais humanos da presente invenção. As composições podem ser formuladas com carreadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis bem como quaisquer outros adjuvantes 25 conhecidos e excipientes de acordo com as técnicas convencionais, tais como aquelas divulgadas em Remington: The Science and Practice of Farmacy, 19°
Edição, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995.
As composições da invenção também podem ser administradas na terapia de combinação, isto é, combinadas com outros agentes relevantes • · · • · · · · · · · ··· · ··· para a doença ou condição a ser tratada. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir uma composição da presente invenção com pelo menos um agente de imunossupressão, pelo menos um agente antiinflamatório, pelo menos, um agente de psoríase ou pelo menos um agente 5 quimioterapêutico.
Em uma forma de realização, tais agentes terapêuticos incluem um ou mais agentes de imunossupressão, tais como ciclosporina, azatioprina, ácido micofenólico, micofenolato mofetil, corticoesteróides, tais como
prednisona, metotrexato, sais de ouro, sulfasalazina, antimalária, brequinar, leflunomida, mizoribina, 15-desoxispergualina, 6-mercaptopurina, ciclofosfamida, rapamicina, tacrolimus (FK-506), OKT3, globulina antitimócito, etc.
Em uma outra forma de realização, as composições da invenção são administrados em combinação com dois ou mais agentes 15 imunosupressivos, tais como prednisona e ciclosporina; prednisona, ciclosporina e azatioprina ou prednisona, ciclosporina e micofenolato mofetila.
Em uma outra forma de realização, tais agentes terapêuticos incluem um ou mais agentes anti-inflamatórios, tais como um medicamento esteroidal ou um NSAID (medicamento anti-inflamatório não esteroidal). Os agentes preferidos incluem, por exemplo, aspirina e outros salicilatos, inibidores de Cox-2, tais como rofecoxib e celecoxib, NSAIDs, tais como ibuprofen, fenoprofen, naproxen, sulindac, diclofenac, piroxicam, cetoprofen, diflunisal, nabumetona, etodolac, oxaprozina e indometacina.
Em uma outra forma de realização, tais agentes terapêuticos incluem um ou mais DMARDs, tais como metotrexato, hidroxicloroquina, sulfasalazina, inibidores da síntese de pirimidina, por exemplo, leflunomida, agentes bloqueadores do receptor de IL-1, por exemplo, anaquinra, e agentes bloqueadores de TNF-oc, por exemplo, etanercept, infliximab e adalimumab.
Outros DMARDs adequados são anticorpos anti-IL-6R, CTLA4Ig e anticorpos anti-IL-15.
Em uma outra forma de realização, tais agentes terapêuticos incluem um ou mais agentes para tratar distúrbios de pele inflamatórias ou hiperproliferativas, tais como medicações tópicas, incluindo alcatrão, vitamina A, antralina, calcipotrien, tarazoteno e corticoesteróides, medicações orais ou injetadas, tais como corticoesteróides, metotrexato, retinóides, por exemplo, acicretina, ciclosporina, etanercept, alefacept, efaluzimab, 6-
tioguanina, micofenolato mofetila, tacrolimo (FK-506) e hidroxiuréia. Outros exemplos são CTLA4Ig e infliximab. Outros tratamentos podem incluir exposição à luz do sol ou fototerapia, incluindo UVB (ultra violeta B de banda larga e de banda estreita), UVA (ultravioleta A) e PUVA (psoralen metoxalen mais ultravioleta A).
Em uma outra forma de realização, as composições da invenção são adminsitradas em combinação com duas ou mais das terapias acima, tais como metotrexato + fototerapia (PUVA ou UVA); metotrexato +
acitretina; acitretina + fototerapia (PUVA ou UVA); metotrexato + acitretina + fototerapia (PUVA ou UVB); hidroxiuréia + fototerapia (PUVA ou UVB); hidroxiuréia + acitretina; ciclosporina + metotrexato ou calcipotrieno + fototerapia (UVB).
Ainda em uma outra forma de realização, tais agentes terapêuticos incluem um ou mais quimioterapêuticos, tais como doxorubicina, cisplatina, bleomicins, carmustina, ciclofosfamida, vindesina, vincristina e clorambucila.
Ainda em uma outra forma de realização, os presente anticorpos podem ser administrados em conjunção com radioterapia e/ou transplante de medula óssea.
Ainda, em uma outra forma de realização, os presente anticorpos podem ser administrados em combinação com outros anticorpos, por exemplo, outros anticorpos monoclonais humanos imunossuppressores, tais como anticorpos que ligam-se ao p75 do receptor de IL-2 ou anticorpos que ligam-se a por exemplo, MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD28, B7, CD40, CD45, IFN-γ, TNF-oc, IL-4, IL-5, IL-6R, IL-7, IL-8, IL-10, CDlla, CD20 ou 5 CD58 ou anticorpos que ligam-se a outros ligandos ou em combinação com outros compostos imunomoduladores, por exemplo, IL- 15R ou IL-10 solúveis.
Como usado neste, “carreador farmaceuticamente aceitável”
inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de atraso isotônico e de absorção e outros que são fisiologicamente compatíveis.
Preferivelmente, o carreador é adequado para a administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espinhal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou infusão).
Um “sal farmaceuticamente aceitável” refere-se a um sal que retêm a atividade biológica desejada do composto precursor e não comunica quaisquer efeitos toxicológicos indesejados (ver, por exemplo, Berge, S. M.,
et al. (1977) J. Farm. Sei. 66:1 a 19). Os exemplos de tais sais incluem os sais de adição ácida e os sais de adição básica. Os sais de adição ácida incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos não tóxicos, tais como ácidos clorídricos, nítricos, fosfóricos, sulfuricos, bromídricos, iodídricos, fosforoso e outros, bem como dos ácidos orgânicos não tóxicos, tais como ácidos mono e di carboxílicos alifáticos, ácidos alcanóicos substituídos por fenila, ácidos hidróxi alcanóicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfônicos alifáticos e aromáticos e outros. Os sais de adição básica incluem aqueles derivados de metais alcalinos terrosos, tais como sódio, potássio, magnésio, cálcio e outros, bem como de aminas orgânicas não tóxicas, tais como N,N'-dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína e outros.
As composições da presente invenção, incluindo as composições farmacêuticas (terapêuticas), podem ser administradas por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Como será estimado pelo técnico habilitado na técnica, a via e/ou o modo de administração variarão dependendo dos resultados desejados. Os compostos ativos podem ser preparados com carreadores que protegerão o composto contra a liberação rápida, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, emplastros transdérmicos e sistemas de liberação
microencapsuladas. Os polímeros biodegradáveis compatíveis podem ser usados, tais como acetato de etileno vinila, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido poliacético. Os métodos para a preparação de tais formulações são, no geral, conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Ver, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery
Systems, J. R. Robinson, ed., Marcei Dekker, Inc., New York, 1978.
Para administrar as composições da invenção por certas vias de administração, podem ser necessário revestir o composto com ou co administrar o composto com um material para evitar sua inativação. Por exemplo, o composto podem ser administrado a um paciente em um carreador apropriado, por exemplo, lipossomas ou um diluente. Os diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem solução salina e soluções aquosas de tampão. As lipossomas incluem as emulsões de CGF água em óleo em água bem como lipossomas convencionais (Strejan et al. (1984) J. Neuroimunol. 7:
27).
Os carreador farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. O uso de tal meio e dos agentes para as substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Exceto, na medida em que qualquer meio ou agente convencionais forem incompatíveis com o composto ativo, seu uso nas composições farmacêuticas • · · · ··· · ··· · · da invenção é considerado. Os compostos ativos complementares também podem ser incorporados nas composições.
As composições terapêuticas devem ser, tipicamente estéreis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenagem. A composição pode 5 ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma ou outras estruturas ordenadas adequadas à concentração alta de medicamento. O carreador pode ser um solvente ou meio de dispersão que contém, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e
polietileno glicol líquido e outros) e misturas adequadas destes, a fluidez própria pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, para a manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e para o uso de tensoativos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como glicerol, manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. A adsorção prolongada das composições injetáveis pode ser realizada pela inclusão na composição de um agente que atrasa a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.
Em uma forma de realização os anticorpos monoclonais humanos da invenção são adminsitradas na forma cristalina por injeção subcutânea, conforme Yang et al. (2003) PNAS, 100 (12): 6934-6939.
As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas pela incrporação do composto ativo na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, como requerido, seguido pela microfiltração por esterilização. No geral, as dispersões são preparadas pela incorporação do composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos a partir daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação preferidos são secagem a vácuo e secagem por congelamento
(liofilização que produz um pó) do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional a partir de uma solução previamente filtrada estéril destes.
Os regimes de dosagem são ajustados para fornecer resposta desejada ótima (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um bolo simples pode ser administrado, diversas doses divididas podem ser administradas por tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêutica. E
especialmente vantajoso formular composições parenterais na forma de dosagem única para facilitar a administração e a uniformidade da dosagem. A forma de dosagem única como usada neste refere-se a unidades fisicamente distintas adaptadas como dosagens unitárias para os pacientes a serem tratados; cada unidade contém um quantidade predeterminada de composto ativo calculada para a produção do efeito terapêutico desejado em associação com o carreador farmacêutico requerido. A especificação para as formas de dosagem únicas da invenção é ditada por e diretamente dependente na (uma) características únicas do composto ativo e o efeito terapêutico particular a ser atingido e (b) as limitações inerentes na técnica de composição de um tal
composto ativo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.
Os exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes, tais como ácido ascórbico, cloridreto de cisteína, bissulfato de sódio, metabisulfito de sódio, sulfito de sódio e outros; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais, como palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, gaiato de propila, alfa-tocoferol e outros e (3) agentes quelantes de metal, tais como ácido cítrico, ácido etilenodiamino tetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico e outros.
As composições terapêuticas da presente invenção podem ser formuladas para vias particulares de administração, tal como administração &3 • · · ··· · ··· · ··· oral, nasal, tópica (incluindo bucal e sublingual), retal, vaginal e/ou parenteral. As formulações podem ser convenientemente apresentadas na forma de dosagem única e podem ser preparadas por quaisquer métodos conhecidos na técnica da farmácia. A quantidade de ingrediente ativo que podem ser combinada com um material carreador para a produção de uma forma de dosagem simples variará dependendo do paciente sendo tratado e o modo particular de administração. A quantidade de ingrediente ativo que podem ser combinada com um material carreador para a produção de uma
forma de dosagem simples será, no geral, que a quantidade da composição que produz um efeito terapêutico. No geral, fora dos cem por cento, esta quantidade variará de cerca de 0,01% a cerca de 99% de ingrediente ativo, preferivelmente de cerca de 0,1% a cerca de 70%, mais preferivelmente de cerca de 1% a cerca de 30%.
As formulações da presente invenção que são adequadas para a administração vaginal também inclui formulações de pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas ou pulverizações que contém tais carreadores como são conhecidos na técnica por serem apropriados. As formas de
dosagem para a administração tópica ou transdérmica de composições desta invenção inclui pós, pulverizações, ungüentos, pastas, cremes, loções, géis, soluções, emplastros e inalantes. O composto ativo pode ser misturado sob condições estéreis com um carreador farmaceuticamente aceitável e com quaisquer preservativos, tampões ou propelentes que podem ser requeridos.
As frases “administração parenteral” e “parenteralmente administrado” como usadas neste significa modos de administração que não as administrações entéricas e tópicas, usualmente por injeção e inclui, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnóide, intraespinhal, epidural e intrastemal.
Os exemplos de carreadores aquoso e não aquosos adequados que podem ser utilizados nas composições farmacêuticas da invenção incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol e outros) e misturas adequadas destes, óleos vegetais, tais como óleo de oliva e 5 ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila. A fluidez própria pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, tais como lecitina, para a manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersões e para o uso de tensoativos.
Estas composições também podem conter adjuvantes tais como preservativos, agentes umectantes, agentes emulsificantes e agentes dispersantes. A prevenção da presença de microorganismos pode ser garantida tanto pelos procedimentos de esterilização, supra quanto pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico e outros. Também pode ser desejável incluir agentes isotônicos, tais como açúcares, cloreto de sódio e outros nas composições. Além disso, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser realizada pela inclusão de agentes que atrasam a absorção,
tais como monoestearato de alumínio e gelatina.
Quando os compostos da presente invenção são administrados como produtos farmacêuticos, a seres humanos e animais, estes podem ser dados sozinhos ou em combinação com uma composição farmacêutica que contém, por exemplo, 0,01 a 99,5% (mais preferivelmente, 0,1 a 90%) de ingrediente ativo em combinação com um carreador farmaceuticamente aceitável.
Com respeito à via de administração selecionada, os compostos da presente invenção, que podem ser usados em uma forma hidratada adequada e/ou as composições farmacêuticas da presente invenção, são formuladas em formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis por métodos convencionais conhecidos por aqueles habilitados na técnica.
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Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados a fim de obter um ingrediente ativo que é eficaz para atingir a resposta terapêutica desejada para um paciente particular, composição e modo de administração, 5 sem serem tóxicos ao paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos incluindo a atividade das composições particulares da presente invenção utilizadas ou o éster, sal ou amida destes, a via de administração, o temperatura ambiente ode
administração, a razão de excreção do composto particular sendo utilizado, a duração do tratamento, outros medicamentos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particulares utilizadas, a idade, sexo, peso, condição, saúde geral e histórico médico anterior do paciente sendo tratado e outros fatores bem conhecidos nas técnicas médicas.
Um médico ou veterinário que tenha uma habilidade comum na técnica pode determinar e prescrever facilmente a quantidade eficaz da composição farmacêutica requerida. Por exemplo, o médico ou veterinário pode começar com doses dos compostos da invenção utilizados na
composição farmacêutica em níveis menores do que os requeridos a fim de atingir o efeito terapêutico desejado e aumentar gradualmente a dosagem até o efeito desejado ser atingido. No geral, uma dose diária adequada de uma composição da invenção será que a quantidade de composto que é a dose mais baixa eficaz para produzir um efeito terapêutico. Uma tal dose eficaz dependerá, no geral, dos fatores descritos acima. E preferido que a administração seja intravenosa, intramuscular, intraperitoneal ou subcutânea, preferivelmente administrada próxima ao local do alvo. Enquanto for possível para um composto da presente invenção ser administrado sozinho, é preferível administrar o composto como uma formulação farmacêutica (composição). A dosagem pode ser determinada ou ajustada medindo-se a quantidade dos anticorpos anti-CD25 monoclonais circulantes em pontos de tempo diferentes ♦ ·· ······ • · · · ··· · ··* · ··· seguindo a administração de uma amostra biológica por realizar o uso de anticorpos anti-idiotípicos que alvejam os anticorpos anti-CD25.
Os anticorpos monoclonais humanos da invenção podem ser administrados para a prevenção de rejeição ao transplante pelo tratamento de indução, isto é, como uma terapia profilática de curto período para a administração simples ou múltipla antes do transplante e na fase muito precoce antes do transplante, por exemplo, logo antes do transplante e até 3 meses após o transplante.
Em uma forma de realização, os anticorpos monoclonais da invenção podem, por exemplo, ser administrados para a prevenção da rejeição de transplante em dosagens totais de cerca de 20 a 100 mg por exemplo, administradas como infusões intravenosas de 15 ou 20 mg com a primeira dose dada de maneira pré-operatória e as doses subsequentes dadas dentro dos primeiros 10 dias de pós-operatório. Altemativamente, as dosagens podem ser 15 administradas pelas injeções de bolo. Em uma outra forma de realização os anticorpos monoclonais da invenção podem ser administrados para a prevenção de rejeição ao transplante em uma dosagem de 0,5 a 1,5 mg/kg
intravenosamente, semana sim, semana não por até cinco doses com a primeira dose dada de maneira pré-operatória. Tal administração podem ser combinada com terapia imunossupressiva, por exemplo, esteróides, tais como prednisona ou metilprednisolona e ciclosporina; esteróides, tais como prednisona ou metilprednisolona, ciclosporina e azatioprina ou esteróides, tais como prednisona ou metilprednisolona, ciclosporina e micofenolato mofetila. A administração dos anticorpos humanos pode ser, vantajosamente esteróides 25 escassos ou resulta na retirada rápida de esteróide.
Em uma outra forma de realização, os anticorpo monoclonais humanos da invenção podem ser administrados para tratar ou prevenir a rejeição ao transplante por um regime de infusão de dose dupla (cerca de 20 mg por dose no dia do transplante e cerca de 20 mg no dia 4 após o
8$
• · · · · · · ··· · • · · · · · · · ··· transplante). Tal administração podem ser combinada com a terapia imunossupressora, por exemplo, como divulgado acima. Por exemplo, 1 g de micofenolato mofetil pode ser administrado oralmente antes da cirurgia, e 500 mg de metilprednisolona no período de indução de anestesia. A ciclosporina pode ser introduzida no segundo dia após o transplante e o micofenolato mofetil podem ser continuado em 1 g após o transplante. Os esteróides podem ser diminuídos à prednisona 20 mg oralmente no quarto dia pós-operattório.
Ainda em uma outra forma de realização, os anticorpos monoclonais humanos da invenção podem ser administrados para tratar ou prevenir a rejeição ao transplante por uma terapia de indução de dose dupla a primeira dose de lmg/kg dada 1 hora antes da cirurgia e a segunda dose 4 dias após o transplante. Tal administração pode ser combinada com a terapia imunosupressora, por exemplo, como divulgado acima.
Os anticorpos monoclonais humanos da invenção podem ser administrados para a prevenção da rejeição ao transplante pela terapia de longo período, por exemplo, pela administração de uma dose na faixa de 10 a 150 mg, tal como 20 a 40 mg, em uma base semanal ou base mensal, por exemplo de 3 a 8 administrações semanais, opcionalmente seguido por uma ou mais administrações mensais. Para a terapia de longo período, a terapia de manutenção com ciclosporina pode ser reduzida ou evitada.
As composições terapêuticas de anticorpo podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, em uma forma de realização preferida, uma composição terapêutica da invenção pode ser administrada com um dispositivo de injeção hipodérmico sem agulha, tal como os dispositivos divulgados na US 5.399.163; US 5.383.851; US 5.312.335; US 5.064.413; US 4.941.880; US 4.790.824 ouUS 4.596.556. os exemplos de implantes e módulos bem conhecidos na técnica úteis na presente invenção incluem: US 4.487.603, que divulga uma bomba de microinfusão implantável para dispensar a medicação em uma razão • · · ··· ······ • · ·· · · · · ···♦·· • ···· ··· ·· · • * ··· · ··· · ··· controlada; US 4.486.194, que divulga um dispositivo terapêutico para a administração de medicamentos através da pele; US 4.447.233, que divulga uma bomba de infusão de medicação para a liberação de medicação em uma razão de infusão precisa; US 4.447.224, que divulga um mecanismo de 5 infusão implantável de fluxo variável para a liberação contínua de medicamento; US 4.439.196, que divulga um sistema de liberação de medicamento osmótico que tem compartimentos de câmaras múltiplas e US
4.475.196, que divulga um sistema osmótico de liberação de medicamento.
Muitos outros tais implantes, sistemas de liberação e módulos são conhecidos por aqueles habilitados na técnica.
Em certas formas de realização, os anticorpo monoclonais humanos da invenção podem ser formulados para garantir a distribuição apropriada in vivo. Por exemplo, a barreira sangue-cérebro (BBB) exclui muitos compostos altamente hidrofilicas. Para garantir que os compostos 15 terapêuticos da invenção possam cruzar a BBB (se desejado), este podem ser formulados, por exemplo, em lipossomas. Para os métodos de fabricar, lipossomas, ver, por exemplo, US 4.522.811; US 5.374.548 e US 5.399.331. As lipossomas podem compreender uma ou mais porções que são
seletivamente transportados em células ou órgãos específicos, desta maneira intensificam a liberação de medicamento alvejado (ver, por exemplo, V. V.
Ranade (1989) J. Clin. Farmacol. 29: 685). As porções de alvejamento exemplares incluem folato ou biotina (ver, por exemplo, US 5.416.016 concedida a Low et al.); manosidas (Umezawa et al., (1988) Biochem.
Biophys. Res. Commun. 153: 1038); anticorpos (P. G. Bloeman et al. (1995)
FEBS Lett. 357: 140; M. Owais et al (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); receptor de proteína A de tensoativo (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physio. 1233: 134), cujas espécies diferentes podem compreender as formulações da invenção, bem como os componentes das moléculas inventadas; pl20 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 9090); ver • 4 · · *4 · ··· ·· • 4 4 4 ♦ · 4 · · · · ♦· • 4 4 4 4 4 4 4·· • · 4 4 4 · ··· ·4 4 4 também K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Imunomethods 4: 273. Em uma forma de realização da invenção, os compostos terapêuticos da invenção são formulados em lipossomas; em uma forma de realização mais preferida, as lipossomas incluem uma porção de alvejamento. Em uma forma de realização mais preferida, os compostos terapêuticos nas lipossomas são liberados pela injeção de bolo a um local próximo da área desejada, por exemplo, o local de inflamação ou de infecção ou o local de um tumor. A composição fluida deve
ser fluida até o ponto que a facilidade de injetabilidade exista. Esta deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento e devem ser preservadas contra a ação contaminante de microorganismos, tais como bactérias e fungos.
As dosagens e os regimes de dosagem eficientes para os anticorpos monoclonais humanos da invenção dependem da doença ou da 15 condição a ser tratada e podem ser determinados pelas pessoas habilitadas na técnica.
Uma “dosagem terapeuticamente eficaz” para evitar a rejeição ao transplante preferivelmente reduzirá o número e a gravidade de episódios
de rejeição a transplante precoces.
Uma “dosagem terapeuticamente eficaz” para artrite reumatóide, preferivelmente, resultará em uma Definição Preliminar de
ACR20 de Melhora nos pacientes, mais preferido em uma Definição
Preliminar ACR50 de Melhora e mesmo mais preferido em uma Definição
Preliminar ARC70 de Melhora.
A Definição Preliminar de ACR20 de Melhora é definida como: melhora de > 20% em: Tender Joint Count (TJC) e Swollen Joint Count (SJC) e: melhora de > 20% em 3 dos seguintes 5 estimativas: Patient Pain Assessment (VAS), Patient Global assessment (VAS), Physician Global Assessment (VAS), Patient Self-Assessed Disability (HAQ) e, Reagente de qo ♦ ♦ <··«· · · · · · • · ··· · ··· · ♦· ·
Fase Aguda (CRP ou ESR).
ACR50 e ACR70 são definidos do mesmo modo com melhoras de 250% e 270%, respectivamente. Para mais detalhes ver Felson et al. em American College of Rheumatology Preliminary Definition of
Improvement in Rheumatoid Arthritis; Arthritis Rheumatism (1995) 38: 727735.
Altemativamente, uma dosagem terapeuticamente eficaz para artrite reumatóide pode ser medida por DAS (contagem da atividade da
doença), incluindo DAS28 e, mais preferivelmente, DAS56, como definido por EULAR.
Uma “dosagem terapeuticamente eficaz” para psoríase preferivelmente resultará em um PASI50, mais preferivelmente um PASI75 e, ainda mais preferivelmente um PASI90 nos pacientes ou uma redução na avaliação de psoríase total comparando-se à impressão de melhora depois do 15 tratamento com medicamento quando comparado à condição de prétratamento. O PASI (índice de Área e Gravidade de Psoríase) é um sistema de contagem usado para avaliação da área e gravidade da doença. PASI50 é
definido como melhora de > 50% da contagem. Do mesmo modo, PASI75 e PASI90 são definidos como melhoras de 75% e > 90% da contagem, respectivamente.
Uma “dosagem terapeuticamente eficaz” para terapia de tumor pode ser medida por respostas de tumor objetivas que podem ser completas ou parciais. Uma resposta completa (CR) é definida como não clínica, radiológica ou outra evidência de doença. Uma resposta parcial (PR) resulta 25 de uma redução em tamanho de tumor agregado de mais do que 50%. O tempo médio para progressão é uma medida que caracteriza a durabilidade da resposta de tumor objetiva.
Uma “dosagem terapeuticamente eficaz” para terapia de tumor também pode ser medida por sua capacidade de estabilizar a progressão de
9) • · ····· ··· · · * <··· · >· · · · · · ♦ 4 * · · · ♦ · • · · « · « · ♦ · a · · · doença. A capacidade de um composto inibir o câncer pode ser avaliado em um sistema de modelo de animal predito da eficácia em tumores humanos. Altemativamente, esta propriedade de uma composição pode ser avaliada examinando-se a capacidade do composto inibir o crescimento celular ou 5 induzir a apoptose por ensaios in vitro conhecido pelo médico habilitado.
Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto terapêutico pode diminuir o tamanho do tumor ou, outro modo, melhorar os sintomas em um paciente. Uma das habilidades usuais na técnica seria capaz de determinar tais
quantidades com base em tais fatores como a estatura do paciente, a gravidade dos sintomas do paciente e, a composição ou via de administração selecionadas particulares.
VI, Usos e Métodos da Invenção
Os anticorpos humanos da presente invenção, bem como derivados/conjugados e composições destes, têm numerosas utilidades que 15 envolvem o tratamento de distúrbios mediados por CD25 ou distúrbios que envolvem células que expressam CD25.
Em uma forma de realização, os anticorpos humanos da presente invenção podem ser administrados in vivo a um paciente para
bloquear ou inibir a ligação de CD25 ao seu ligando (IL-2). Este, por sua vez, pode ser usado para prevenir ou inibir uma variedade de doenças associadas com células que carregam CD25.
As doenças exemplares que podem ser tratadas (por exemplo, melhoradas) ou prevenidas incluem, mas não estão limitadas a, rejeição de transplante, incluindo rejeição de aloenxerto e xenoenxerto, em pacientes que passam por ou, que passaram por transplante de órgão ou de tecido, tal como coração, pulmão, combinado coração-pulmão, traquéia, rim, fígado, pâncreas, esôfago, intestino, pele, transplante de membro, transplante de cordão umbilical, transplante de célula tronco, transplante de célula ilhota, etc. Tais pacientes incluem adultos mas também podem ser pacientes de pediatria.
Os anticorpos da presente invenção desta maneira, podem ser usados na profilaxia de rejeição de aloenxerto e xenoenxerto ou serem usados para reverter, tratar ou, de outro modo melhorar episódios de rejeição de aloenxerto e zenoenxerto aguda.
Outras doenças que podem ser tratadas incluem doença enxerto versus hospedeiro, por exemplo, doença enxerto versus hospedeiro de transfusão sangüínea e doença enxerto versus hospedeiro de medula óssea; doenças inflamatórias, imunes ou autoimunes, tais como artrite
reumatóide, espondilite ancilosante, artrite psoriática, diabete tipo 1, diabete tipo 2 que requer insulina, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico, miastenia grave, doença inflamatória do intestino, doença de
Crohn, colite ulcerativa, dermato-polimiosite, síndrome de Sjõgren, arterites, incluindo arterite de células gigantes, anemia aplásica, asma, esclerodermia e uveíte; distúrbios de pele inflamatórios ou hiperproliferativos, por exemplo, psoríase, incluindo psoríase de placa, pustulose palmoplantar (PPP), líquen plano erosivo, pênfígo bolhoso, epidermólise bolhosa, dermatite de contato e dermatite atópica; e uma variedade de neoplasmas linfóides, por exemplo, leucemia de célula T,
doença de Hodgkin, leucemia de célula capilar ou linfoma de célula T cutânea, incluindo micose fungóide e síndrome de Sezary.
Outras doenças que podem ser tratadas são malignidad.es nas quais uma inibição de infiltração de CD25+ células T reguladoras é benéfica, tal como câncer gástrico, cânceres esofágicos, melanoma maligno, câncer colorretal, câncer de pâncreas, câncer 25 de mama, câncer pulmonar de pequenas células, câncer pulmonar de células não pequenas, câncer cervical, câncer ovariano e, carcinoma de célula renal;
distúrbios hematológicos, tais como leucemia de célula T adulta/linfoma, linfoma de célula grande anaplástico, leucemia linfocítica crônica (CLL)/linfoma linfocítico pequeno (SLL), linfoma de célula T periférica e, amiloidase secundária;
distúrbios de pele, tais como piodermatite gangrenosa, granuloma anular, dermatite de contato alérgica, penfigóide cicatricial e, herpes gestacional;
distúrbios hepato-gastrointestinal, tais como colite colágena, colangite esclerosante, hepatite ativo crônico, hepatite lupóide, hepatite autoimune, hepatite alcóolica, pancreatite crônica e, pancreatite aguda;
distúrbios cardíacos, tais como miocardite e pericardite; distúrbios vasculares,
tais como arterioesclerose, arterite de células gigantes/polimialgia reumática, artrite de Takayasu, poliarterite nodosa, síndrome de Kawasaki, granulomatose de Wegener, poliangiíte microscópica, síndrome de ChurgStrauss, angiíte lucocitoclástica e vasculite lucocitoclástica secundária;
distúrbios renais, tais como glomeruloneírite aguda, glomerulonefrite crônica, nefrite de mudança mínima e síndrome de
Goodpasture;
distúrbios pulmonares, tais como alveolite, bronquiolite obliterante, silicose e, beriliose;
distúrbios neurológicos, tais como esclerose múltipla, doença
de Alzheimer, miastenia grave, polineuropatia desmielinizante crônica e, polirradiculite incluindo síndrome de Guillain-Barré;
distúrbios de tecido conectivo, tais como policondrite recidivante, sarcoidose, lúpus eritematoso sistêmico, lúpus do SNC, lúpus discóide, nefrite por lúpus, síndrome da fadiga crônica e, fibromialgia; distúrbios endocrinológicos, tais como doença de Graves, tiroidite de Hashimoto e, tiroidite subaguda; e infecções virais, tais como paraparesia espástica tropical.
As vias adequadas de administração das composições de anticorpo (por exemplo, os anticorpos humanos e imunoconjugados) da invenção in vivo e in vitro são bem conhecidas na técnica e podem ser
selecionado por aqueles de habilidade usual. Por exemplo, as composições de anticorpo podem ser administradas por injeção (por exemplo, intravenosa ou subcutânea).
As dosagens adequadas das moléculas usadas dependerá da 5 idade e do peso do paciente e da concentração e/ou formulação da composição de anticorpo.
O anticorpo pode ser administrado sozinho ou junto com um outro agente terapêutico, tal como um agente imunossupressivo, um agente
anti-inflamatório, um agente para tratar distúrbios de pele inflamatórios ou hiperproliferativos, um agente quimioterapêutico ou, uma citotoxina que age em conjunção com ou, sinergisticamente com a composição de anticorpo para tratar ou prevenir doenças associadas com células que expressam CD25, especialmente células T ativadas.
Como previamente descrito, os anticorpos anti-CD25 humanos da invenção podem ser co-administrados com um ou mais outros agentes terapêuticos, por exemplo, um agente imunossupressivo ou um agente anti-inflamatório para aumentar o efeito anti-inflamatório total. O
anticorpo pode ser ligado ao agente (como um imunocomplexo) ou pode ser administrado separado do agente. No último caso (a administração separada), o anticorpo pode ser administrado antes, depois ou concorrentemente com o agente.
Também, dentro do escopo da presente invenção, estão conjuntos que compreendem as composições de anticorpo da invenção (por exemplo, os anticorpos humanos e imunoconjugados) e instruções para o uso. 25 O conjunto pode conter ainda um ou mais agentes adicionais, tais como um agente imunossupressivo ou, um ou mais anticorpos humanos adicionais da invenção.
Conseqüentemente, os pacientes tratados com composições de anticorpo da invenção podem ser adicionalmente administrados (antes de,
simultaneamente com ou, seguinte à administração de um anticorpo humano da invenção) com um outro agente terapêutico, tal como um agente imunossupressivo, um agente anti-inflamatório, um agente para tratar distúrbios de pele inflamatórios ou hiperproliferativos ou, um agente 5 quimioterapêutico, que intensifica ou aumenta o efeito terapêutico dos anticorpos humanos.
Ainda em uma outra forma de realização, os imunoconjugados da invenção podem ser usados para compostos alvos (por exemplo, agente
terapêuticos, rótulos, citotoxinas, imunossupressores, etc.) às células que têm CD25 ligado à sua superfície pela ligação de tais compostos ao anticorpo.
Desta maneira, a invenção também fornece métodos para localizar células ex vivo ou in vitro que expressam CD25 (por exemplo, com um rótulo detectável, tal como um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima ou, um co-fator de enzima). Em uma outra forma de realização, a invenção fornece métodos para matar células que têm CD25 ligado à sua superfície pela administração de imunotoxinas da presente invenção.
Em uma forma de realização adicional, os anticorpos da
invenção podem ser usados in vivo ou in vitro para diagnosticar doenças nas quais as células ativadas que expressam CD25 desempenham um papel ativo na patogênese pela detecção de níveis de CD25 ou, níveis de células que contenham CD25 na sua superfície de membrana. Isto pode ser alcançado, por exemplo, colocando-se em contato uma amostra a ser testada, opcionalmente junto com uma amostra de controle, com o anticorpo humano sob condições que leva em conta a formação de um 25 complexo entre o anticorpo e CD25. A formação do complexo é então detectada (por exemplo, usando-se um ELISA). Quando usa-se uma amostra de controle junto com a amostra de teste, o complexo é detectado em ambas amostras e qualquer diferença estatisticamente significante na formação de complexos entre as amostras é indicativo da presença de
CD25 na amostra de teste.
A presente invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos que não deve ser interpretado como limitante adicional.
EXEMPLOS
Exemplo 1 Produção dos Anticorpos Humanos Contra CD25
Antígeno: Uma linha de célula de transfecção que expressa superfície celular CD25 foi desenvolvida para o uso como um reagente para imunizar camundongos HuMAb e caracterizar anticorpos anti-CD25.
Esta linha de célula é uma linha de célula CHO construída para expressar os domínios extra-celulares de CD25 ligados ao domínio de transmembrana do receptor do fator de crescimento derivado das plaquetas. As seqüências de CD25 foram amplificadas a partir do cDNA preparado a partir de células HUT102 e as seqüências do receptor do fator de crescimento derivado das plaquetas foram obtidas a partir do vetor DISPLAY 15 (Invitrogen Corporation). uma construção de expressão que codifica a proteína de fusão foi construído em um vetor de expressão. A linha de célula de transfecção de CHO passou por 2 ciclos de amplificação de
metotrexato em 5 nM e 50 nM de metotrexato para aumentar os níveis de expressão de CD25.
Cultura de transfectoma de CHO-CD25: as células de transfectoma de CHO-CD25 (Medarex Inc., NJ, USA) foram cultivadas em meio CHO-S-SFM II (Gibco BRL), sem hipoxantina, sem timidina, com penicilina (5000 U/ml), estreptamicina (5000 mg/ml; BioWhittaker, Bélgica) e, metotrexato (concentração final de 50nM, Sigma). As células foram 25 refrescadas de cada dois a três dias.
Camundongos transgênicos: Os camundongos HCo7 e Hcol2 foram alojados em gaiolas com filtro e foram avaliados estarem em boa condição física em datas de imunização, sangrias e, o dia da fusão. Os camundongos que produziram os hibridomas selecionados foram todos
machos. O camundongo ID’s 23185.23196, 23197 e, 23198 têm o genótipo (CMD)++; (HCo7) 11952+; (JKD)++; (KCo5) 9272+. O camundongo ID 23175 foi de genótipo (CMD)++; (HCol2) 15087+; (JKD)++; (KCo5) 9272+. As designações de transgene individuais estão em parênteses, seguidas por 5 números de linha para transgenes randomicamente integrados. Os símbolos ++ e + indicam homozigotos ou hemizigotos; entretanto, porque os camundongos são rotineiramente avaliados usando-se um ensaio com base em
PCR, não foi possível distinguir entre heterozigosidade e homozigosidade
para os transgenes humanos Ig randomicamente integrados. Uma designação + pode ser dada aos camundongos que são realmente homozigotos para estes elementos.
Procedimento e Lista de Imunização: Os camundongos foram imunizados com antígeno de duas formas: As células vivas (o CD25 transfectou células CHO descritas acima) e a proteína purificada (CD25 15 humano recombinante (rhCD25)), uma proteína recombinante NS/0expressada de R&D Systems, (cat# 223-2A/CF), Minneapolis, MN). O rhDC25 solúvel foi misturado com adjuvante de Freund completo (CFA) ou adjuvante de Freund incompleto (IFA). O adjuvante de Freund foi obtido pela
Gibco-BRL, Rockville, MD. Os camundongos foram injetados com 0,2 ml de antígeno preparado na cavidade intraperitoneal. As imunizações na veia da cauda finais foram realizadas com CD25 solúvel em PBS estéril ou solução salina (NaCl a 0,9%).
As imunizações com células transfectadas foram administradas na cavidade intraperitoneal (i. p.) a 0,2 ml em solução salina estéril a 1,0 - 2,0 25 x 10 células por camundongo. Todas as imunizações foram injetadas na cavidade intraperitoneal. Três e dois dias antes da fusão, reforços intravenosos (i. v.) foram realizados. A lista de imunização é descrita na Tabela 1. Todos os camundongos foram incluídos entre um coorte de doze (12) camundongos de genótipos HCo7 e Hcol2.
Tabela 1
Data de atividade Imunização: adjuvante, antígeno Sangria e titulador
Dial 1,5 x 10z células transfectadas de CD25 vivas, IP em solução salina
Dia 12 CFA, rhCD25 (20 pg)
Dia 21 1,5 x 10z células transfectadas de CD25 vivas, IP em solução salina
Dia 28 CFA, rhCD25 (20 pg)
Dia 35 Titulador
Dia 42 Fusão 23175/23197
Dia 42 1,5 x 10z células transfectadas de CD25 vivas, IP em solução salina
Dia 56 CFA, rhCD25 (20 pg)
Dia 63 Titulador
Dia 68 1,5 x 10z células transfectadas de CD25 vivas, IP em solução salina
Dia 71 Fusão 23196/23198
Dia 81 Titulador
Dia 85 Fusão 23185
*Para tituladores, ver, por favor, a Tabela 2.
Tituladores de camundongo: os tituladores para o camundongo #s 23175, 23185, 23196, 23197 e 23198 são mostrados abaixo na Tabela 2. Os tituladores mostrados na Tabela 2 indicam diluições de soro que mostraram-se positivas em testes específicos de CD25. A resposta ao antígeno depois que repetiu as imunizações mostra um nível de resposta forte e o camundongo foi preparado para fusão.
Tabela 2
Camundongo # Titulador Dia 35 Titulador Dia 63 Titulador Dia 81
23175 12800
23185 6400 12800 12800
Camundongo # Titulador Dia 35 Titulador Dia 63 Titulador Dia 81
23196 6400 25600
23197 50000
23198 3200 25600
Procedimento de Fusão: A linha de célula de mieloma SP2/0agl4 (ATCC CRL 1581, lote F-15087) foi usada para as fusões. O frasco de ATCC original foi descongelado e expandido em cultura. Um estoque de semente de frascos congelados foi preparado a partir desta expansão. As células foram mantidas em cultura por 6 a 8 semanas, passadas duas vezes uma semana.
DMEM de Glicose Alta: (Mediatech Cellgro, # 1001233) que contém FBS a 10% (Hyclone cat# SH30071), antibiótico-antimicótico (100 x) (Gibco, # 15240062) e, L-glutamina a 0,1% foram usados para cultivar células de mieloma. Os suplementos de meios adicionais foram adicionados aos meios de crescimento de hibridoma, incluindo Fator de Clonagem de Hibridoma Origen a 5% (Igen), piruvato de sódio a 4,5 x 10’4 Μ, HAT (hipoxantina a 1,0 x 10'4 M, aminopterina a 4,0 x 10’ M, timidina a 1,6 x IO'5
M; Sigma) e, soro fetal bovino (Hyclone, Logan, Utah).
O baço do camundongo número #23197 foi normal em tamanho e produziu 4,0 x 108 células viáveis. O baço do camundongo número #23175 foi normal em tamanho e produziu 2,6 x 108 células viáveis. Os baços do camundongo #23196 e #23198 foram normais em tamanho e produziram
2,4 x 108 e 2,0 x 108 células viáveis, respectivamente. O último baço do 15 camundongo #23185 foi normal em tamanho e produziu 1,9 x 108 células viáveis. Os esplenócitos foram fundidos de acordo com procedimento padrão.
Meios Usados para a geração de hibridoma (fusão): DMEM de glicose alta (Mediatech, lote #10013264) que contém soro fetal bovino a 10%
(FBS); (Hyclone, Logan, Utah, SH30071 lote#AJE10321) antibióticoantimicótico (Gibco BRL, lote #15240062) e, L-glutamina a 0,1% (Gibco, lote #1013845) foram usados para cultivar as células de mieloma. Os suplementos de meios adicionais foram adicionados aos meios de crescimento de hibridoma, que incluíram: Fator de Clonagem de Hibridoma Origen a 5% (Igen, lote #36600 e 36782 e 36684), piruvato de sódio a 4,5 x IO'4 M, HAT 25 (Sigma, H 0262): hipoxantina a 1,0 x 10’4 M, aminopterina 4,0 x IO’7 M, timidina a 1,6 x IO'5 M ou, HT (Sigma, H0137): hipoxantina a 1,0 x 10’4 M, timidina a 1,6 x IO’5 M.
O baço e os linfonodos foram removidos dos camundongos imunizados e estes órgãos foram colocados em um tubo que contém DMEM
JCO
• · ··· · ··· · + FBS a 10%. O tubo foi transferido a um ambiente de cultura de tecido e uma suspensão celular simples foi fabricada a partir do baço e de linfonodos e as células foram contadas. Um volume apropriado de células SP2/0 (ATCC CRL 1581, lote F-15087; 6 células de baço ou de linfonodo por 1 célula de
SP2/0) foi transferido e as células foram misturadas e recolocadas em suspensão. Aproximadamente 1,2 ml de PEG foi adicionado (1 minuto enquanto submete-se o tubo ao turbilhonamento leve em um béquer contendo água a 37°C). O tubo foi deixado por 90 segundos, 15 ml de DMEM foram
adicionados e a lavagem com meio foi realizada. Depois de rotacionar as células, o sobrenadante foi removido e as células foram recolocadas em suspensão. Dez (10) ml de meio contendo HAT foram adicionados ao tubo. Depois da incubação de 30 a 60 minutos em uma incubadora de CO2, as células foram colocadas em placas de cultura de 96 reservatórios, 200 gl/reservatório (cerca de 1 χ 107 células por placa de 96 reservatórios). No dia 15 7, as células foram alimentadas com meio contendo HT, 250 μΐ/reservatório (meio HT é meio HAT com aminopterina removida).
A avaliação ELISA inicial para anticorpos IgG,K humanos foi
realizado de 7 a 10 dias após a fusão. Os reservatórios positivos de IgG,K humano foram então avaliados em placas ELISA revestidas de CD25 solúvel. Os hibridomas positivos de antígeno foram então transferidos a placas de 24 reservatórios e, finalmente a frascos de cultura de tecido. Os hibridomas positivos de antígeno foram preservados em vários estágios no processo de desenvolvimento pelo congelamento de células em meio congelante de DMSO Origen (Fisher Cat # IG-50-0715).
Protocolo ELISA para detecção de IgG/κ (usado para avaliação das fusões): as placas ELISA foram revestidas durante a noite com anti-humano-κ, 1 gg/ml (Immunotech, lote #0173) ou anti-humano-γ, 1 /ig/ml (Jackson, lote #109-006-098), 50 /ig/reservatório. As placas foram esvaziadas e locais de ligação residuais foram bloqueados com PBS suplementado com ιοί
· · ···· ··· · • ········· • · · · ··· · ··♦ tween-20 (0,05%) e soro de galinha a 5% (PBSTC) por 1 hora em temperatura ambiente (RT). As placas foram lavadas 3 vezes com PBS suplementado com tween-20 a 0,05% (PBST). Os sobrenadantes derivados das fusões e os subclones foram, no geral, testados, diluídos 1:2 em PBSTC. Como um controle positivo, IgG humano (Calbiochem) foi usado. Depois de incubar as amostras por cerca de 2 horas, as placas foram lavadas com PBST e um anticorpo secundário, conjugado anti-humano-IgG-Fc-HRP (Jackson, lote #109-036-098), diluído 1:5000 em PBSTC foi adicionado aos reservatórios (100 μϊ). Depois da incubação de 1 hora em temperatura ambiente, o ELISA foi desenvolvido usando-se ABTS (Sigma) de acordo com as recomendações do fabricante.
Determinação de isotipo por ELISA: placas ELISA de 96 reservatórios (Greiner, Alemanha) foram revestidas durante a noite (100 μϊ/ reservatório, temperatura ambiente (RT)) com IgGl anti-humano de camundongo (CLB, Países Baixos, diluído 1:5.000 do estoque) ou com IgG3 anti-humano de camundongo (CLB, diluído 1:10.000 do estoque). Depois de lavar as placas 3 x com PBST (150 μΐ/reservatório), as placas foram incubadas com PBSTC por 1 hora em temperatura ambiente. Os sobrenadantes de clones de anticorpo monoclonal de CD25 humano foram então adicionados (100, μϊ/ reservatório; 2 horas em temperatura ambiente). Os sobrenadantes de anti-KLH IgGl (1 /ig/ml) e de anti-KLH IgG3 (1 /xg/ml) serviram como controles positivos. O meio de cultura e PBSTC serviram como controles negativos. Depois de lavar em PBST (3 x), cabra-anti-hlgGHRP (Fc específico; Jackson Labs, Maine, USA) foi adicionado (1 hora em temperatura ambiente). Para a detecção de IgGl, o conjugado foi diluído 1:500, enquanto para a detecção de IgG3 o conjugado foi diluído 1:2000. Depois de lavar em PBST (3 x), 10 mg de ABTS (Roche) por 10 ml de tampão de ABTS (Roche) foi fabricado e 100 μΐ adicionados a cada reservatório. Depois de 20 minutos, absorção foi lida a 405 nm com um leitor
• ··♦ · ·· · · · • ··· · ······ • · · ·· · · · • ········ • · · · · · · ··· • · · · · · ··· · ···
ELISA (EL 808, Bio-Tek Instruments, Vermont, USA).
Com base nos hibridomas específicos do antígeno 4 do procedimento de imunização foram selecionados os quais foram todos derivados de camundongos HCo: AB1, AB7, AB11 e AB12. Os isotipos destes quatro clones foram observados ser IgGl,K.
Os anticorpos da invenção podem ser recombinantemente expressados como outros isotipos, por exemplo IgG2, IgG3, IgG4, IgM e,
IgA.
Meios usados para manter os hibridomas depois da seleção:
Todas as linhas de célula de hibridoma de anticorpo monoclonal de CD25 humano foram cultivadas em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (Biowhittaker, lote #BE12-709F) suplementado com FCS a 10% (Wisent
Multicell ótimo C241), 2 mM de L-glutamina (Glutamax-II), 50 IU/ml de penicilina, 50 /zg/ml de estreptomicina (pen/estrep), 2 μΜ de β-ΜΕ (todos 15 derivados de Gibco BRL, Life Technologies, Escócia), HCF a 24% (Origen,
Igen Intemational Inc., Gaithersburg, USA).
Purificação dos anticorpos: Antes da purificação ou da concentração dos anticorpos específicos de CD25 humano do sobrenadante de
cultura, o sobrenadante de cultura celular deve ser filtrado através de um filtro superior de garrafa descartável conduzido a vácuo para remover material bruto tal como restantes de célula ou outras impurezas. A amostra pode ser concentrada se o volume da amostra for acima de 500 ml a um volume abaixo de 500 ml com uma Prep/escala® TFF, cartucho de 1 pé2 (30,5 cm2) (Millipore, USA).
A purificação da proteína A dos anticorpos específicos de
CD25 foi realizada usando-se cromatografia de afinidade.
Depois do equilíbrio da coluna de Proteína A de 5 ml (5 ml de
ProtA SP, versão 041201, Amersham Pharmacia Biotech AB, Suécia) com
PBS, pH 7,4 e, preparação de amostra-bomba A com PBS, pH 7,4, o ··· ··
Κ)3 sobrenadante contendo anticorpos específicos de CD25 foi carregado na coluna, amostra não ligada lavada e a bomba do sistema B enxaguada com ácido cítrico 0,1 M, pH 5, (tampão de eluição 1). Depois disso, IgG bovino (presente no sobrenadante de cultura) foi eluído com tampão de eluição 1 por 5 intermédio da bomba de sistema B. Depois de enxaguar a bomba de sistema A com ácido cítrico 0,1 M, pH 3, (tampão de eluição 2), os anticorpos específicos de CD25 humano foram eluídos por intermédio da bomba de sistema A com tampão de eluição 2. A bomba de sistema B foi então
enxaguada com ácido cítrico 0,1 M, pH 2, (tampão de eluição 3) e todo IgG que permanece ligado à coluna foi eluído por intermédio da bomba de sistema
B com tampão de eluição 3. Os anticorpos específicos de CD25 eluídos foram neutralizados com 10% de (v/v) Tris-HCl 2 M (Sigma), pH 9 e, as frações de pico foram então reunidas.
As frações de pico reunidas da etapa de eluição 2 foram dialisadas a PBS (30 ml de material purificado a 5 1 de PBS), por 18 horas a
4°C. Para preservar e armazenar o material purificado, as amostras foram concentradas. A concentração de IgG humano foi determinada usando-se
Ensaio nefelométrico (Dade-Behring,BNII) que usa anticorpos anti-IgG policlonais (CLB, Amsterdam, Os Países Baixos, lote #M1090). Os anticorpos foram aliquotados, congelados por pressão e, armazenados a 80°C.
Exemplo 2 Seqüenciamento de anticorpo dos Anticorpos Humanos Contra CD25
Seqüenciamento das regiões Vt. e Vh dos anticorpos
Seqüenciamento: As regiões VDJ foram seqüenciadas depois da clonagem no Sistema de Vetor pGEMT II. O seqüenciamento foi realizado em Baseclear (Leiden, Países Baixos).
As seqüências foram alinhadas para as seqüências de gene V de linhagem germinal (www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/intro.htm).
JOM
Preparação de RNA: O RNA total foi preparado a partir de 5 x
106 células de quatro (4) linhas de célula de hibridoma de CD25 humano
diferentes (AB1, AB7, AB11, AB12) com conjunto de Rneasy (Qiagen, Westburg, Leusden, Países Baixos) de acordo com o protocolo do fabricante.
Preparação de DNA: O DNA complementar (cDNA) de RNA das células de hibridoma de CD25 foi preparado a partir de 3 /zg de RNA total com Transcriptase Reversa AMV com tampão (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha), oligo d(T)i5 (Promega, Madison, WI, USA), dNTP (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) e RNAsin (Promega) de acordo com o protocolo do fabricante (2000, versão 3).
As regiões VH e VL foram amplificadas usando-se os seguintes iniciadores de PCR:
VH: iniciadores FR1 5’
AB62 CAg gTK CAg CTg gTg CAg TC (SEQ ID NO: 41)
AB63 SAg gTg CAg CTg KTg gAg TC (SEQ ID NO: 42)
AB65 gAg gTg CAg CTg gTg CAg TC (SEQ ID NO: 43) iniciadores VH líderes 5’
AB85 ATg gAC Tgg ACC Tgg AgC ATC (SEQ ID NO: 44)
AB86 ATg gAA TTg ggg CTg AgC Tg (SEQ ID NO: 45)
AB87 ATg gAg TTT ggR CTg AgC Tg (SEQ ID NO: 46)
AB88 ATg AAA CAC CTg Tgg TTC TTC (SEQ ID NO: 47)
AB89 ATg ggg TCA ACC gCC ATC CT (SEQ ID NO: 48) iniciadores VH 3 ’
AB90 TgC CAg ggg gAA gAC CgA Tgg (SEQ ID NO: 49) VK: iniciadores FR1 5’
AB8 RAC ATC CAg ATg AYC CAg TC (SEQ ID NO: 50)
AB9 gYC ATC YRg ATg ACC CAg TC (SEQ ID NO: 51) AB10 gAT ATT gTg ATg ACC CAg AC (SEQ ID NO: 52) AB11 gAA ATT gTg TTg ACR CAg TC (SEQ ID NO: 53)
ΑΒ12
ΑΒ13
ΑΒ14 * · · · ♦·· · ··· gAA ATW gTR ATg ACA CAg TC (SEQ ID NO: 54) gAT gTT gTg ATg ACA CAG TC (SEQ ID NO: 55) gAA ATT gTg CTg ACT CAg TC (SEQ ID NO: 56) iniciadores VK líderes 5’:
AB123 CCC gCT Cag CTC CTg ggg CTC CTg (SEQ ID NO: 57) AB124 CCC TgC TCA gCT CCT ggg gCT gC (SEQ ID NO: 58) AB125 CCC AgC gCA gCT TCT CTT CCT CCT gC (SEQ ID NO: 59)
AB126 ATg gAA CCA Tgg AAg CCC CAg CAC AgC (SEQ ID NO: 60) iniciador VK 3’
AB16 Cgg gAA gAT gAA gAC AgA Tg (SEQ ID NO: 61)
Nas seqüências de iniciador acima, K, S, R, Y e W têm os seguintes significados:
K = GouT
S = C ou G
Y = CouT
W=AouT
Condições de PCR usadas para amplificar as regiões VH e Vl para clonagem: As reações de cadeia polimerase (PCR) foram realizadas com polimerase AmpliTaq (Perkin Ehner) em um Termocycler TI 96 (Biometra, Westburg, Leusden, Países Baixos).
Protocolo de ciclização de PCR:
15 94°C 2 minutos
11 ciclos 94°C 30 segundos
65°C 30 segundos, menos 1° por ciclo
72°C 30 segundos
30 ciclos 94°C 30 segundos
20 55°C 30 segundos
72°C 30 segundos
72°C 10 minutos esfriar até 4°C
A clonagem de Vp e VL no Sistema de VetorpGEMTII: Depois de analisar os produtos de PCR em um gel de agarose, os produtos foram purificados com o Conjunto de Extração de Gel QIAEX II (Qiagen, Westburg, Leusden, Países Baixos). Sempre 2 produtos de PCR independentemente amplificados, que usam FR1 ou iniciadores líderes, de
cada região VH e Vl são clonados no Sistema de Vetor pGEMT II (Promega) de acordo com o protocolo do fabricante (1999, versão 6).
Depois da transformação para E. coli JM109, as colônias individuais foram avaliados pelo PCR de colônia que usa iniciadores T7 e
SP6, 30 ciclos de recozimento a 55°C. O DNA de plasmídeo das colônias foi purificado usando-se o conjunto miniprep Qiaprep Spin (Qiagen). Para análise 15 adicional das regiões VH e VL uma digestão Ncol/Notl (NE Biolabs,
Westburg, Leusden, Países Baixos) foi realizada e analisada no gel de agarose.
As quatro linhas de célula de hibridoma selecionadas
expressaram as seguintes seqüências de anticorpo:
AB1: um anticorpo IgGl,K monoclonal humano com as seqüências de aminoácido: SEQ ID NOs: 2 e 4;
AB7: um anticorpo IgGl,K monoclonal humano com as seqüências de aminoácido: SEQ ID NOs: 6 e 8;
AB11: um anticorpo IgGl,K monoclonal humano com as seqüências de aminoácido: SEQ ID NOs: 10 e 12; e
AB12: um anticorpo IgGl,K monoclonal humano com as seqüências de aminoácido: SEQ ID NOs: 14 e 16.
As seqüências obtidas são mostradas nas Figuras de 1 a 10.
Exemplo 3 Características de Ligação dos Anticorpos Humanos Contra
100
CD25
Ligação de sobrenadantes de anticorpos monoclonais de CD25 humano à CD25 constitutivamente expressado em células CHO: AB1, AB7, AB11 e AB12 todos ligam-se ao CD25 expressado nas células CHO transfectadas quando determinado pela citometria de fluxo (ver Tabela 3).
Ligação de sobrenadantes de anticorpos monoclonais de CD25 humano ao hrCD25 no ensaio ELISA: AB1, AB7, AB11, e AB12 todos ligados a CD25 quando testados em um ELISA que usa hrCD25 como o antígeno de revestimento. As placas de 96 reservatórios (Greiner) foram revestidas durante a noite em temperatura ambiente com rhCD25 (100 ng/ml; R&D), na ligação não específica foi bloqueada pelo revestimento das placas com PBSTC por 1 hora em temperatura ambiente. Depois de lavar as placas (3 x) com PBST, 100 μΐ de anticorpo de amostra foram adicionados. Depois de lavar as placas 3 x (PBST), as placas foram incubadas com estreptavidinapoli-HRP (1:10.000) em PBS e 100 μΐ adicionados em cada reservatório (1 hora, RT). Depois de lavar as placas (3 x em PBST), 10 mg de ABTS (Roche) por 10 ml de tampão de ABTS (Roche) foram fabricados e 100 μΐ adicionados em cada reservatório. Depois de 20 minutos, a absorção foi lida a 405 nm com um leitor ELISA (EL 808, Bio-Tek Instruments).
Tabela 3
Nomes de clone, isotipos e, ligação ao CD25
Clone Sub-classe ligação de CD251 CHO-CD252
AB1 IgGl + +
AB7 IgGl + +
AB11 IgGl + +
AB12 IgGl + +
Ligação de sobrenadantes de cultura de clone como determinada pelo rhCD25 ELISA Ligação ao CD25 expressado nas células CHO transfectadas e determinadas pela citometria de fluxo
Inibição de ligação de IL-2 biotinilado ao seu receptor pelos sobrenadantes de anticorpos monoclonais de CD25 humano: A fim de examinar a extensão cujos anticorpos monoclonais humanos bloqueiam ou inibem a ligação de IL-2 ao CD25, as placas de 96 reservatórios (Greiner),
101
foram revestidas durante a noite em temperatura ambiente com rhCD25 (100 ng/ml; R&D systems, MN, USA), na ligação não específica foi bloqueada pelo revestimento das placas com PBSTC por 1 hora em temperatura ambiente. Depois de lavar as placas (3 x) com PBST, 100 μΐ de anticorpo de amostra (faixa de concentração: 10, 33 e, 100 ng/ml) foram adicionados. Para comparação Zenapax® também foi adicionado. Depois de 10 minutos, rIL-2biotina (50 ng/ml) foi adicionada (1,5 hora, RT). Depois de lavar as placas 3x (em PBST), as placas foram incubadas com estreptavidina-poli-HRP (diluída 1:10.000 do estoque) em PBS e 100 μΐ foram adicionados em cada reservatório (1 hora, RT). Depois de lavar as placas (3 x em PBST), 10 mg de ABTS (Roche) por 10 ml tampão de ABTS (Roche) foram fabricados e 100 μ[ adicionados em cada reservatório. Depois de 20 minutos, a absorção foi lida a 405 nm com um leitor ELISA (EL808, Bio-Tek Instruments). Os dados mostram um dos dois experimentos representativos. Como mostrado na Figura 11, os sobrenadantes de anticorpos monoclonais de CD25 humano AB1, AB7, AB11 e AB12 foram capazes de inibir a ligação de IL-2 biotinilado ao CD25 mais eficientemente do que o Zenapax®.
Inibição de ligação de Zenapax® ao CD25 pelos sobrenadantes de anticorpos monoclonais de CD25 humano: A fim de examinar a extensão cujos anticorpos monoclonais humanos bloqueiam ou inibem a ligação de Zenapax® ao CD25, as placas de 96 reservatórios (Greiner) foram revestidas durante a noite em temperatura ambiente com rhCD25 (100 ng/ml; R&D systems, MN, USA), na ligação não específica foi bloqueada pelo revestimento das placas com PBSTC por 1 hora em temperatura ambiente. Depois de lavar as placas (3 x) com PBST, 100 μΐ de amostra (faixa de concentração: 10, 33 e, 100 ng/ml) foram adicionados. Depois de 10 minutos, Zenapax® biotinilado (5 ng/ml) foi adicionado (1,5 hora, RT). Depois de lavar as placas 3x (em PBST), as placas foram incubadas com estreptavidina-poli-HRP (diluído 1:10.000 do estoque) em
102
PBS e, 100 μΐ foram adicionados em cada reservatório (1 hora, RT). Depois de lavar as placas (3x em PBST), 10 mg de ABTS (Roche) por 10 ml de tampão de ABTS (Roche) foram fabricados e 100 μΐ adicionados em cada reservatório. Depois de 20 minutos, a absorção foi lida a 405 nm com um 5 leitor ELISA (EL 808, Bio-Tek Instruments). Os dados mostram um dos dois experimentos representativos. Como mostrado na Figura 12, os sobrenadantes dos anticorpos monoclonais humanos AB1, AB7, AB11 e, AB12 bloqueiam a ligação Zenapax® ao CD25.
Exemplo 4 Anticorpos monoclonais humanos contra CD25 inibem a proliferação de célula T induzida por anticorpo anti-CD3
Os anticorpos humanos foram testados quanto a sua capacidade de inibir a proliferação de célula T usando-se o ensaio de proliferação de célula T. Para comparação, Zenapax® bem como um anticorpo de controle de isotipo (hIgGl/κ) também foi testado.
Isolamento de PBMC: Células sangüíneas humanas (obtidas em camadas leucocitárias de Dutch Red Cross Blood Bank, Utrecht, Países
Baixos) foram colocadas em um gradiente ficoll (Pharmacia, 2500 rpm, 25 minutos). Com uma pipeta, as PBMCs foram coletadas em RPMI 1640 (suplementado com FCS a 10% (Wisent Multicell optimum C241), 2 mM de
L-glutamina, 50 IU/ml de penicilina, 50 /xg/ml de estreptomicina, 25 mM de
HEPES (todos derivados de BioWhittaker, Europa)).
Ensaio de proliferação de célula T: As PBMCs humanas foram diluídas em RPMI 1640 (suplementado com FCS a 10% (Wisent
Multicell optimum C241), 2 mM de L-glutamina, 50 IU/ml de penicilina, 50 25 Bg/ml de estreptomicina, 25 mM de HEPES (todos derivados de
BioWhittaker, Europa)) a 1,5 x 105 células/reservatório (em tripleto) em placas de fundo plano de 96 reservatórios (Greiner). As células foram estimuladas com anticorpo anti-CD3 (CLB-T3/4. E, cat#M1654, 10 ng/ml).
Depois, 50 μΐ de anticorpos experimentais cada vez mais diluídos foram
103 adicionados às células (variando de 500 ng/ml a 7,8 ng/ml, em diluições de duas etapas). Depois de cinco dias (37°C, CO2 a 5%) a proliferação foi quantificada pelo uso de BrdU (concentração final: 10 μΜ, Roche) de acordo com o método descrito abaixo.
Ensaio de rotulação de BrdU (conjunto de fingimento por
BrdU Roche, cat no 1 647 229): A solução de rotulação de BrdU (100 μΜ) foi adicionada aos reservatórios e as células foram incubadas durante a noite (37°C, CO2 a 5%). As células foram recolocadas em suspensão em
reservatórios e centrifugadas (10 minutos, 300 g). O sobrenadante foi descartado e grão de célula foi secado (1 hora, 60°C). O grão foi então incubado com FixDenat (200 μΐ/reservatório; 30 minutos, RT). Depois da incubação, FixDenat foi descartado e 100 μΐ/reservatório de anti-BrdU-POD (adicionar 100 μΐ de solução de estoque de anti-BrdU a 10 ml de solução de Ab-diluição) foram adicionados ao grão (1 hora, RT). Depois de descartar o sobrenadante, as placas foram lavadas (3 x) com solução de lavagem (200 μΐ/reservatório). Finalmente, 100 ml/reservatório de solução de substrato foram adicionados ao grão (5 minutos, RT). A reação de coloração foi
interrompida por H2SO4 (25 μΐ/reservatório, 1M) e a densidade óptica foi lida pelo leitor ELISA a 450 nm (Bio-Tek Instruments).
Como mostrado na Figura 13, os anticorpos monoclonais humanos AB1, AB7 e AB12 inibiram a proliferação de célula T induzida por anticorpo anti-CD3 de uma maneira dependente de dose. A inibição pelos anticorpos humanos foi mais eficiente do que por Zenapax®.
Os dados mostram um de três experimentos representativos.
Exemplo 5 Anticorpos monoclonais humanos contra CD25 inibem MLR
Os anticorpos humanos foram testados quanto a sua capacidade de inibir MLR usando-se o ensaio de MLR. Para comparação, Zenapax® bem como um anticorpo de controle de isotipo (hlgd/κ) também foi testado. As PBMCs humanas (obtidas em camadas leucocitárias do Dutch
104
Red Cross Blood Bank, Utrecht, Países Baixos) de dois doadores que não competem com MHC foram diluídos em RPMI 1640 (suplementado com FCS a 10% (Wisent Multicell optimum C241), 2 mM de L-glutamina, 50 IU/ml de penicilina, 50 gg/ml de estreptomicina (todos derivados de Gibco BRL, Life 5 Technologies, Paisley, Escócia)) a 2,0 χ 106 células/ml. As PBMCs do primeiro doador foram irradiadas (2000 rads) e misturados (1,0 χ 105 células/reservatório) com as PBMCs do segundo doador (1,0 χ 105 células/reservatório) em placas de fundo plano de 96 reservatórios (Greiner)
em tripleto. Então, 50 μΐ de anticorpos experimentais cada vez mais diluídos foram adicionados às células (variando de 50 ng/ml a 0,8 ng/ml, em diluições de duas etapas). Depois seis dias de cultura, (37°C, CO2 a 5%) a proliferação foi quantificada pelo uso de BrdU (concentração final: 10 μΜ, Roche) de acordo com o método descrito acima.
Como mostrado na Figura 14, os anticorpos monoclonais humanos AB1, AB7 e, AB12 inibiram o MLR de uma maneira dependente de dose. A inibição de MLR por AB1, AB7 e AB12 (em doses entre cerca de 1 e 3 ng/ml) foi mais eficiente do que a inibição por Zenapax®. Os dados mostram um de três experimentos representativos.
Exemplo 6 Análise cinética de AB12 em instrumento Biacore 3000
As análises de afinidade foram avaliadas pelas mudanças de monitoramento em ressonância de plasmônio de superfície usando-se um instrumento BIAcore 3000. Um controle de software BIAcore 3000 e
BIAcore 3000 (BIAcore, Uppsala, Suécia, lote #BR-1100-43) foi usado. CD25 humano (R&D Systems, lote #223-2A/CFO) foi imobilizado a um chip 25 de sensor CM-5 em baixa densidade (BIAcore, lote #BR-1000-14) que usa química de ligação de amina de acordo com as recomendações do fabricante. Depois de bloquear os locais de ligação residuais do chip de sensor ativado usando-se etanol-amina-HCl, uma análise cinética foi realizada a 25°C (de acordo com as recomendações do fabricante) usando-se anticorpo monoclonal
1 lâ
•· · · ··· · ·· · * .· · · · · · · · · · · · • • ·
105 :· • ········· · · • • •
• · · · · · · · ··· · humano AB12 e para comparação, Zenapax®. As amostras que contém AB12 e Zenapax®, respectivamente, foram fluidas na superfície do chip de sensor revestido permitindo a AB12 e Zenapax® associarem-se com rhCD25. A associação e dissociação de AB12 e Zenapax®, respectivamente, foram • · ·
5 monitoradas usando-se ressonância de plasmônio de superfície (SPR) no chip de sensor. Os resultados foram visualizados usando-se um BIAcore 3000 (Bio-tek Instruments) e analitos usando-se o Software 3.1 BIAevaluation (BIAcore, Uppsala, Suécia) e ligação de Languir 1:1 foi usada como modelo pré-fixado.
10 O KD de AB12 para a ligação ao rhCD25 determinado pela análise BIAcore: 4,74 x 10’11 ± 0,43 x 10'11. O KD de Zenapax para a ligação ao rhCD25 determinado pela análise BIAcore: 1,52 x 10‘10 ± 0,27 x IO'10.
15 Exemplo 7 Tratamento de AB12 de blastos de células T resulta na introversão de CD25 AB12 foi testado quanto a sua capacidade de induzir a introversão de CD25. O anti-KLH (anticorpo do isotipo IgGl/k humano, específico para hemocianina do lapa buraco de fechadura) foi incluído como
20 anticorpo de controle de isotipo. Indução de blastos de células T: Depois do isolamento de células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs) a partir de amostras de heparina-sangue que usam gradiente de meio de separação de linfócito, as PBMCs foram estimuladas por três a quatro dias com 5 /zg/ml de
25 fitoemaglutinina (PHA; Difco, cat # 211796) em meio de cultura (37°C, CO2 a 5%). Estimulação de blastos de células T para examinar a introversão: Depois da colheita das células e da lavagem em PBS, as células foram contadas com azul tripano. Uma parte dos blastos de célula T (1 x 106
/13
106
células/ml) foi pré-incubada (4°C, por 15 minutos) com AB12 rotulado com FITC (2 gg/ml de AB12-FITC) ou, anti-KLH rotulado com FITC (2 /ig/ml) como controle de isotipo ou, sem adição dos anticorpos. Depois da pré-incubação, as células foram lavadas em PBS e, 1 x 106 células (em 1 ml 5 de meio de cultura) foram adicionados às placas de 24 reservatórios e, incubados por 18 horas (37°C, CO2 a 5%). O remanescente dos blastos de células T foi incubado na ausência ou na presença de AB12 rotulado com
FITC (2 gg/ml) ou, anti-KLH rotulado com FITC (2 /zg/ml) por 18 horas
(37°C, CO2a5%).
Depois da incubação, as células foram colhidas e, rotuladas com aglutinina de germe de trigo rotulada com rodamina (1 gg/ml, rotulação de membrana; Molecular Probes, cat No. W-849), a 4°C por 15 minutos. Depois disso, as células foram lavadas com PBS e, recolocadas em suspensão em 25 μΐ de Vectashield DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA).
Depois, 10 μ,Ι da suspensão celular foi pipetada em lâminas de tecido, coberta e, analisada pela microscopia de fluorescência (Carl Zeiss) e, fotografias tiradas com filtro TRITC para fingimento por rodamina (série de filtro 15, Zeiss), ou filtro FITC para o fingimento por FITC (série de filtro 09, Zeiss). O
fingimento de membrana, obtido com a aglutinina de germe de trigo rotulada com rodamina, não é mostrado.
Como mostrado nas Figuras 15A e 15B, depois de 18 horas de cultura, o sinal de AB12-FITC pode ser encontrado dentro das células. A Figura 15A mostra o resultado depois de cultivar as células por 18 horas seguinte a pré-incubação (15 minutos) com AB12-FITC e lavagem e, a Figura 25 15B mostra o resultado depois de cultivar as células por 18 horas na presença de AB12-FITC. Um experimento de controle com o anticorpo anti-KLH conjugado com FITC irrelevante (Figura 15C) não mostra nenhuma introversão de anticorpo rotulado com FITC.
Exemplo 8 Tratamento de AB12 de blastos de células T resulta na
114
107 introversão de CD25 como medido pela citometria de fluxo
Em um outro experimento a citometria de fluxo foi usada para determinar a introversão de AB12 rotulado com FITC em blastos de células T em intervalos de tempo diferentes.
Depois do isolamento das células mononucleares sangüíneas periféricas (PBMCs) a partir de amostras de heparina-sangue, que usam gradiente de meio de separação de linfócito (Ficoll), as PBMCs foram estimuladas por três a quatro dias com 5 /zg/ml de fitoemaglutinina (PHA; Difco, cat No 211796) em meio de cultura (37°C, CO2 a 5%).
Depois de três dias de cultura os blastos de células T foram colhidos, lavados com PBS e, contados com azul tripano. Aos blastos de células T (2,5 χ 106 células em 2 ml de meio de cultura), 2 gg/ml de AB12 rotulado com FITC ou anti-KLH rotulado com FITC (anticorpo de controle de isotipo) foram adicionados. Depois da pré-incubação das células (4°C, 1 hora), as células foram divididas em duas porções. Uma porção foi lavada em meio de cultura, enquanto que a outra porção não foi lavada. Depois de lavar, as amostras de pré-incubação foram recolocadas em suspensão em meio de cultura. Ambas as porções foram incubadas a 4°C ou a 37°C.
Depois de 0, 0,5, 1 ou, 4,5 horas de incubação (a 4°C ou a 37°C), 3 ml de tampão de FACS (PBS suplementado com BSA a 0,05% e 0,01 gg/ml de azida de sódio) foram adicionados às células e, as células foram rotacionados a 300 g (4°C). Em uma porção, as células foram recolocadas em suspensão em 200 pl de tampão de FACS, enquanto que na outra porção, as células foram recolocadas em suspensão em 200 gl de tampão de FACS e 1 mg/ml de brometo de etídio (Sigma, cat No. E8751). O brometo de etídio foi imediatamente adicionado antes da aquisição de célula pela citometria de fluxo.
O brometo de etídio foi usado para extinguir o sinal de fluorescência na superfície celular. Como mostrado na Figura 16, a razão de
113
108
fluorescência das amostras incubadas a 4°C medida com ou sem brometo de etídio foi aproximadamente um. Isto indica que nenhuma introversão aconteceu. As células cultivadas a 37°C mostraram um aumento desta razão de fluorescência durante um período extraordinário. Isto indica que a introversão de AB12-FITC ocorreu. Como esperado, a incubação de células na presença continuada de AB12 rotulado com FITC resulta em níveis mais altos de introversão (Figura 16B) quando comparado à células apenas préincubadas com AB12 rotulado com FITC (Figura 16A). A Figura 16A mostra
a razão da intensidade de fluorescência média (MFI) para células préincubadas por 1 hora e excesso de AB12 rotulado com FITC lavado. A Figura
16B mostra o resultado depois de cultivar as células na presença de AB12 rotulado com FITC. A razão de MFI é determinada dividindo-se a MFI das amostras de teste pela MFI de amostra a 0 hora. Nenhum tingimento foi observado com o anticorpo de controle de isotipo (anti-KLH-FITC, dados não 15 mostrados).
Esta característica de introversão dos anticorpos da invenção os tomarão adequados para a conjugação com uma toxina para o tratamento
de por exemplo leucemia de célula T adulta/linfoma, linfoma de célula grande anaplástico, linfoma de célula T cutâneo (incluindo micose fungóide e síndrome de Sezary), linfomas de célula T periféricos, linfoma de Hodgkin, leucemia de célula capilar e leucemia linfocítica crônica (CLL)/linfoma linfocítico pequeno (SLL).
Em uma outra colocação, os anticorpos da invenção são submetidos ao reasiolabeling com um radioisótopo adequado para o 25 tratamento de por exemplo leucemia de célula T adulta/linfoma, linfoma de célula grande anaplástico, linfoma de célula T cutâneo (incluindo micose fungóide e síndrome de Sezary), linfomas de célula T periféricos, linfoma de Hodgkin, leucemia de célula capilar e leucemia linfocítica crônica (CLL) /linfoma linfocítico pequeno (SLL).
109
Além disso, os anticorpos podem ser rotulado com mIn para a determinação da carga de tumor e ajustar, desse modo, a dosagem de anticorpo radiorrotulado a ser administrado.
Equivalentes
Aqueles habilitados na técnica reconhecerão ou serão capazes de verificar, usando-se não mais do que a experimentação de rotina, muitos equivalentes das formas de realização específicas da invenção descritas neste.
Tais equivalentes são pretendidos ser abrangidos pelas seguintes
reivindicações. Qualquer combinação das formas de realização divulgadas nas reivindicações dependentes também são consideradas estarem dentro do escopo da invenção.
Incorporação por Referência
Todas as patentes, pedidos de patente pendentes e outras publicações citadas neste, são por meio deste, incorporadas por referência em sua totalidade.

Claims (32)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Anticorpo humano isolado monoclonal, caracterizado pelo fato de que se liga ao CD25 humano e inibe a ligação de IL-2 ao CD25, em que o anticorpo compreende Vh CDR1, CDR2 e CDR3 e Vl CDR1, CDR2 e CDR3 selecionados do grupo de:
    (i) SEQ ID N°: 23, 24, 25, 26, 27 e 28;
    (ii) SEQ ID N°: 29, 30, 31, 32, 33 e 34;
    (iii) SEQ ID N°: 35, 36, 37, 38, 39 e 40;
    (iv) SEQ ID N°: 17, 18, 19, 20, 21 e 22; ou (v) modificações de sequência conservadoras de qualquer uma das sequências definidas em (i) a (iv).
  2. 2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo que consiste de um anticorpo IgG1, um IgG2, um IgG3, um IgG4, um IgM, um IgA1, um IgA2, um IgA secretor, um IgD e um IgE.
  3. 3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo IgG1.
  4. 4. Anticorpo de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo IgG4.
  5. 5. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo dissocia-se a partir do CD25 humano com uma constante de equilíbrio de dissociação (KD) de cerca de 10-8 M ou menos, preferivelmente de cerca de 10-9 M ou menos e mais preferivelmente de cerca de10-10 M ou menos ou 10-11 M ou ainda menos, quando determinado pela tecnologia de ressonância de plasma de superfície (SPR) em um instrumento BIAcore 3000 usando-se CD25 recombinante humano como o ligando e o anticorpo como o analito.
  6. 6. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo tem uma ou mais das
    Petição 870190010756, de 01/02/2019, pág. 7/14 seguintes características:
    (a) especificidade para CD25 humano;
    (b) inibe a ligação de IL-2 ao CD25;
    (c) elimina as células T que expressam CD25;
    (d) tolera as células T;
    (e) inibe a proliferação de células T que expressam CD25;
    (f) inibe a proliferação de célula T induzida pelo anticorpo anti-CD3 de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs);
    (g) inibe a reação de linfócito mista (MLR);
    (h) introversão de CD25 expressado nas células T.
  7. 7. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes de 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser codificado pelos ácidos nucléicos de cadeia pesada humana e cadeia leve capa humana que compreendem seqüência de nucleotídeo em suas regiões variáveis como apresentado na SEQ ID N°: 5 e SEQ ID N°: 7, respectivamente ou suas modificações de seqüência conservadoras.
  8. 8. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes de 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser codificado pelos ácidos nucléicos de cadeia pesada humana e cadeia leve capa humana que compreendem seqüência de nucleotídeo em suas regiões variáveis como apresentado na SEQ ID N°: 13 e SEQ ID N°: 15, respectivamente ou suas modificações de seqüência conservadoras.
  9. 9. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes de 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser codificado pelos ácidos nucléicos de cadeia pesada humana e cadeia leve capa humana, que compreendem a seqüência de nucleotídeo em suas regiões variáveis como apresentado na SEQÜÊNCIA ID N°: 1 e SEQ ID N°: 3, respectivamente ou suas modificações de seqüência conservadoras.
  10. 10. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações
    Petição 870190010756, de 01/02/2019, pág. 8/14 precedentes de 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser codificado pelos ácidos nucléicos de cadeia pesada humana e cadeia leve capa humana que compreende seqüência de nucleotídeo em suas regiões variáveis como apresentado na SEQ ID N°: 9 e SEQ ID N°: 11, respectivamente ou suas 5 modificações de seqüência conservadoras.
  11. 11. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes de 1 a 6, caracterizado pelo fato de ter regiões variáveis de cadeia pesada humana e cadeia leve capa humana que compreende as seqüências de aminoácido como apresentado na SEQ ID N°: 6 e SEQ ID N°: 8,
    10 respectivamente ou suas modificações de seqüência conservadoras.
  12. 12. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes de 1 a 6, caracterizado pelo fato de ter regiões variáveis de cadeia pesada humana e cadeia leve capa humana, que compreendem as seqüências de aminoácido como apresentado na SEQ ID N°: 14 e SEQ ID N°: 16,
    15 respectivamente ou suas modificações de seqüência conservadoras.
  13. 13. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes de 1 a 6, caracterizado pelo fato de ter regiões variáveis de cadeia pesada humana e cadeia leve capa humana, que compreendem as seqüências de aminoácido como apresentado na SEQ ID N°: 2 e SEQ ID N°: 4,
    20 respectivamente ou suas modificações de seqüência conservadoras.
  14. 14. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes de 1 a 6, caracterizado pelo fato de ter regiões variáveis de cadeia pesada humana e cadeia leve capa humana, que compreendem as seqüências de aminoácido como apresentado na SEQ ID N°: 10 e SEQ ID N°: 12,
    25 respectivamente ou suas modificações de seqüência conservadoras.
  15. 15. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo intacto selecionado do grupo que consiste de um anticorpo de IgG1 intacto, anticorpo de IgG2 intacto, um anticorpo de IgG3 intacto, um anticorpo de IgG4 intacto,
    Petição 870190010756, de 01/02/2019, pág. 9/14 um anticorpo de IgM intacto, um anticorpo de IgA1 intacto, um anticorpo de IgGA2 intacto, um anticorpo de IgA secretor intacto, um anticorpo IgD intacto e um anticorpo IgE intacto, em que o anticorpo é glicosilado em uma célula eucariótica.
  16. 16. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo intacto selecionado do grupo que consiste de um anticorpo de IgG1,K intacto, um anticorpo de IgG1 ,λ intacto, um anticorpo de IgG4,K intacto e um anticorpo de IgG4, λ intacto, em que o anticorpo é glicosilado em uma célula eucariótica.
  17. 17. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que é um fragmento de anticorpo ou um anticorpo de cadeia simples.
  18. 18. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que é uma proteína de fusão de imunoglobulina de domínio de ligação que compreende (i) uma região variável de cadeia pesada ou uma região variável de cadeia leve, como definida na reivindicação 11-14, que é fundida a um polipeptídeo de região de articulação de imunoglobulina, (ii) uma região constante de CH2 de cadeia pesada de imunoglobulina fundida à região de articulação e (iii) uma região constante de CH3 de cadeia pesada de imunoglobulina fundida à região constante de CH2.
  19. 19. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes produzido por um hibridoma, caracterizado pelo fato de que inclui uma célula B obtida a partir de um animal não humano transgênico, em que as redisposições de segmento de gene V-(D)-J resultaram na formação de um transgene de cadeia pesada humano funcional e um transgene de cadeia leve humano funcional, fundido a uma célula imortalizada.
  20. 20. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o
    Petição 870190010756, de 01/02/2019, pág. 10/14 anticorpo humano como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 17 e um carreador farmaceuticamente aceitável.
  21. 21. Composição de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que ainda compreende um agente terapêutico.
  22. 22. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 17, caracterizado pelo fato de que ainda compreende um ligador quelador para ligar um radioisótopo.
  23. 23. Imunoconjugado, caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 17 ligado a uma gente citotóxico, um radioisótopo ou um medicamento.
  24. 24. Molécula biespecífica ou multiespecífica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 17 e uma especificidade de ligação para CD3, CD4, IL-15R, TNF-α ligado por membrana ou ligado por receptor ou IL- 15 ligado por membrana ou ligado por receptor.
  25. 25. Método para detectar a presença de antígeno CD25 ou uma célula que expressa CD25, em uma amostra caracterizado pelo fato de que compreende: contactar a amostra com o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 17 sob as condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo e CD25 e detectar a formação de um complexo.
  26. 26. Conjunto de diagnóstico para detectar a presença de antígeno CD25 ou uma célula que expressa CD25, em uma amostra caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 17, em que o anticorpo é opcionalmente ligado a um rótulo detectável.
  27. 27. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica a região variável de
    Petição 870190010756, de 01/02/2019, pág. 11/14 uma cadeia leve, cadeia pesada e tanto cadeias leves quanto pesadas de um anticorpo humano que se liga ao CD25 humano.
  28. 28. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que ainda compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica a região constante de uma cadeia leve, cadeia pesada ou tanto cadeia leve quanto pesada de um anticorpo humano que se liga ao CD25 humano.
  29. 29. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma região variável de cadeia pesada que compreende um nucleotídeo selecionado do grupo que consiste da seqüência de nucleotídeo como apresentado na SEQ ID N°: 1, 5, 9 ou 13 ou modificações conservadoras destes e uma região variável leve que compreende uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo que consiste da seqüência de nucleotídeo como apresentado na SEQ ID N°: 3, 7, 11 ou 15 ou modificações conservadoras destes.
  30. 30. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma região variável de cadeia pesada que compreende uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo que consiste das seqüências de aminoácido como apresentadas na SEQ ID N°: 2, 6, 10 ou 14 e a região variável de cadeia leve que compreende a seqüência de aminoácido selecionada do grupo que consiste das seqüências de aminoácido como apresentado na SEQ ID N°: 4, 8, 12 ou 16 e suas modificações de seqüência conservadoras.
  31. 31. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que codifica um anticorpo monoclonal humano como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 17.
  32. 32. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor de expressão como definido em qualquer uma das reivindicações de 27 a 31 e um carreador farmaceuticamente aceitável.
BRPI0316282A 2002-11-15 2003-11-14 anticorpo humano isolado monoclonal, composição, imunoconjugado, molécula biespecífica ou multiespecífica, método e conjunto de diagnóstico para detectar a presença de antígeno cd25 ou uma célula que expressa cd25, e, vetor de expressão BRPI0316282B8 (pt)

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