BRPI0609692B1

BRPI0609692B1 - Processos de fermentação e de fabricação de uma preparação de um antígeno de c. diphtheriae

Info

Publication number: BRPI0609692B1
Application number: BRPI0609692-1A
Authority: BR
Inventors: Philippe Marc Helene Dehottay; Sandrine Dessoy; Marc Roger Fernand Orval; Oliver Marc Serge Ghislain Laloux
Original assignee: Glaxosmithkline Biologicals S. A.
Priority date: 2005-03-23
Filing date: 2006-03-21
Publication date: 2019-02-12
Also published as: ATE449788T1; KR101341121B1; EP2174950A1; EP2174950B1; JP4917087B2; CA2602143C; BRPI0609692B8; US20140242635A1; RU2007135122A; CN101180313A; GB0505996D0; US20080193475A1; AU2006226542B2; KR20070116132A; BRPI0609692A2; EP1861420A1; DE602006010676D1; RU2394914C2; ES2378193T3; AU2006226542A1

Abstract

processos de fermentação, de fabricação de uma preparação de um antígeno de c. diphtheriae e de fabricação de uma composição farmacêutica, e, usos do antígeno, toxina de dipteria ou mutante da mesma, e de uma composição farmacêutica. a presente invenção refere-se a um processo de fermentação compreendendo uma etapa de fermentação de cultivo de uma cepa de corynebacterium diphtheria em meio em um fermentador sob condições de agitação suficientes para manter uma cultura homogênea e aeração limitada, de modo que o po2 dentro da cultura cai a menos de 4% na maior parte da etapa de fermentação.

Description

“PROCESSOS DE FERMENTAÇÃO E DE FABRICAÇÃO DE UMA

PREPARAÇÃO DE UM ANTÍGENO DE C. DIPHTHERIAE”

A presente invenção refere-se ao campo de antígenos de difteria, particularmente toxinas (incluindo formas mutantes de toxina de difteria, como CRM197) e processos de fermentação para a fabricação de culturas em bruto destes antígenos.

A toxina de difteria é uma exotoxina de proteína produzida pela bactéria Corynebacterium diphtheria. Ela é produzida como um polipeptídeo único que é prontamente emendado para formar duas subunidades ligadas por uma ponte dissulfeto, fragmento A e fragmento B, como um resultado da clivagem em resíduo 190, 192 ou 193 (Moskaug et al Biol. Chem. 264: 15709-15713, 1989. O fragmento A é a porção cataliticamente ativa e é uma ADP- ribosiltransferase dependente de NAD que especificamente marca um fator EF-2 de síntese de proteína, assim inativando EF-2 e parando a síntese de proteína em uma célula.

A imunidade a uma toxina bacteriana, como toxina de difteria, pode ser adquirida naturalmente durante o curso de infecção, ou artificialmente por injeção de uma forma destoxificada da toxina (toxóide) (Germanier, er, Bacterial Vaccines, Academic Press, Orlando, Fl., 1984). Os toxóides tem sido tradicionalmente feitos por modificação química de toxinas nativas (Lingood et al Brit. J. Exp. Path. 44, 177, 1963), tomando as mesmas não tóxicas enquanto retendo uma antigenicidade que protege o animal vacinado sobre desafio subseqüente pela toxina natural. Altemativamente, várias toxinas de difteria mudadas foram descritas que tem toxicidade reduzida. (US4709017, US4950740).

Petição 870180145694, de 29/10/2018, pág. 9/12

CRM197 é uma forma não tóxica da toxina de difteria mas é imunologicamente indistinguível da toxina de difteria. CRM197 é produzido por C. diphtheriae infectado pela fase não toxigênica β 197tox-, criada pela mutagenese de nitrosoguanidina do carinefago b toxigênico (Uchida et al 5 Nature New Biology (1971) 233; 8-11 ). A proteína CRM197 tem o mesmo peso molecular que a toxina de difteria mas difere da mesma por uma mudança de fase única no gene estrutural. Isto leva a uma mudança de glicina em glutamina de aminoácido em posição 52 que toma o fragmento A incapaz de ligar NAD e, assim, é não tóxico ((Pappenheimer 1977, Ann Rev, 10 Biochem. 46; 69-94, Rappuoli Applied Environmental Microbiology Set.

1983 p560-564).

O toxóide de difteria e uma forma mutante com toxicidade reduzida, CRM197, são componentes em muitas vacinas provendo imunidade contra Corynebacterium diphtheriae. Várias vacinas de combinação são 15 conhecidas as quais podem evitar Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, e opcionalmente vírus de hepatite B e/ou Haemophilus influenzae tipo b (ver, por exemplo, WO 93/24148 e WO 97/00697, WO 02/055105).

A toxina de difteria e as formas mutantes incluindo CRM197 20 também foram usadas em vacinas como veículos dependentes de células T efetivos para sacarídeos. CRM197 é atualmente usado na vacina conjugada de CRM197 oligossacarídeo tipo B de tipo de Haemophilus influenzae (HibTitre ®; Lederle Praxis Biologicals, Rochester, N.Y.).

Os métodos de preparação de toxina de difteria (DT) são bem 25 conhecidos na arte. Por exemplo, DT pode ser produzido por purificação da toxina a partir de uma cultura de Corynebacterium diphtheriae seguido por destoxificação química, ou pode ser feito por purificação de um análogo destoxificado geneticamente, ou recombinante, da toxina (por exemplo, CRM197, ou outros mutantes como descrito em US 4,709,017, US 5,843,711,

US 5,601,827, e US 5,917,017). Corynebacterium diphtheriae é cultivado sob condições aeróbicas. Rappuoli et al (Biotechnology Fevereiro 1985, pl61163) sugeriram que pO2 pode ser regulado a 25% por aeração com uma mistura de ar e oxigênio que é automaticamente regulada para manter o pO2 desejado.

A produção de quantidades significantes de toxinas de difteria como CRM197 para uso em vacinas foi impedida devido à pequena abundância de proteína. Este problema foi dirigido previamente por introdução de outras cópias de um gene codificando toxina de difteria ou uma 10 forma mutante em Corynebacterium diphtheriae (US 4,925,792; US 5,614,382). Estes métodos levam a um aumento na produção de cerca de três vezes. Os métodos de ainda melhorar os rendimentos de toxina de difteria em um modo reprodutível podem ser de benefício para permitir maiores níveis de produção destes antígenos valiosos.

Conseqüentemente, o presente pedido provê um processo de fermentação melhorado compreendendo uma etapa de fermentação de cultivo de uma cepa de Corynebacterium diphtheria em um meio em um fermentador sob condições de agitação suficientes para manter uma cultura homogênea e

aeração limitada como pO2 dentro da cultura está a menos de 4% para a maior parte da etapa de fermentação.

A fermentação ocorre sob condições aeróbicas, mas de aeração limitada, como que oxigênio é usado logo que ele entrada na cultura durante a maior parte da fermentação, isto é, após a fase inicial em que a densidade de C. diphtheriae é relativamente baixa e os níveis de pO2 podem ser maiores.

Os inventores verificaram que a cultura sob estas condições resulta em uma expressão mais eficiente e/ou consistente de toxina de difteria ou mutante comparado com os métodos de fermentação realizados em maior pO2. O processo da invenção é mais robusto do que a fermentação em níveis maiores de oxigênio, e permite que os rendimentos de toxina de difteria permaneçam elevados mesmo quando o meio de cultura cotem ferro adicionado ou quando matérias primas complexas de qualidade variável são usadas.

Em um segundo aspecto da invenção, provê-se um processo para a fabricação de uma preparação de toxina de difteria ou seu mutante compreendendo realizar o processo de fermentação da invenção e isolar a toxina de difteria ou seu mutante da cultura. Apesar da toxina de difteria e mutantes serem descritos aqui, visa-se que qualquer antígeno de C. diphtheriae possa ser isolado usando o processo da invenção.

O uso deste método resulta em maiores rendimentos de toxina de difteria ou mutante, por exemplo, CRM197, comparado com quando se mantém 5% pO2 ou maior, por exemplo 20%.

Em um terceiro aspecto da invenção, provê-se uma toxina de difteria ou seu mutante isolado pelo processo da invenção.

Em um quarto aspecto da invenção, provê-se uma composição farmacêutica compreendendo a toxina de difteria ou seu mutante da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Em um outro aspecto da invenção, provê-se uma toxina de difteria ou seu mutante para uso em terapia, particularmente para o tratamento de prevenção de doença bacteriana como doença causada por C. diphtheriae.

Em um outro aspecto da invenção, provê-se um uso da toxina de difteria ou seu mutante da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de doença bacteriana, particularmente doença causada por C. diphtheriae.

Em um outro aspecto da invenção, provê-se um método de prevenção ou tratamento de infecção bacteriana, particularmente infecção por C. diphtheriae compreendendo a administração da composição farmacêutica da invenção a um paciente.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 - Gráficos mostrando o perfil de oxigenação e seu uso

na determinação de KLa de uma fermentação. O painel A mostra o curso de tempo de oxigenação após uma mudança de nitrogênio para ar. O painel B mostra um gráfico de ln(100-pO2) contra tempo, que permite a avaliação de KLa por determinação do gradiente da linha.

Figura 2 - Esquema de um processo de fermentação para C.

diphtheriae.

Figura 3 - Gráfico mostrando a cinética típica de crescimento de uma cultura de C. diphtheriae. A linha com marcadores circulares mostra o OD a 650 nm após vários tempos de cultura. A linha marcada com diamantes 10 mostra o pH da cultura.

Figura 4 - Géis SDS-PAGE dos sobrenadantes de cultura. C. Trilha 1 - marcadores de peso molecular, trilha 2 - Igg CRM197 padrão, trilha 3 - 0,5pg CRM197 padrão, trilha 4 - 0,25pg CRM197 padrão, trilhas 5-11, sobrenadantes de fermentações de C. diphtheriae. Gel A mostra os 15 sobrenadantes de CDT082 em trilha 5, CDT198 em trilhas 6-8 (o sobrenadante foi removido a 22,5 horas para trilha 6, 24 horas para trilha 7 e 28 horas para trilha 8), CDT199 em trilhas 9, 10 e 11 (o sobrenadante foi removido a 22 hora 45 minutos em trilha 9, 24 horas 45 minutos em trilha 10 e após subseqüente microfiltração e filtração em trilha 11 ). Gel B mostra 20 sobrenadantes de CDT082 em trilha 5, de CDT205 em trilhas 6-9 (trilha 7 após 21 horas 43 minutos de fermentação, trilha 8 após 23 horas fermentação, trilha 9 após 24 horas de fermentação) e de CDT206 em trilhas 10-13 (trilha após 22 horas 10 minutos de fermentação, trilha 11 após 23 horas 49 minutos de fermentação, trilha 12 após 24 horas 30 minutos de fermentação, 25 trilha 13 após microfiltração e filtração).

Figura 5 - Gráfico mostrando o KLa de um fermentador de 150 litros em diferentes velocidades de agitação sob condições de aeraçao de 23 litros por minuto.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Os termos compreendendo, compreender, compreende aqui se destinam pelos inventores a serem opcionalmente substituíveis com os termos consistindo de, consistir de e consiste de, respectivamente, em cada caso.

Um aspecto da invenção é um processo de fermentação compreendendo uma etapa de fermentação de cultivo de uma cepa de Corynebacterium diphtheria em meio em um fermentador sob condições de agitação suficientes para manter uma cultura homogênea (por exemplo suficiente para produzir um tempo de mistura de menos que 30, 20, 15,10, 9, 10 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 segundos) e aeração limitada de modo que pO2 dentro da cultura está a menos que 5%, 4%, 3%, 1 % ou 0,5% para a maior parte da etapa de fermentação. Em uma forma de realização preferida, o pO2 cai para se aproximar de zero, preferivelmente na maior parte da etapa de fermentação.

Por exemplo, o pO2 com a cultura cai a menos que 5%, 4%,

3%, 1% ou 0,5% do tempo quando Corynebacterium diphtheria foi cultivada a uma densidade suficiente para consumir a maior parte do oxigênio logo que o oxigênio entra na cultura (fase de latência, por exemplo de pelo menos 1,2, 3, 4, 5 ou 6 horas após o início de fermentação), até o ponto da fermentação 20 quando a concentração de pO2 se eleva novamente, próxima do final da etapa de fermentação (por exemplo 16, 18, 20, 22 ou 24 horas após a fase de latência).

A fermentação tipicamente termina e a cultura é colhida quando p)2 se eleva acima das condições de aeração limitadas. Deve-se notar 25 que sob condições de inoculação diferentes, por exemplo, quando o fermentador é inoculado com uma cultura bem maior de C. diphtheriae, as condições de aeração limitadas começam desde logo após o início de fermentação (por exemplo 1,5, 10, 20, 30, 40 ou 60 minutos após o início de fermentação).

	Um pO2 a 100% é a quantidade de oxigênio presente quando o
	meio (na ausência de uma cultura) é saturado com oxigênio após borbulhamento de ar comprimido através do meio a 34,5 °C e pressão de 0,5 bar. Para um fermentador de 150 litros, a taxa de aeração e velocidade de
5	agitação devem ser ajustadas a 23 litros/ min e 240 rpm, enquanto para um fermentador de 20 litros, a taxa de aeração e velocidade de agitação devem ser ajustadas a 3 litros/ min e 300 rpm. Isto deve ser fixado como a quantidade de oxigênio presente em um meio de fermentação completamente aerado antes da inoculação.
•¹⁰	Uma cultura homogênea é uma cultura em que as bactérias são uniformemente dispersas em todo o fermentador de modo que pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10% das bactérias estão presentes nos 10% superiores o meio de cultura. Uma etapa de fermentação é definida como a etapa em que
15	Corynebacterium diphtheriae é cultivado dentro do fermentador. A etapa de fermentação começa com a introdução da pré-cultura no fermentador e termina quando, sob as condições de aeração limitada aqui descritas, o pO2 eventualmente aumenta a acima de 10%. A etapa de fermentação tipicamente dura acima de 12, 14, 16, 18, 20 ou 24 horas, por exemplo entre 16 e 40
♦ 20	horas, ou por exemplo entre 22 e 28 horas. A agitação é opcionalmente por agitação da cultura no fermentador mas pode ser qualquer outro meio apropriado, por exemplo por agitação, vibro-misturador e/ou borbulhamento de gás. A agitação é suficiente

para produzir um tempo de mistura para a cultura de menos que 20, 15, 10, 8, 25 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 segundos.

Um tempo de mistura de uma cultura pode ser medido em um fermentador de vidro. Este é o tempo que leva após a introdução de uma solução aquosa colorida para a solução aquosa colorida ser uniformemente dispersa em todo o meio de cultura.

Um fermentador é um aparelho apropriado para a produção industrial de culturas bacterianas. No entanto, este termo não inclui frascos de cultura que são tipicamente usados para crescimento de bactérias em uma escala menor.

A maior parte da etapa de fermentação é definida como um tempo de mais que 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% do comprimento total da etapa de fermentação. A fermentação é tipicamente sob condições de aeração limitada de 12, 14, 16, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ou 28 horas.

A aeração limitada descreve condições de aeração que permitem que o C. diphtheriae use respiração aeróbica e ainda limite a quantidade de oxigênio disponível de modo que, após a cultura ter aumentado em densidade (por exemplo, após pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 horas de fermentação) oxigênio é consumido muito lentamente após entrar na cultura, de modo que o pO2 é menor que 5, 4, 3, 2, 1 ou 0,5%. Deve-se notar que por aumento da quantidade de cultura usada para inocular o fermentador, as condições de aeração limitada podem ser obtidas muito perto após a inoculação (por exemplo após 1, 5, 10, 20 ou 30 minutos após o início da fermentação).

Estas condições de aeração limitada levam a uma expressão robusta de uma toxina, como toxina de difteria ou seus mutantes.

Um pO2 caindo a se aproximar de zero é obtido pela taxa de aeração e agitação sendo tais que o oxigênio introduzido na cultura é usada pela cultura para respiração logo após sua introdução na cultura de modo a que, apesar da aeração da cultura, o pO2 está pronto como zero ou próximo de zero em um monitor de oxigênio.

Durante a etapa de fermentação, o pO2 irá começar em um nível maior para um dado ajuste de agitação e taxa de aeração. Isto é porque a densidade de bactérias na cultura é baixa no início da etapa de fermentação e aumenta durante a etapa de fermentação. Um período de tempo (por exemplo até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 horas) é tipicamente requerido antes de pO2 cair a menos que 5%. Deste ponto em diante, o pO2 permanece abaixo de 5,

4, 3, 2, ou 0,5%, preferivelmente a um nível se aproximando de zero até ficar próximo do final da etapa de fermentação, por exemplo até a coleta do fermentador.

Opcionalmente, a etapa de fermentação é realizada em um KLa constante em toda a etapa de fermentação. Altemativamente, a etapa de fermentação é realizada em um ou mais KLa, de modo que a aeração limitada é obtida nos valores de KLa presentes durante a maior parte (pelo mesmo 10 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%) da etapa de fermentação.

KLa é uma medida da taxa em que oxigênio entra na cultura. Quanto maior o KLa, maior a taxa em que oxigênio é introduzido na cultura. Vários fatores incluindo o volume e composição do meio, agitação, aeração, pressão, temperatura e posição e características de partes móveis do 15 fermentador irão influenciar o KLa de uma etapa de fermentação particular.

Tipicamente, oxigênio é introduzido na cultura de fermentação por borbulhamento de ar comprimido através da cultura. Onde diferentes concentrações de oxigênio estão presentes no ar introduzido na cultura, a vazão deve ser adaptada a levar em conta este fato, por exemplo, onde um 20 suprimento de 100% de oxigênio é introduzido na cultura, a vazão deve ser correspondentemente menor. Onde o gás contendo menos oxigênio do que ar é introduzido na cultura, uma maior vazão pode ser aplicada.

KLa pode ser medido usando o método descrito no exemplo 1. O método envolve ajustar o fermentador com as condições de volume de 25 meio, temperatura, pressão, agitação e aeração pra as quais KLa deve ser medido, gaseificando por substituição do ar com gás nitrogênio, gaseificando por restauração da aeração do ar e medindo a taxa em que pO2 retoma para seu nível de estado uniforme.

In (100-pO2) —-KLa. T + C

Ao traçar em gráfico In (100-p()2) contra tempo, o gradiente (ou coeficiente angular) da linha é - KLa.

O KLa de uma etapa de fermentação é influenciado por vários fatores, incluindo a quantidade de agitação da cultura e a taxa de aeração da 5 cultura. Um KLa constante pode ser mantido enquanto, por exemplo, diminuindo a agitação da cultura e aumentando a taxa de aeração ou viceversa. No entanto, em uma forma de realização, tanto a agitação da cultura como a taxa de aeração são constantes durante a etapa de fermentação.

A etapa de fermentação é realizada, por exemplo, a um KLa de entre 10-200h-l, 10 - 150 h-1, 10 - 100 h-1, 10-80 h-1, 10-50 h-1, 10-40h-l, 10-30 h-1, 20-150 h-1, 20-100 h- 1, 20-50 h-1, 20-60 h-1, 20-80 h-1, 20-30 h1, 20-40 h-1, 30-60 h-1,60-80 h-1, 60-150 h- 1 ou 60-200 h-1.

O KLa do processo de fermentação da invenção pode diferir, dependendo do tamanho da cultura de fermentação. Para culturas de 10-30 15 litros, um KLa de 10-30 h-1, 15-30, 20-30 ou 22-28 h-1 pode ser usado. Para culturas de 30-250 litros, um KLa de 30-60 ou 40-50 h-1 pode ser usado. Para culturas de 250-800 litros, um KLa de 30-50, 40-50, 40-60, 30-60, 30-80 ou 60-150 h-1 pode ser usado. Para culturas de 800-3000 litros, um KLa de 3050, 40-50, 40-60, 30-60, 30- 80, 60-150 ou 60-200 h-1 pode ser usado.

Para uma tamanho de cultura de fermentação e 10-30 litros, um KLa de 10-30 h-1 é obtido, por exemplo usando uma vazão de ar ou aeração de 1 -5 litros/ min e uma velocidade de agitação de 200- 400rpm, por exemplo uma taxa de aeração de 2-4 litros/ min e uma velocidade de agitação de 250- 350 rpm.

Para uma cultura de fermentação de 30-250 litros, um KLa de

30-60 h-1 é obtido, por exemplo usando uma vazão de ar de 15-25 litros/ min e uma velocidade de agitação de 150-250 rpm, por exemplo, usando uma vazão de ar de 20-25 litros/ min e uma velocidade de agitação de 200-250 rpm, por exemplo usando uma vazão de ar de 15-20 litros/ min e uma

PA velocidade de agitação de 200-250 rpm.

O pH da cultura de C. diphtheriae em meio CY durante a etapa de fermentação depende das condições de aeração e agitação da cultura (Nikolajewski et al J. Biological Standardization, 1982, 10; 109-114). No início da etapa de fermentação, o pH do meio CY é 7,4. No caso de aeração baixa ou KLa, o PH cai a cerca de 5. No caso de aeração elevada, o pH aumenta a em tomo de 8,5. Em uma forma de realização da invenção, o C. diphtheriae é cultivado em meio CY ou meio SOC ((Sambrook J et al 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory

Press, Cold Spring Harbor, NY) ou meio similar. O pH dentro do fermentador pode ser mantido entre 7,0 e 7,8, pelo grau de aeração, opcionalmente sem requerer adição de ácido ou base.

O processo da invenção pode ser usado com qualquer cepa de Corynebacterium diphtheriae. Estas cepas podem produzir toxina de difteria de tipo selvagem, proteínas de fusão incluindo toxina de difteria ou seu fragmento (por exemplo como descrito em US 5863891) ou formas mutantes ou fragmentos de toxina de difteria, preferivelmente os que tem toxicidade reduzida. Os exemplos de toxinas mutantes são CRM176, CRM 197, CRM228, CRM 45 (Uchida et al J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973); CRM

9, CRM 45, CRM102, CRM 103 e CRM107 e outras mutações descritas por

Nicholls e Youle em Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Marcei Dekker Inc, 1992; deleção ou mutação de Glu-148 em Asp, Gin ou Ser e/ou Ala 158 em Gly e outras mutações descritas em US 4709017 ou US 4950740; mutação de pelo menos um ou mais resíduos Lys 516, Lys 526, Phe 530 e/ou

Lys 534 e outras mutações descritas em US 5917017 ou US 6455673; ou fragmento descrito em US 5843711. Em uma forma de realização, a cepa de C. diphtheriae produz CRM 197.

Em uma forma de realização, as seguintes cepas de C. diphtheriae são usadas nos processos da invenção; ATCC39255,

ATCC39526, ATCC 11049, ATCC 11050, ATCC 11051, ATCC 11951, ATCC 11952, ATCC 13812, ATCC 14779, ATCC 19409, ATCC27010, ATCC27011, ATCC27012, ATCC296, ATCC43145, ATCC51280 ou ATCC51696.

O meio para uso na invenção pode conter um ou mais dos seguintes constituintes : 5-20 g/L, 10-16g/L ou lOg/L ácidos de casamino ou hidrolisado de caseína, 5-20 g/L, 7-15g/L ou 9-12g/L peptona de soja e/ou 1040g/L, 14-32g/L ou 18-22g/L de extrato de levedura.

Sabe-se que o teor de ferro do meio de crescimento pode afetar o crescimento de C. diphtheriae e influenciar a produção de toxinas (ver WO 00/50449). Ferro é essencial para o crescimento bacteriano, no entanto, ferro em grandes concentrações foi demonstrado como inibindo a produção de toxina. Durante o processo da invenção, o teor de ferro do meio tem um nível menor do que 10, 50, 75, 100, 120 ou 150 ppb e um limite superior de 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000 ou 5000 ppb. Por exemplo, concentrações de ferro no meio são: 50-1000 ppb, 1001000 ppb, 200-1000 ppb, 400-1000 ppb, 500-1500 ppb, 700- 1300 ppb, 502000 ppb, 100-2000 ppb, 200-2000 ppb, 400-2000 ppb, 700-2000 ppb, 503000 ppb, 100-3000 ppb, 200-3000 ppb, 400-3000 ppb, 700-3000 ppb, 10003000 ppb, 1500- 3000 ppb, 1700-3000 ppb, 50-4000 ppb, 100-4000 ppb, 2004000 ppb, 400-4000 ppb, 700- 4000 ppb, 1000-4000 ppb, 1500-4000 ppb, 1700-4000 ppb ou 2000-4000 ppb. O ferro pode estar na forma de Fe2+ e/ou

Fe3+.

Em uma forma de realização, o processo da invenção é suficientemente tolerante à presença de sais de ferro no meio de modo que nenhum tratamento do meio para remover ferro é requerido antes do uso.

A etapa de fermentação ocorre a uma temperatura apropriada para a cultura de C. diphtheriae, por exemplo 25-45 °C, 25 -40 °C, 30-38 °C, ou 34-35 °C.

A etapa de fermentação é submetida a uma grande quantidade de produção de espuma. A fim de controlar a formação de espuma, um agente anti-espumante é opcionalmente adicionado ao fermentador. Opcionalmente, uma sonda de espuma ou rompedor de espuma mecânico é usado no 5 fermentador, por exemplo assim como um agente anti-espumante.

Um segundo aspecto da invenção é um processo para a fabricação de uma preparação de um antígeno, por exemplo toxina de difteria ou mutante ou fragmento da mesma, compreendendo as etapas de realizar o processo de fermentação da invenção como mencionado acima e isolar o 10 antígeno, por exemplo toxina de difteria ou mutante ou fragmento da mesma da cultura.

Um terceiro aspecto da invenção é uma toxina de difteria ou mutante ou fragmento da mesma (por exemplo CRM197) isolada pelo processo da invenção.

A toxicidade da toxina de difteria é opcionalmente reduzida por tratamento químico incluindo tratamento com reagentes de reticulação para formar um toxóide. As referências a uma toxina incluem toxóides.

Um outro aspecto da invenção é uma composição farmacêutica

compreendendo a toxina de difteria ou mutante (por exemplo CRM197) ou um fragmento do mesmo da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.

A composição farmacêutica da invenção opcionalmente ainda compreende antígenos adicionais em uma vacina de combinação. Em uma forma de realização, antígeno (s) a serem combinados com a toxina de 25 difteria, mutante ou fragmento da mesma, como descrito acima, inclui(em) um ou mais dos toxóides de tétano, coqueluche de célula completa (Pw), coqueluche acelular(Pa) (como descrito abaixo), antígeno de superfície de hepatite B, vírus de hepatite A, polissacarídeos ou oligossacarídeos de Haemophilus influenzae b, polissacarídeos ou oligossacarídeos neisseriais (por exemplo TV. meningitidis), proteínas de serotipo B de N. meningitidis, opcionalmente como parte de uma vesícula de membrana externa, polissacarídeos ou oligossacarídeos pneumococos, proteínas pneumocócicas, ou qualquer um dos antígenos listados abaixo. Os polissacarídeos bacterianos 5 podem ser conjugados a uma proteína veículo. A toxina de difteria ou toxóide ou mutantes de toxina de difteria como CRM197 ou fragmentos, por exemplo feitos usando um processo da invenção, podem ser usados como uma proteína veículo. No entanto, outras proteínas veículo, como toxóide de tétano, fragmento C de toxóide de tétano, pneumolisina, proteína D (US 6342224) 10 também podem ser usados. Uma dada composição farmacêutica opcionalmente contém polissacarídeos ou oligossacarídeos múltiplos conjugados a diferentes proteínas veículo.

A toxina de difteria, ou seu mutante, por exemplo CRM197, ou seu fragmento feitos usando o processo da invenção podem ser formulados 15 com polissacarídeos ou oligossacarídeos capsulares, derivados de um ou mais dentre Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae b. Streptococcus pneumoniae, Grupo A Streptococci, Grupo B Streptococci, Staphylococcus aureus ou Staphylococcus epidermidis. Por exemplo, a composição farmacêutica ou imunogênica pode compreender polissacarídeos capsulares 20 derivados de um ou mais dos sorogrupos A, C, W-135 e Y de Neisseria meningitidis. Por exemplo sorogrupos AeC; Ae W, Ae Y; C e W, CeY, W e ΥχΑ, C e W; A C e Y^A, W e Y; C, W ejou A, C, W e Y podem ser _ formulados com CRM197. Em outro exemplo, a composição imunogênica compreende polissacarídeos capsulares derivados de Streptococcus 25 pneumoniae. Os antígenos de polissacarídeos capsulares pneumococos são preferivelmente selecionados dentre os sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11 A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F e 33F (mais preferivelmente os sorotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V] 14, 18C, 19F e 23F). Um outro exemplo deve conter os polissacarídeos capsulares PRP (ou oligossacarídeos) de Haemophilus influenzae tipo b. Um outro exemplo deve conter o tipo 5, Tipo 8, 336, PNAG ou polissacarídeos dPNAG capsulares de Staphylococcus aureus. Um outro exemplo deve conter os polissacarídeos capsulares Tipo I, Tipo II, Tipo III ou PIA de Staphylococcus epidermidis.

Um outro exemplo deve conter os polissacarídeos capsulares de Tipo Ia, Tipo Ic, Tipo II ou Tipo III de estreptococos de Grupo B. Um outro exemplo deve conter os polissacarídeos capsulares de estreptococos de Grupo A, opcionalmente ainda compreendendo pelo menos uma proteína M e mais preferivelmente tipos múltiplos de proteína M.

Os polissacarídeos bacterianos para uso na invenção podem ser de comprimento completo, sendo polissacarídeos nativos purificados. Altemativamente, os polissacarídeos são de tamanho entre 2 e 20 vezes, por exemplo 2-5 vezes, 5-10 vezes, 10-15 vezes ou 15-20 vezes, de modo que os polissacarídeos são menores em tamanho para um maior controle. Os 15 oligossacarídeos tipicamente contém entre 2 e 20 unidades de repetição.

Estes polissacarídeos capsulares podem ser não conjugados ou conjugados a uma proteína veículo como toxóide de tétano, fragmento C de toxóide de tétano, toxóide de difteria ou CRM197 (ambos por exemplo feitos pelo método da invenção), pneumolisina, ou proteína D (US 6342224). 20 Toxina de tétano, toxina de difteria e pneumolisina são destoxificados ou por mutação genética e/ou por tratamento químico.

O conjugado de polissacarídeo ou oligossacarídeo pode ser preparado por qualquer técnica de copulação conhecida. Por exemplo, o polissacarídeo pode ser copulado via uma ligação tioéter. Este método de 25 conjugação se baseia na ativação do polissacarídeo com tetrafluoroborato de l-ciano-4-dimetilamino piridínio (CDAP) para formar um éster cianato. O polissacarídeo ativado pode assim ser copulado diretamente ou via um grupo espaçador a um grupo amino sobre a proteína veículo. Opcionalmente, o éster cianato é copulado com hexano diamina e o polissacarídeo amino derivatizado é conjugado a uma proteína veículo usando química de heteroligação envolvendo a formação da ligação tioéter. Estes conjugados são descritos no pedido publicado PCT WO 93/15760 Uniformed Services

University.

Os conjugados também podem ser preparados por métodos de aminação redutiva direta como descrito em US 4365170 (Jennings) e US 4673574 (Anderson). Outros métodos são descritos em EP-0-161-188, EP208375 e EP-0-477508.

Um outro método envolve a copulação de um polissacarídeo ativado por brometo de cianogene derivatizado com hidrazida de ácido adípico (ADH) para o veículo de proteína por condensação de carbodiimida (Chu C. et al Infect. Immunity, (1983) 245; 256).

Em exemplos particulares, a toxina de difteria ou fragmento ou mutante da mesma (por exemplo CRM197) é conjugada a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 15 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 antígenos adicionais da composição farmacêutica. Em uma forma de realização, ela é conjugada a componente (s) de polissacarídeo, por exemplo polissacarídeos bacterianos incluindo os listados acima.

A composição farmacêutica ou imunogênica da invenção pode ainda compreender componentes de proteína adicionais. Ela é opcionalmente formulada com antígenos proporcionando proteção contra uma ou mais infecções causadas por Bordetella pertussis. O componente de coqueluche pode ser B. pertussis de célula completa (Pw) ou coqueluche acelular (Pa) que contém pelo menos um antígeno (preferivelmente dois ou todos os três) de 25 PT, FHA e pertactina 69 kDa. Algumas outras formulações de coqueluche acelular também contém aglutinogenes, como Fi2 e Fim3 e estas vacinas são também contempladas para uso na invenção. Tipicamente, o antígeno provendo proteção contra tétano é toxóide de tétano que são ou toxinas quimicamente inativas (por exemplo após tratamento com formaldeído) ou inativadas pela introdução de uma ou mais mutação(ões) de pontos.

A composição farmacêutica ou imunogênica da invenção opcionalmente compreende antígenos de proteínas pneumocócicas, por exemplo as proteínas pneumocócicas que são expostas sobre a superfície 5 externa do pneumococo (capaz de ser reconhecido pelo sistema imune do hospedeiro durante pelo menos parte do ciclo de vida do pneumococo), ou são proteínas que são secretadas ou liberadas pelo pneumococo. Por exemplo, a proteína pode ser uma toxina, adesina, transdutor de sinal de 2 componentes, ou lipoproteína de Streptococcus pneumoniae ou seus fragmentos. Os 10 exemplos destas proteínas incluem, mas não são limitados a pneumolisina (preferivelmente destoxificada por tratamento químico ou mutação), [Mitchell et al. Nucleic Acids Res. 1990 Jul 11; 18(13): 4010 Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 e

2., Mitchell et al. Biochim Biophys Acta 1989 Jan 23; 1007(1): 67-72 15 Expression in the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purification and biological properties., WO 96/05859 (A. Cyanamid), WO 90/06951 (Paton et al), WO 99/03884 (NAVA)J; PspA e suas variantes de deleção de transmembrana (US 5804193 - Briles et al.); PspC e suas variantes de deleção de transmembrana (WO 97/09994 - Briles et al); PsaA e suas variantes de 20 deleção de transmembrana (Berry & Paton, Infect lmmun 1996 Dec;64(12):5255-62 Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae)·, proteínas de ligação de colina pneumocócica e variantes de deleção de transmembrana das mesmas; CbpA e variantes de deleção de transmembrana 25 do mesmo (WO 97/41151; WO 99/51266); Gliceraldeído-3-fosfatodesidrogenase (Infect. lmmun. 1996 64:3544); HSP70 (WO 96/40928); PcpA (Sanchez-Beato et al. FEMS Microbiol Lett 1998, 164:207-14); proteína semelhante a Μ, (EP 0837130) e adesina 18627, (EP 0834568). Outros antígenos de proteína pneumocócica para inclusão na composição

imunogênica são os descritos em WO 98/18931, WO 98/18930 e

PCT/US99/30390.

Exemplos de proteínas Neisseriais a serem formuladas com a composição imunogênica da invenção incluem TbpA (WO93/06861; EP586266; WO92/03467; US5912336), TbpB (WO93/06861; EP586266), Hsf (WO99/31132), NspA (WO96/29412), Hap (PCT/EP99/02766), PorA, PorB, OMP85 (também conhecida com Dl 5) (WOOO/23595), PilQ (PCT/EP99/03603), PldA (PCT/EP99/06718), FrpB (WO96/31618 ver SEQ ID NO:38), FrpA ou FrpC ou uma porção conservada em comum a ambos em pelo menos 30, 50, 100, 500, 750 aminoácido (W092/01460), LbpA e/ou LbpB (PCT/EP98/05117; Schryvers et al Med. Microbiol. 1999 32: 1117), FhaB (WO98/02547 SEQ ID NO: 38), HasR (PCT/EP99/05989), Iipo02 (PCT/EP99/08315), MItA (WO99/57280) e ctrA (PCT/EP00/00135). As proteínas neisseriais são opcionalmente adicionadas como proteínas purificadas ou como parte de uma preparação de membrana externa.

A composição farmacêutica ou imunogênica da invenção opcionalmente compreende um ou mais antígenos que pode proteger um hospedeiro contra Haemophilus influenzae não tipificável, RSV e/ou um ou mais antígenos que podem proteger um hospedeiro contra vírus de influenza.

Os exemplos de antígenos de proteína de H. influenza incluem proteína Fimbrina (US 5766608) e fusões compreendendo peptídeos da mesma (por exemplo fusão LB1) (US 5843464 - Ohio State Research Foundation), OMP26, P6, proteína D, TbpA, TbpB, Hia, Hmwl, Hmw2, Hap, eD15.

Exemplos de antígenos de vírus de influenza incluem vírus completos, vivos ou inativados, vírus de influenza divididos, cultivados em ovos ou células MDCK, ou células Vero, ou virossomas completos de resfriado (como descrito por R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920) ou suas proteínas purificadas ou recombinantes, como proteínas HA, NP, NA, ou M, ou suas combinações.

Exemplos de antígenos de RSV (vírus sincicial respiratório) incluem a glicoproteína F, a glicoproteína G, a proteína HN, a proteína M ou seus derivados.

Deve-se notar que as composições antigênicas da invenção podem compreender um ou mais polissacarídeos capsulares de uma única espécie de bactérias. As composições antigênicas podem também compreender polissacarídeos capsulares derivados de uma ou mais espécies de bactérias.

Um outro aspecto da invenção inclui composições imunogênicas ou vacinas compreendendo a toxina de difteria, fragmento ou mutante da mesma, (por exemplo CRM197) feitos pelos processos da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Opcionalmente, a composição imunogênica ou vacina contém uma quantidade de um adjuvante suficiente para melhorar a resposta imune do imunogene. Os adjuvantes apropriados incluem, mas não são limitados a sais de alumínio, misturas de esqualeno (SAF-1), muramil peptídeo, derivados de saponina, preparações de parede celular micobactéria, monofosforil lipídeo A, derivados de ácido micólico, tensoativos de copolímero de bloco não 20 iônico, QuilA, subunidade de toxina B de cólera, polfosfazeno e derivados, e complexos imunoestimulantes (ISCOMs), como os descritos por Takahashi et al. (1990) Nature 344:873-875. Para uso veterinário e para produção de anticorpos em animais, os componentes mitogênicos de adjuvante de Freund também podem ser usados.

Como com todas as composições ou vacinas imunogênicas, as quantidades imunologicamente efetivas dos imunogenes podem ser determinadas empiricamente. Os fatores a serem considerados incluem a imunogeni cidade, seja ou não o imunogene complexado com ou covalentemente fixado a um adjuvante ou proteína veículo ou outro veículo,

via de administrações e o número de dosagens imunizantes a serem administradas. Estes fatores são bem conhecidos na arte de vacinas e de acordo com os conhecimentos dos imunologistas para fazer estas determinações sem experimentação indevida.

O agente ativo pode estar presente em concentrações variadas na composição farmacêutica ou vacina da invenção. Tipicamente, a concentração mínima da substância é uma quantidade necessária para obter seu uso pretendido, enquanto a concentração máxima é a quantidade máxima que irá permanecer em solução ou colocada homogeneamente em suspensão dentro da mistura inicial. Por exemplo, a quantidade mínima de uma agente terapêutico é preferivelmente um que irá prover uma dosagem terapeuticamente efetiva única. Para substâncias bioativas, a concentração mínima é uma quantidade necessária para bioatividade quando da reconstituição e a concentração máxima é a no ponto em que uma suspensão homogênea não pode ser mantida. No caso de unidades de dose única, a quantidade é a de uma aplicação terapêutica única. Geralmente, espera-se que cada dose irá compreender l-100pg de antígeno de proteína, preferivelmente 5-50pg e mais preferivelmente 5-25pg. As doses preferidas de polissacarídeos bacterianos são de 10-20pg, 10-5pg, 5-2,5pg ou 2,5-1 pg. A quantidade preferida da substância varia de substância a substância mas é facilmente determinável por um versado na arte.

__ As preparações de vacina da presente invenção podem ser usadas para proteger ou tratar um mamífero (por exemplo um paciente humano) susceptível a infecção, por meio da administração de referida vacina através de uma via sistêmica ou mucosal. Estas administrações podem incluir injeção através das vias intramuscular, intraperitoneal, intradérmica ou subcutânea, ou através de administração mucosal para os tratos oral/ alimentar, respiratório, genitourinário. Apesar da vacina da invenção poder ser administrada como uma dose única, os seus componentes também podem

ser co-administrados juntos ao mesmo tempo ou em tempos diferentes (por exemplo, se polissacarídeos estão presentes em uma vacina, estes podem ser administrados separadamente ao mesmo tempo ou 1-2 semanas após a administração da combinação de proteína bacteriana para coordenação ótima 5 das respostas imunes com relação uma à outra). Além de uma via de administração única, 2 vias diferentes de administração podem ser usadas. Por exemplo, os antígenos virais podem ser administrados ID (intradérmica), enquanto as proteínas bacterianas podem ser administradas IM (intramuscular) ou IN (intranasal). Se polissacarídeos estão presentes, eles 10 podem ser administrados IM (ou ID) e proteínas bacterianas podem ser administradas IN (ou ID). Além disso, as vacinas da invenção podem ser administradas IM para doses de iniciação e IN para doses de reforço.

A preparação de vacina é geralmente descrita em Vaccine Design (The subunit and adjuvant approach (eds Powell M. F. & Newman 15 MJ.) (1995) Plenum Press New York). Encapsulação dentro de lipossomas é descrita por Fullerton, Patente US 4.235.877.

Um outro aspecto da invenção é um processo para a fabricação de uma composição farmacêutica, compreendendo uma etapa de fazer a toxina de difteria ou fragmento ou mutante da mesma (por exemplo CRM197) 20 usando o processo de fermentação da invenção e combinando a mesma com um veículo farmaceuticamente aceitável e opcionalmente adicionando qualquer um dos antígenos adicionais acima mencionados.

Este processo pode ainda compreender uma etapa de conjugar a toxina de difteria ou fragmento ou mutante da mesma (por exemplo 25 CRM197) a um ou mais componentes adicionais da composição farmacêutica, preferivelmente polissacarídeos ou oligossacarídeos bacterianos como descrito acima.

Um outro aspecto da invenção é o uso de toxina de difteria ou fragmento ou mutante da mesma (por exemplo CRM 197) da invenção na

preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de doença bacteriana, particularmente doença C. diphtheriae.

Um outro aspecto da invenção é um método de prevenção ou tratamento de infecção bacteriana, particularmente infecção por C.

diphtheriae, compreendendo a administração da composição farmacêutica, composição imunogênica ou vacina da invenção a um paciente.

Todas as referências ou pedidos de patentes citados neste relatório de patente são incorporadas aqui por referência.

A invenção é ilustrada nos exemplos anexos. Os exemplos abaixo são realizados usando técnicas padrões, que são bem conhecidas e rotineiras para os versados na arte, exceto onde de outra forma descrito em detalhes. Os exemplos são ilustrativos, mas não limitam a invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Medições de KLa

A fim de medir o KLa de uma etapa de fermentação, o fermentador foi carregado com o volume desejado de água e os parâmetros de fermentação (por exemplo, temperatura, pressão, agitação e aeração) foram aplicados e o sistema deixado alcançar um estado estável. A sonda de pO2 foi calibrada a 100%.

aeração foi deslocada rapidamente em gás nitrogênio, enquanto mantendo a mesma vazão. O pO2 foi acompanhado até pO2 cair a menos do que 5%. Quando este ponto foi alcançado, a aeração foi deslocada rapidamente em ar enquanto mantendo a mesma vazão. O nível de pO2 foi acompanhado e registrado em vários pontos de tempo como uma porcentagem 25 do nível de 100% do estado estável original.

KLa foi calculado traçando em gráfico o log (100-pO2%) contra tempo. O coeficiente angular da parte linear do gráfico corresponde a Kla. Tipicamente, somente os dados entre 20% e 80% de pO2 são considerados.

Resultados

As leituras de pO2 em vários pontos de tempo são mostradas na tabela 1 abaixo.

Tabela 1

Tempo (s)	Tempo (h)	pO2 (%)	Em(100-pO2)
200	0,056	20	4,382026635
210	0,058	21,9	4,357990057
.........22#........		......................21.......................	~ -4,34805422-........-
230	0,064	25	4,317488114
240	0,067	27	4,290459441
250	0,069	29	4,262679877
260	0,072	32	4,219507705

Os resultados foram traçados em gráfico como mostrado na figura 1 e o KLa determinado a partir do coeficiente angular da linha na figura IB.

Exemplo 2: Fermentação da cepa ATCC39255 de C. diphtheriae na escala de 150 litros

A bactéria usada na preparação de CRM197 (Material de

Reação Cruzada) é uma cepa mutante de Corynebacterium diphtheriae obtida por tratamento com nitrosoguanidina de acordo com o método de A. Pappenheimer (Nature New Biol. 233: 8-11, 1971). Ela expressa uma toxina de difteria destoxificada (aa 52: mutação de glicina em ácido glutâmico). Ela foi obtida a partir de ATCC onde é referida como 39255. O esquema geral do processo de fermentação é mostrado na figura 2.

Uma semente de trabalho contendo 1,1 χ IO¹⁰ cfu/ml foi retirada do congelador (-70°C) e descongelada em temperatura ambiente. Imediatamente após descongelar, o frasco foi submetido a vórtice e 250 μΐ da 20 semente são retirados com uma seringa com agulha de 1 ml.

Este volume foi injetado em 100 ml de solução salina estéril (0,9%). O frasco foi agitado. Dois ml da suspensão foram retirados com uma seringa de 2 ml com agulha e usados para inocular um frasco erlenmeyer de 3 1 contendo 500 ml do meio descrito em US 4.925.792. O frasco foi incubado em 34,5°C ± 0,05°C em velocidade de agitação de 250 rpm até a densidade óptica (650 nm) alcançar 4,0 a 6,0 (após 16a 19 h de incubação).

Um fermentador de 150 litros foi esterilizado e 100 L do meio de cultura foram transferidos assepticamente para o fermentador. O frasco 5 com ácido foi carregado com 500 ml de H₃PO₄ a 25% (v/v); o pH do meio era inicialmente cerca de 7,4 e não foi ajustado.

O fermentador foi preparado no dia anterior à inoculação e mantido em condições de reserva de 34,5°C de temperatura, pressão manométrica de 0,5 bar, vazão de 23 N 1/min no espaço superior e velocidade 10 de agitação de 50 rpm durante 16-20 h, até inoculação.

Antes da inoculação, o fermentador foi ajustado nas condições de cultura de 34,5°C de temperatura, pressão de 0,5 bar, vazão de 23 N 1/min aspergida no meio e velocidade de agitação de 240 rpm. Uma agitação de 240 rpm dá uma velocidade de ponta de 1,76 m/s e um tempo de misturação 15 teórico de 3,9 s. O oxigênio dissolvido não é regulado, somente monitorado, o sistema de controle de espuma foi comutado e o pH deixado alcançar 7,8 e depois mantido por adição de H₃PO₄. Antes da inoculação, a sonda de pO2 foi ajustada a 100%.

A velocidade de agitação foi ajustada a 240 rpm, 20 correspondente a uma velocidade periférica de 1,76 m/s. A velocidade de agitação de 240 rpm combinada com uma taxa de aeração de 23-L/min _ _ resultou_em_um KLa (20-80%, água 30°C, 0,5 bar) estimado em 42 h-1 (ver figura 6).

O fermentador foi inoculado através da abertura de inóculo 25 com 400 ml da cultura de semente descrita acima.

A fermentação continuou até ambas as seguintes condições serem alcançadas. 20 h de fermentação são decorridas e o nível de oxigênio dissolvido aumentou até 10%. A duração de fermentação total estava geralmente entre 22 e 28 h.

Ao término da fermentação, a temperatura foi mudada para um ajuste de 20°C, a regulagem de pH foi desligada, o fluxo de ar foi deslocado no espaço superior a fim de limitar a formação de espuma, o sistema de controle de espuma foi desligado, os outros parâmetros não foram trocados.

O sistema de microfiltração foi conectado ao fermentador e, quando a temperatura da suspensão alcançou 21°C, a microfiltração foi iniciada. A microfiltração foi operada em duas fases: uma concentração e uma diafiltração. Durante a fase de concentração, os parâmetros foram: pressão interna: 0,6 bar, pressão externa: - 0,1 bar, fluxo de permeado: mantido 10 constante em 2 1/min usando uma bomba peristáltica calibrada (a pressão do permeado era cerca de 0,3 bar). A suspensão foi concentrada até um dos seguintes eventos acontecerem primeiramente. Ou a pressão de entrada alcançou 0,9 bar ou 75 litros de permeado foram recuperados.

Durante a fase de destilação, os seguintes parâmetros foram usados: a pressão interna foi mantida na pressão alcançada ao término da etapa de concentração (máximo de 0,9 bar); água foi adicionada em 2 1/min; o total de água adicionado foi 3 volumes de retido.

O retido foi filtrado em uma membrana de 0,22 pm e armazenado a +4°C. A estabilidade do CRM 197 nesta suspensão foi testada 20 após até 4 dias de armazenagem tanto a +4°C como em temperatura ambiente (+20°C<RT<23°C). Nenhuma degradação e nenhuma diferença foram observadas tanto por quantificação ELISA como SDS-page. Um teste para confirmação de ausência de crescimento foi feito em agar DAB incubado a 36°C.

Resultados

Duas fermentações na escala de 150 1 foram realizadas usando o protocolo de fermentação descrito acima (CDT 199 e CDT 206). As condições de pré-cultura e cultura são mostradas nas tabelas 2 e 3 e rendimentos de CRM197 são mostrados na tabela 4. A figura 3 mostra um

gráfico das cinéticas típicas de crescimento de uma pré-cultura. Quando o O.D. (650 nm) estava entre 4,0 e 6,0, a cultura estava claramente em uma fase exponencial de crescimento e o pH mudou apenas um pouco.

Tabela 2. Condições de pré-culturas

Número da Cultura	Duração da précultura (h:min)	O.D. 650 de précultura	pH final
CDT199	16:44	5,88	7,30
---.......-CDT206...........-	...........-.....................................	.......... 4 03 .........	.......X2-S ......

Tabela 3. Condições de Culturas

Número da cultura	Duração da fermentação (h:min)	25% de H3PO4 usados (g)	O.D. 650 final	Quantidade de antiespumante total necessária (g)	Estimativa de CFU (bact/ml)
CDT199	24:45	2	17,2	102	4,9 E9
CDT206	24:31	2	13,9	119	Não feita

Tabela 4. Estimativa de CRM 197

Número da Cultura	Densidade em SDS-page (mg/l)	Elisa (mg/l)
CDT199	89/106	138
CDT206	92/83	116

Durante a fermentação, foram observadas fases diferentes.

A primeira fase foi caracterizada por um decréscimo do oxigênio dissolvido até 0% ser alcançado (duração de cerca de 6-7 h). Durante esta fase, o pH permanece estável ou diminui levemente (em unidade de pH de cerca de 0,1).

Durante a segunda fase, o pH diminuiu e alcançou um patamar de cerca de pH 7,8. Neste nível, a regulagem do pH foi acionada, no entanto, freqüentemente, nenhum ácido no todo devia ser adicionado nestas condições de fermentação. Durante este patamar de pH, foi observado um aumento do nível de oxigênio dissolvido acima de 0%, seguido por uma queda de 0%.

A terceira fase foi caracterizada por um decréscimo do pH em cerca de 7,4.

Finalmente, um aumento de pO2 foi observado entre 22 e 24 h de fermentação. Isto é o sinal para colheita.

Os gases de exaustão do fermentador foram analisados por espectrômetro de massa. Um perfil típico de produção de CO2 foi observado.

As duas fermentações apresentadas foram prolongadas após o sinal de colheita a fim de estimar as cinéticas de produção de CRM 197. Os requerentes observaram que o nível de CRM 197 não aumenta após o sinal de colheita ser alcançado, mas houve um aumento na produção de espuma. A fim 5 de limitar o consumo de antiespumante, é preferível interromper a fermentação ao sinal de colheita. No entanto, o CRM 197 parece não afetado por formação de espuma excessiva e nenhuma degradação ocorreu. Microfiltração

Os dados são mostrados para a microfiltração de CDT206.

74,3 L de permeado foram coletados quando a pressão de entrada alcançou 0,9 bar. A pressão de saída estava entre 0,15 e 0,10 bar por toda a etapa de concentração. A pressão do permeado foi 0,3-0,4 bar por toda a etapa de concentração e a etapa de concentração durou 36 minutos.

Para a fase de diafiltração, 75 L de água foram 15 progressivamente adicionados (2 1/min) enquanto o permeado foi extraído na mesma vazão. A pressão de entrada foi 0,9 bar no início e caiu para 0,7 bar ao término da diafiltração. A pressão de saída foi estável em 0,1 bar. A duração da etapa de diafiltração foi 39 min.

Quantificação de CRM 197

O nível de expressão de CRM197 em condições de baixa aeração foi geralmente 2-4 vezes mais alto do que o obtido em condições de aeração mais alta onde pO2 foi mantido em 5% ou mais alto durante toda a fermentação.

SDS-page colorido de sobrenadantes de cultura

Géis de SDS-PAGE (figura 4) foram ciclados dos sobrenadantes de cultura em condição redutora de modo que foi possível detectar quaisquer bandas de degradação (após recorte, 2 subunidades de respectivamente 35 e 23 kD podem ser detectadas). Eles foram subseqüentemente coloridos com Azul Coomassie.

Resultados

Os géis coloridos com coomassie de amostras de duas fermentações são mostrados na figura 4A (CDT 199) e 4B (CDT 206). O CRM 197 apareceu no peso molecular esperado (Mw teórico: 58,4 kD). O 5 CRM 197 não foi degradado uma vez que nenhuma mudança padrão foi notada nas amostras tomadas após o sinal do término de fermentação (figura 4A, trilhas 9 e 10). A quantidade de CRM 197 não foi afetada pela microfiltração e filtração final em 0,22 μΜ uma vez que as trilhas 9 e 11 da figura 4A não mostram quantidades equivalentes de CRM 197.

A temperatura pode ter um efeito negativo sobre a estabilidade de CRM (figura 4B trilha 12). Esta amostra foi tomada enquanto a válvula da amostra estava quente e a quantidade de CRM 197 presente nesta amostra é reduzida.

Exemplo 3: Fermentação da cepa ATCC 39255 de C. diphtheriae na 15 escala de 20 litros

Um método similar ao descrito no exemplo 2 foi usado para fermentar C. diphtheriae exceto que um fermentador de 20 1 foi usado. A cultura foi agitada em 300 rpm e o fluxo de ar fixado em 3 1/min. Nenhuma adição de ácido ou base foi requerida durante a fermentação uma vez que o 20 pH permaneceu quase neutro por toda a fermentação.

A cultura cresceu em um OD final (650 nm) de 18,3. Verificou-se que o rendimento de CRM197 foi 103 mg/1 como avaliado por densitometria em um gel colorido.

Exemplo 4: Fermentação da cepa ATCC 39255 de C diphtheriae em 25 escalas diferentes

O processo de fermentação de C. diphtheriae em crescimento sob condições de KLa constantes pode ser adaptado para uso em fermentadores de outros tamanhos e desenhos diferentes. Bons resultados de produção de CRM 197 foram obtidos seguindo as condições de tamanho do fermentador, vazão e velocidade de agitação indicadas na tabela 5. As três fermentações na escala de 150 1 foram realizadas em fermentadores de desenho diferente.

Tabela 5

Escala (1)	Fluxo de ar (1/min)	Velocidade agitação (rpm)	KLa (h-l)
20	3	300	22-28
m —	............ 2-3........................	..........240 .....-	-.....................-42.................
150	23	185	-50
150	17	200	-40

Como mostrado na tabela 5, o KLa foi importante em vez de uma escolha específica de condições de fluxo de ar e de velocidade de agitação. Assim, um fluxo de ar mais baixo pode ser compensado por uma velocidade de agitação mais elevada, de modo a resultar em um KLa similar e bons rendimentos de CRM 197 foram ainda obtidos. A velocidade de agitação 10 deve ser suficiente para produzir uma suspensão homogênea e a aeração é limitada para manter um pO2 baixo. Diferentes fermentadores foram usados para as fermentações de 20 litros. As diferentes geometrias dos diferentes fermentadores levam à faixa de valores de KLa mostrados na tabela 5.

No entanto, diferentes condições de KLa foram ótimas para diferentes escalas de fermentação. Assim, para fermentação em um fermentador de 20 litros, um KLa mais baixo de 22-28 h-l foi considerado ótimo.

Condições de KLa ótimas são as que permitem uma aeração limitada de modo que o pO2 na cultura está em níveis baixos. Um versado na 20 arte deve, facilmente, ser capaz de determinar estas condições para um tamanho e geometria particulares do fermentador.

Exemplo 5: Efeito da concentração de ferro sobre o rendimento de fermentações em pO2 diferente.

Uma série de fermentações de C. diphtheriae cepa ATCC 25 39255 foi realizada na escala de 20 litros seguindo o método descrito no exemplo 3, de modo que pO2 foi baixo durante a maior parte da fermentação

ou em um ajuste constante de pO2 a 5%. A quantidade de Fe3+ presente variou entre nenhuma adição de Fe3+, adição de Fe3+ 250 ppb, adição de Fe3+ 500 ppb e adição de Fe2+ 500 ppb. O rendimento de CRM197 ao término da fermentação foi medido por densitometria de um gel SDS-PAGE. Este método tende a dar resultados aproximadamente 20% mais baixos do que os obtidos por ELISA.

Resultados

Tabela 6

Condições de fermentação	Rendimento de CRM197 (mg/l)
Meio pO2 a 5% sem adição de Fe3+	38
Meio pO2 a 5% com Fe3+ 250 ppb adicionado	14
Meio pO2 a 5% com Fe3+ 500 ppb adicionado	18
Meio pO2 a 5% com Fe2+ 500 ppb adicionado	13
pO2 baixo, KLa constante, meio sem adição de Fe3+	100
pO2 baixo, KLa constante, meio com adição de Fe3+ 250 ppb	88
pO2 baixo, KL a constante, meio com adição de Fe3+ 500 ppb	97

Como mostrado na tabela 6, quando C. diphtheriae é fermentado em pO2 a 5%, a adição de ferro leva a uma redução de rendimento. No entanto, quando o nível de pO2 é reduzido e a fermentação é realizada em condições de pO2 baixo em KLa constante, como descrito no exemplo 3, rendimentos mais elevados foram obtidos e o rendimento não foi afetado pela adição de Fe3+.

Exemplo 6: Efeito da concentração de ferro sobre o rendimento de DT ou CRM197 em condições de baixa aeração de CRM197 foi determinada em microplacas. As microplacas simulam as condições de aeração limitadas existentes no processo de fermentação da invenção.

A cultura em microplacas foi realizada no mesmo meio como foi usado nas fermentações descritas acima (em um meio similar a meio CY). Fe3+ foi adicionado de uma solução de carga de FeC13.6H2O em 1 g/1 de íon Fe3+.

As cavidades das placas de microtitulação foram carregadas com o meio e foram inoculadas em 8 E5 bact/ml.

As placas de microtitulação foram inoculadas em 34,5°C com agitação de 250 rpm durante 46 h no caso de ambos Corynebacterium 5 diphtheriae expressando CRM197 e Corynebacterium diphtheriae expressando toxina de difteria.

As amostras foram filtradas através de um filtro de 0,22 pm.

A expressão foi medida pelo método de densitometria em SDS-page (XT Criterion 4-12% bis tris de BioRad) colorido com azul 10 Coomassie (coloração Gelcode blue de Pierce). A referência usada para a quantificação foi o mutante CRM de toxina de difteria do List Biological Laboratories INC, introduzido em diferentes concentrações no gel.

Resultados

A tabela 7 mostra a expressão de CRM 197 em diferentes concentrações de ferro para C. diphtheriae cultivado em condições de aeração limitadas em cavidades de microtitulação. A expressão de CRM 197 foi fracamente sensível à repressão por Fe3+ e não foi significativamente afetada pela adição de Fe3+ 1 ppm ou 2 ppm. Somente em 3 ppm ocorreu uma queda significativa da expressão de CRM197. Mesmo neste nível de Fe3+, a 20 expressão de CRM197 foi ainda 79% da obtida sem adição de Fe3+.

Tabela 7. Corynebacterium diphtheriae expressando CRM 197

Fe3+ adicionado (ppm)	Densidade óptica 46 h	PH	CRM (%)
0	18,1	7,66	100
200 ppb	17,9	7,72	96
300 ppb	16,9	7,77	97
400 ppb	16,9	7,8	106
500 ppb	17,2	7,83	109
600 ppb	17,7	7,81	112
700 ppb	17,2	7,77	109
800 ppb	17,2	7,77	103
900 ppb	16,5	7,79	101
1 ppm	16,9	7,75	96
2 ppm	17	7,79	88
3 ppm	16,9	7,83	79

Os rendimentos de CRM197 sào expressados como uma porcentagem do rendimento obtido sem adição de Fe3+ extra,

Os resultados da expressão de DT são mostrados na tabela 8 para C. diphtheriae cultivado em cavidades de microtitulação nas condições indicadas. A produção de DT em condições de aeração limitadas também foi fracamente sensível à repressão por Fe3+. A expressão de DT aumentou com a concentração de Fe3+ aumentando com a produção de DT máxima obtida em 700 ppb. A expressão de DT começou a cair somente quando a concentração de Fe3+ foi aumentada para 3 ppm.

Tabela 8. Corynebacterium diphtheriae expressando toxina de difteria

Fe 3+ adicionado (ppm)	Densidade óptica 46 h	PH	DT (%)
0	4,16	8,66	100
200 ppb	4,72	8,42	106
300 ppb	4,6	8,47	107
400 ppb	4,9	8,51	125
500 ppb	4,22	8,59	155
600 ppb	4,48	8,51	148
700 ppb	4,04	8,63	167
800 ppb	4,28	8,52	164
900 ppb	4,58	8,62	168
1 ppm	4,48	8,84	166
2 ppm	4,7	8,68	176
3 ppm	4,2	8,68	141

Os rendimentos de DT são expressados como uma porcentagem do rendimento obtido sem adição de Fe3+ extra.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo de fermentação, caracterizado pelo fato de compreender uma etapa de fermentação de cultivo de uma cepa de Corynebactedum diphtheria em meio em um fermentador sob condições de agitação suficientes para manter uma cultura homogênea e aeração limitada, de modo que pO2 dentro da cultura cai para menos de 4% por mais que 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% do comprimento total da etapa de fermentação, em que a etapa de fermentação ocorre tanto em a) um fermentador de 100-250 litros a um KLa de 30-60 h-1 ou b) um fermentador de 250-800 litros a um KLa de 60-150h-l.
2. Processo de fermentação de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pO2 cai até se aproximar de zero durante a maior parte da etapa de fermentação.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o pO2 de menos de 4% é mantido desde o momento quando a Corynebactedum diphtheria foi cultivada até uma densidade suficiente para pO2 cair a menos de 4% devido a um consumo rápido de oxigênio, até a etapa de fermentação estar completada.
4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a etapa de fermentação é realizada em KLa constante.
5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a etapa de fermentação é realizada a uma velocidade de agitação e taxa de aeração constantes.
6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a etapa de fermentação é realizada sob condições de KLa variáveis.
7. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de fermentação ocorre com um fluxo de ar de ar

Petição 870180145694, de 29/10/2018, pág. 10/12 comprimido de 15-25 L/min e uma velocidade de agitação de 150-250 rpm.
8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o meio é CY, SOC ou meio similar e pH dentro do fermentador é mantido entre 7,0 e 7,8 pelo grau de aeração sem requerer adição de ácido ou base.
9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a cepa de Corynebactedum diphtheria produz toxina de difteria ou um mutante da mesma, particularmente CRM 197.
10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a cepa de Corynebactedum diphtheria é ATCC39255.
11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10 caracterizado pelo fato de que o meio contém entre 10 - 4000 ppb de ferro.
12. Processo de fabricação de uma preparação de um antígeno de C. diphtheriae, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de realizar o processo de fermentação como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11 e isolar o antígeno de C. diphtheriae da cultura.
13. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o antígeno de C. diphtheriae é toxina de difteria ou um fragmento ou mutante da mesma (por exemplo CRM 197).
14. Processo de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de compreender uma etapa de adicionar um ou mais antígeno(s) adicional(ais) ao antígeno de C. diphtheriae.
15. Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de ainda compreender a etapa de conjugar a toxina de difteria ou fragmento ou mutante da mesma a um ou mais antígeno (s) adicional (ais).