BRPI0708865A2 - mÉtodos para produzir uma resposta imune À tuberculose - Google Patents

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BRPI0708865A2
BRPI0708865A2 BRPI0708865-5A BRPI0708865A BRPI0708865A2 BR PI0708865 A2 BRPI0708865 A2 BR PI0708865A2 BR PI0708865 A BRPI0708865 A BR PI0708865A BR PI0708865 A2 BRPI0708865 A2 BR PI0708865A2
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Debora Lewinsohn
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Univ Oregon Health & Science
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Abstract

MÉTODOS PARA PRODUZIR UMA RESPOSTA IMUNE À TUBERCULOSE. A presente invenção refere-se a métodos para produzir uma resposta imune ao Mycobacterium tuberculosis (Mtb), que são descritos aqui. Em vários exemplos, a resposta imune é uma resposta imune protetora. Em modalidades adicionais, são descritos métodos para prevenir uma infecção com Mtb, ou tratar uma infecção com Mtb. Composições farmacêuticas para a prevenção e/ou tratamento de tuberculose também são descritos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOSPARA PRODUZIR UMA RESPOSTA IMUNE À TUBERCULOSE".
Reivindicação de Prioridade
Esse pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. Nq60/782.364, depositado em 14 de março de 2006, que está incorporado aquipor referência.
Declaração de Apoio Governamental
Essa invenção foi feita com o apoio do governo dos Estados U-nidos de acordo com a Concessão N5 NIH-R01-AI48090 e Concessão N9NIH NIAID HHSN266200400081C N01-AI-40081 do National Institutes ofHealth; o governo dos Estados Unidos tem certos direitos na invenção. Essainvenção também foi feita com o apoio do Department of Veteran's Affairs.
Campo
Esse pedido refere-se ao campo da imunologia, mais especifi-camente a métodos para a produção de uma resposta imune para antígenosda tuberculose.
Antecedentes
Micobactérias são um gênero de organismos bacterianos intra-celulares aeróbicos que, após a infecção de um hospedeiro, sobrevivemdentro de compartimentos endossomais de monócitos e macrófagos. Doen-ças micobacterianas humanas incluem a tuberculose (causada pela M. tu-berculosis), lepra (causada pela M. leprae), úlceras de Bairnsdale (causadaspela M. ulcerans), e várias infecções causadas por M. marinum, M. kansasii,M. scrofulaceum, M. szulgai, M. xenopi, M. fortuitum, M. chelonei, M. hae-mophilum e M. intracellulare (veja Wolinsky, E., Capítulo 37 em Microbiology:Including Immunology and Molecular Genetics, 3- Ed., Harper & Row, Fila-délfia, 1980).
Um terço da população mundial é portadora de M. tuberculosis eestá em risco de desenvolver tuberculose (TB). Em pacientes imunocom-prometidos, a tuberculose está aumentando em uma proporção quase Ioga-rítmica e cepas resistentes a múltiplos fármacos estão surgindo. Além disso,cepas de Micobactérias que anteriormente eram consideradas sendo cepasnãõ-patogênicas (por exemplo, M. avium) se tornaram agora uma causa demorte de pacientes imunossuprimidos com AIDS. Além disso, as vacinasatuais para Micobactérias são inadequadas (tal como a vacina BCG para M.tuberculosis) ou não estão disponíveis (tal como para M. leprae) (Kaufmann,S., Microbiol. Sei. 4:324-328, 1987; U.S. Congress1 Office of Technology As-sessment, The Continuing Challenge of Tuberculosis, pp. 62-67, OTA-H-574,U.S. Government Printing Office, Washington, D.C., 1993).
Células T CD4+ e CD8+ específicas para Mycobacterium tuber-culosis (Mtb) são críticas para o controle efetivo da infecção por Mtb. Nomodelo de camundongo, a transferência passiva de células T CD4+ para a-nimais irradiados subletalmente os torna menos suscetíveis à infecção porMtb (Orme, J Immunol. 140:3589-3593, 1988). Camundongos nos quais o(s)gene(s) para CD4 (CD4"/_) ou para moléculas de MHC Classe Il são inter-rompidos assim como camundongos selvagem com depleção de células TCD4+ demonstram suscetibilidade aumentada à infecção por Mtb (Flory etal., J Leukoc Biol. 51:225-229, 1992). Em seres humanos, indivíduos infec-tados com o vírus da imunodeficiência humana são sensivelmente suscetí-veis a desenvolver tuberculose (TB) após exposição ao Mtb, o que sustentaum papel essencial para as células T CD4+ (Hirsch et al., J Infect Dis.180:2069-2073, 1999). As células T CD8+ também são importantes para aimunidade eficaz de células T (veja Lazarevic & Flynn, Na J Respir Crit CareMed. 166:116-1121, 2002). Em seres humanos, células T CD8+ específicaspara Mtb foram identificadas em indivíduos infectados por Mtb e incluem cé-lulas T CD8+ que são tanto classicamente restritas por HLA-Ia a (veja porexemplo, Lewinsohn et al., J Immunol. 165:925-930, 2000) como não-classicamente restritas pelas moléculas de HLA-lb, HLA-E (Lewinsohn et al.,J Exp Med 187:1633-1640, 1998). Entretanto, não há vacinas ou estratégiasterapêuticas que induzam uma resposta imune eficaz, tal como uma respos-ta de CD8, ao Mtb. Assim, permanece uma necessidade por agentes quepossam produzir uma resposta imune ao Mtb e que possam ser usados notratamento e/ou proteção de uma infecção por Mtb.Sumário
Métodos para produção de uma resposta imune ao Mycobacteri-um tuberculosis (Mtb) são descritos aqui. Métodos para tratar uma infecçãopor Mtb ou prevenir uma infecção por Mtb em um indivíduo também sãodescritos aqui. A infecção por Mtb pode ser latente ou ativa.
Em várias modalidades, os métodos incluem administrar ao indi-víduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo ou umpolinucleotídeo que codifica o polipeptídeo, em que o polipeptídeo compre-ende pelo menos uma das seqüências de aminoácido descritas como SEQID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12.Em modalidades adicionais, os métodosincluem administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz deum polipeptídeo que compreende pelo menos nove a vinte aminoácidosconsecutivos de pelo menos uma das seqüências de aminoácidos descritascomo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ IDNO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ IDNO: 10, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12, em que os nove a vinte aminoá-cidos consecutivos se ligam especificamente ao complexo principal de histo-compatibilidade (MHC) classe I. Em vários exemplos, a resposta imune éuma resposta imune protetora. Em modalidades adicionais, são descritosmétodos para prevenir uma infecção por Mtb ou tratar uma infecção por Mtb.
Polipeptídeos isolados são descritos aqui, os quais incluem novea vinte aminoácidos consecutivos de pelo menos uma das seqüências deaminoácidos descritas como SEQ ID NO: 1-12, em que os nove a vinte ami-noácidos consecutivos se ligam especificamente ao complexo principal dehistocompatibilidade (MHC) classe I, em que o polipeptídeo isolado não in-clui nenhuma das seqüências de aminoácido de extensão completa descri-tas como SEQ ID NO:1 a 12. Ácidos nucléicos que codificam esses polipep-tídeos, vetores que incluem esses ácidos nucléicos, células hospedeiras queincluem esses ácidos nucléicos e composições imunogênicas que incluemesses polipeptídeos, ácidos nucléicos e/ou células hospedeiras também sãodescritos. Composições farmacêuticas que incluem uma quantidade terapeu-ticamente eficaz desses polipeptídeos, ácidos nucléicos e/ou células hospe-deiras também são descritos.
O precedente e outros aspectos e vantagens ficarão mais clarosa partir da seguinte descrição detalhada de várias modalidades, a qual pros-segue fazendo referência às figuras anexas.Breve Descrição das Figuras
Figura 1 são dois gráficos que mostram a determinação das fre-qüências de células efetoras humanas ex vivo usando o ensaio ELISPOT deIFN-γ. Células T CD8+ purificadas por esferas magnéticas foram cultivadascom DC (20.000/cavidade) infectadas com Mtb (H37Rv, MOI = 50) quantopulsadas com um "pool" de peptídeos que representa CFP10 (5 pg/ml decada peptídeo; 11 aa em superposição de 15-mers) em um ensaio ELISPOT
de IFN- γ. Cada população de célula T responsiva foi testada em duplicataem quatro concentrações diferentes. Para determinar a freqüência de célulasefetoras de células T antígeno-específicas, o número médio de marcações,"spots", por cavidade para cada duplicata foi plotado contra o número de cé-lulas reagentes por cavidade. Análise de regressão linear foi usada para de-terminar a inclinação da linha, a qual representa a freqüência de células Tantígeno-específicas. O ensaio foi considerado positivo (refletindo a presen-ça de uma resposta de célula T iniciada), se a probabilidade binominal parao número de spots fosse significativamente diferente em ensaios experimen-tais e de controle.
Figura 2 é um grupo de gráficos mostrando que as freqüênciasde células T CD8+ ex vivo para antígenos de Mtb estão associadas com in-fecção por Mtb. Como descrito acima (veja Fig. 1), para determinar as fre-qüências de células T CD8+ ex vivo, DC autólogas infectadas com Mtb oupulsadas com "pools" de peptídeos cognatos foram incubadas com células TCD8+ em um ensaio ELISPOT de IFN-γ. Indivíduos sem evidência de infec-ção por Mtb, aqueles com LTBI e aqueles com TB ativa (tuberculose pulmo-nar confirmada por cultura) foram avaliados. "Infectados por Mtb" inclui aque-les com infecção tuberculosa latente (TB) e tuberculose ativa. Valores de Pestão registrados onde P = <0,05 (Wilcoxon/Kruskal-Wallis).
Figuras 3a a 3d são de um grupo de imagens digitais que mos-tram a definição de Especificidade Antigênica e Restrição por HLA (a carac-terização do clone de célula T D466 D6). Para os resultados mostrados nasFiguras 3a-3c, para identificar o antígeno e o epítopo mínimo reconhecidopelo clone de célula T, células T, D466 D6 (5000 células/cavidade) foramincubadas com LCL autólogo (20.000/cavidade) e 5 Mg/ml de antígeno. IFN-γfoi avaliado por ELISPOT após dezoito horas de co-cultura. Para os resulta-dos apresentados na Figura 3a, as antígenos consistiram de "pools" de pep-tídeos representando antígenos CD4+ conhecidos, formados de peptídeosde 15 aminoácidos (aa) que se superpõem por 11 aa. Para os resultadosapresentados na Figura 3b, os antígenos consistiram de peptídeos CFP10de 15 aa individuais que juntos constituíram o "pool" de peptídeos. Para osresultados apresentados na Figura 3c, os antígenos consistiram de peptí-deos CFP10-1-15 individuais aninhados (10 aa, 9 aa ou 8 aa), usados aindapara mapear adicionalmente o epítopo. Para os resultados apresentados naFigura 3d, o alelo Iimitante foi identificado usando LCL (20.000/cavidade)expressando alelos de HLA que combinam com D466 em um ou dois alelos,pulsadas com CFP102-io (5Mg/ml) como APC. Após 2 horas, as células foramlavadas e incubadas com células T (500 células/cavidade) em um ensaioELISPOT de IFN- γ.
Figura 4 é um gráfico linear que mostra a confirmação do mape-amento do epítopo mínimo de D466 D6. Para confirmar o epítopo mínimo,LCL autóloga (20.000/cavidade) foi pulsada com peptídeo na concentraçãoindicada e co-cultivada com células T (1000 células/cavidade). IFN-γ foi ava-liada por ELISPOT após dezoito horas de co-cultura. Cada ponto representaa média das determinações em duplicata.
Figura 5 é um conjunto de gráficos de barras mostrando a defini-ção de perfil do padrão de imuno-dominância para CFP10. Para determinaras freqüências de célula efetora, DC autólogas (20.000/cavidade) foram pul-sadas com cada peptídeo de 15 mer individual (5 Mg/ml), ou com o "pool" depeptídeos (PP, 5 pg/cada peptídeo) ou com o epítopo mínimo (ME) determi-nado a partir dos clones de célula T derivados de cada doador(D466:CFP102-h; D480:CFP103-h; D481 :CFP1075-sa; 5 Mg/ml), e testadascontra 250.000 células T CD8+ purificadas por esferas magnéticas. A libera-ção de IFN-D foi avaliada por ELISPOT após dezoito horas de co-cultura.
Cada ponto representa a média das determinações em duplicata.
Figura 6 é um grupo de gráficos resumindo os dados do mape-amento de epítopo mínimo. Para determinar o epítopo mínimo, LCL autólo-gas (20.000/cavidade) foram pulsadas com peptídeo na concentração indi-cada e co-cultivadas com células T (1000 células/cavidade). IFN-D foi avali-ado por ELISPOT após dezoito horas de co-cultura. Cada ponto representaa média das determinações em duplicata.
Figura 7 é um gráfico linear que mostra o mapeamento do Epí-topo Mínimo para Clones de D504. Para determinar o epítopo mínimo, LCLautólogas (20.000/cavidade) foram pulsadas com peptídeo na concentraçãoindicada e co-cultivadas com clones de células T (1000 células/cavidade) e opeptídeo na concentração indicada. IFN-D foi avaliada por ELISPOT apósdezoito horas de co-cultura. Cada ponto representa a média das determina-ções em duplicata.
Listagem de Seqüências
As seqüências de ácido nucléico e aminoácidos listados na lista-gem de seqüências anexa são mostrados usando as abreviações de letrapadrão para bases de nucleotídeos e código de três letras para aminoácidos,como definido em 37 C.F.R. 1.822. Apenas um filamento de cada seqüênciade ácido nucléico é mostrado, mas o filamento complementar é entendidocomo incluído por qualquer referência o filamento apresentado. Na listagemde seqüências anexa:
SEQ ID NOs: 1 a 12 são as seqüências de aminoácidos de polipeptídeos deMtb.
SEQ ID NOs: 13 a 14 são os aminoácidos de peptídeos de Mtb.
SEQ ID NOs: 15 a 25 são as seqüências de ácido nucléico de polinucleotí-
deos que codificam os polipeptídeos de Mtb.
SEQ ID NOs: 26 a 38 são as seqüências de aminoácidos de epítopos espe-cíficos de Mtb.Descrição Detalhada
Métodos para produzir uma resposta imune para Mycobacterium tuberculo-sis (Mtb) são descritos aqui. Em vários exemplos, a resposta imune é umaresposta imune protetora. Em modalidades adicionais, são descritos méto-dos para prevenir uma infecção com Mtb ou tratar uma infecção por Mtb.Composições farmacêuticas para prevenção e/ou tratamento de tuberculosetambém são descritas.
Termos
A menos que mencionado de outra maneira, termos técnicos sãousados de acordo com o uso convencional. As definições de termos comunsem biologia molecular podem ser encontradas em Benjamin Lewin, Genes V,publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrewetal. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por BlackwellScience Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Robert A. Meyers (ed.), Molecu-lar Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicadopor VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
A fim de facilitar a revisão das várias modalidades dessa descri-ção, as seguintes explicações de termos específicos são fornecidas:
Adjuvante: Um veículo usado para aumentar a antigenicidade.Adjuvantes incluem uma suspensão de minerais (alume, hidróxido de alumí-nio ou fosfato) nas quais o antígeno está adsorvido; ou emulsão água-em-óleo na qual a solução de antígeno é emulsificada em óleo mineral (adjuvan-te incompleto de Freund), algumas vezes com a inclusão de micobactériasmortas (adjuvante completo de Freund) para aumentar ainda mais a antige-nicidade (inibe a degradação do antígeno e/ou causa influxo de macrófagos).Oligonucleotídeos imunoestimulatórios (tais como aqueles que incluem ummotivo CpG) também podem ser usados como adjuvantes (por exemplo,veja Patente U.S. N9 6.194.388; Patente U.S. N9 6.207.646; Patente U.S. N96.214.806; Patente U.S. N9 6.218.371; Patente U.S. N9 6.239.116; PatenteU.S. N9 6.339.068; Patente U.S. N9 6.406.705; e Patente U.S. N9 6.429.199).Adjuvantes incluem moléculas biológicas (um "adjuvante biológico"), taiscomo moléculas co-estimulatórias. Adjuvantes exemplares incluem IL-2,RANTES, GM-CSF1 TNF-a, IFN-γ, G-CSF, LFA-3, CD72, B7-1, B7-2, OX-40L e 41 BBL.
Antíqeno: Um composto, uma composição ou substância quepode estimular a produção de anticorpos ou uma resposta de célula T emum animal, incluindo composições que são injetadas ao absorvidas por umanimal. Um antígeno reage com os produtos de imunidade humoral ou celu-lar específicas, incluindo aqueles induzidos por imunógenos heterólogos. Aexpressão "antígeno" inclui todos os epítopos antigênicos relacionados. "Epí-topo" ou "determinante antigênico" refere-se a um sítio sobre um antígeno aoqual as células B e/ou T respondem. Em uma modalidade, as células T res-pondem ao epítopo quando o epítopo é apresentado em conjunto com umamolécula de MHC. Epítopos podem ser formados por tanto pelos aminoáci-dos contíguos como pelos aminoácidos não-contíguos justapostos pelo do-bramento terciário de uma proteína. Geralmente, as células T reconhecemepítopos de aminoácidos contíguos. Epítopos formados por aminoácidoscontíguos são tipicamente retidos após exposição a solventes desnaturantesenquanto que epítopos formados por dobramento terciário são tipicamenteperdidos no tratamento com solventes desnaturantes. Um epítopo inclui tipi-camente pelo menos 3, e mais geralmente, pelo menos 5, cerca de 9 ou cer-ca de 8 a 10 aminoácidos em uma conformação espacial única. Métodospara determinar a conformação espacial de epítopos incluem, por exemplo,cristalografia de raio X e ressonância nuclear magnética bidimensional.
Um antígeno pode ser um antígeno tecido-específico ou um an-tígeno doença-específico. Esses termos não são exclusivos, já que um antí-geno tecido-específico também pode ser um antígeno doença-específico.Um antígeno tecido-específico é expresso em um número limitado de teci-dos, tal como um único tecido. Um antígeno tecido-específico pode ser ex-presso por mais de um tipo de tecido relacionado, tal como tecido alveolar ebrônquico. Um antígeno específico para doença-específico é expresso juntocom um processo de doença. Exemplos específicos não-limitantes de umantígeno doença-específico são antígenos cuja expressão se correlacionacom ou, é preditiva de, tuberculose. Um antígeno doença-específico podeser um antígeno reconhecido pelas células T ou células B.
Amplificacão: De uma molécula de ácido nucléico (por exemplo,uma molécula de DNA ou RNA) refere-se ao uso de uma técnica que au-menta o número de cópias de uma molécula de ácido nucléico em um espé-cime. Um exemplo de amplificação é a reação em cadeia da polimerase, naqual uma amostra biológica coletada de um indivíduo é colocada em contatocom um par de iniciadores de oligonucleotídeos, sob condições que permi-tem a hibridização dos iniciadores a um ácido nucléico molde na amostra.
Os iniciadores são estendidos sob condições adequadas, dissociados domolde, e então re-anelados, estendidos e dissociados para amplificar o nú-mero de cópias do ácido nucléico. O produto de amplificação pode ser ca-racterizado por eletroforese, padrões de clivagem com endonuclease de res-trição, hibridização ou ligação de oligonucleotídeo e/ou seqüenciamento deácido nucléico usando técnicas padronizadas. Outros exemplos de amplifi-cação incluem amplificação por deslocamento de filamento, como descritona Patente U.S. Ns 5.744.311; amplificação isotérmica sem transcrição, co-mo descrito na Patente U.S. N- 6.033.881; e amplificação por reação de re-paro de cadeia, como descrito na WO 90/01069; amplificação por reação emcadeia da ligase, como descrito em EP-A-320 308; amplificação por reaçãoem cadeia da ligase com preenchimento de intervalos, como descrito na Pa-tente U.S. Ns 5.427.930; e amplificação sem transcrição de RNA NASBA™,como descrito na Patente U.S. Nq 6.025.134.
Anticorpo: Moléculas de imunoglobulina e porções imunologica-mente ativas de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contêmum sítio de ligação de antígeno que se liga especificamente (imunoreagecom) um antígeno.
Um anticorpo que ocorre naturalmente (por exemplo, IgG, IgM,IgD) inclui quatro cadeias de polipeptídeos, duas cadeias pesadas (H) e du-as cadeias leves (L) interligadas por ligações de dissulfeto. Entretanto, temsido mostrado que a função de ligação de antígeno de um anticorpo podeser realizada por fragmentos de um anticorpo que ocorre naturalmente. As-sim, esses fragmentos de ligação de antígeno também são pretendidos co-mo sendo designados pelo termo "anticorpo". Exemplos específicos, não-Iimitantes de fragmentos de ligação abrangidos dentro do termo anticorpoincluem: (i) um fragmento Fab que consiste dos domínios VL, VH, Cl e Cm;
(ii) um fragmento Fd que consiste nos domínios Vh e Cm; (iii) um fragmentoFv que consiste nos domínios Vl e Vh de um único braço de um anticorpo;(iv) um fragmento dAb (Ward et aí., Nature 341:544-546, 1989) que consisteem um domínio VH; (v) uma região de determinação de complementaridade(CDR) isolada; e (vi) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente quecompreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto naregião de dobradiça.
Imunoglobulinas e certas variantes destas são conhecidas e vá-rias tem sido preparadas em culturas de célula recombinante (por exemplo,veja Patente U.S. N9 4.745.055; Patente U.S. Nq 4.444.487; WO 88/03565;EP 256.654; EP 120.694; EP 125,023; Faoulkner et al., Nature 298:286,1982; Morrison, J. Immunol. 123:793, 1979; Morrison et al., Ann Rev. Immu-nol 2:239, 1984).
Animal: Organismos vertebrados multicelulares vivos, uma cate-goria que inclui, por exemplo, mamíferos e pássaros. O termo mamífero in-clui tanto os mamíferos humanos como não-humanos. Similarmente, a ex-pressão "indivíduo" inclui tanto indivíduos humanos como animais.
Célula apresentadora de antígeno (APC): Uma célula que podeapresentar um antígeno a uma célula T, para que as células T sejam ativa-das. Células dendríticas são as principais células apresentadoras de antíge-no (APCs) envolvidws em respostas imunes primárias. Sua principal funçãoé obter antígeno em tecidos, migrar para órgãos linfóides e apresentar o an-tígeno a fim de ativar as células T.
Quando um sinal de maturação apropriado é recebido, as célu-las dendríticas são sinalizadas para se submeterem a rápidas alteraçõesmorfológicas e fisiológicas que facilitam o início e o desenvolvimento de res-postas imunes. Entre esses há a regulação positiva de moléculas envolvidasna apresentação do antígeno; produção de citocinas pró-inflamatórias, inclu-indo IL-12, chave para a geração de respostas de Th1; e secreção de quimi-ocinas que auxiliam a direcionar a diferenciação, expansão e migração decélulas Th naives circundantes. Coletivamente, essas moléculas reguladaspositivamente facilitam a habilidade de células dendríticas coordenarem aativação e função efetora de outros linfócitos circundantes que em últimaanálise fornecem proteção para o hospedeiro.
cDNA (DNA complementar): Um pedaço de DNA que não temsegmentos internos, não codificantes (íntrons) e seqüências regulatórias quedeterminam a transcrição. O cDNA é sintetizado no laboratório por transcri-ção reversa de RNA mensageiro extraído das células.
CD4: Grupo de diferenciação de fator 4, uma proteína de super-fície de célula T que media a interação com a molécula MHC Classe II. CD4serve como sítio receptor primário para HIV sobre células T durante infecçãopor HIV. As células que expressam CD4 são geralmente células T auxiliares.
CD8: Grupo de diferenciação fator 8, uma proteína da superfícieda célula T que media a interação com a molécula de MHC Classe I. Célulasque expressam CD8 são geralmente células T citotóxicas. "Imunidade medi-ada por célula T CD8+" é uma resposta imune implementada pela apresen-tação de antígenos a células T CD8+.
cDNA (DNA complementar): Um pedaço de DNA que carece desegmentos internos, não codificadores (introns) e seqüências regulatóriasque determinam a transcrição. cDNA é sintetizado no laboratório por trans-crição reversa de RNA mensageiro extraído das células.
Variantes conservativas: Substituições "conservativas" de ami-noácidos são aquelas que não afetam substancialmente ou diminuem a ati-vidade ou antigenicidade do polipeptídeo de Mycobacterium. Exemplos es-pecíficos, não-limitantes de uma substituição conservativa incluem os se-guintes exemplos:
Resíduo Original Substituições Conservativas
Ala Ser
Arg Lys
Asn Gln, HisAsp GluCys SerGln AsnGlu AspHis Asn; GlnIle Leu, ValLeu He; ValLys Arg; Gln; GluMet Leu; IlePhe Met; Leu; TyrSer ThrThr SerTrp TyrTyr Trp; PheVal lie; Leu
O termo variação conservativa também inclui o uso de um ami-noácido substituído no lugar de um aminoácido parente não-substituído, con-tanto que os anticorpos surgidos para o polipeptídeo substituído tambémimunorreajam com o polipeptídeo não-substituído ou que uma resposta imu-ne possa ser gerada contra o polipeptídeo substituído que é similar à respos-ta imune contra o polipeptídeo não-substituído, tal como um antígeno de My-cobacterium. Assim, em uma modalidade, substituições não-conservativassão aquelas que reduzem a atividade ou antigenicidade.
Consiste Essencialmente em/Consiste em: Com relação a umpolipeptídeo, um polipeptídeo que consiste essencialmente em uma seqüên-cia de aminoácido especificada se ele não inclui quaisquer resíduos adicio-nais de aminoácido. Entretanto, o polipeptídeo pode incluir componentesnão-peptídicos adicionais, tais como rótulos (por exemplo, rótulos fluores-centes, radioativos ou partículas sólidas), açúcares ou lipídios. Com relaçãoa um polipeptídeo, um polipeptídeo que consiste em uma seqüência de ami-noácido especificada não inclui quaisquer resíduos de aminoácido adicio-nais, nem inclui componentes não-peptídicos adicionais, tais como lipídios,açúcares ou rótulos.
Colocar em contato: O processo de incubar um agente na pre-sença de outro. Assim, quando uma célula é colocada em contato com umagente, a célula é incubada com o agente por um período de tempo suficien-te para o agente e a célula interagirem.
Molécula co-estimulatória: Apesar da ligação do TCR com o pep-tídeo-MHC liberar um sinal para a célula T, esse sinal sozinho pode ser insu-ficiente para ativar a célula T. Moléculas co-estimulatórias são moléculasque, quando ligadas aos seus ligantes, liberam um segundo sinal necessáriopara que a célula T se torne ativada. A molécula co-estimulatória mais bem-conhecida na célula T é CD28, que se liga a B7-1 (também chamado deCD80) ou B7-2 (também conhecido como CD86). Uma molécula co-estimulatória adicional é B7-3. Moléculas acessórias que também fornecemum segundo sinal para ativação de células T incluem a molécula de adesãointracelular (ICAM-1 e ICAM-2) e o antígeno associado à função do leucócito(LFA-1, LFA-2 e LFA-3). Membros da superfamília das integrinas e fator denecrose do tumor (TNF) também podem servir como moléculas co-estimulatórias.
Citocina: Proteínas feitas pelas células que afetam o comporta-mento de outras células, tais como linfócitos. Em uma modalidade, uma cito-cina é uma quimiocina, uma molécula que afeta o trânsito celular. Exemplosespecíficos, não-limitantes de citocinas incluem as interleucinas (IL-2, IL-4,IL-6, IL-10, IL-21, etc.), e IFN-γ.
Variante degenerada: Um polinucleotídeo que codifica um epíto-po de um polipeptídeo de Mtb que inclui uma seqüência que é degeneradacomo resultado do código genético. Existem 20 aminoácidos naturais, amaioria dos quais são especificados por mais de um códon. Portanto, todasas seqüências de nucleotídeo degeneradas estão incluídas nessa descriçãoassim como a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo de Mtb codificadapela seqüência de nucleotídeo que está inalterada.
Célula dendrítica (PC): Células dendríticas são as principais cé-lulas apresentadoras de antígeno (APCs) envolvidas em respostas imunesprimárias. Células dendríticas incluem células dendríticas plasmacitóides ecélulas dendríticas mielóides. Sua função principal é obter antígeno em teci-dos, migrar para órgãos linfóides e apresentar o antígeno a fim de ativar ascélulas T. Células dendríticas imaturas se originam na medula óssea e resi-dem na periferia como células imaturas.
Diagnóstico: Identificar a presença ou natureza de uma condiçãopatológica, tal como, mas não-limitada a tuberculose. Métodos de diagnósti-co diferem na sua sensibilidade e especificidade. A "sensibilidade" de umensaio diagnóstico é o percentual de indivíduos doentes com teste positivo(percentual de positivos verdadeiros). A "especificidade" de um ensaio diag-nóstico é 1 menos a taxa de falso positivo, onde a taxa de falso positivo édefinida como a proporção daqueles sem doença cujo teste é positivo. Em-bora um método de diagnóstico particular possa não fornecer um diagnósticodefinitivo de uma condição, ele é suficiente se o método fornecer uma indi-cação positiva que auxilie no diagnóstico. "Prognóstico" significa predizer aprobabilidade de desenvolvimento (por exemplo, severidade) de uma condi-ção patológica, tal como tuberculose.
Apresentação: O processo de localização de um complexo pep-tídeo:antígeno ou peptídeo na superfície externa de uma célula onde o com-plexo peptídeo:antígeno é acessível a uma segunda célula, moléculas apre-sentadas pela segunda célula ou fatores solúveis. Um peptídeo ou um com-plexo peptídeo:antígeno é "apresentado" por uma célula quando ele estápresente sobre a superfície externa da célula e é acessível para uma segun-da célula, a moléculas apresentadas pela segunda célula ou a fatores soluveis.
Epítopo: Um determinante antigênico. Esses são grupos quími-cos particulares ou seqüências peptídicas, em uma molécula, que são anti-gênicos, isto é, que fazem surgir uma resposta imune específica. Um anti-corpo se liga especificamente a um epítopo antigênico em particular em umpolipeptídeo, tal como um polipeptídeo de Mycobacterium.
Seqüências de Controle de Expressão: Seqüências de ácido nu-cléico que regulam a expressão de uma seqüência de ácido nucléico heteró-Ioga com a qual está operativamente ligada. Seqüências de controle de ex-pressão estão operativamente ligadas a uma seqüência de ácido nucléicoquando as seqüências de controle da expressão controlam e regulam atranscrição e, conforme apropriado, a tradução da seqüência de ácido nu-cléico. Assim, as seqüências de controle da expressão podem incluir promo-tores apropriados, intensificadores, terminadores da transcrição, um códonde início (isto é, ATG) na frente de um gene que codifica uma proteína, sinalde "splicing" para íntrons, manutenção da fase de leitura correta daquelegene para permitir a tradução apropriada de mRNA e códons de parada. Aexpressão "seqüências de controle" pretende incluir, no mínimo, componen-tes cuja presença possam influenciar a expressão e pode incluir tambémcomponentes adicionais cuja presença pode influenciar a expressão, e tam-bém pode incluir componentes adicionais suja presença é vantajosa, porexemplo, seqüências líder e seqüências parceiras de fusão. Seqüências decontrole de expressão podem incluir um promotor.
Um promotor é uma seqüência mínima suficiente para direcionara transcrição. Também incluídos estão aqueles elementos promotores quesão suficientes para tornar a expressão do gene dependente do promotorcontrolável para tipos específicos de células ou tipos específicos tecidos, ouinduzíveis por sinais ou agentes externos; tais elementos podem estar locali-zados nas regiões 5' ou 3' do gene. Tanto promotores constitutivos comoinduzíveis estão incluídos (veja, por exemplo, Bitter et ai, Methods in Enzy-mology 153:516-544, 1987). Por exemplo, quando se clona em sistemasbacterianos, promotores induzíveis tais como pL de bacteriófago lambda,plac, ptrp, ptac (promotor híbrido ptrp-lac) e semelhantes podem ser usados.Em uma modalidade, quando se clona em sistemas celulares de mamífero,promotores derivados do genoma de células de mamíferos (por exemplo,promotor de metalotioneína) ou de vírus de mamíferos (por exemplo, a repe-tição terminal longa de retrovírus; o promotor tardio de adenovírus; o promo-tor do vírus da vacínia de 7,5 K) podem ser usados. Promotores produzidospor técnicas de DNA recombinante ou sintéticas também podem ser usadospara proporcionar a transcrição das seqüências de ácidos nucléicos. Emuma modalidade, o promotor é um promotor de citomegalovírus.
Fracionamento: Submeter uma amostra a condições ou proce-dimentos que separam os componentes da amostra com base nas proprie-dades físicas ou químicas tais como, mas não-limitadas a tamanho, carga,solubilidade ou composição. Exemplos de procedimentos de fracionamentoincluem, mas não são limitados a, precipitação seletiva, extração orgânica,diálise por exclusão de tamanho ou cromatografia, tal como cromatografia detroca de íon. Em uma modalidade, uma fração é um extrato solúvel ou umextrato orgânico de um organismo, tal como um Mycobacterium.
Funcionalmente equivalente: Alterações de seqüência, tal comoem um epítopo de um antígeno, que produzem os mesmos resultados queos descritos aqui. Tais alterações de seqüência podem incluir, mas não sãolimitadas a substituições conservativas, deleções, mutações, alterações noquadro de leitura e inserções.
Heteróloqo: Originado de fontes ou espécies genéticas separa-das. Um polipeptídeo que é heterólogo a um polipeptídeo de Mtb se originade um ácido nucléico que não codifica o polipeptídeo de Mtb. Em um exem-plo específico, não-limitante, um polipeptídeo que compreende nove amino-ácidos consecutivos de um polipeptídeo de Mtb ou no máximo 20 aminoáci-dos consecutivos do polipeptídeo de Mtb e uma seqüência de aminoácidosheteróloga inclui uma seqüência de aminoácidos de β-galactosidase, de umaproteína de ligação a maltose, albumina, antígeno de superfície da hepatiteB ou uma imunoglobulina. Geralmente, um anticorpo que se liga especifica-mente a uma proteína de interesse não se ligará especificamente a uma pro-teína heteróloga.
Células hospedeiras: Células nas quais um vetor pode ser pro-pagado e seu DNA expresso, A célula pode ser procariótica ou eucariótica. Acélula pode ser de mamífero, tal como uma célula humana. O termo tambéminclui qualquer progênie da célula hospedeira do indivíduo. É entendido quetoda a progênie pode não ser idêntica a célula parental já que pode havermutações que ocorrem durante a replicação. Entretanto, tal progênie estáincluída quando o termo "célula hospedeira" é usado.Antíqeno Leucocitário Humano (HLA): Uma designação genéticado complexo principal de histocompatibilidade humano (MHC). Loci individu-ais são designados pelas letras maiúsculas, como em HLA-E e alelos sãodesignados por números, como em HLA-A*0201. Os três genes principais deMHC classe I são chamados HLA-A, HLA-B, e HLA-C. Entretanto, existemvários genes que codificam moléculas da superfície celular associadas à β2microglobulina que são ligados aos genes de MHC classe I. A expressãodesses genes é variável, tanto na distribuição no tecido quanto na quantida-de expressa nas células; esses genes foram denominados de genes MHCclasse IB.
Resposta imune: Uma resposta de uma célula do sistema imune,tal como uma célula B, uma célula natural killer ou uma célula T, a um estí-mulo. Em uma modalidade, a resposta é específica para um antígeno emparticular (uma "resposta antígeno-específica"). Em uma modalidade, umaresposta imune é uma resposta de célula T, tal como resposta de Th1, Th2,ou Th3. Em outra modalidade, uma resposta imune é uma resposta de célulaT supressora.
Peptídeo imunogênico: Um peptídeo que compreende um motivoalelo-específico ou outra seqüência tal que o peptídeo se ligará a uma molé-cuia de MHC e induzirá uma resposta de linfócito T citotóxico ("CTL") ou umaresposta de célula B (por exemplo, produção de anticorpo) contra o antígenoa partir do qual o peptídeo imunogênico é derivado.
Em uma modalidade, peptídeos imunogênicos são identificadosusando motivos de seqüência ou outros métodos, tais como rede neural oudeterminações polinomiais, conhecidas na técnica. Tipicamente, algoritmossão usados para determinar o "limiar de ligação" de peptídeos para selecio-nar aqueles com escores que lhes dão uma alta probabilidade de se ligarcom certa afinidade e que serão imunogênicos. Os algoritmos são baseadostanto nos efeitos da ligação de MHC de um aminoácido particular em umaposição particular, nos efeitos da ligação de anticorpo de um aminoácidoparticular em uma posição particular, ou nos efeitos da ligação de uma subs-tituição particular em um peptídeo que contém um motivo. Dentro do contex-to de um peptídeo imunogênico, um "resíduo conservado" é aquele que apa-rece em uma freqüência significativamente maior do que seria esperada peladistribuição aleatória em uma posição particular em um peptídeo. Em umamodalidade, um resíduo conservado é aquele onde a estrutura de MHC po-de fornecer um ponto de contato com o peptídeo imunogênico.
Peptídeos imunogênicos também podem ser identificados pelamedida de suas ligações com uma proteína de MHC específica e pela suahabilidade de estimular CD4 e/ou CD8 quando apresentados no contexto daproteína de MHC.
Em um exemplo, um "peptídeo de Mtb" imunogênico é uma sériede resíduos de aminoácidos contíguos da proteína de Mtb geralmente entre9 e 20 resíduos de aminoácidos de extensão, tal como cerca de 9 a 12 resí-duos de extensão. Polipeptídeos imunogênicos específicos que são descri-tos aqui têm 9 ou 10 resíduos de aminoácidos de extensão, ou no máximo12 aminoácidos de extensão. Geralmente, polipeptídeos imunogênicos deMtb podem ser usados para induzir uma resposta imune em um indivíduo, talcomo uma resposta de célula B ou uma resposta de célula T. Em um exem-plo, um polipeptídeo imunogênico de Mtb, quando ligado a uma molécula deMHC Classe I, ativa linfócitos T citotóxicos (CTLs) contra Mtb. A indução deCTLs usando peptídeos sintéticos e ensaios de citotoxicidade de CTL sãoconhecidos na técnica, veja Patente U.S. Nq 5.662.907, que está incorpora-da aqui por referência. Em um exemplo, um peptídeo imunogênico inclui ummotivo alelo-específico ou outra seqüência tal que o peptídeo se ligará auma molécula de MHC e induzirá uma resposta de linfócito T citotóxico ("C-TL") contra o antígeno a partir do qual o peptídeo imunogênico é derivado.
Composição imunoqênica: Uma composição que compreendeum polipeptídeo imunogênico de Mtb ou um ácido nucléico que codifica opolipeptídeo imunogênico de Mtb que induz uma resposta de CLT mensurá-vel contra Mtb ou induz uma resposta mensurável de célula B (tal como pro-dução de anticorpos que se ligam especificamente a um polipeptídeo deMtb). Para uso in vitro, a composição imunogênica pode consistir no ácidonucléico isolado, vetor que inclui o ácido nucléico/ou peptídeo imunogênico.Para uso in vivo, a composição imunogênica compreenderá tipicamente oácido nucléico, vetor que inclui o ácido nucléico e/ou polipeptídeo imunogê-nico, em veículos farmaceuticamente aceitáveis e/ou outros agentes. Umacomposição imunogênica pode opcionalmente incluir um adjuvante, umamolécula co-estimulatória ou um ácido nucléico que codifica uma moléculaco-estimulatória. Um polipeptídeo de Mtb1 ou ácido nucléico que codifica opolipeptídeo, pode ser rapidamente testado quanto a sua habilidade de indu-zir uma CTL por ensaios reconhecidos na técnica.
Inibir ou tratar uma doença: Inibir uma doença, tal como tubercu-lose, refere-se a inibição do desenvolvimento completo de uma doença. Emvários exemplos, inibir uma doença refere-se a minimizar os sintomas detuberculose. "Tratamento" refere-se a uma intervenção terapêutica que me-lhora um sinal ou sintoma de uma doença ou condição patológica relaciona-da a doença, tal como tuberculose.
Interferon qamma (v): IFN-γ é uma proteína dimérica com subu-nidades de 146 aminoácidos. A proteína é glicosilada em dois sítios e o pl é8.3-8.5. IFN-γ é sintetizado como uma proteína precursora de 166 aminoáci-- dos que inclui uma seqüência de sinal secretória de 23 aminoácidos. Duasformas moleculares da proteína biologicamente ativa de 20 e 25 kDa foramdescritas. Ambas são glicosiladas na posição 25. A forma de 25 kDa tam-bém é glicosilada na posição 97. As diferenças observadas de IFN-γ naturalcom relação a massa molecular e carga são devidas a padrões variáveis deglicosilação. Formas de 40 a 60 kDa observadas sob condições não desna-turantes são dímeros e tetrâmeros de IFN-γ. O gene humano tem uma ex-tensão de aproximadamente 6 kb. Ele contém quatro éxons e mapeia o cro-mossomo 12q24.1.
IFN-γ pode ser detectado por imunoensaios sensíveis, tais comoum teste ELISPOT que permite a detecção de células individuais que produ-zem IFN-γ. Quantidades mínimas de IFN-γ podem ser detectadas indireta-mente pela medida de proteínas induzidas por IFN tal como proteína Mx. Aindução da síntese de IP-10 também tem sido usada para medir a concen-tração de IFN-γ. Além disso, bioensaios podem ser usados para detectarIFiM-γ, tal como um ensaio que emprega indução de atividade de indolamina2,3-desoxigenase em células 2D9. A produção de IFN-γ pode ser usada pa-ra avaliar a ativação de célula T, tal como a ativação de uma célula T por umantígeno HLA-E apresentado por Mycobacterium.
Isolado: Um ácido nucléico "isolado" foi substancialmente sepa-rado ou purificado de outras seqüências de ácido nucléico na célula do or-ganismo no qual o ácido nucléico ocorre naturalmente, isto é, outro DNA eRNA cromossômico e extracromossômico. A expressão "isolado" abrangeassim ácidos nucléicos purificados por métodos padronizados de purificaçãode ácido nucléico. A expressão também engloba ácidos nucléicos prepara-dos por expressão recombinante em uma célula hospedeira assim como á-cidos nucléicos sintetizados quimicamente.
Rótulo: Um composto ou composição detectável que é conjuga-do diretamente ou indiretamente com outra molécula para facilitar a detec-ção daquela molécula. Exemplos específicos, não-limitantes de rótulos in-cluem sinais fluorescentes, ligações enzimáticas e isótopos radioativos.
Seqüência liqante: Uma seqüência Iigante é uma seqüência deaminoácidos que se liga covalentemente dois domínios de polipeptídeo. Se-qüências Iigantes podem ser incluídas entre os epítopos de Mtb descritosaqui para fornecer liberdade rotacional aos domínios de polipeptídeo ligadose dessa maneira promover dobramento do domínio e apresentação ao MHC.Por exemplo, em um polipeptídeo recombinante que compreende dois domí-nios de Mtb, seqüências Iigantes podem ser fornecidas entre eles, tal comoum polipeptídeo que compreende polipeptídeo de Mtb-Iigante- polipeptídeode Mtb. Seqüências ligantes, que tem geralmente entre 2 e 25 aminoácidosde extensão, são bem-conhecidas na técnica e incluem, mas não são limita-das ao espaçador glicina(4)-serina (GGGGS x3) descrito por Chaudhary etal., Nature 339:394-397, 1989.
Linfócitos: Um tipo de célula branca do sangue que está envolvi-da nas defesas imunes do corpo. Existem dois tipos principais de linfócitos:células B e células T.
Mamífero: Essa expressão inclui os mamíferos humanos e osnão-humanos. Similarmente, a expressão "paciente" ou "indivíduo" inclui osindivíduos humanos e animais.
Micobactéria: Um gênero de organismos bacterianos intracelula-res aeróbicos. Após a invasão de um hospedeiro, esses organismos sobre-vivem dentro de compartimentos endossomais de monócitos e macrófagos.Doenças micobacterianas humanas incluem tuberculose (causada pela M.tuberculosis), Lepra (causada pela M. leprae), úlceras de Bairnsdale (causa-da pela M. ulcerans) e outras infecções que podem ser causadas por M. ma-rinum, M. kansasii, M. scrofulaceum, M. szulgai, M. xenopi, M. fortuitum, M.haemophilum, M. chelonei, e M. intracellulare. Cepas de Mycobacterium queeram consideradas serem não-patogênicas previamente (tal como M. avium)também são conhecidas agora por serem as causas de morte de pacientesimunossuprimidos com AIDS.
Uma resposta imune à micobactéria pode envolver reações dehipersensibilidade mediadas por célula (DTH) com células T e macrófagosdesempenhando papéis importantes na morte intracelular e incorporação (oucontenção) do organismo (formação de granuloma). Uma resposta de célulaT envolve linfócitos CD4+ que reconhecem proteínas de choque térmico mi-cobacterianas e antígenos imunodominantes assim como células CD8+.
Qperativamente ligado: Uma primeira seqüência de ácido nucléi-co está operativamente ligada com uma segunda seqüência de ácido nucléi-co quando a primeira seqüência de ácido nucléico está colocada em um re-lacionamento funcional com a segunda seqüência de ácido nucléico. Porexemplo, um promotor está operativamente ligado a uma seqüência codifi-cante se o promotor efetuar a transcrição ou expressão da seqüência codifi-cante. Geralmente, seqüências de DNA operativamente ligadas são contí-guas e, onde é necessário ligar duas regiões codificantes de proteína, asfases de abertas leitura estão alinhadas.
ORF (fase de aberta leitura): Uma série de três nucleotídeos(códons) que codificam aminoácidos sem nenhum códon de terminação. Es-sas seqüências são geralmente traduzíveis em um polipeptídeo.
Modificações de peptídeo: Polipeptídeos de Mycobacterium in-cluem modalidades sintéticas de peptídeos descritos aqui. Além disso, aná-logos (moléculas orgânicas não peptídicas), derivados (moléculas de peptí-deo quimicamente funcionalizadas obtidas começando com as seqüênciasde peptídeo descritas) e variantes (homólogos) dessas proteínas podem serutilizados nos métodos descritos aqui. Cada polipeptídeo da invenção écompreendido por uma seqüência de aminoácidos, que podem ser L- e/ouD-aminoácidos, que ocorrem naturalmente e de outra maneira.
Peptídeos podem ser modificados por uma variedade de técni-cas químicas para produzir derivados que têm essencialmente a mesma ati-vidade que os peptídeos não modificados e, opcionalmente, têm outras pro-priedades desejáveis. Por exemplo, grupos de ácido carboxílico da proteína,ou da terminação carboxila ou da cadeia lateral, podem ser fornecidos naforma de um sal de um cátion farmaceuticamente aceitável ou esterificadospara formar um éster de C1-C16 ou convertidos em uma amida de fórmulaNR1R2 em que R1 e R2 são cada um independentemente H ou C1-16 alquilaou combinados para formar um anel heterocíclico, tal como um anel de 5 ou6 membros. Grupos amina do peptídeo, ou da terminação amina ou da ca-deia lateral, podem estar na forma de um sal de adição ácida farmaceutica-mente aceitável, tal como HCI, HBr. acético, benzóico, toluenossulfônico,maléico, tartárico ou outros sais orgânicos, ou podem ser modificados paraC1-C16 alquila ou dialquil amina ou ainda convertidos para uma amida.
Grupos hidroxila das cadeias laterais do peptídeo podem serconvertidos para C1-C16 alcóxi ou para um éster de C1-C16 usando técnicasbem-reconhecidas. Anéis de fenila e fenólico das cadeias laterais do peptí-deo podem ser substituídos com um ou mais átomos de halogênio, tal comoflúor, cloro, bromo ou iodo ou com C1-C16 alquila, C1-C16 alcoxi, ácidos car-boxílicos ou ésteres desses ou amidas de tais ácidos carboxílicos. Gruposde metileno das cadeias laterais do peptídeo podem ser estendidos para C2-C4 alquilenos homólogos. Tióis podem ser protegidos com qualquer um devários grupos protetores bem-reconhecidos, tais como grupos acetamida.Aqueles versados na técnica reconhecerão métodos para introduzir estrutu-ras cíclicas nos peptídeos da invenção para selecionar e fornecer restriçõesconformacionais à estrutura que resultam em estabilidade aumentada.
Modalidades de peptidomiméticos e organomiméticos são pre-vistas, pelas quais o arranjo tridimensional dos constituintes químicos de taispeptido- e organomiméticos mimetiza o arranjo tridimensional do arcabouçodo peptídeo e das cadeias laterais de aminoácidos componentes, resultandoem tais peptido- e organomiméticos de um polipeptídeo de Mycobacteriumque têm habilidade mensurável ou aumentada para gerar uma resposta imu-ne. Para aplicações de modelagem por computador, um farmacóforo é a de-finição tridimensional ideal das necessidades estruturais para atividade bio-lógica. Peptido- e organomiméticos podem ser desenhados para se ajustar acada farmacóforo com um programa atual de modelagem por computadorusando o desenho de fármaco assistido por computador ou CADD). VejaWalters, "Computer-Assisted Modeling of Drugs", in Klegerman & Groves,eds., 1993, Pharmaceutical Biotechnology, Interpharm Press: Buffalo Grove,IL, pp. 165-174 e Principies of Pharmacology Munson (ed.) 1995, Ch. 102,para descrições de técnicas usadas em CADD. Os miméticos preparadosusando tais técnicas também estão incluídos.
Agente farmacêutico ou fármaco: Um composto ou composiçãoquímica capaz de induzir um feito terapêutico ou profilático desejado quandoadministrada a um indivíduo apropriadamente.
Veículos farmaceuticamente aceitáveis: Os veículos farmaceuti-camente aceitáveis úteis com os polipeptídeos e ácidos nucléicos descritosaqui são convencionais. Remingtori's Pharmaeeutical Sciences, por E. W.Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15- Edição (1975), descreve com-posições e formulações adequadas para liberação farmacêutica das proteí-nas de fusão descritas nesse.
Em geral, a natureza do veículo dependerá do modo de adminis-tração em particular a ser empregado. Por exemplo, formulações parenteraisgeralmente compreendem fluidos injetáveis que incluem fluidos farmaceuti-camente e fisiologicamente aceitáveis tais como água, solução salina, solu-ções de sal balanceadas, dextrose aquosa, glicerol ou semelhantes comoum veículo. Para composições sólidas, (por exemplo, formas de pó, pílula,comprimido ou cápsula), veículos sólidos não-tóxicos podem incluir, por e-xemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido ou estearato demagnésio. Além dos veículos biologicamente neutros, composições farma-cêuticas a serem administradas podem conter pequenas quantidades desubstancias auxiliares não-tóxicas, tais como agentes umectantes ou emulsi-ficantes, conservantes e agentes de tamponamento de pH e semelhantes,por exemplo, acetato de sódio ou monolaurato de sorbitano.
Polinucleotídeo: Uma seqüência linear de nucleotídeo, incluindoseqüências maiores do que 100 bases de nucleotídeo em extensão.
Polipeptídeo: Qualquer cadeia de aminoácidos, sem levar emconsideração a extensão ou modificação pós-tradução (por exemplo, glicosi-lação ou fosforilação). Um "peptídeo" é uma cadeia de aminoácidos que temmenos de 100 aminoácidos de extensão. Em uma modalidade, um "peptí-deo" é uma porção de um polipeptídeo, tal como cerca de 10, 20, 30, 40, 50,ou 100 aminoácidos contíguos de um polipeptídeo que maior do que 100aminoácidos de extensão.
Porção de uma seqüência de ácido nucléico: Pelo menos 10, 20,30 ou 40 nucleotídeos contíguos da seqüência relevante, tal como uma se-qüência que codifica um antígeno. Em alguns exemplos, pode ser vantajosousar uma porção que consiste de 50 ou mais nucleotídeos. Por exemplo,quando se descreve uma porção de um antígeno (tal como um epítopo anti-gênico), pode ser vantajoso remover uma porção da seqüência relevanteque compreende pelo menos 10, 20, 30, 40 ou 50 nucleotídeos em exten-são.
Sondas e iniciadores: Sondas e iniciadores de ácido nucléicopodem ser facilmente preparados baseados nos ácidos nucléicos fornecidospor essa invenção. Uma sonda compreende um ácido nucléico isolado aco-plado a um rótulo detectável ou molécula repórter. Rótulos típicos incluemisótopos radioativos, ligantes, agentes quimioluminescentes e enzimas. Mé-todos para marcação instruções para a escolha de rótulos apropriados paravários propósitos estão discutidos, por exemplo, em Sambrook etal. (1989)e Ausubel et al. (1987).Iniciadores são pequenos ácidos nucléicos, preferivelmente oli-gonucleotídeos de DNA com 15 nucleotídeos ou mais de extensão. Iniciado-res podem ser anelados a uma fita de DNA alvo complementar pela hibridi-zação de ácido nucléico para formar um híbrido entre o iniciador e a fita deDNA alvo e então estendido ao longo do DNA alvo por uma enzima DNApolimerase. Pares de iniciadores podem ser usados para amplificação deuma seqüência de ácido nucléico, por exemplo, pela reação em cadeia dapolimerase (PCR) ou outros métodos de amplificação de ácido nucléico co-nhecidos na técnica.
Métodos para preparar e usar sondas e iniciadores estão descri-tos, por exemplo, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2- ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et ai, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, NY, 1989, e Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel etai, Greene Publishing and Wiley-lnterscience, Nova Iorque, 1987 (com atua-lizações periódicas). Pares de iniciadores de PCR podem ser derivados deuma seqüência conhecida, por exemplo, pelo uso de programas de compu-tador pretendidos para esse propósito tal como Primer (Version 0.5, © 1991,Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA).
Prevenir ou tratar uma doença: "Prevenir" uma doença refere-sea inibição do desenvolvimento completo de uma doença, por exemplo emuma pessoa que é conhecida por estar em risco de infecção com M. tubercu-losis, ou M. Ieprae. Um exemplo de uma pessoa com uma predisposiçãoconhecida é alguém que vive com uma pessoa diagnosticada com tubercu-lose, profissionais de saúde ou alguém que de alguma maneira tenha sidoexposto a M. tuberculosis. "Tratamento" refere-se a uma intervenção tera-pêutica que melhora um sinal ou sintoma de uma doença ou condição pato-lógica, tal como tuberculose, após ela ter começado a se desenvolver.
Promotor: Um promotor é um arranjo de seqüências de controlede ácido nucléico que direcionam a transcrição de um ácido nucléico. Umpromotor inclui seqüências de ácido nucléico necessárias próximas do sítiode início da transcrição, tal como, no caso de um promotor do tipo polimera-se II, um elemento TATA. Um promotor, opcionalmente, também inclui ele-méntos intensificadores ou repressores distais que podem estar localizadosaté milhares de pares de bases do sítio de início da transcrição. O promotorpode ser um promotor constitutivo ou induzível. Um exemplo específico, não-limitante, de um promotor é o promotor de HCMV IE.
Purificado: A expressão "purificado" não requer pureza absoluta;particularmente, ela é compreendida como uma expressão relativa. Assim,por exemplo, uma preparação de antígeno purificada é aquela em que o an-tígeno é mais puro do que a proteína em seu ambiente de origem dentro deuma célula. Uma preparação de antígeno é tipicamente purificada tal que oantígeno representa pelo menos 50% do total de conteúdo de proteína dapreparação. Entretanto, preparações mais altamente purificadas podem sernecessárias para certas aplicações. Por exemplo, para tais aplicações, aspreparações nas quais o antígeno compreende pelo menos 75% ou pelomenos 90% do conteúdo total de proteína podem ser empregadas.
Recombinante: Um ácido nucléico ou polipeptídeo recombinanteé aquele que tem uma seqüência que não ocorre naturalmente ou tem umaseqüência que é feita por uma combinação artificial de dois ou mais segmen-tos de seqüência normalmente separados. Essa combinação artificial é ge-ralmente obtida por síntese química ou, mais comumente, pela manipulaçãoartificial de segmentos isolados de ácidos nucléicos, por exemplo, por técni-cas de manipulação genética.
Identidade de seqüência: A similaridade entre seqüências deaminoácidos é expressa em termos da similaridade entre as seqüências,normalmente referida como identidade de seqüência. Identidade de seqüên-cia freqüentemente é medida em termos de percentual de identidade (ousimilaridade ou homologia); quanto maior a porcentagem, mais similares sãoas duas seqüências. Variantes de polipeptídeo de antígeno possuirão umgrau relativamente alto de identidade de seqüência quando alinhadas usan-do métodos padronizados.
Métodos para alinhamento de seqüências para comparação sãobem-conhecidos na técnica. Altschul et al. (1994) apresenta uma considera-ção detalhada de métodos de alinhamento de seqüência e cálculo de homo-logia. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al.,1990) está disponível em várias fontes, incluindo o National Center for Biote-chnology Information (NCBI, Bethesda1 MD) e na Internet, para uso em con-junto com os programas de análise de seqüência blastp, blastn, blastx, t-blastn e tblastx. Ele pode ser acessado no sítio da internet da NCBI. Umadescrição de como determinar a identidade de seqüência usando esse pro-grama está disponível no website da NCBI, assim como estão os parâmetrospredeterminados.
Variantes de polipeptídeos antigênicos, tais como um polipeptí-deo de Mycobacterium, são tipicamente caracterizadas por possuírem pelomenos 50% de identidade de seqüência calculada sobre o alinhamento daextensão completa com a seqüência de aminoácidos de uma seqüência an-tigênica nativa usando o NCBI Blast 2.0, "gapped blastp set" para parâme-tros de default. Proteínas com similaridade até maior com as seqüências dereferência mostrarão percentuais de identidade aumentados quando avalia-das por esse método, tal como pelo menos 60%, %, pelo menos 65%, pelomenos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelomenos 95% de identidade de seqüência. Quando menos do que a seqüênciainteira está sendo comparado para identidade de seqüência, variantes tipi-camente possuirão pelo menos 75% de identidade de seqüência sobre jane-las pequenas de 10-20 aminoácidos e podem possuir identidades de se-qüência de pelo menos 85% ou pelo menos 90% ou 95% dependendo desua similaridade com a seqüência de referência. Métodos para determinaçãode identidade de seqüência sobre tais janelas pequenas estão descritos nosítio da Internet da NCBI. Variantes de polipeptídeos de domínio de MHCtambém retêm a atividade biológica do peptídeo nativo.
Polipeptídeo terapeuticamente ativo: Um agente, tal como umepítopo de Mtb que causa indução de uma resposta imune, como medidopela resposta clínica (tal como um aumento em uma população de célulasimunes, atividade citolítica contra Mtb aumentada ou redução mensurável deum sintoma de uma infecção). Moléculas terapeuticamente ativas tambémpodem ser feitas a partir de ácidos nucléicos. Exemplos de molécula tera-péuticamente ativa baseada em ácido nucléico é uma seqüência de ácidonucléico que codifica um epítopo de Mtb1 em que a seqüência de ácido nu-cléico está operativamente ligada a um elemento de controle tal como umpromotor.
Dose terapeuticamente eficaz: Uma dose suficiente para preve-nir o desenvolvimento ou para causar a regressão da doença ou que é ca-paz de aliviar sintomas causados pela doença. Em uma modalidade, umadose terapeuticamente eficaz é uma dose suficiente para prevenir o desen-volvimento ou aliviar sintomas de tuberculose.
Transduzido e Transformado: Um vírus ou vetor "transduz" umacélula quando ele transfere ácido nucléico para a célula. Uma célula é "trans-formada" pelo ácido nucléico transduzido na célula quando o DNA se tornaestavelmente replicado pela célula, tanto pela incorporação do ácido nucléi-co no genoma celular quanto por replicação epissomal. Como usado nesse,a expressão transformação abrange todas as técnicas pelas quais uma mo-lécula de ácido nucléico pode ser introduzida em tal célula, incluindo trans-fecção com vetores virais, transformação com vetores de plasmídio e intro-dução de DNA nu por eletroporação, lipofecção e aceleração de arma departículas.
Tuberculose (TB): Uma doença que é geralmente causada porMycobacterium tuberculosis que comumente infecta os pulmões. Entretanto,outras micobactérias "atípicas" tal como M. kansasii podem produzir um as-pecto clínico e patológico similares da doença.
A transmissão de M. tuberculosis ocorre por via aérea em áreasconfinadas com pouca ventilação. Em mais de 90% dos casos, após infec-ção com M. tuberculosis, o sistema imune previne o desenvolvimento de do-ença por M. tuberculosis, geralmente chamada de tuberculose ativa. Entre-tanto, nem todas as M. tuberculosis são mortas e, assim, cápsulas durasmuito pequenas são formadas. "Tuberculose primária" é a doença observadaque se desenvolve após uma infecção inicial, geralmente em crianças. Ofoco inicial de infecção é um pequeno granuloma subpleural acompanhadode infecção granulomatosa de Iinfonodos hílares. Juntos, esses constituem ocomplexo de Ghon. Em aproximadamente todos os casos, esses granulo-mas se resolvem e não há disseminação posterior da doença. "Tuberculosesecundária" é vista principalmente em adultos como uma reativação de in-fecção prévia (ou reinfecção), particularmente quando o estado de saúdedeclina. A infecção granulomatosa é muito mais florida e amplamente dis-seminada. Tipicamente, os lobos pulmonares superiores são mais afetadose pode ocorrer cavitação. A disseminação da tuberculose para fora dos pul-mões pode levar ao aparecimento de vários achados incomuns com padrõescaracterísticos que incluem tuberculose óssea, tuberculose do trato genital,tuberculose do trato urinário, tuberculose do sistema nervoso central (CNS),tuberculose gastrointestinal, tuberculose adrenal, escrófulo e tuberculosecardíaca. Tuberculose "latente" é uma infecção por Mtb em um indivíduo quepode ser detectada por um ensaio diagnóstico, tal como, mas não-limitado ateste cutâneo da tuberculina (TST) em que a infecção não produz sintomasnaquele indivíduo. Tuberculose "ativa" é uma infecção por Mtb sintomáticaem um indivíduo.
Microscopicamente, a inflamação produzida pela infecção de TBé granulomatosa, com macrófagos epitelióides e células gigantes de Lange-rhans junto com linfócitos, células plasmáticas, às vezes algumas célulaspolimorfonucleares, fibroblastos com colágeno e necrose caseosa caracte-rística no centro. A resposta inflamatória é mediada por uma reação de hi-persensibilidade tipo IV e o teste cutâneo é baseado nessa reação. Em al-guns exemplos, a tuberculose pode ser diagnosticada por um teste cutâneo,uma coloração ácida rápida, uma coloração com auramina ou uma combina-ção desses. O espécime examinado mais comum é o escarro, mas as colo-rações histológicas também podem ser realizadas em tecidos ou outros flui-dos corporais.
TB é uma complicação freqüente de infecção por HIV. Infecçãopor TB em indivíduos infectados com o vírus da imunodeficiência humana(HIV) pode disseminar de imediato e progredir rapidamente para doença ati-va. Sintomas específicos de doença pulmonar devido a infecção por Mtb in-cluem tosse crônica e escarro hemoptóico. Outros sintomas de doença porTB incluem fadiga, perda de apetite, perda de peso, febre e sudorese notur-na.
Vetor: Uma molécula de ácido nucléico como introduzida emuma célula hospedeira, produzindo dessa maneira uma célula hospedeiratransduzida ou transformada. Um vetor pode incluir seqüências de ácido nu-cléico que permitem que ele se replique na célula hospedeira, tal como umaorigem de replicação. Um vetor também pode incluir um ou mais genes rótu-los selecionáveis e outros elementos genéticos conhecidos na técnica. Veto-res incluem vetores de plasmídeo, incluindo plasmídeos para expressão emcélulas bacterianas gram negativas e gram positivas. Vetores exemplaresincluem aqueles para expressão em E. coli e Salmonella. Vetores tambémincluem vetores virais, tais como, mas não-limitados a retrovírus, ortopox,avipox, varíola aviária, capripox, suipox, adenovirus, vírus do herpes, alfavírus, baculovírus, vírus Sindbis, vírus da vacínia e vetores de poliovírus.Vetores também incluem vetores para expressão em células de levedura.
A menos que explicado de outra maneira, todos os termos técni-cos e científicos usados nesse tem o mesmo significado como comumentecompreendidos pelo versado na técnica a qual essa invenção pertence. Asexpressões no singular "um", "uma", "o" e "a" incluem referências no plural amenos que o contexto indique claramente de outra maneira. Similarmente, apalavra "ou" pretende incluir "e" a menos que o contexto indique claramentede outra maneira. Deve ser entendido ainda que todos os tamanhos de basee tamanhos de aminoácidos e todos os pesos moleculares e massas mole-culares, dados para ácidos nucléicos ou polipeptídeos, são aproximados esão fornecidos para descrição. Embora métodos e materiais similares ouequivalentes àqueles descritos nesse possam ser usados na pratica ou testedessa descrição, métodos e materiais adequados estão descritos abaixo. Aexpressão "compreende" significa "inclui". Todas as publicações, pedidos depatente, patentes e outras referências mencionadas nesse estão incorpora-das por referência em toda sua totalidade. No caso de conflito, o presentepedido, incluindo explicações das expressões, predominará. Além disso, osmateriais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem serIiniitantes.
Polipeptídeos de Mycobacterium
É descrito aqui que vários polipeptídeos de Mycobacterium po-dem ser usados para induzir uma resposta imune a Mtb1 tal como uma res-posta de célula T. Em várias modalidades, o polipeptídeo compreende ouconsiste na seqüência de aminoácido descrita como:
1. MX1SRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSG MAEATS-
LDTMX2X3MNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQASQQILS, (SEQID NO: 1, em que X1 é A ou T, X2 é T ou A e X3 é qualquer aminoácido, talcomo Q ou nenhum aminoácido)
Em vários exemplos, o polipeptídeo compreende ou consiste naseqüência de aminoácido descrita como
a. MASRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGA GWSGMAEATSLDTMTQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQASQQILS (SEQ ID NO: 2) (veja também TUBERCULIST N9 Rv1038c, dispo-nível em 1 de março de 2007, incorporado aqui por referência, conhecidocomo EsxJ, ES6_2, TB 11.0, QILSS)
b. MASRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISG AGWSGMAEATSLDTMAQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQASQQILSS (SEQ ID NO: 3, TUBERCULIST N9 Rv1197, disponível em 1 demarço de 2007, incorporado aqui por referência, também conhecido comoEsxK, ES6_3, TB11.0, QILSS)
c. MASRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATS-LDTMT+MNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQASQQILSS (SEQID NO: 4, TUBERCULIST N2 Rv 1992, disponível em 1 de março de 2007,incorporado aqui por referência, conhecido como EsxM, TB11.0, QILSS.
d. MATRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDTMAQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQASQQILSS (SEQ ID NO: 5, TUBERCULIST N9 Rv 2347c, disponível em 1de março de 2007, incorporado aqui por referência, conhecido como EsxP,ES6_7, QILSS)
e. MTSRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDTMTQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQASQQILSS (SEQ ID NO: 6, TUBERCULIST N9 Rv3620c, disponível em 1 demarço de 2007, incorporado aqui por referência, conhecido como EsxW,ES6_10, QILSS).
Em modalidades adicionais, o polipeptídeo compreende ou con-siste na seqüência de aminoácido descrita como:
2. MSYMIATPAALTAAATDIDGIGSAVSVANAAAVAATTGVLAAGGDEVLAAIARLFNANAEEYHALSAQVAAFQTLFVRTLTGGCGVFRRRRGRQCVTAAEHRAAGAGRRQRRRRSGDGQW RLRQQRHFGCGGQPEFRQHSE-HRR (SEQ ID NO: 7, TUBERCULIST NO. Rv1088, disponível em 1 de mar-ço de 2007, incorporado aqui por referência, conhecido como PE9).
3. VSLVIATPQLLATAALDLASIGSQVSAANAAAAMPTTEVVAAAADEVSAAIAGLFGAHARQYQALSVQVAAFHEQFVQALTAAAGRYASTEAAVERSLLGAVNAPTEALLGRPLIGNGADGTAPGQPGAAGGLLFGNGGNGAAGGFGQTGGSGGAAGLIGNGGNGGAGGTGAAGGAGGNGGWLWGNGGNGGVGGTSVAAGIGGAGGNGGNAGLFGHGGAGGTGGAGLAGANGVNPTPGPAASTGDSPADVSGIGDQTGGDGGTGGHGTAGTPTGGTGGDGAT ATAGSGKATGGAGGDGGTAAAGGGGGNGGDGGVAQGDIASAFGGDGGNGSDGVAAGSGGGSGGAGGGAFVHIATATSTGGSGGFGGNGAASAASGADGGAGGAGGNGGAGGLLFGDGGNGGAGGAGGIGGDGATGGPGGSGGNAGIARFDSPDPEAEPDVVGGKGGDGGKGGSGLGVGGAGGTGGAGGNGGAGGLLFGNGGNGGNAGAGGDGGAGVAGGVGGNGGGGGTATFHEDPVAGVWAVGGVGGDGGSGGSSLGVGGVGGAGGVGGKGGASGMLIGNGGNGGSGGVGGAGGVGGAGGDGGNGGSGGNASTFGDENSIGGAGGTGGNGGNGANGGNGGAGGIAGGAGGSGGFLSGAAGVSGADGIGGAGGAGGAG GAGGSGGEAGAGGLTNGPGSPGVSGTEGMAGAPG (SEQ ID NO:8, TUBERCULIST NO. Rv2487, disponível em 1 de março de 2007, incorpo-rado aqui por referência, também conhecido como PE_PGRS42)
4. MHQVDPNLTRRKGRLAALAIAAMASASLVTVAVPATANADPEPAPPVPTTAASPPSTAAAPPAPATPVAPPPPAAANTPNAQPGDPNAAPPPADPNÀPPPPVIAPNAPQPVRIDNPVGGFSFALPAGWVESDAAHFDYGSALLSKTTGDPPFPGQPPPVANDTRIVLGRLDQKLYASAEATDSKAAARLGSDMGEFYMPYPGTRINQETVSLDANGVSGSASYYEVKFSDPSKPNGQIWTGVIGSPAANAPDAGPPQRWFVVWLGTANNPVDKGAAKALAESIRPLVAPPPAPAPAPAEP APAPAPAGEVAPTPTTPTPQRTLPA (SEQ ID NO: 9, TUBERCULISTN9 Rv1860, disponível em 1 de março de 2007, incorporado aqui por refe-rência, também conhecido como Apa, modD, mpt32)
5. MLLALLRQHIRPYRRLVAMLMMLQLVSTLASLYLPTVNAAIVDDGVAKGDTATIVRLGAVMLGVTGLQVLCAIGAVYLGSRTGAGFGRDLRSAMFEHIITFSERETARFGAPTLLTRSTNDVRQILFLVQMTATVLVTAPIMCVGGIIMAIHQEAALTWLLLVSVPILAVANYWIISHMLPLFRRMQSLIDGINRVMRDQLSGVRVVRAFTREGYERDKFAQANTALSNAALSAGNWQALMLPVTTLTINASSVALIWFGGLRIDSGQMQVGSLIAFLSYFAQILMAVLMATMTLAVLPRASVCAERITEVLSTPAALGNPDNPKFPTDGVTGVVRLAGATFTYPGADCPVLQDISLTARPGTTTAIVGSTGSGKSTLVSLICRLYDVTAGAVLVDGIDVREYHTERLWSAIGLVPQRSY
LFSGTVADNLRYGGGPDQVVTEQEMWEALRVAAADGFVQTDGLQTRVAQGGVNFSGGQRQRLAIARAVIRRPAIYVFDDAFSALDVHTDAKVHASLRQVSGDATIIVVTQRISNAAQADQVIVVDNGKIVGTGTHETLLADCPTYAEFAASQSLSATVGGVG (SEQ ID NO: 10, TUBERCULIST NO. Rv1273c, disponível em1 de março de 2007, incorporado aqui por referência).
6. MSYVIAAPEMLATTAADVDGIGSAIRAASASAAGPTTGLLAAAADEVSSAAAALFSEYARECQEVLKQAAAFHGEFTRALAAAGAAYAQAEASNTAAMSGTAGSSGALGSVGMLSGNPLTALMMGGTGEPILSDRVLAIIDSAYIRPIFGPNNPVAQYTPEQWWPFIGNLSLDQSIAQGVTLLNNGINAELQNGHDVVVFGYSQSAAVATNEIRALMALPPGQAPDPSRLAFTLIGNINNPNGGVLERYVGLYLPFLDMSFNGATPPDSPYQTYMYTGQYDGYAHNPQYPLNILSDLNAFMGIRWVHNAYPFTAAEVANAVPLPTSPGYTGNTHYYMFLTQDLPLLQPIRAIPFVGTPIAELIQPDLRVLVDLGYGYGYADVPTPASLFAPINPIAVASALATGTVQGPQAALVSIGLLP
QSALPNTYPYLPSANPGLMFNFGQSSVTELSVLSGALGSVARLIPPIA (SEQID NO: 11, TUBERCULIST NO. Rv0159c, disponível em 1 de março de2CJ07, incorporado aqui por referência, também conhecido como PE3 ou PE).7. MEFPVLPPEINSVLMYSGAGSSPLLAAAAAWDGLAEELGSAAVSFGQVTSGLTAGVWQGAAAAAMAAAAAPYAGWLGSVAAAAEAVAGQARVVVGVFEAALAATVDPALVAANRARLVALAVSNLLGQNTPAIAAAEAEYELMWAADVAAMAGYHSGASAAAAALPAFSPPAQALGGGVGAFLTALFASPAKALSLNAGLGNVGNYNVGLGNVGVFNLGAGNVGGQNLGFGNAGGTNVGFGNLGNGNVGFGNSGLGAGLAGLGNIGLGNAGSSNYGFANLGVGNIGFGNTGTNNVGVGLTGNHLTGIGGLNSGTGNIGLFNSGTGNVGFFNSGTGNFGVFNSGNYNTGVGNAGTASTGLFNAGNFNTGVVNVGSYNTGSFNAGDTNTGGFNPGGVNTGWLNTGNTNTGIANSGNVNTGAFISGNFNNGVLWVGDYQGLFGVSAGSSIPAIPIGLVLNGDIGPITIQPIPILPTIPLSIHQTVNLGPLVVPDIVIPAFGGGIGIPINIGPLTITPITLFAQQTFVNQLPFPTFSLGKITIPQIQTFDSNGQLVSFIGPIVIDTTIPGPTNPQIDLTIRWDTPPITLFPNGISAPDNPLGLLVSVSISNPGFTIPGFSVPAQPLPLSIDIEGQIDGFSTPPITIDRIPLTVGGGVTIGPITIQGLHIPAAPGVGNTTTAPSSGFFNSGAGGVSGFGNVGAGSSGWWNQAPSALLGAGSGVGNVGTLGSGVLNLGSGISGFYNTSVLPFGTPAAVSGIGNLGQQLSGVSAAGTTLRSMLAGNLGLANVGNFNTGFGNVGDVNLGAANIGGHNLGLGNVGDGNLGLGNIGHGNLGFANLGLTAGAAGVGNVGFGNAGINNYGLANMGVGNIGFANTGTGNIGIGLVGDHRTGIGGLNSGIGNIGLFNSGTGNVGFFNSGTGNFGIGNSGRFNTGIGNSGTASTGLFN AGSFSTGIANTG DYNTGSFNAG DTNTGG FNPGGINTGWFNTGHANTGLANAGTFGTGAFMTGDYSNGLLWRGGYEGLVGVRVGPTISQFPVTVHAIGGVGPLHVAPVPVPAVHVEITDATVGLGPFTVPPISIPSLPIASITGSVDLAANTISPIRALDPLAGSIGLFLEPFRLSDPFITIDAFQWAGVLFLENIIVPG LTVSGQILVTPTPIPLTLNLDTTPWTLFPNG FTIPAQTPVTVG MEVANDGFTFFPGGLTFPRASAGVTGLSVGLDAFTLLPDGFTLDTVPATFDGTILIGDIPIPIIDVPAVPGFGNTTTAPSSGFFNTGGGGGSGFANVGAGTSGWWNQGHDVLAGAGSGVANAGTLSSGVLNVGS
GISGWYNTSTLGAGTPAVVSGIGNLGQQLSGFLANGTVLNRSPIVNIGWADVGAFNTGLGNVGDLNWGAANIGAQNLGLGNLGSGNVGFGNIGAGNVGFANSGPA VGLAGLGNVGLSNAGSNNWGLANLGVGNIGLANTGTGNIGIGLVGDYQTGIGGLNSGSGNIGLFNSGTGNVGFFNTGTGNFGLFNSGSFNTGIGNSgTgstglfnagnfntgianpgsyntgsfnvgdtntggfnpgdintgwfnt
gimntgtrntgalmsgtdsngmlwrgdheglfglsygitipqfpiritttggigpivipdttilpplhlqitgdadysftvpdipipaihigingvvtvgftapeatllsalknngsfisfgpitlsnidippmdftlglpvlgpitgqlgpihlepivvagigvpleiepipldaislsesipiripvdipasvidgismsevvpidasvdipa vtitgttisaiplgfdirtsagplnipiidipaapgfgnstqmpssgffntgagggsgignlgagvsgllnqagagslvgtlsglgnagtlasgvlnsgtaisglfnvstldattpavisgfsnlgdhmsgvsidgliailtfppaesvfdqiidaaiaelqhldignalalgnvggvnlglanvgefnlgagnvgninvgagnlggsnlglgnvgtg n lg fg nig ag n fg fg nag ltag ag g lg nvg lg nag s
gswglanvgvgniglantgtgnigigltgdyrtgigglnsgtgnlglfnsgtgnigffntgtgnfglfnsgsystgvgnagtastglfnagnfntglanagsyntgslnvgsfntggvnpgtvntgwfntghtntglfntgnvntgafnsgsfnngalwtgdyhglvgfsfsidiagstlldlnetlnlgpihieqidipgmslfdvheiveigpftipqvdvpaipleihesihmdpivlvpattipaqtrtipldipaspgstmtlplismrfegedwilgstaaipnfgdpfpaptqgitihtgpgpgttgelkisipgfeipqiattrflldvnisgglpaftlfaggltiptnaipltidasgaldpitifpggytidplplhlalnltvpdssipiidvpptpgfgnttatpssgffnsgaggvsgfgnvgsnlsgwwnqaasalagsgsgvlnvgtlgsgvlnvgsgvsgiyn
tsvlplgtpavlsglgnvghqlsgvsaagtalnqipilnigladvgnfnvgfgnvgdvnlgaanlgaqnlglgnvgtgnlgfanvghgnigfgnsgltagaaglgntgfgnagsanygfanqgvrniglantgtgnigiglvgdnltgigglnsgagniglfnsgtgnigffnsgtgnfgignsgsfntgignsgtgstglfnagsfntgvanagsyntgsfnagdtntggfnpgtintgwfntghtntgiansgnvgtgafmsgnfsngllwrgdheglfslfysldvpritivdahldggfgpvvlppipvpavnahltgnvamgaftipqidipaltpnitgsaafrivvgsvrippvsviveqiinasvgaemridpfemwtqgtnglgitfysfgsadgspyatg plvfgagtsd
gshltisassgafttpqletgpitlgfqvpgsvnaitlfpggltfpatsllnldvtagaggvdipaitwpeiaasadgsvyvlassiplinipptpgignstitpssgffnagagggsgfgnfgagtsgwwnqahtalagagsgfanvgtlhsgvLfôLGSGVSGIYNTSTLGVGTPALVSGLGNVGHQLSGLLSGGSAVNPVTVLNIGLANVGSHNAGFGNVGEVNLGAANLGAHNLGFGNIGAGNLGFGNIGHGNVGVGNSGLTAGVPGLGNVGLGNAGGNNWGLANVGVGNIGLANTGTGNIGIGLTGDYQTGIGGLNSGAGNLGLFNSGAGNVGFFNTGTGNFGLFNSGSFNTGVGNSGTGSTGLFNAGSFNTGVANAGSYNTGSFNVGDTNTGGFNPGSINTGWLNAGNANTGVAN
AG N VNTG AFVTG N FSNGILWRG DYQG LAG FAVG YTLPLFPAVG AD VSGGIGPITVLPPIHIPPIPVGFAAVGGIGPIAIPDISVPSIHLGLDPAVHVGSITVNPITVRTPPVLVSYSQGAVTSTSGPTSEIWVKPSFFPGIRIAPSSGGGATSTQGAY FVGPISIPSGTVTFPGFTIPLDPIDIGLPVSLTIPG FTIPGGTLIPTLPLGLALSNGIPPVDIPAIVLDRILLDLHADTTIGPINVPIAGFGGAPGFGNSTTLPSSGFFNTGAGGGSGFSNTGAGMSGLLNAMSDPLLGSASGFANFGTQLSGILNRGAGISGVYNTGALGVVTAAVVSGFGNVGQQLSGLLFTGVGP (SEQ ID NO: 12,TUBERCULIST Nq 3350c, disponível em 1 de março de 2007, incorporadoaqui por referência, também conhecido como PPE56 ou PPE.
Em uma segunda modalidade, um polipeptídeo de Mtb de usonos métodos descritos aqui tem uma seqüência pelo menos 75%, 85%,90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% homóloga à seqüência de aminoácidodescrita em uma de SEQ ID NOs: 1 a 12. Por exemplo, o polipeptídeo podeter uma seqüência de aminoácido, pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%,98% ou 99% homóloga a uma das seqüências de aminoácido descritas emSEQ ID NOs: 1 a 12. Seqüências exemplares podem ser obtidas usandoprogramas de computador que são facilmente disponíveis na internet e asseqüências de aminoácido descritas aqui. Em um exemplo, o polipeptídeoretém uma função da proteína Mtb, tal como ligação a um anticorpo que seliga especificamente ao epítopo de Mtb.
Modificações menos importantes das seqüências de aminoácidoprimárias de um polipeptídeo de Mtb pode resultar em peptídeos que têmatividade substancialmente equivalente quando comparados a um polipeptí-deo equivalente descrito aqui. Tais modificações podem ser intencionais,como por mutagênese sítio-dirigida, ou pode ser espontânea. Todos os poli-peptídeos produzidos por estas modificações estão incluídos aqui. DessafoTma, um exemplo não-limitante específico de um polipeptídeo de Mtb éuma variante conservativa do polipeptídeo de Mtb. Uma tabela de substitui-ções conservativas é fornecida aqui. Substituições da seqüência de aminoá-cidos mostradas em SEQ ID NOs: 1 a 12 podem ser feitas baseadas nestatabela.
Polipeptídeos de Mtb são descritos aqui, os quais podem serusados para induzir uma resposta imune (imunogênica). Estes peptídeosincluem ou consistem em pelo menos nove aminoácidos, tal como nove avinte aminoácidos consecutivos de um polipeptídeo de Mtb descrito acima.Exemplos não-limitantes específicos são doze, onze, dez, ou nove aminoá-cidos consecutivos de um dos polipeptídeos de Mtb descritos acima. Nessesexemplos, o polipeptídeo de Mtb não inclui as seqüências de aminoácido deextensão completa descritas como SEQ ID NOs: 1-12.
Um polipeptídeo isolado é descrito, o qual inclui nove a doze a-minoácidos consecutivos de um polipeptídeo de Mtb, em que o polipeptídeoisolado compreende a seqüência de aminoácido descrita como QTVEDE-ARRMW (SEQ ID NO: 13). Em algumas modalidades, o polipeptídeo temnove, dez ou onze aminoácidos de extensão. Em modalidades adicionais, opolipeptídeo consiste na seqüência de aminoácido descrita como SEQ IDNO: 13. Um polipeptídeo isolado é descrito, o qual inclui nove a doze amino-ácidos consecutivos de um polipeptídeo de Mtb, em que o polipeptídeo iso-lado compreende a seqüência de aminoácido descrita como VSAAIAGLF(SEQ ID NO: 14). Em algumas modalidades, o polipeptídeo tem nove, dezou onze aminoácidos de extensão. Em modalidades adicionais, o polipeptí-deo consiste na seqüência de aminoácido descrita como SEQ ID NO: 14.
Em várias modalidades, o polipeptídeo de Mtb isolado é incluídoem uma proteína de fusão. Dessa forma, a proteína de fusão pode incluir opolipeptídeo de Mtb (veja acima) e uma segunda porção heteróloga, tal co-mo uma proteína Myc, uma enzima ou um veículo (tal como uma proteínatransportadora de hepatite ou albumina bovina sérica) ligada covalentementeao polipeptídeo de Mtb. Em vários exemplos, um polipeptídeo que consisteem nove a doze aminoácidos de uma das seqüências de aminoácido descri-tas como SEQ ID NOs: 1 a 14 que se ligam a MHC classe I é ligado covalen-temente a um veículo. Em um exemplo adicional, um polipeptídeo que con-siste em uma das seqüências de aminoácido descritas em uma das SEQ IDNOs: 1 a 14 é ligado covalentemente a um veículo.
Em exemplos adicionais, o polipeptídeo pode ser uma proteínade fusão e também pode incluir seqüências heterólogas que não estão inclu-ídas em SEQ ID NO: 1). Dessa forma, em vários exemplos não-limitantesespecíficos, o peptídeo imunogênico é um polipeptídeo de fusão, por exem-plo, o polipeptídeo inclui seis resíduos de histidina seqüenciais, uma se-qüência de aminoácido de β-galactosidase, ou uma seqüência de aminoáci-do de imunoglobulina. O polipeptídeo também pode ser ligado covalente-mente a um veículo. Veículos adequados incluem, mas não são limitados àpequena proteína do envelope de hepatite B, HBsAg. Essa proteína tem acapacidade de auto-agrupar em agregados e pode formar partículas seme-lhantes a um vírus. A preparação de HBsAg é bem-conhecida, veja por e-xemplo a Publicação de Pedido de Patente Europeu Ne EP-A-O 226 846,Publicação de Pedido de Patente Europeu N- EP-A-O 299 108 e PublicaçãoPCT N9 WO 01/117554, e a seqüência de aminoácido descrita, por exemplo,em Tiollais et al., Nature, 317: 489, 1985, e Publicação de Patente EuropéiaNg EP-A-O 278 940, e Publicação PCT Nq WO 91/14703, todos os quais es-tão incorporados aqui por referência.
Em modalidades adicionais, a proteína consiste no polipeptídeode Mtb. Uma segunda porção heteróloga pode ser não-covalentemente liga-da ao polipeptídeo de Mtb. Por exemplo, um polipeptídeo que consiste emnove a doze aminoácidos consecutivos de uma das proteínas descritas co-mo uma SEQ ID NO: 1 a 14 pode ser ligada não covalentemente a um veículo.
O polipeptídeo pode opcionalmente incluir repetições de um oumais dos polipeptídeos de Mtb descritos aqui. Em um exemplo não-limitanteespecífico, os polipeptídeos incluem dois, três, quatro, cinco ou até dez repe-tições de um dos polipeptídeos de Mtb descritos acima. Alternativamente,mais de um peptídeo pode ser incluído em um polipeptídeo de fusão. Dessaforma, em vários exemplos, o polipeptídeo pode incluir pelo menos dois, pelomenos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, ou pelo menos seis dasseqüências de aminoácido descritas como SEQ ID NOs: 1 a 14. Uma se-qüência Iigante pode ser opcionalmente incluída entre os polipeptídeos deMtb.
Os polipeptídeos de Mtb descritos aqui podem ser sintetizadosquimicamente por métodos comuns, ou podem ser produzidos recombinan-temente. Um processo exemplar para produção de polipeptídeo é descritaem Lu et al., Federation of European Biochemical Societies Letters. 429:31-35, 1998. Eles também podem ser isolados por métodos que incluem croma-tografia preparativa e separações imunológicas.
Se desejado, os polipeptídeos também podem ser sintetizadosquimicamente por tecnologias em ascensão. Um de tais processos é descri-to em W. Lu et al., Federation of European Biochemical Soeieties Letters.429:31-35, 1998. Os polipeptídeos também podem ser produzidos usandotécnicas de genética molecular, tal como por inserir um ácido nucléico quecodifica Mtb ou um epítopo deste em um vetor de expressão, introduzir ovetor de expressão em uma célula hospedeira, e isolar o polipeptídeo (vejaabaixo).
Um polipeptídeo de Mtb pode ser ligado covalentemente a umveículo, que é uma macromolécula imunogênica à qual uma molécula anti-gênica pode estar ligada. Os veículos são escolhidos para aumentar a imu-nogenicidade da molécula ligada e/ou para fazer surgir altos títulos de anti-corpos contra o veículo, os quais são benéficos como diagnóstico, analitica-mente, e/ou terapeuticamente. A ligação covalente de uma molécula a umveículo pode conferir imunogenicidade aumentada e dependência de célulaT (veja Pozsgay et al., PNAS 96:5194-97, 1999; Lee et al., J. Immunol.116:1711-18, 1976; Dintzis et al., PAMS 73:3671-75, 1976). Veículos úteisincluem veículos poliméricos, que podem ser naturais (por exemplo, polissa-carídeos, polipeptídeos, ou proteínas de bactérias ou vírus), materiais semi-sintéticos ou sintéticos que contém um ou mais grupos funcionais aos quaisa porção reagente pode ser ligada. Produtos bacterianos e proteínas virais(tal como antígeno de superfície de hepatite B ou antígeno nuclear) tambémpodem ser usados como veículos, assim como proteínas de organismos su-periores tais como hemocianina de keyhole limpet, hemocianina de caran-guejo-ferradura, albuminas séricas de mamífero, e imunoglobulinas de ma-mífero. Produtos bacterianos adicionais para uso como veículos incluem pro-teínas de parede celular e outros produtos (por exemplo, paredes celularesestreptocócicas ou estafilocócicas e lipopolissacarídeo (LPS)).
Polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos de Mtb descri-tos aqui também são fornecidos. Seqüências de ácido nucléico exemplaressão descritas abaixo:
ESXJ (PROTEÍNA 2 SEMELHANTE A ESAT-6)atggcctcgcgttttatgacggatccgcacgcgatgcgggacatggcgggccgttttgaggtgcacgcccagacggtggaggacgaggctcgccggatgtgggcgtccgcgcaaaacatctcgggcgcgggctggagtggcatggccgaggcgacctcgctagacaccatgacccagatgaatcaggcgtttcgcaacatcgtgaacatgctgcacggggtgcgtgacgggctggttcgcgacgccaacaactacgaacagcaagagcaggcctcccagcagatcctcagcagctga(SEQ ID NO: 15)
ESXK (PROTEÍNA 3 SEMELHANTE A ESAT-6)
atggcctcacgttttatgacggatccgcacgcgatgcgggacatggcgggccgttttgag
gtgcacgcccagacggtggaggacgaggctcgccggatgtgggcgtccgcgcaaaacatt
tccggtgcgggctggagtggcatggccgaggcgacctcgctagacaccatggcccagatg
aatcaggcgtttcgcaacatcgtgaacatgctgcacggggtgcgtgacgggctggttcgc
gacgccaacaactacgagcagcaagagcaggcctcccagcagatcctcagcagctaa
(SEQ ID NO: 16)
ESXM (PROTEÍNA ESXM SEMELHANTE A ESAT-6)
atggcctcacgttttatgacggatccgcatgcgatgcgggacatggcgggccgttttgag
gtgcacgcccagacggtggaggacgaggctcgccggatgtgggcgtccgcgcaaaacatt
tccggtgcgggctggagtggcatggccgaggcgacctcgctagacaccatgacctagatg
aatcaggcgtttcgcaacatcgtgaacatgctgcacggggtgcgtgacgggctggttcgc
gacgccaacaactacgaacagcaagagcaggcctcccagcagatcctgagcagctag(SEQ ID NO: 17)
ESXP (PROTEÍNA 7 SEMELHANTE A ESAT-6)
atggcaacacgttttatgacggatccgcacgcgatgcgggacatggcgggccgttttgag
gtgcacgcccagacggtggaggacgaggctcgccggatgtgggcgtccgcgcaaaacatc
tcgggcgcgggctggagtggcatggccgaggcgacctcgctagacaccatggcccagatg
aatcaggcgtttcgcaacatcgtgaacatgctgcacggggtgcgtgacgggctggttcgc
gacgccaacaactacgagcagcaagagcaggcctcccagcagatcctcagcagctaa
(SEQ ID NO: 18)
ESXW (PROTEÍNA 10 SEMELHANTE A ESAT-6)
atgacctcgcgttttatgacggatccgcacgcgatgcgggacatggcgggccgttttgag
gtgcacgcccagacggtggaggacgaggctcgccggatgtgggcgtccgcgcaaaacatt
tccggcgcgggctggagtggcatggccgaggcgacctcgctagacaccatgacccagatg
aatcaggcgtttcgcaacatcgtgaacatgctgcacggggtgcgtgacgggctggttcgc
gacgccaacaactacgaacagcaagagcaggcctcccagcagatcctcagcagctga
(SEQ ID NO: 19)
PE9 (PROTEÍNA DA FAMÍLIA PE)
atgtcatacatgattgccacaccagcggcgttgacggcggcggcaacggatatcgacggg
attggctcggcggttagcgttgcgaacgccgcggcggtcgccgcgacaaccggagtgctg
gccgccggtggcgatgaagtgttggcggccatcgctaggctgttcaacgcaaacgccgag
gaatatcacgccctcagcgcgcaggtggcggcgtttcaaaccctgtttgtgcgcaccttg
actggggggtgcggagtctttcgccggcgccgaggccgccaatgcgtcacagctgcagag
catcgcgcggcaggtgcggggcgccgtcaacgccgtcgccggtcaggtgacgggcaatgg
cggctccggcaacagcggcacttcggctgcggcggccaacccgaattccgacaacacagc
Gagcatcgccgatag
(SEQ ID NO: 20)
PE_PGRS42 (PROTEÍNA DA FAMÍLIA PE-PGRS)
gtgtcgttggtgatcgcgacgccgcagctgctggcaactgcggctttggatttagegagt
attggttcgcaggtgagcgcggctaatgcggccgcggcgatgccgacgacggaagtggtggctgcggctgccgatgaagtgtcggcggcgattgcggggttgttcggggcccatgctcgg
cagtatcaggcgctcagcgtacaggtggcagcgtttcacgagcagtttgtgcaggcgttg
actgcggccgcgggtcggtatgccagcactgaggccgctgttgagcggagtctgctgggt
gcggtgaatgcgcccaccgaggcgcttttggggcgcccgttgatcggaaacggcgccgac
gggacggcacccgggcagcctggcgcggccggcgggttgctgtttggcaacggtggcaac
ggcgcggctggcgggttcggtcaaaccggcggcagcggaggcgcggccgggttgatcggc
aacggcggcaacggcggggccggtggtaccggcgcggccggcggtgccggtgggaacggg
gggtggttgtggggcaacggcggcaacggcggtgtcggcggcaccagcgtggccgcaggc
atcgggggtgcgggcggtaacggcggcaacgccgggctgttcggccatggcggcgccggt
ggtaccggcggcgccggcctcgccggggcaaacggggtcaatcccacgcccggccccgcg
gccagcaccggggacagcccggcagatgtgtccggcatcggtgatcaaaccggcggcgac
ggcggcacgggcggccatggcactgccggcacgccgaccggtggcaccggcggcgacggt
gccaccgcgacggcaggctcgggcaaggccaccggcggtgccggtggtgacggcggtacc
gccgctgccggtggcggcggcggcaacggcggcgacggcggagtcgcgcagggcgacatt
gcgagcgcctttggcggtgatggtggcaacgggtccgacggtgtagccgccggcagtggg
ggtggtagcggcggcgccggaggcggcgctttcgtacacatcgccactgccacctctacc
ggtggtagcggcggtttcggtggtaacggggctgccagtgccgcctccggcgccgacggt
ggcgcagggggagctggcggcaatggtggcgccggcgggttgctattcggtgatggcggc
aacggtggcgccggtggcgcgggtggtatcggtggtgacggcgccacgggggggcccggg
ggaagcggcggcaacgctggcatcgcgaggtttgacagcccagaccccgaggcagaaccc
gatgtggtcggcggcaagggtggtgatggcggcaagggcggcagcggccttggcgtcggc
ggcgccggcgggaccggcggcgcgggcggcaacggcggcgcGggcgggttgttgttcggc
aacggcggcaacggcggcaacgccggggccggcggggatggcggcgccggcgttgccggt
ggggttggcggtaacggcggcggtggtggcaccgcgacgtttcacgaagacccggtcgct
ggtgtctgggcggtcggtggcgtaggtggtgatggtggctccggcggcagctcgcttggt
gtcggcggggtgggcggagccggtggcgtgggtggcaagggtggcgccagcggcatgttg
atcggcaacggcggcaacggtggcagcggcggagtcggtggggccggtggagtcggcggg
gctggcggtgacggcggcaacggcggctccggtggcaacgccagtacttttggcgatgag
aactccatcggcggggccggcgggacgggcggcaacgggggcaacggcgcaaacggcggt
aacggtggcgctggcggtattgccggcggtgcgggtgggtccggagggttcctcagcggt
gccgcaggagtcagcggcgctgacggtatcggtggcgcgggcggcgcaggcggtgccggt
ggcgcgggcggtagcggcggtgaggcaggcgcggggggcctcaccaacggccccgggtcccctggcgtttccggcaccgaaggcatggccggcgcgcccggctag(SEQ ID NO: 21)
Rv1860 (PROTEÍNA DE LIGAÇÃO DE FIBRONECTINA)
atgcatcaggtggaccccaacttgacacgtcgcaagggacgattggcggcactggctatc
gcggcgatggccagcgccagcctggtgaccgttgcggtgcccgcgaccgccaacgccgat
ccggagccagcgcccccggtacccacaacggccgcctcgccgccgtcgaccgctgcagcg
ccacccgcaccggcgacacctgttgcccccccaccaccggccgccgccaacacgccgaat
gcccagccgggcgatcccaacgcagcacctccgccggccgacccgaacgcaccgccgcca
cctgtcattgccccaaacgcaccccaacctgtccggatcgacaacccggttggaggattc
agcttcgcgctgcctgctggctgggtggagtctgacgccgcccacttcgactacggttca
gcactcctcagcaaaaccaccggggacccgccatttcccggacagccgccgccggtggcc
aatgacacccgtatcgtgctcggccggctagaccaaaagctttacgccagcgccgaagcc
accgactccaaggccgcggcccggttgggctcggacatgggtgagttctatatgccctac
ccgggcacccggatcaaccaggaaaccgtctcgctcgacgccaacggggtgtctggaagc
gcgtcgtattacgaagtcaagttcagcgatccgagtaagccgaacggccagatctggacg
ggcgtaatcggctcgcccgcggcgaacgcaccggacgccgggccccctcagcgctggttt
gtggtatggctcgggaccgccaacaacccggtggacaagggcgcggccaaggcgctggcc
gaatcgatccggcctttggtcgccccgccgccggcgccggcaccggctcctgcagagccc
gctccggcgccggcgccggccggggaagtcgctcctaccccgacgacaccgacaccgcag
Cggaccttaccggcctga
(SEQ ID NO: 22)
Rv1273c (PROVÁVEL PROTEÍNA TRANSPORTADORA ABC TRANS-
MEMBRANA DE LIGAÇÃO AO ATP DE TRANSPORTE DE FÁRMACOS)
atgctcctggccctgctgcgccagcacatccgaccgtaccgccggctggtcgcgatgctg
atgatgctgcagctggtcagcaccctggcttcgctatacctcccgacggtcaacgccgca
atcgtcgacgacggcgtcgccaagggcgacaccgccaccatcgtacggctgggtgcggtg
atgcttggggtgaccggattgcaggtgctgtgcgcgatcggggcggtctatctgggctcc
cggaccggggcgggtttcggccgtgacctgcgctcggcaatgttcgaacacatcatcacc
ttctcggaacgcgagaccgcccgattcggcgctccgacgttgttgacccgcagcaccaac
gacgtccggcagatcctgttcctggtccagatgaccgccaccgtgctggtcaccgcaccgatcatgtgcgtcggcggaatcatcatggccatccaccaggaggccgcgctgacatggctg
ctgctggtcagcgttccgattctggccgtagcaaactactggatcatctcccacatgctg
ccgctcttccgccgcatgcagagcctgatcgacggcatcaaccgggtgatgcgcgatcag
ctgtccggggtgcgagtggtccgcgccttcacccgcgaaggctatgaacgcgacaagttc
gcgcaggccaatacggcgctgtcgaatgccgcactgagcgccggcaactggcaagcactg
atgctgccggtgaccacgctgaccatcaacgcatccagcgtcgcactgatctggttcggt
gggctacgcatcgacagcggccagatgcaggtcggctccctgatcgccttcctgtcctac
ttcgcccagatcctgatggcggtgttgatggcgaccatgacgctggccgtgctgccacga
gcgtcggtctgcgccgaacgcatcaccgaggtgctttccacgcccgccgcactcggtaac
cccgacaatcccaagttcccgacggacggggtcacgggcgtagtgcgcttggctggcgca
acctttacctatcctggcgccgactgcccggtgctgcaggacatttcgttgactgcgcgg
cccggtaccaccaccgcgatcgtcggcagtaccggttcgggcaagtcgacactggtgtcg
ttgatctgccggctctacgacgtcaccgctggcgcggtcttggttgacggtatcgacgtc
cgcgagtaccacaccgagcggctctggtcagcgatcgggctggtgccccagcgcagctac
ctcttctccggaaccgtcgcggacaacctgcgctacggcgggggcccagaccaggtagtc
accgagcaggagatgtgggaggcgctgcgggtcgccgcggccgacggctttgtacaaaca
gacgggctgcagacgcgtgtcgcccaaggtggtgtcaacttctccggcgggcagcgccaa
cggctggcgatagcccgagcggtcatccgacgtccggccatctatgtgttcgacgacgcg
ttctccgcacttgacgtgcacaccgacgccaaagtccacgcatcgctgcgacaggtatct
ggtgatgcaaccatcattgttgttacacaacggatttcgaatgccgctcaggccgaccag
gtcatcgttgtcgataacggtaagatcgtcggcacgggcacccacgaaacgctgctggcc
gattgccccacctatgccgaattcgccgcctcacaatcgctgagcgccacggtcgggggt
Gtagggtga
(SEQ ID NO: 23)
RvO 159c (PROTEÍNA DA FAMÍLIA PE)
atgtcctacgtcatcgcggccccggagatgttggcaacgacggccgcggacgtggacggg
atcggttcggcgatacgagcggccagcgcgtccgctgcgggtccaacgaccggactgctg
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gctgccgccggggccgcctatgcccaggctgaagccagcaacaccgctgctatgtcgggc
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(SEQ ID NO: 24)
Rv3350c (PROTEÍNA DA FAMÍLIA PPE)
atggagtttccggtgttgccaccggaaatcaactccgtgctgatgtattcgggtgcgggg
tcgagcccgttgctggcggcggccgcggcgtgggatgggctggctgaggagttggggtcg
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gggcccatctccatcccctccggcacggtgaccttcccgggattcaccatccccctcgac
ccgatcgacatcggcctgccggtgtcgctgaccatcccggggttcaccatcccgggcggc
accctgatccccaccctcccgctgggcctcgcgttgtccaatggcatcccgcccgtcgac
atcccggccatcgttctcgaccggatcttgctggacctgcacgccgacaccactatcggc
ccgatcaacgtcccgatcgccgggttcggcggggcgccgggtttcgggaactcgaccacg
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ggcttcgccaacttcggcacccagctctccggcatcctcaaccgcggcgccggcatctcg
ggcgtgtacaacaccggcgcgctgggtgttgtcaccgcggccgtcgtctcgggtttcggc
aacgtcggccagcaactgtcgggcttgctcttcaccggcgtcgggccctaa
(SEQ ID NO: 25)
Esses polinucleotídeos incluem seqüências de DNA, cDNA eRNA que codificam o polipeptídeo de interesse. Mutações silenciosas naseqüência codificante resultam da degeneração (isto é, redundância) do có-digo genético, pela qual mais de um códon pode codificar o mesmo resíduode aminoácido. Dessa forma, por exemplo, Ieucina pode ser codificada porCTT, CTC, CTA, CTG, TTA, ou TTG; serina pode ser codificada por AAT ouAAC; ácido aspártico pode ser codificado por GAT ou GAC; cisteína podeser codificada por TGT ou TGC; alanina pode ser codificada por GCT, GCC,GCA, ou GCG; glutamina pode ser codificada por CAA ou CAG; tirosina po-de ser codificada por TAT ou TAC; e isoleucina pode ser codificada por ATT,ATC, ou ATA. As tabelas que mostram o código genético padrão podem serencontradas em várias fontes (por exemplo, L. Stryer, 1988, Biochemistry, 3-Edição, W.H. 5 Freeman and Co., NY).
Um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de Mtb pode serclonado ou amplificado por métodos in vitro, tal como a reação em cadeia dapolimerase (PCR), a reação em cadeia da Iigase (LCR), o sistema de ampli-ficação baseado em transcrição (TAS), o sistema de replicação de seqüên-cia auto-sustentado (3SR) e o sistema de amplificação de replicase Οβ (QB).
Por exemplo, um polinucleotídeo um polinucleotídeo que codifica a proteínapode ser isolado por reação em cadeia da polimerase de cDNA usando inici-adores baseados na seqüência de DNA da molécula. Uma grande variedadede metodologias de clonagem e amplificação in vitro é bem-conhecida dosversados na técnica. Métodos de PCR são descritos, por exemplo, na Paten-te U.S. N2 4.683.195; Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. BioL51:263, 1987; e Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989).Polinucleotídeos também podem ser isolados por pesquisa de bibliotecasgenômicas ou de cDNA com sondas selecionadas a partir das seqüênciasdo polinucleotídeo desejado sob condições estringentes de hibridização.
Os polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo de Mtb inclu-em um DNA recombinante que é incorporado em um vetor, em um plasmí-deo ou vírus de replicação autônoma, ou dentro de DNA genômico de umprocarioto ou eucarioto, ou que existe como uma molécula separada (tal co-mo um cDNA) independente de outras seqüências. Os nucleotídeos da in-venção podem ser ribonucleotídeos, desoxirribonucleotídeos, ou formas mo·dificadas de qualquer um dos dois nucleotídeos. O termo inclui formas úni-cas e duplas de DNA.
Em uma modalidade, os vetores são usados para expressão emlevedura, tal como S. cerevisiae ou Kluyveromyces lactis. Vários promotoressão conhecidos por terem uso em sistemas de expressão de levedura taiscomo os promotores constitutivos H+-ATPase da membrana plasmática(PMA1), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GPD), fosfoglicerato quina-se-1 (PGK1), álcool desidrogenase-1 (ADH1), e bomba de resistência a múl-tiplos fármacos (PDR5). Além disso, promotores induzíveis podem ter uso,tais como GAL1-10 (induzido por galactose), PH05 (induzido por nível baixode fosfato inorgânico extracelular), e elementos de choque térmico em tan-dem HSE (induzidos por elevação da temperatura para 37°C). Promotoresque direcionam expressão variável em resposta a um indutor titulável inclu-em promotores de MET3 e MET25 que respondem à metionina e promotoresCUP1 dependentes de cálcio. Qualquer um desses promotores pode serclonado em plasmídeos de múltiplas cópias (2μ) ou de cópia única (CEN)para gerar um nível adicional de controle no nível da expressão. Os plasmí-deos podem incluir rótulos nutricionais (tais como URA3, ADE3, HIS1, e ou-tros) para seleção em levedura e resistência a antibióticos (AMP) para pro-pagação em bactérias. Plasmídeos para expressão em K. Iactis são conhe-cidos, tal como pKLACI. Dessa forma, em um exemplo, após amplificaçãoem bactérias, os plasmídeos podem ser introduzidos nos auxotrofos de Ie-vedura correspondentes por métodos similares para transformação bacteria-na.
Os polipeptídeos de Mtb podem ser expressos em uma varieda-de de cepas de levedura. Por exemplo, sete veículos de resistência a múlti-plos fármacos YOR1, SNQ2, PDR5, YCF1, PDR10, PDR11, e PDR15, juntocom seus fatores de transcrição ativadores, PDR1 e PDR3, foram deletadossimultaneamente em células hospedeiras de levedura, tornando a cepa re-sultante sensível a fármacos. Cepas de levedura com composição de lipí-deos da membrana plasmática alterada, tal como o mutante erg6 com defei-to na biossíntese de ergosterol, também podem ser utilizadas. Proteínas quesão altamente sensíveis à proteólise podem ser expressas em uma leveduraque não tem a endopeptidase vacuolar principal Pep4, que controla a ativa-ção de outras hidrolases vacuolares. A expressão heteróloga em cepas quecarregam alelos sensíveis a temperatura (ts) de genes pode ser empregadase o mutante null correspondente não for viável.
Vetores virais também podem ser preparados, os quais codifi-cam os polipeptídeos de Mtb descritos aqui. Vários vetores virais foramconstruídos, incluindo polioma, SV40 (Madzak et a!., 1992, J. Gen. Virol.,73:15331536), adenovírus (Berkner, 1992, Cur. Top. Microbiol. Immunol.,158:39-6; Berliner et al., 1988, Bio Techniques, 6:616-629; Gorziglia et al.,1992, J. Virol., 66:4407-4412; Quantin et al., 1992, Proc. Nad. Acad. Sei.USA, 89:2581-2584; Rosenfeld et al., 1992, Cell1 68:143-155; Wilkinson etal., 1992, Nucl. Acids Res., 20:2233-2239; Stratford-Perricaudetetal., 1990,Hum. Gene Ther., 1:241-256), vírus da vacínia (Mackett et al., 1992, Biote-chnology, 24:495-499), vírus adeno-associado (Muzyczka, 1992, Curr. Top.Microbiol. Immunol., 158:91-123; On et al., 1990, Gene, 89:279-282), herpesvírus incluindo HSV e EBV (Margolskee, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immu-nol., 158:67-90; Johnson et al., 1992, J. Virol., 66:29522965; Fink et al.,1992, Hum. Gene Ther. 3:11-19; Breakfield et al., 1987, Mol. Neurobiol.,1:337-371; Fresse et al., 1990, Biochem. Pharmacol., 40:2189-2199), vírusSindbis (H. Herweijer et al., 1995, Human Gene Therapy 6:1161-1167; Pa-tente U.S. Ne 5.091.309 e Patente U.S. Ns 5.2217.879), alfavírus (S. Schle-singer, 1993, Trends Biotechnol. 11:18-22; I. Frolov et al., 1996, Proc. Natl.Acad. Sei. USA 93:11371-11377) e retrovírus de ave (Brandyopadhyay et al.,1984, Mol. Cell Biol., 4:749-754; Petropouplos et al., 1992, J. Virol., 66:3391-3397), de murino (Miller, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:1-24; Mil-Ier et al., 1985, Mol. Cell Biol., 5:431-437; Sorge et al., 1984, Mol. Cell Biol.,4:1730-1737; Mann et al., 1985, J. Virol., 54:401-407), e de origem humana(Page et al., 1990, J. Virol., 64:5370-5276; Buchschalcher et al., 1992, J. Vi-rol., 66:2731-2739). Vetores de baculovírus (vírus da poliedrose multinuclearde Autographa californica; AeMNPV) também são conhecidos na técnica, epodem ser obtidos de fontes comerciais (tal como PharMingen, San Diego,Califórnia; Protein Sciences Corp., Meriden, Conn.; Stratagene, La Jolla, Ca-lifórnia).
Dessa forma em uma modalidade, o polinucleotídeo que codificaum polipeptídeo de Mtb está incluído em um vetor viral. Vetores adequadosincluem vetores de retrovírus, vetores de orthopox, vetores de avipox, veto-res de fowlpox, vetores de capripox, vetores de suipox, vetores adenovirais,vetores de herpes vírus, vetores de alfa vírus , vetores de baculovírus, veto-res de vírus Sindbis, vetores de vírus da vacínia e vetores de poliovírus. Ve-tores exemplares específicos são vetores poxvírus tais como vírus da vací-nia, vírus fowlpox e um vírus da vacínia altamente atenuado (MVA adenoví-rus, baculovírus e semelhantes.
Poxvírus exemplares na prática dos presentes métodos incluemorhtopox, suipox, avipox, e capripox vírus. Orthopox inclui vacínia, ectromeli-a, e raccoon pox. Um exemplo de um orthopox de uso é vacínia. Avipox in-clui fowlpox, canarypox e pigeon pox. Capripox inclui goatpox e sheeppox.Em um exemplo, o suipox é swinepox. Exemplos de vetores pox virais paraexpressão como descrito, por exemplo, na Patente U.S. Nq 6.165.460, queestá incorporada aqui por referência. Outros vetores virais que podem serusados incluem outros vírus de DNA tal como herpes vírus e adenovírus, evírus de RNA tal como retrovírus e pólio.
Em alguns casos, vetores virais de vacínia podem criar uma for-te resposta de anticorpos. Dessa forma, embora sejam possíveis vários re-forços com vetores de vacínia, seu uso repetido pode não ser útil em certoscasos. Entretanto, esse problema de sensibilidade pode ser minimizado porusar pox vírus de gêneros diferentes para os reforços. Em um exemplo,quando o primeiro, ou inicial, vetor de pox vírus é vacínia, o segundo, e ossubseqüentes, vetores de pox vírus são selecionados a partir dos pox vírusde um gênero diferente tal suipox, avipox, capripox ou um orthopox imuno-genicamente distinto da vacínia.
O genoma do vírus da vacínia é conhecido na técnica. Ele écomposto de uma região HIND F13L, uma região TK e uma região HA. Ovírus da vacínia recombinante tem sido usado para incorporar um gene exó-geno para expressão do produto do gene exógeno (veja, por exemplo, Per-kus et al. Science 229:981-984, 1985; Kaufman et al. Int. J. Câncer 48:900-907, 1991; Moss Science 252:1662, 1991). Um gene que codifica um antí-geno de interesse, tal como um polipeptídeo de Mtb imunogênico, pode serincorporado na região HIND F13L ou alternativamente incorporado na regiãoTK de um vetor de vírus da vacínia (ou outras regiões não-essenciais do ge-noma do vírus da vacínia. Baxby e Paoletti (Vaccine 10:8-9, 1992) descre-vem a construção e uso do pox vírus não-replicativo como um vetor, incluin-do Canarypox vírus, Fowlpox virus e outras espécies de vírus de ave. Suttere Moss (Proc. Natl Acad. Sci U.S.A. 89:10847-10851, 1992) e Sutter et al.(Virology 1994) descrevem a construção e uso do vírus Ankara não-replicativo recombinante como um vetor (MVA, vacínia Ankara modificado)na construção e uso de um vetor.Vetores adequados são descritos, por exemplo, na Patente U.S.Nq 6.998.252, que está incorporada aqui por referência. Em um exemplo, umpoxvírus recombinante tal como o vírus das vacínia recombinante é modifi-cado sinteticamente pela inserção de um gene quimérico contendo seqüên-cias regulatórias de vacínia ou seqüências de DNA funcionalmente equiva-lentes a estas, as quais, na natureza não são contíguas com as seqüênciasde DNA de vacínia regulatórias flanqueadoras que codificam um polipeptí-deo de Mtb. O vírus recombinante que contém tal gene quimérico é eficazem expressar o polipeptídeo de Mtb. Em um exemplo, o vetor viral de vací-nia compreende (A) um segmento compreendido de (i) uma primeira se-qüência de DNA que codifica um polipeptídeo de Mtb e (ii) um promotor depoxvírus, em que o promotor de poxvírus é adjacente a, e exerce controletranscricional sobre, a seqüência de DNA que codifica um polipeptídeo deMtb; e, flanqueando o dito segmento, (B) DNA de uma região não essencialde um genoma de poxvírus. O vetor viral pode codificar um rótulo selecioná-vel. Em um exemplo, o poxvírus inclui, por exemplo, um gene de timidinaquinase (veja a Patente U.S. Nq 6.998.252, que está incorporada aqui porreferência).
Vetores virais, tais como vetores poxvirais, que codificam umpolipeptídeo de Mtb incluem pelo menos um elemento de controle de ex-pressão operativamente ligado à seqüência de ácido nucléico que codifica opolipeptídeo de Mtb. Os elementos de controle de expressão são inseridosno vetor viral para controlar e regular a expressão da seqüência de ácidonucléico. Exemplos de elementos de controle de expressão de uso nessesvetores incluem, mas não são limitados a, sistema lac, regiões operadoras epromotoras de fago lambda, promotores de levedura, e promotores deriva-dos de polioma, adenovírus, retrovírus ou SV40. Elementos operacionaisadicionais incluem, mas não são limitados a, seqüência líder, códons determinação, sinais de poliadenilação e qualquer outra seqüência necessáriapara a transcrição apropriada e subseqüente tradução da seqüência de áci-do nucléico que codifica o polipeptídeo de Mtb no sistema hospedeiro. Ovetor de expressão pode conter elementos adicionais necessários para atransferência e subseqüente replicação do vetor de expressão contendo aseqüência de ácido nucléico no sistema hospedeiro. Exemplos de tais ele-mentos incluem, mas não são limitados a origens de replicação e rótulosselecionáveis. Será ainda compreendido por um versado na técnica que taisvetores são facilmente construídos usando métodos convencionais (Ausubelet al., (1987) em "Current Protocols in Molecular Biology," John Wiley andSons, Nova Iorque, N.Y.) e estão disponíveis comercialmente.
Técnicas básicas para preparar vírus de DNA recombinantescontendo uma seqüência de DNA heteróloga que codifica um ou mais poli-peptídeos de Mtb são conhecidas. Tais técnicas envolvem, por exemplo,recombinação homóloga entre as seqüências de DNA viral que flanqueiam aseqüência de DNA em um plasmídeo doador e seqüências homólogas pre-sentes no vírus de origem (Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sei. USA79:7415-7419). Em particular, vetores virais recombinantes tal como um ve-tor poxviral, podem ser usados na liberação do gene. O vetor pode ser cons-truído, por exemplo, por etapas conhecidas na técnica, tais como etapas a-nálogas aos métodos para criar recombinantes sintéticos do vírus fowlpoxdescrito na Patente U.S. Ne 5.093.258, incorporada aqui por referência. Ou-tras técnicas envolvem usar um único sítio de endonuclease de restrição queestá presente naturalmente ou é inserido artificialmente no vetor viral de ori-gem para inserir o DNA heterólogo.
Geralmente, um vetor doador de DNA contém os seguintes ele-mentos: (i) uma origem procariótica de replicação, para que o vetor possaser amplificado em um hospedeiro procariótico; (ii) um gene que codifica umrótulo que permite a seleção de células hospedeiras procarióticas contendoo vetor (por exemplo, um gene que codifica resistência a antibiótico); (iii) pe-lo menos uma seqüência de DNA que codifica um ou mais polipeptídeos deMtb localizados adjacentes a um promotor transcricional capaz de dirigir aexpressão da seqüência; e (iv) seqüências de DNA homólogas à região dogenoma do vírus de origem onde o(s) gene(s) estranho(s) será(ao) inseri-do^), flanqueando o construto do elemento (iii). Métodos para construirplasmídeos doadores para a introdução de múltiplos genes estranhos empox vírus são descritos na Publicação PCT N2 WO 91/19803, incorporadaaqui por referência.
Geralmente, fragmentos de DNA para construção do vetor doa-dor, incluindo fragmentos que contêm promotores transcricionais e fragmen-tos que contêm seqüências homólogas à região do genoma do vírus de ori-gem dentro do qual as seqüências de DNA estranho devem ser inseridas,podem ser obtidos de fragmentos de DNA genômico ou DNA clonado. Osplasmídeos doadores podem ser mono-, bi- ou multivalentes (isto é, podemconter uma ou mais seqüências de DNA estranho inseridas). O vetor doadorpode conter um gene adicional que codifica um rótulo que permitirá identifi-car vírus contendo DNA estranho inserido. Vários tipos de genes rótulos po-dem ser usados para permitir a identificação e isolamento de vírus recombi-nantes. Estes incluem genes que codificam resistência a antibióticos ouquímicos (veja por exemplo, Spyropoulos et al., 1988, J. Virol. 62:1046;Falkner & Moss, 1988, J. Virol. 62:1849; Franke et al., 1985, Mol. Cell. Biol.5:1918), assim como genes tais como o gene de IacZ de E. coli, que permitea identificação de placas virais recombinantes por ensaio colorimétrico. (Pa-nicali et al., 1986, Gene 47:193-199).
A seqüência gênica de DNA a ser inserida no vírus pode ser co-locada em um plasmídeo doador, tal como um construto de plasmídeo de E.coli ou Salmonella, dentro do qual DNA homólogo a uma porção do DNA talcomo aquela do local de inserção do pox vírus onde o DNA deve ser inseridoé ligado a um promotor. A ligação promotor-gene é posicionada no construtode plasmídeo tal que a ligação promotor-gene seja fIanqueada em ambas asextremidades por DNA homólogo a uma seqüência de DNA que flanqueiauma região de DNA de pox que é a região de inserção desejada com umvetor viral de pox de origem, um promotor de pox é usado. O construto deplasmídeo resultante é então amplificado por crescimento dentro de bacté-rias E. coli e isolado. A seguir, o plasmídeo isolado contendo a seqüênciagênica de DNA a ser inserida é transfectado para uma cultura de células, porexemplo fibroblastos de embrião de galinha, junto com o vírus precursor, porexemplo, pox vírus. A recombinação entre DNA de pox homólogo no plasmí-deo e o genoma viral resulta respectivamente em um poxvírus recombinantemodificado pela presença do construto promotor-gene no seu genoma, emum local que não afeta a viabilidade do vírus.
Como observado acima, a seqüência de DNA é inserida em umaregião (região de inserção) no vírus que não afeta a viabilidade viral do vírusrecombinante resultante. Um versado na técnica pode identificar facilmentetais regiões em um vírus, por exemplo, por testar aleatoriamente segmentosde DNA de vírus para regiões que permitem formação recombinante semafetar seriamente a viabilidade viral do recombinante. Uma região que podeser facilmente usada e está presente em vários vírus é o gene de timidinaquinase (TK). O gene TK foi encontrado em todos os genomas de pox vírusexaminados, incluindo Ieporipoxvirus (Upton et al., 1986, J. Virology 60:920);shope fibromavírus; capripoxvírus (Gershon et al., 1989, J. Gen. Virol.70:525) Kenya sheep-1; ortopoxvírus (Weir et al., 1983, J. Virol. 46:530) va-cínia (Esposito et al., 1984, Virology 135:561); monkeypox e vírus da varíola(Hruby et al., 1983, PNAS 80:3411) vacínia (Kilpatrick et al., 1985, Virology143:399); vírus do tumor de macaco de Yaba; avipoxvírus (Binns et al.,1988, J. Gen. Virol. 69:1275); fowipox; (Boyle et al., 1987, Virology 156:355);fowlpox (Schnitzlein et al., 1988, J. Virological Methods 20:341); fowipox,quailpox; entomopox (Lytvyn et al., 1992, J. Gen. Virol. 73:3235-3240). Emvacínia, além da região TK, outras regiões de inserção incluem, por exem-plo, o fragmento M de HindllI. Em fowipox, além da região TK, outras regiõesde inserção incluem, por exemplo, o fragmento J de BamHI (Jenkins et al.,1991, AIDS Research and Human Retroviruses 7:991-998) o fragmento deEcoRI-HindIII, fragmento de EcoRV-HindIII, fragmento de BamHI e o frag-mento de Hindlll descrito no Pedido N2 0 308220 A1 (veja também Calvert etal., 1993, J. Virol. 67:3069-3076; Taylor et al., 1988, Vaccine 6:497-503;Spehner et al., 1990; Boursnell et al., 1990, J. Gen. Virol. 71:621-628).
Em swinepox, sítios de inserção incluem a região de timidinaquinase. Além da necessidade de que o gene seja inserido em uma regiãode inserção, a expressão bem sucedida do gene inserido pelo pox vírus mo-dificado requer a presença de um promotor operativamente ligado ao genedesejado. Geralmente, o promotor é colocado tal que ele esteja localizado amontante do gene a ser expresso. Promotores são bem-conhecidos na téc-nica e podem ser facilmente selecionados dependendo do hospedeiro e dotipo celular que se deseja atingir. Em um exemplo, em poxvírus, promotorespoxvirais são usados; tais como os promotores de vacínia de 7,5 K, 40 K oufowlpox tais como FPV C1A. elementos intensificadores também podem serusados em cominação para aumentar o nível de expressão. Além disso,promotores induzíveis podem ser utilizados.
Recombinação homóloga entre DNA de plasmídeo doador eDNA viral em uma célula infectada pode resultar na formação de vírus re-combinantes que incorporam os elementos desejados. Células hospedeirasapropriadas para recombinação in vivo são geralmente células eucarióticasque podem ser infectadas pelo vírus e transfectadas pelo vetor de plasmí-deo. Exemplos de tais células adequadas para uso com um pox vírus sãofibroblastos de embrião de galinha, células HuTKI 43 (humanas), e célulasCV-1 e BSC-40 (ambas de rim de macaco). A infecção de células com poxvírus e transfecção dessas células com vetores plasmidiais é obtida por me-todologias usuais na técnica, (veja Pat. U.S. Nq 4,603,112 e Publicação PCTNq WO 89/03429).
Após recombinação in vivo, a progênie viral recombinante podeser identificada por uma de várias técnicas. Por exemplo, se o vetor doadorde DNA for desenhado para inserir genes estranhos no gene de timidinaquinase (TK) do vírus precursor, vírus contendo DNA integrado serão TK- epodem ser selecionados com base nisso (Mackett et al., 1982, Proc. Natl.Acad. Sei. USA 79:7415). Alternativamente, co-integração de um gene quecodifica um rótulo ou gene indicador com o(s) gene(s) estranho(s) de inte-resse, como descrito acima, pode ser usada para identificar a progênie re-combinante. Um exemplo não-limitante específico de um gene indicador é ogene de IacZ de E. coli. Vírus recombinantes que expressam beta-galactosidase podem ser selecionados usando um substrato cromogênicopara a enzima (Panicali et al., 1986, Gene 47:193). Uma vez que um vírusrecombinante foi identificado, vários métodos bem-conhecidos podem serusados para testar a expressão da seqüência de Mtb codificada pelo frag-mento de DNA inserido. Estes métodos incluem ensaio de placa preta (umimunoensaio enzimático in situ realizado em placas virais), análise de Wes-tern blot, radioimunoprecipitação (RIPA), e imunoensaio enzimático (EIA).
A descrição abrande um vírus recombinante que compreendemais do que um antígeno de interesse para o propósito de ter uma vacinamultivalente. Por exemplo, o vírus recombinante pode compreender o geno-ma do vírus ou porções deste, a seqüência de ácido nucléico que codifica opolipeptídeo de Mtb e uma seqüência de ácido nucléico que codifica um an-tígeno de superfície de hepatite B ou qualquer outra proteína transportadora.
Em uma modalidade, é fornecida uma composição que inclui umvírus recombinante que compreende um genoma do vírus da vacínia ou por-ções deste, a seqüência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo deMtb e um vírus recombinante que compreende a seqüência de ácido nucléi-co que codifica a molécula imunoestimulatória. Esta descrição também a-brange um vírus recombinante que compreende o polipeptídeo de Mtb que éadministrado com um segundo vírus recombinante que compreende o ge-noma do vírus ou uma porção deste, e uma ou mais seqüências de ácidonucléico que codificam uma ou mais moléculas B7, tais como um vírus davacínia recombinante que expressa B7-1 e/ou B7-2.
Desta forma, em um exemplo, é descrito um vírus recombinanteque é um vírus da vacínia recombinante que contém B7-1 e um vírus da va-cínia recombinante que B7-2 (designados rV-B7-1 e rV-B7-2, respectivamen-te); a composição pode incluir rV-B7-1 e/ou rV-B7-2 em combinação com umpolipeptídeo de Mtb imunogênico.
A molécula B7 inclui, mas não é limitada a B7-1, B7-2 e análo-gos destas. O gene B7 pode ser clonado a partir de fontes de mamífero, in-cluindo mas não-limitadas a tecidos de mamíferos, bibliotecas genômicas oubibliotecas de cDNA, tais como fontes murinas ou humanas. Sem estar pre-so pela teoria, acredita-se que moléculas co-estimulatórias da família B7(particularmente B7-1, B7-2, e possivelmente B7.3) sejam membros da su-perfamília de genes da imunoglobulina. Essas moléculas estão presentesem macrófagos, células dendríticas, monócitos (células apresentadoras deantígeno (APCs)). Amplificação significativa da resposta imune contra umdado antígeno geralmente não ocorre sem co-estimulação (June et al. (Im-munology Today 15:321-331, 1994); Chen et al. (Immunology Today 14:483-486); Townsend et al. (Science 259:368-370)). Freeman et al. (J. Immunol.143:2714-2722, 1989) relatam clonagem e seqüenciamento do gene B7-1.Azuma et al. (Nature 366:76-79, 1993) relatam clonagem e seqüenciamentodo gene B7-2. Dessa forma, em uma modalidade, o gene B7-1 ou o geneB7-2 são administrados em conjunto com o polipeptídeo de Mtb. A inserçãodos ácidos nucléicos que codificam B7-1 e B7-2 em vírus da vacínia foi des-crita (veja, por exemplo, Patente U.S. Ng 6.893.869, incorporada aqui porreferência; essa Patente U.S. também descreve o uso de um ácido nucléicoque codifica IL-2 em um vírus de vacínia). Vários vetores incluindo IL-2, B7-1e B7-2 foram depositados com a American Type Culture Collection (ATCC)em 3 de outubro de 1994, sob os termos do tratado de Budapeste (por e-xemplo, rV-CEA/nIL-2 (Designação ATCC, VR 2480), rV-mB7-2 (DesignaçãoATCC, VR 2482); e rV-mB7-1 (Designação ATCC, VR 2483)).
Seqüências de DNA que codificam um polipeptídeo de Mtb po-dem ser expressas in vitro por transferência de DNA em uma célula hospe-deira adequada. A célula pode ser procariótica ou eucariótica. O termo tam-bém inclui qualquer progênie da célula hospedeira do indivíduo. Entende-seque toda a progênie pode não ser idêntica à célula precursora já que podemocorrer mutações durante a replicação. Métodos de transferência estável,significando que o DNA estranho é continuamente mantido no hospedeiro,são conhecidos na técnica.
Como observado acima, uma seqüência de polinucleotídeo quecodifica um polipeptídeo de Mtb pode ser operativamente ligada a seqüên-cias de controle de expressão. Uma seqüência de controle de expressãooperativamente ligada a uma seqüência codificante é ligada tal que a ex-pressão da seqüência codificante é obtida sob condições compatíveis comas seqüências de controle de expressão. As seqüências de controle de ex-pressão incluem, mas não são limitadas a, promotores apropriados, intensifi-cadores, terminadores de transcrição, um códon de início (isto é, ATG) nafrente de um gene codificante de proteína, sinais de "splicing" para íntrons,manutenção da fase de leitura correta daquele gene para permitir traduçãoapropriada de mRNA, e códons de parada.
As células hospedeiras podem incluir células hospedeiras micro-bianas, de levedura, e de mamífero. Métodos de expressar seqüências deDNA que têm seqüências eucarióticas ou virais em procariotos são bem-conhecidos na técnica. Exemplos não-limitantes de células hospedeiras a-dequadas incluem células de bactérias, arquea, insetos, fungos (por exem-pio, levedura), micobactérias (tais como M. smegmatis), plantas, e animais(por exemplo, células de mamífero, tais como humanas). Células exempla-res de uso incluem Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevi-siae, Salmonella typhimürium, células SF9, células C129, células 293, Neu-rospora, e linhagens celulares mielóides e linfóides de mamífero imortaliza-das. Técnicas para a propagação de células de mamíferos em cultura sãobem-conhecidas (veja, Jakoby & Pastan (eds), 1979, Cell Culture. Methodsin Enzymology1 volume 58, Academic Press, Inc., Harcourt Brace Jovanovi-ch, N.Y.). Exemplos de linhagens celulares hospedeiras de mamífero comu-mente usadas são células VERO e HeLa, células CHO1 e linhagens celula-res WI38, BHK, e COS, embora possam ser usadas linhagens celulares, taiscomo células planejadas para fornecer padrões de glicosilação desejáveisde maior expressão, ou outras características. Como discutido acima, técni-cas para a transformação de células de levedura, tal como transformaçãocom polietileno glicol, transformação de protoplasto, e armas gênicas tam-bém são conhecidas na técnica (veja Gietz & Woods Methods in Enzymo-logy 350: 87-96, 2002).
Transformação de uma célula hospedeira com DNA recombinan-te pode ser obtida por técnicas convencionais bem-conhecidas daquelesversados na técnica. Quando o hospedeiro é procariótico, tal como, masnão-limitado a, E. coli, células competentes, que são capazes de absorverDNA, podem ser preparadas a partir de células colhidas após fase de cres-cimento exponencial e subseqüentemente tratadas pelo método de CaCbusando procedimentos bem-conhecidos na técnica. Alternativamente, MgCI2ou RbCI podem ser usados. A transformação também pode ser realizadaapós formar um protoplasto da célula hospedeira se desejado, ou por eletro-poração.
Quando a célula hospedeira é um eucarioto, tais métodos detransfecção de DNA como co-precipitados de fosfato de cálcio, procedimen-tos mecânicos convencionais tais como microinjeção, eletroporação, inser-ção de um plasmídeo encerrado em lipossomos, ou vetores virais podem serusados. Células eucarióticas também podem ser co-transformadas com se-qüências de polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo de Mtb, e umasegunda molécula de DNA estranho que codifica um fenótipo selecionável,tal como o gene da timidina quinase de herpes simples. Outro método é usarum vetor viral eucariótico, tal como vírus símio 40 (SV40) ou vírus do papi-loma bovino para infectar transitoriamente ou transformar células eucarióti-cas e expressar a proteína (veja por exemplo, Eukaryotic Viral Vectors, ColdSpring Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982).Métodos terapêuticos e Composições Farmacêuticas
Os polipeptídeos de Mtb descritos aqui, ou os ácidos nucléicosque codificam os polipeptídios de Mtb, podem ser usados para gerar umaresposta imune em um indivíduo. Em vários exemplos, o indivíduo é infecta-do com Mtb ou está em risco de ser infectado com Mtb. Dessa forma, emvárias modalidades, os métodos incluem administrar a um indivíduo umaquantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais dos polipeptídeos de Mtbdescritos aqui (ou polinucleotídeos que codificam esses polipeptídeos), a fimde gerar uma resposta imune, tal como, mas não-limitada a uma respostaimune protetora.
Em pedidos exemplares, são administradas composições a umindivíduo em uma quantidade suficiente para produzir uma resposta imuneao Mtb. Esses polipeptídeos de Mtb, ou polinucleotídeos que codificam es-ses polipeptídeos são usados para evitar uma infecção com Mtb, evitar aprogressão para doença em um indivíduo que tem uma infecção por Mtblatente, ou para tratar tuberculose em um indivíduo infectado com Mtb. Emvários exemplos, a administração de uma quantidade terapeuticamente efi-caz de uma composição que inclui um ou mais dos polipeptídeos de Mtbdescritos aqui (ou polinucleotídeos que codificam esses polipeptídeos) induzuma resposta imune suficiente para diminuir um sintoma de uma doençadevido a infecção por Mtb1 para evitar o desenvolvimento de um ou mais sin-tomas de tuberculose, ou evitar infecção com Mtb.
Em alguns exemplos, as composições são usadas na prevençãode uma infecção futura com Mtb. Dessa forma, uma quantidade terapeuti-camente eficaz da composição é administrada a um indivíduo em risco de setornar infectado com Mtb. A composição evita o desenvolvimento de tubercu-lose, tal como tuberculose latente ou ativa no indivíduo pela subseqüenteexposição ao Mtb.
Em exemplos adicionais, as composições são administradas aum indivíduo com uma infecção por Mtb latente, e evitam o desenvolvimentode sintomas de tuberculose. Dessa forma, as composições são usadas notratamento de um indivíduo com tuberculose latente, tal que o indivíduo nãodesenvolve tuberculose ativa.
Quantidades eficazes para esses usos dependerão da severida-de da doença, do estado geral da saúde do paciente, e da robustez do sis-tema imune do paciente. Em um exemplo, uma quantidade terapeuticamenteeficaz do composto é aquela que fornece alívio subjetivo de um sintoma ouuma melhora objetivamente identificável observada pelo médico ou outroobservador qualificado. Em outros exemplos, uma quantidade terapeutica-mente eficaz é uma quantidade suficiente para evitar uma infecção com Mtbem um indivíduo pela subseqüente exposição do indivíduo ao Mtb. Em e-xemplos adicionais, uma quantidade terapeuticamente eficaz é uma quanti-dade suficiente para evitar o desenvolvimento de sintomas em um indivíduoinfectado com MTb.
Um polipeptídeo de Mtb pode ser administrado por qualquermeio conhecido daqueles versados na técnica (veja Banga, A., "ParenteralControlled Delivery of Therapeutic Peptides and Proteins," in TherapeuticPeptides and Proteins, Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, PA, 1995)localmente ou sistemicamente, tal como por injeção intramuscular, injeçãosubcutânea, infecção intraperitoneal, injeção intravenosa, administração oral,administração nasal, administração transdérmica ou até mesmo administra-ção anal. Em uma modalidade, a administração é por injeção oral, subcutâ-nea, ou intramuscular. Para aumentar o tempo durante o qual o peptídeo ouproteína está disponível para estimular uma resposta, o peptídeo ou proteínapode ser fornecido como um implante, uma injeção oleosa, ou como um sis-tema particulado. O sistema particulado pode ser uma micropartícula, umamicrocápsula, uma microesfera, uma nanocápsula, ou particular similar (ve-ja, por exemplo, Banga, supra). Um veículo particulado baseado em um po-límero sintético foi mostrado agindo como um adjuvante para aumentar aresposta imune, além de fornecer uma resposta controlada, sais de alumíniotambém podem ser usados como adjuvantes para produzir uma respostaimune.
Em um exemplo específico não-limitante, o polipeptídeo de Mtbé administrado de forma a direcionar a resposta imune para uma respostacelular (isto é, uma resposta de linfócito T citotóxico (CTL)) ao invés de umaresposta humoral (de anticorpo),
Opcionalmente, uma ou mais citocinas, tais como IL-2, IL-6, IL-12, RANTES, GM-CSF, TNF-α, or IFN-γ, um ou mais fatores de crescimento,tais como GM-CSF ou G-CSF; uma ou mais moléculas tais como OX-40L ou41 BBL, ou combinações destas moléculas, podem ser usadas como adju-vantes biológicos (veja, por exemplo, Salgaller et al., 1998, J. Surg. Oncol.68(2): 122-38; Lotze et al., 2000, CancerJ Sei. Am. 6 (Supl 1):S61-6; Cao etal., 1998, Stem Cells 16 (Supl 1):251-60; Kuiper et al., 2000, Adv. Exp. Med.Biol. 465:381-90). Essas moléculas podem ser administradas sistemicamen-te (ou localmente) ao hospedeiro. Em vários exemplos, IL-2, RANTES, GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, G-CSF, LFA-3, CD72, B7-1, B7-2, B7-1 B7-2, OX-40L,41 BBL e ICAM-1 são administrados.
Vários meios para induzir respostas celulares, tanto in vitro comoin vivo, são conhecidos. Lipídios foram identificados como agentes capazesde auxiliar no "priming" de CTL in vivo contra vários antígenos. Por exemplo,como descrito na Patente U.S. N- 5.662,907, resíduos de ácido palmíticopodem ser ligados aos grupos alfa e épsilon de um resíduo de Iisina e entãoligados (por exemplo, através de um ou mais resíduos de ligação, tal comoglicina, glicina-glicina, serina, serina-serina, ou semelhantes) a um peptídeoimunogênico. O peptídeo Iipidado pode então ser injetado diretamente emuma forma micelar, incorporado em um lipossomo, ou emulsificado em umadjuvante. Como outro exemplo, lipoproteínas de E. coli, tal como tripalmito-il-S-glicerilcisteinliseril-serina podem ser usadas para o iniciada de CTL tu-mor-específicas quando ligadas covalentemente a um peptídeo apropriado (veja Deres et al., Nature 342:561, 1989). Além disso, já que a indução deanticorpos neutralizantes também pode ser iniciada com a mesma moléculaconjugada a um peptídeo que apresenta um epítopo apropriado, duas com-posições podem ser combinadas para fazer surgir respostas imunes humo-rais e mediadas por células, onde isto for considerado desejável.
Uma composição farmacêutica incluindo um polipeptídeo de Mtbé então fornecida. Essas composições são usadas para promover uma res-posta imune a Mtb. Em uma modalidade, o polipeptídeo de Mtb é misturadocom um adjuvante que contém dois ou mais de um detergente estabilizador,um agente formador de micelas, e um óleo. Detergentes estabilizadores a-dequados, agente formadores de micelas, e óleos são detalhados na Paten-te U.S. N9 5.585.103; Patente U.S. N9 5.709.860; Patente U.S. N9 5.270.202;e Patente U.S. N9 5.695.770, todas as quais estão incorporadas por referên-cia. Um detergente estabilizador é qualquer detergente que permite que oscomponentes da emulsão permaneçam como uma emulsão estável. Taisdetergentes incluem polissorbato, 80 (TWEEN) (Sorbitan-mono-9-octadecenoato-poli{óxi-1.2-etanediil; fabricado por ICI Américas, Wilmington,DE), TWEEN 40™, TWEEN 20™, TWEEN 60™, ZWITTERGENT™ 3-12,TEEPOL HB7™, e SPAN 85™. Esses detergentes são geralmente forneci-dos em uma quantidade de aproximadamente 0,05 a 0,5%, tal como cercade 0,2%. Um agente formador de micela é um agente que é capaz de estabi-lizar a emulsão formada com os outros componentes tal que uma estruturasemelhante a uma micela é formada. Tais agentes geralmente causam al-gum irritação no local de injeção a fim de recrutar macrófagos para aumentara resposta celular. Exemplos de tais agentes incluem tensoativos poliméri-cos descritos pelas publicações de BASF Wyandotte, por exemplo, Schmol-ka, J. Am. Oii Chem. Soe. 54:110, 1977, e Hunter et al., J. Immunol129:1244, 1981, PLURONIC™ L62LF, L101, e L64, PEG1000, e TETRO-NIC™ 1501, 150R1, 701, 901, 1301, e 130R1. As estruturas químicas de taisagentes são bem-conhecidas da técnica. Em uma modalidade, o agente éescolhido para ter um balanço hidrofílico-lipofílico (HLB) entre 0 e 2, comodefinido por Hunter & Bennett, J. Immun. 133:3167, 1984. O agente pode serfornecido em uma quantidade eficaz, por exemplo, entre 0,5 e 10%, ou emuma quantidade entre 1,25 e 5%.
O óleo incluído na composição é escolhido para promover a re-tenção do antígeno em uma emulsão óleo-em-água, tal como para fornecerum veículo para o antígeno desejado, e preferivelmente tem uma temperatu-ra de fusão de menos do que 65°C tal que a emulsão seja formada em tem-peratura ambiente (cerca de 20°C a 25°C), ou uma vez que a temperaturada emulsão for reduzida para temperatura ambiente. Exemplos de tais óleosincluem esqualeno, Squalane, EICOSANE™, tetratetracontano, glicerol, eóleo de amendoim ou outros óleos vegetais. Em um exemplo específico não-limitante, o óleo é fornecido em uma quantidade 1 e 10%, ou entre 2,5 e 5%.O óleo deve ser biodegradável e biocompatível para que o corpo possa que-brar o óleo ao longo do tempo e para que nenhum efeito adverso, tais comogranulomas, sejam evidentes pelo uso do óleo.
Em uma modalidade, o adjuvante é uma mistura de detergentesestabilizantes, agentes formadores de micela, e óleo, disponível sob o nomePROVAX® (IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA). Um adjuvante tambémpode ser um ácido nucléico imunoestimulatório, tal como um ácido nucléicoque inclui um motivo CpG, ou um adjuvante biológico (veja acima).
Formulações parenterais de liberação controlada podem ser fei-tas como implantes, injeções oleosas, ou sistemas particulados. Para umaampla revisão de sistemas de liberação de proteínas, veja Banga, Therapeu-tic Peptides and Proteins: Formulation, Processing, and Delivery Systems,Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, PA, 1995. Sistemas parti-culados incluem microesferas, micropartículas, microcápsulas, nanocápsu-las, nanoesferas e nanopartículas. Microcápsulas contêm a proteína tera-pêutica como um núcleo central. Em microesferas, o agente terapêutico estádisperso por toda a partícula. Partículas, microesferas e microcápsulas me-nores do que cerca de 1 Dm são geralmente referidas como nanopartículas,nanoesferas, e nanocápsulas, respectivamente. Capilares têm um diâmetrode aproximadamente 5 Dm para que apenas nanopartículas sema adminis-tradas intravenosamente. Micropartículas tem tipicamente cerca de 100 Dmde diâmetro e são administradas subcutaneamente ou por via intramuscular(veja Kreuter, Colloidal Drug Delivery Systems, J. Kreuter, ed., Mareei Dek-ker, Inc., Nova Iorque, NY, pp. 219-342, 1994; Tice & Tabibi, Treatise onControlled Drug Delivery, A. Kydonieus, ed., Mareei Dekker, Inc. Nova Ior-que, NY, pp. 315-339, 1992).
Polímeros podem ser usados para a liberação controlada poríons. Várias matrizes poliméricas degradáveis e não-degradáveis para usoem liberação controlada de fármaco são conhecidas na técnica (Langer, Ac-counts Chem. Res. 26:537, 1993). Por exemplo, o co-polímero em bloco,polaxâmero 407 existe como um líquido viscoso, porém móvel em baixastemperaturas mas forma um gel semi-sólido na temperatura do corpo. Ele foimostrado como sendo um veículo eficaz para a formulação e liberação sus-tentada de interleucina -2 recombinante e urease (Johnston et al., Pharm.Res. 9:425, 1992; and Pec, J. Parent. Sei. Tech. 44(2):58, 1990). Alternati-vamente, hidroxiapatita foi usada como um microveículo para liberação con-trolada de proteínas (Ijntema et al., Int. J. Pharm. 112:215, 1994). Ainda emoutro aspecto, Iipossomos são usados para liberação controlada assim comodirecionamento farmacológico de fármacos encapsulado em lipídeo (Betage-ri et al., Liposome Drug Delivery Systems, Technomic Publishing Co., Inc.,Lancaster, PA, 1993). Vários sistemas adicionais para liberação controladade proteínas terapêuticas são conhecidos (por exemplo, Patente U.S. N95.055.303; Patente U.S. N5 5.188.837; Patente U.S. Nq 4.235.871; PatenteU.S. N5 4.501.728; Patente U.S. Ne 4.837.028; Patente U.S. N9 4.957.735; ePatente U.S. N9 5.019.369; Patente U.S. N9 5.055.303; Patente U.S. N95.514.670; Patente U.S. Ng 5.413.797; Patente U.S. N9 5.268.164; PatenteU.S. N9 5.004.697; Patente U.S. N9 4.902.505; Patente U.S. N9 5.506.206;Patente U.S. N9 5.271.961; Patente U.S. N9 5.254.342; e Patente U.S. N95.534.496).
Em outra modalidade, uma composição farmacêutica inclui umácido nucléico que codifica um polipeptídeo de Mtb. Uma quantidade tera-peuticamente eficaz do polinucleotídeo de Mtb pode ser administrada a umindivíduo a fim de gerar uma resposta imune.
Opcionalmente, uma ou mais citocinas, tais como IL-2, IL-6, IL-12, RANTES, GM-CSF, TNF-α, ou IFN-γ, um ou mais fatores de crescimen-to, tais como GM-CSF ou G-CSF, uma ou mais moléculas co-estimulatórias,tais como ICAM-1, LFA-3, CD72, B7-1, B7-2, ou outras moléculas relaciona-das a B7; uma ou mais moléculas tais como OX-40L ou 41 BBL1 ou combi-nações dessas moléculas, podem ser usadas como adjuvantes biológicos(veja, por exemplo, Salgaller et al., 1998, J. Surg. Oncol. 68(2):122-38; Lotzeet al., 2000, Câncer J Sei. Am. 6 (Supl 1):S61-6; Cao et al., 1998, Stem Cells16 (Supl 1):251-60; Kuiper et al., 2000, Adv. Exp. Med. Biol. 465:381-90).Estas moléculas podem ser administradas sistemicamente ao hospedeiro.Deve ser observado que estas moléculas podem ser co-administradas atra-vés da inserção de um ácido nucléico codificante das moléculas em um ve-tor, por exemplo, um vetor de pox recombinante (veja, por exemplo, Pat.U.S. N9 6.045.802). Em várias modalidades, o ácido nucléico que codifica oadjuvante biológico pode ser clonado no mesmo vetor em um ou mais veto-res separados para co-administração. Além disso, fatores imunomodulado-res inespecíficos tais como Bacilo de Calmette-Guerin (BCG) e Ievamisolpodem ser co-administrados.
Uma abordagem para administração de ácidos nucléicos é dire-cionar a imunização com DNA de plasmídeo, tal como com um plasmídeo deexpressão de mamífero. Como descrito acima, a seqüência de ácido nucléi-co que codifica um polipeptídeo de Mtb pode ser colocada sob o controle deum promotor para aumentar a expressão da molécula.Imunização por construtos de ácido nucléico é bem-conhecidana técnica e ensinada, por exemplo, na Patente U.S. Nq 5.643.578 (a qualdescreve métodos de imunizar vertebrados por introduzir um DNA que codi-fica um antígeno desejado para fazer surgir uma resposta mediada por célu-la ou humoral), e Patente U.S. Ne 5.593.972 e Patente U.S. N2 5.817.637 (aqual descreve ligar operativamente uma seqüência de ácido nucléico quecodifica um antígeno a seqüências regulatórias que tornam a expressãopossível). Patente U.S. Nq 5.880.103 descreve vários métodos de liberaçãode ácidos nucléicos que codificam peptídeos imunogênicos ou outros antí-genos a um organismo. Os métodos incluem liberação Iipossomal dos ácidosnucléicos (ou dos peptídeos sintéticos em si), e construtos imuno-estimulatórios, ou ISCOMS™, estruturas semelhantes a uma jaula carrega-das negativamente de 30 a 40 nm de tamanho formadas espontaneamenteao misturar colesterol e Quil A™ (saponina). Imunidade protetora foi geradaem uma variedade de modelos experimentais de infecção, incluindo toxo-plasmose, e tumores induzidos pelo vírus Epstein-Barr, usando ISCOMS™como o veículo de liberação para antígenos (Mowat & Donachie, Immunol.Today 12:383, 1991). Doses de antígeno tão baixas quanto 1 Dg encapsula-das em ISCOMS™ foram vistas produzindo respostas de CTL mediadas porClasse I (Takahashi et al., Nature 344:873, 1990).
Em outra abordagem para usar ácidos nucléicos para imuniza-ção, um polipeptídeo de Mtb também pode ser expresso por hospedeirosvirais atenuados ou vetores bacterianos, vírus de vacínia recombinantes,vírus adeno-associados (AAV), herpes vírus, retrovírus, ou outros vetoresvirais podem ser usados para expressão do peptídeo ou proteína fazendosurgir assim uma resposta de CTL. Por exemplo, vetores de vacínia e méto-dos úteis em protocolos de imunização são descritos na Patente U.S. N24.722.848. BCG (Bacilo de Calmette Guerin) fornece outro vetor para ex-pressão dos peptídeos (veja Stover, Nature 351:456-460, 1991).
Quando um vetor viral é utilizado, é desejável fornecer ao recep-tor uma dosagem de cada vírus recombinante na composição na faixa decerca de 105 a cerca de 1010 unidades formadoras de placa/MG de mamífe-ro, embora uma dose menor ou maior possa ser administrada. A composiçãode vetores virais recombinantes pode ser introduzida em um mamífero (1)antes de qualquer evidência de uma infecção com Mtb; (2) para evitar o de-senvolvimento de tuberculose em um indivíduo infectado com tuberculose;
ou (3) para diminuir um sintoma de tuberculose em um mamífero infectadocom Mtb. Exemplos de métodos para administrar a composição em mamífe-ros incluem, mas não são limitados a, exposição de células ao vírus recom-binante ex vivo, ou injeção da composição no tecido afetado ou administra-ção intravenosa, subcutânea, intradérmica ou intramuscular do vírus. Alter-nativamente, o vetor viral recombinante ou combinação de vetores virais re-combinantes pode ser administrado localmente em um veículo farmaceuti-camente aceitável. Geralmente, a quantidade de vetor viral recombinantecarregando a seqüência de ácido nucléico de um ou mais polipeptídeos deMtb a ser administrada se baseia no titulo das partículas do vírus. Uma faixaexemplar do imunógeno a ser administrada é 105 a 1010 partículas de víruspor mamífero, tal como um humano.
Na modalidade onde uma combinação de um primeiro vetor viralrecombinante que carrega uma seqüência de ácido nucléico de um ou maispolipeptídeos de Mtb e um segundo vetor viral recombinante que carrega aseqüência de ácido nucléico de uma ou mais moléculas imunoestimulatóriasé usada, o mamífero pode ser imunizado com diferentes proporções do pri-meiro e segundo vetor viral recombinante. Em uma modalidade a proporçãodo primeiro vetor para o segundo vetor é de cerca de 1:1, ou cerca de 1:3,ou cerca de 1:5. Proporções ótimas do primeiro vetor para o segundo vetorpodem ser facilmente tituladas usando os métodos conhecidos na técnica(veja, por exemplo, a Patente U.S. Ns 6.893.869, incorporada aqui por refe-rência).
Em uma modalidade os vírus recombinantes foram construídospara expressar citocinas (tais como TNF-α, IL-6, GM-CSF, e IL-2), e molécu-Ias co-estimulatórias e acessórias (B7-1, B7-2) sozinhas e em uma varieda-de de combinações. A produção simultânea de uma molécula imuno-estimulatória e do polipeptídeo de Mtb aumenta a geração de efetores espe-cíficos. Sem estar preso pela teoria, dependendo das diferentes moléculasimuno-estimulatórias, diferentes mecanismos poderiam ser responsáveispela imunogenicidade aumentada: aumento de sinal de ajuda (IL-2), recru-tamento de APCs profissionais APC (GM-CSF), aumento na freqüência deCTL (IL-2), efeito sobre a via de processamento de antígeno e expressão deMHC (IFNy e TNFa) e semelhantes. Por exemplo, IL-2, IL-6, interferon, fatorde necrose tumoral, ou um ácido nucléico que codifica estas moléculas, po-dem ser administrados em conjunto com um polipeptídeo de Mtb imunogêni-co, ou um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de Mtb. A co-expressão de um polipeptídeo de Mtb junto com pelo menos uma moléculaimuno-estimulatória pode ser eficaz em um modelo animal para mostra efei-tos anti-tumorais.
Em uma modalidade, um ácido nucléico que codifica um polipep-tídeo de Mtb é introduzido diretamente nas células. Por exemplo, o ácidonucléico pode ser carregado em microesferas de outro por métodos usuais eé introduzido na pele por um dispositivo tal como HeIiosD Gene Gun da Bio-Rad. Os ácidos nucléicos podem ser "nus" consistindo em plasmídeos sob ocontrole de um promotor forte. Tipicamente, o DNA é injetado no músculo,embora ele também possa ser injetado diretamente em outros locais, inclu-indo tecidos em proximidade a metástases. Dosagens para injeção são ge-ralmente de cerca de 0,5 Dg/kg a cerca de 50 mg/kg, e tipicamente são decerca de 0,005 mg/kg a cerca de 5 mg/kg (veja, por exemplo, Patente U.S.N5 5.589.466).
Em um exemplo específico não-limitante, uma composição far-macêutica para administração intravenosa incluiria cerca de 0,1 pg a 10 mgde polipeptídeo de Mtb imunogênico por paciente por dia. Dosagens de 0,1até cerca de 100 mg por paciente por dia podem ser usadas, particularmen-te, se o agente for administrado a um local isolado e não no sistema circula-tório ou linfático, tal como em uma cavidade corporal ou dentro da luz de umórgão. Métodos modernos para preparar composições administráveis serãoconhecidos ou claros para aqueles versados na técnica e são descritos emmais detalhes em publicações tais como Remingtons Pharmaceutical Scien-ces, 19" Ed., Mack Publishing Company1 Easton, Pensilvânia, 1995.
Administrações únicas ou múltiplas das composições são admi-nistradas dependendo da dosagem e da freqüência, conforme necessário etolerado pelo indivíduo. Em uma modalidade, a dosagem é administradauma vez como um bólus, mas em outra modalidade pode ser aplicada perio-dicamente até que um resultado terapêutico seja obtido. Em uma modalida-de, a dose é suficiente para tratar ou melhorar os sintomas ou sinais de tu-berculose sem produzir toxicidade inaceitável para o indivíduo. Em outramodalidade, a dose é suficiente para evitar a infecção com Mtb em subse-qüente exposição ao Mtb. Em uma modalidade adicional, a dose é suficientepara evitar um sintoma de tuberculose em um indivíduo com uma infecçãopor Mtb latente. Administração sistêmica ou local pode ser utilizada.
Em outro método, células apresentadoras de antígeno (APCs),tais como células dendríticas, são isoladas de um indivíduo de interesse epulsadas ou co-incubadas com peptídeos que compreendem um polipeptí-deo de Mtb in vitro. Em um exemplo específico não-limitante, as células a-presentadoras de antígeno são células autólogas isoladas do indivíduo deinteresse. Uma quantidade terapeuticamente eficaz das células apresenta-doras de antígeno é administrada (re-introduzida) no indivíduo de interesse.
O polipeptídeo de Mtb pode ser liberado para as células dendrí-ticas ou para precursores de células dendríticas através de qualquer métodoconhecido na técnica, incluindo, mas não-limitado a, pulsar células dendríti-cas diretamente com um antígeno, ou utilizar uma ampla variedade de veícu-los de liberação de antígeno, tais como, por exemplo, lipossomos, ou outrosvetores conhecidos por liberar antígeno para as células. Em um exemploespecífico não-limitante, uma formulação antigênica inclui cerca de 0.1 pg acerca de 1.000 pg, ou cerca de 1 a cerca de 100 pg de um, polipeptídeo deMtb selecionado. O polipeptídeo de Mtb também pode ser administrado comagentes que promovem a maturação de células dendríticas. Exemplos espe-cíficos não-limitantes de agentes usados são interleucina-4 (IL-4) e fator es-timulador de colônia de granulócito/macrófago (GM-CSF), ou Iigante de flt-3(flt-3L). A preparação também pode conter tampões, excipientes, conservan-tes, dentre outros ingredientes.
Em uma modalidade, células apresentadoras de antígeno madu-ras são geradas para apresentar o polipeptídeo de Mtb imunogênico. Estascélulas dendríticas são então administradas sozinhas a um indivíduo infecta-do com Mtb, ou em risco de infecção com Mtb, em outra modalidade, as cé-lulas dendríticas maduras são administradas em conjunto com agente antiviral.
Alternativamente, as APCs são usadas para sensibilizar célulasCD8, tais como linfócitos de sangue periférico (PBLs). Os PBLs podem serheterólogos. Entretanto, eles devem ser pelo menos restritos por MHC clas-se I aos tipos de HLA que o indivíduo possui.
Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) podemser usadas como as células respondedoras fonte de precursores de linfócitoT citotóxico (CTL). As células apresentadoras de antígeno apropriadas sãoincubadas com peptídeo, após o que as células apresentadoras de antígenoapropriadas são então incubadas com a população de células respondedo-ras com condições de cultura otimizadas. Ativação positiva de CTL pode serdeterminada por testar a cultura quando à presença de CTLs que matamcélulas alvo radio-marcadas, tanto alvos pulsados com peptídeo específicosassim como células alvo que expressam endogenamente formas processa-das de antígeno a partir do que as células CD8+ são então administradas aum indivíduo de interesse.
Dessa forma, as células podem ser administradas a um indiví-duo para tratar uma infecção por Mtb, tal como diminuir um sintoma de umainfecção por Mtb. Nessas aplicações, uma quantidade terapeuticamente efi-caz de células apresentadoras de antígeno, ou linfócitos ativados, são admi-nistrados a um indivíduo em uma quantidade suficiente pára criar uma res-posta imune ao Mtb.
Em métodos adicionais, qualquer regime terapêutico é aumenta-do pela administração de uma citocina, tais como (IL)-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-15, GM-CSF, interferons. Em métodos adicionais, um agente antiviraladicional é administrado ao indivíduo. A descrição é ilustrada pelos seguin-tes Exemplos não-limitantes.Exemplos
Para muitas infecções, o repertório da resposta de CD8 é mol-dado pela entrada de antígeno na via de processamento de MHC-I, ligaçãode peptídeos e/ou antígenos não-peptídicos a moléculas de MHC-I1 e reco-nhecimento dessas estruturas por células T. No final, um subgrupo relativa-mente limitado de células T patógeno-específicas emerge. Embora váriosantígenos de Mtb de CD4 comumente reconhecidos tenham sido descritos(Reed et al., Microbes Infect 7:922-931, 2005) (ESAT-6, CFP10, Ag85, etc.),surpreendentemente pouco é conhecido sobre antígenos de Mtb comunsreconhecidos por células T CD8+ humanas. A maioria dos epítopos de CD8que foram identificados foram definidos por teste de peptídeos de Mtb sele-cionados para alta afinidade de ligação a moléculas de MHC Classe Ia (HLA-A2 na maioria dos casos (veja, por exemplo, Lalvani, Microbes Infeet 7:922-931, (1998)). Em quase todos esses, entretanto, a freqüência ex vivo dessascélulas T em indivíduos infectados por Mtb é baixa ou indetectável, sugerin-do que essas especificidades podem não representar respostas imunodomi-nantes. Em contraste, nos casos limitados nos quais as células T foram usa-das para definir epítopos contidos em antígenos de Mtb selecionados, altasfreqüências ex vivo foram demonstradas veja, Lewinsohn et al., Am J RespirCrit Care Med 166:843-848, 2002), sugerindo, que uma abordagem centradaem célula T pode identificar epítopos imunodominantes. Além disso, respos-tas de célula T CD8 a alguns antígenos de Mtb que representam bons antí-genos de CD4 (CFP10, ESAT-6, Ag85, e Mtb39) foram detectados em altafreqüência em pessoas infectadas com Mtb. Portanto, uma biblioteca limita-da de peptídeos sintéticos superpostos representando vários antígenos deMtb de CD4 conhecidos foi usada para determinar a magnitude da respostade CD8 a esses antígenos em pessoas com tuberculose ativa (TB) e infec-ção latente de tuberculose (LTBI) assim como indivíduos não infectados.Além disso, um painel de clones de célula T CD8+ Mtb-específicas foi utiliza-do para definir epítopos mínimos reconhecidos dentro desses antígenos edeterminar a contribuição desses novos epítopos para a resposta de CD8Mtb-específica ex vivo.Exemplo 1Materiais e Métodos
Indivíduos Humanos. Indivíduos não-infectados foram definidoscomo indivíduos saudáveis com teste cutâneo de tuberculina (TST) negativoe sem fatores de risco conhecidos para infecção com Mtb. Indivíduos comLTBI foram definidos como pessoas saudáveis com TST positivo e sem sin-tomas e sinais de TB ativa. Em todos os casos de TB ativa, a TB pulmonarfoi diagnosticada pelo Controlador de TB do município e confirmada por cul-tura de escarro positiva para Mycobacterium tuberculosis. Células mononu-cleares do sangue periférico (PBMC) foram isoladas do sangue total obtidopor punção venosa ou aférese.
Meios e Reagentes. O meio de cultura consistiu em RPMI 1640suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS; Bio Whittaker), 5 X 10"5M 2 ME (Sigma-AIdrich), e glutamina 2 mM (GIBCO BRL). Para o crescimen-to e ensaio de clones de célula T reativos a Mtb, RPMI 1640 foi suplementa-do com 10% de soro humano. A cepa H37Rv de Mtb foi obtida da AmericanType Culture Collection (Rockville, MD) e preparada como descrito previa-mente (Lewinsohn et al., J Immunol 165:925-930, 2000). Peptídeos foramsintetizados por Genemed Synthesis, Inc, (San Francisco, CA). "Pools" depeptídeos sintéticos consistiram em 15-mers superpostos por 11 aminoáci-dos (aa) representando proteínas de Mtb que demonstraram ser potentesantígenos de CD4. "Pools" de peptídeo representando CFP-10 (Berthet etal., Microbiology 144:3195-3203, 1998; Dillon etal., JCIinMicrobioI38:3285-3290, 2000), ESAT-6 (Sorenson et al., Infeet Immun 63:1710-1717, 1995),Mtb39a (dois "pools", A & B, referência) (Dillon et al., Infeet Immun 67:2941-2950, 1999), Mtb8.4 (Coler et al., J Immunol 161:2356-2364, 1998), Mtb 9.9(Alderson et al., J Exp Med 191:551-560, 2000), (Coler et al., J Immunol161:2356-2364, 1998), Mtb 9.9 (Alderson et al., J Exp Med 191:551-560,2000), EsxG (Rosenkrands et al., Electrophoresis 21:3740-3756, 2002), an-tígeno de 19kDa (Collins et al. J Gen Mierobiol 136:1429-1436, 1990), antí-geno 85b (Borremans et al., Infeetlmmun 57:3123-3130, 1989) (dois "pools",A & Β, referência) foram sintetizados. Peptídeos foram ressuspensos emDMSO e até 50 peptídeos foram combinados em um conjunto tal que cadapeptídeo no conjunto estava em uma concentração de 1 mg/ml. "Pools" depeptídeo foram armazenados a -809C.
Linhagens Celulares e Clones de Células T. Linhagens decélulas B transformadas com EBV, LCL, foram geradas usando sobrenadan-tes da linhagem celular 9B5-8 (American Type Culture Collection) ou obtidasde National Marrow Donor Program (NMDP; Minneapolis, MN). LCL forammantidas por passagem contínua como descrito previamente (Heinzel et al.,J Exp Med 196:1473-1481, 2002). Clones de células T Mtb-específicos fo-ram isolados de indivíduos com LTBI ou tuberculose ativa, usando DCs in-fectadas com Mtb como APCs e metodologia de clonagem por diluição Iimi-tante como descrito previamente (Lewinsohn et al., J Immunol 165:925-930,2000). Resumidamente, células T CD8+ foram isoladas de PBMC usandoseleção negativa usando esferas cobertas com anticorpo de CD4 e entãoseleção positiva usando esferas magnéticas cobertas com anticorpo de CD8de acordo com as instruções do fabricante Miltenyi Biotec, Auburn CA) ouatravés de citometria de fluxo. Nesse caso, células CD4-PE (BD Biosciencesno. cat 555347) negativas, CD8-APC (BD Biosciences, no. cat 555369) posi-tivas (pureza >99%) foram classificadas em um Becton Dickenson LSR II.Células T foram semeadas em várias concentrações na presença de 1 X 105DC autólogas irradiadas infectadas com Mtb, geradas como descrito abaixoe rlL-2 (5 ng/ml) em meio de cultura consistindo de 200 Dl de RPMI 1640suplementado com 10% de soros humanos. Cavidades exibindo crescimentoentre 10 a 14 dias foram avaliados para especificidade para Mtb usando E-LISPOT e DC infectadas com Mtb como uma fonte de APCs. Células T queretiveram especificidade por Mtb foram ainda fenotipadas para expressão dereceptor αβ de célula T e expressão de CD8 por FACS e expandidas comodescrito abaixo. O uso de νβ foi determinado usando o IOTest Beta Mark Kitde Beckman Coulter.
Expansão de clones de células T. Para expandir os clones decélula T CD8+, um protocolo de expansão rápida usando estimulação commAb anti-CD3 foi usado como descrito previamente (Heinzel et al., J ExpMed 196:1473-1481, 2002).
Geração e Infeccão de DCs de Sangue Periférico. DCs deriva-das de monócito foram preparadas (Heinzel et al., supra; Romani et al., JExp Med 180:83-93, 1994). Para gerar DC infectadas por Mtb, as células (1X 106) foram cultivadas durante a noite na presença de Mtb (multiplicidadede infecção [MOI] = 50:1). Após 18 horas, as células foram coletadas e res-suspensas em RPMI/soro humano 10%.
Ensaios de Ligação de MHC. O ensaio de ligação peptídeo-MHCutilizou medidas de habilidade de Iigantes de peptídeo para inibir a ligaçãode um peptídeo radiorrotulado com moléculas de MHC purificadas, e foi des-crito em detalhes em outro lugar ( Sidney et al., 1999. UNIT 18.3 Measure-ment of MHC/peptide interactions by gel filtration. In Current Protocols inlmmunology. Coligan et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., 1996). Resumi-damente, moléculas de MHC purificadas, peptídeos de teste e sonda depeptídeo radiorrotulada foram incubados em temperatura ambiente na pre-sença de microglobulina-B2 humana e um coquetel de inibidores de protea-se. Após dois dias de incubação, a ligação do peptídeo radiorrotulado com amolécula correspondente de MHC Classe I foi determinada pela captura decomplexos MHC/peptídeo sobre placas cobertas com anticorpo W6/32 ((anti-HLA A, B, e C) ou B123.2 (anti-HLA B, C e pouco A) e contagens por minuto(com) de ligação foram medidas usando um contador de microcintilação.Para ensaios de competição, a concentração de peptídeo que fornece 50%de inibição de ligação do peptídeo radiorrotulado foi calculada. Peptídeosforam testados tipicamente em seis concentrações diferentes cobrindo100.000 vezes a dose média e em três ou mais ensaios independentes. Sobas condições utilizadas, onde [rótulo]<[MHC] e IC50 ^ [MHC], os valores me-didos de IC5O são aproximações razoáveis dos valores reais de Kd.
Ensaio ELISPOTde IFN-v ensaio ELISPOT de IFN-γ foi realiza-do como descrito previamente (Beckman et al., J Immunol 157:2795-2803,1996). Para determinação freqüências ex vivo de células T CD4+ ou CD8+que respondem a infecção por Mtb ou antígenos de Mtb, as células T CD4+ou CD8+ foram selecionadas positivamente a partir de PBMC usando esferasmagnéticas (Miltenyi Biotec, Auburn CA) como uma fonte de células T reati-vas e testadas em duplicata em quatro concentrações celulares diferentes.DC autólogas (20.000 células/cavidade) foram usadas como APC e DC fo-ram infectadas com Mtb ou pulsadas com "pools" de peptídeos (5 DgAnI,concentração final de cada peptídeo) e então adicionadas ao ensaio. Paraensaios usando clones de célula T, células T (1000 ou 5000 célu-las/cavidade) foram incubadas com LCL autólogas (20.000/cavidade) napresença ou ausência de antígeno.
Análise de dados: Para determinar a freqüência ex vivo de célu-las T antígeno-específica, o número médio de marcações por cavidade paracada duplicata foi plotado contra o número de células reativas por cavidade.A análise de regressão linear foi usada para determinar a inclinação da linha,a qual representa a freqüência de células T específicas para antígeno. Oensaio foi considerado positivo, isto é, refletindo a presença de uma respostasatisfatória de célula T, se a probabilidade binomial (Lewinshon et al., Micro-bes Infect 8:2587-2598, 2006) para o número de marcações fosse significati-vamente diferente nos ensaios experimental e de controle. Para determinaras diferenças nas freqüências ex vivo de célula T entre os grupos, foi usadaa análise de Wilcoxon/Kruskal-Wallis.
Exemplo 2
Definindo Antíqenos CD8+ Mtb-específicos Imunodominantes
Para definir antígenos CD8+ Mtb-específicos imunodominantes,e determinar se essas respostas resultam ou não de infecção por Mtb, célu-las T CD8+ de doadores não infectados, com LTBI, ou ativamente infectadascom Mtb foram usadas. As respostas foram determinadas tanto diretamenteex vivo quanto usando clones de célula T CD8+ obtidos por clonagem pordiluição Iimitante de DC autóloga infectada por Mtb (Lewinsohn et al., J Im-munoi 165:925-930, 2000). Com tudo que é conhecido sobre de antígenosCD4+ para Mtb dominante, um painel desses antígenos comumente reco-nhecidos foi selecionado para varredura posterior. Esses eram: Mtb39,CFP10, e Mtb8.4, Mtb9.9, ESAT-6, Ag85b, 19kDa, e EsxG. Para evitar o viésintroduzido pelo uso de peptídéos de especificidade de ligação a HLA previs-ta, foram sintetizados peptídeos superpostos (15 aa, superposição de 11 aa)para representar as proteínas de interesse (Lewinshon et al., J Immunol166:439-446, 2001).
Para determinar precisamente as freqüências de célula efetoraex vivo de células T CD8+, foi usada análise de regressão linear. Como mos-trado na Fig. 1, células T CD8+ purificadas com esferas magnéticas foramtestadas contra DC pulsadas com peptídeo ao longo de uma gama de quan-tidades de células T CD8+ em um ensaio de ELISPOT de IFN-γ. Um ensaiopositivo foi determinado como descrito abaixo e se positivo, a freqüência es-pecífica do antígeno foi determinada usando regressão linear.
Indivíduos não infectados (η = 14), aqueles com LTBI (η = 20) eaqueles com TB ativa (n = 12) foram avaliados quanto a respostas de CD8+para um painel de antígenos de célula T CD4+ para Mtb, assim como paraDCs infectadas por Mtb. Todos os indivíduos testados tiveram respostas ro-bustas de células T CD8+ para DCs infectadas por Mtb e foram de magnitu-de maior em indivíduos com TB ativa do que naqueles com LTBI (p = 0,01;Fig. 2, Tabela I). Entretanto, respostas de células T CD8+ para o painel deantígenos foram encontradas quase que exclusivamente naqueles infecta-dos com Mtb nos quais diferenças estatisticamente significativas entre indi-víduos não infectados e infectados por Mtb foram observadas para sete dosdez antígenos para a magnitude de resposta (Fig. 2) e para a proporção deensaios positivos (Tabela I).
Tabela I. Respostas de célula T CD8+ para antígenos de TB conhecidos.
<table>table see original document page 82</column></row><table>ESAT 6 12/25(48) 0/14(0) 0,003
"Pool" A Ag85b 5/22(23) 1/14(7) 0,37
"Pool" B Ag85b 4/22(18) 0/14(0) 0,14
19 kd 6/22(27) 1/12(8) 0,38
EsxG_9/22(41)_0/14(0)_0,006
aEnsaio positivo definido no texto.
Entretanto, diferenças nas respostas entre indivíduos com TBativa e LTBI não foram estatisticamente diferentes. Apesar de respostas for-tes de célula T CD8+ terem sido observadas contra muitos dos antígenostestados, é igualmente notável que vários indivíduos com respostas fortes decélula T CD8+ dirigidas para Mtb não demonstraram respostas para muitosdos antígenos testados.
Esses dados de freqüência ex vivo demonstram a presença derespostas de alta freqüência para vários antígenos de Mtb conhecidos, masnão esclarecem sobre o alelo de restrição, epítopo mínimo ou hierarquia dedominância dentro do gene de interesse. Para responder a essa questão,clonagem por diluição Iimitante de células T CD8+ humanas usando DC in-fectadas com Mtb foi realizada (veja Lewinsohn et al., J Immunol 166:439-446, 2001) e painéis de clones de célula T CD8+ restritos por HLA classica-mente e não-classicamente foram gerados. Usando um "pool" de peptídeosque representam antígenos de CD4+ conhecidos, a especificidade antigênicade clones restritos por HLA-Ia pode ser definida em mais da metade dos clo-nes (Tabela II).
Tabela II. Muitos clones de célula T CD8+ T reconhecem antígenos de célu-la T CD4+ T conhecidos
Doador Condição Clones Antígeno I- # Antíge- # Epíto- de TB HLA-Ia dentificado nos Distin- pos Dis- (#)a (#)b tos (#)c tintos (#)dD431 TB Ativa 1 0 0 0D432 TB Ativa 14 4 2 2D466 TB Ativa 11 10 1 2D571 TB Ativa 7 7 1 1D480 TB Ativa 6 6 1 1D481 TB Ativa 11 11 1 1<table>table see original document page 84</column></row><table>
Essa abordagem é demonstrada em detalhes para um únicoclone representativo, D466 D6, derivado de um indivíduo com TB ativa. Co-mo mostrado na Fig. 3A, testar o clone contra DC autólogas pulsadas comum painel de "pools" de peptídeo, identifica precisamente a especificidadeantigênica como CFP10. O clone foi então testado contra cada um dos pep-tídeos de 15 mer que compreendem o "pool" de CFP10, revelando que oepítopo estava contido dentro de CFPIOm5 (Fig. 3B). Cada possível peptí-deo de 8 aa, 9 aa, 10 aa e 11 aa foi então sintetizado e testado quanto à rea-tividade, revelando atividade antigênica entre os aminoácidos 2 a 11 (Fig,3C). Similarmente, cada clone foi testado contra linhagens celulares Iinfo-blastóides (LCL) partilhando pelo menos um tipo de HLA com o doador (Fig.3D). LCL autóloga e LCL IHW 9058, que partilha B4501 e C1601, apresen-tam o epítopo para o clone, identificando ambos B4501 e C1601 como pos-síveis alelos de restrição. Entretanto, LCL C1601+ D433 não apresenta oepítopo, eliminando C1601 como um candidato a alelo de restrição. Portan-to, D466 D6 é restrito por HLA-B4501. Como demonstrado na Fig. 4, peloteste de cada epítopo plausível sobre uma ampla faixa de concentrações, oepítopo mínimo foi definido como CFP102-io para D466 D6. Dados experi-mentais sustentam a idéia de que o epítopo mínimo é fornecido para cadaclone na Figura complementar. Um resumo da especificidade antigênica,epítopo mínimo e alelo de restrição por HLA é apresentado na Tabela III.Inesperadamente, todos menos um dos clones de célula T foram restringidospor alelos HLA-B. Além disso, uma minoria daqueles observados tinha 9 a-minoácidos de extensão.Tabela III. Resumo de Epítopos Identificados (1 - parte) Clonea Gene Número de A- Alelo restri- Localização
<table>table see original document page 85</column></row><table>
Tabela III. Resumo de Epítopos Identificados {2- parte) Clonea Seqüência do Epi-#SFU Afin. Lig. Região V <table>table see original document page 85</column></row><table><table>table see original document page 86</column></row><table>
Pelo fato de cada clone individual de célula T CD8+ ter sido deri-vado com base no crescimento de DC infectadas com Mtb, foi determinadose o antígeno e os epítopos identificaram ou não epítopos imunodominantesrefletidos ex vivo. Duas abordagens independentes foram adotadas, a pri-meira para determinar se a resposta estava presente em alta freqüência, e asegunda para determinar que proporção da resposta total ao antígeno éconstituída pelo epítopo. Para determinar a freqüência de célula efetora exvivo, como descrito na Figura 1, cada epítopo foi testado usando DC autólo-gas e células T CD8+ purificadas com esferas magnéticas derivadas do doa-dor de quem os clones de célula T foram isolados. Um resumo das freqüên-cias das células efetoras está apresentado na Tabela III. Para a maioria, osepítopos refletem respostas de alta freqüência, e assim podem ser conside-radas uma resposta que foi iniciada por exposição ao Mtb. Notavelmente,clones de células T isolados de quatro doadores reconheceram CFP10. Paradeterminar se os epítopos definidos refletiram uma proporção substancial daresposta total ao antígeno de interesse, células T CD8+ purificadas com es-feras magnéticas de três doadores com células mononucleares de sangueperiférico (PBMC)disponíveis suficientes foram testadas quanto a reatividadea cada peptídeo de 15-mer individual, ao "pool" de peptídeos, e ao peptídeoque representa o epítopo mínimo. Como demonstrado na Figura 5, as fre-qüências ex vivo para o epítopo mínimo, para o(s) peptídeo(s) de 15-mercontendo o epítopo mínimo, e para o "pool" de peptídeo foram notavelmenteconcordantes. Estes dados sugeriram que para cada doador uma hierarquiade dominância foi claramente estabelecida, e está refletida nos clones origi-nais. Finalmente, como é observado na Tabela III, clones-filhas de especifi-cidade idêntica foram identificados com freqüência, um resultado que seriaprevisto com base em uma hierarquia de imunodominância. A coloração pa-ra beta V de TCR foi usada para confirmar a relação clonal entre os clones-filhas. De forma interessante, em dois casos, o epítopo mínimo idêntico e arestrição por HLA foram representados por dois clones distintos (Tabela III).
Pelo fato de que muitos trabalhos sobre as respostas de célula TCD8+ ao Mtb dependeram do uso de algoritmos de previsão de HLA, a me-dida que cada epítopo foi definido, já indagado se os epítopos teriam sido ounão previstos por estas abordagens. Vários destes epítopos não foram clas-sificados de forma convincente. Isto poderia esclarecer as limitações dessesalgoritmos no momento em que eles foram usados. Para responder a estaquestão experimentalmente, a IC5o para cada peptídeo que foi sintetizado nocurso da definição do epítopo mínimo foi determinada contra um painel demoléculas de HLA humanas. A IC5o para o epítopo mínimo com o alelo Iimi-tante cognato está mostrada na Tabela III. Os dados demonstraram que osepítopos de célula T se ligaram avidamente ao HLA1 e mostram um alto graude concordância entre os dados do epítopo de célula T e os dados de liga-ção ao HLA.
Os dados demonstraram que as respostas de células T CD8+estão presentes em pessoas infectadas com Mtb em freqüências que sãocomparáveis àquelas vistas após várias infecções virais comuns tais comovacínia, influenza, e CMV. Todos exceto um dos epítopos que foram mapea-dos estavam restritos por moléculas de HLA-B. Esse dado sugere que pelouso de uma abordagem dirigida por célula T para identificação de epítopo,epítopos dominantes podem ser definidos em seres humanos infectadoscom Mtb.
Exemplo 3
Varredura de clones de célula T em relação a uma biblioteca qenômica depeptídeos
Os clones de célula T restritos classicamente e restritas não-classicamente (veja Tabela Il acima) que não reconheceram um dos "pools"de peptídeo do antígeno de Mtb conhecidos (Rv3875, Rv3874, Rv1886c,Rv0287, Rv3763, Rv1174c, Rv1196, Rv1793, Rv2346c, Rv1037c, Rv3619ce Rv1198) foram avaliados em relação a uma biblioteca genômica de peptí-deos. Esta biblioteca de peptídeos representa 389 genes, representandoaproximadamente 10% do genoma de Mtb. Os peptídeos são 15 me rs comsobreposição de 11 para cada produto gênico. 50nmol de cada peptídeo fo-ram sintetizados individualmente e então agrupados em 777 "pools" de 50peptídeos em um formato de 96 cavidades (nove placas). Cinco cavidades"brancas" e uma cavidade de um "pool" de peptídeo irrelevante, gag de SIV1foram incluídos em cada uma das nove placas. Cinco cavidades "brancos" euma cavidade de um "pool" de peptídeo irrelevante, gag de SIV, foram inclu-ídos em cada uma das nove placas. Para avaliar os clones em relação à bi-blioteca de genômica de peptídeos, os clones são primeiro expandidos etestados em relação a DCs infectadas com Mtb para garantir que cada clonedessa expansão particular produza um sinal Mtb-específico forte no ensaiode ELISPOT.
Para a varredura, clones de célula T (5.000 células/cavidade decada clone), DCs autólogas (20.000 células/cavidade), IL-2 (0,5 ng/ml) e os"pools" de peptídeo (5ug/ml, peptídeos individuais) foram incubados durantea noite a 37eC no ensaio de ELISPOT. Apenas uma repetição da técnica éfeita por "pool" porque 5000 clones de célula T por cavidade com um antíge-no peptídico produziram uma resposta extremamente positiva, resultandoem um resultado definitivo. Seis clones clássicos de D504 foram avaliadosem relação à biblioteca genômica de peptídeos, levando à descoberta de umnovo epítopo. Esse epítopo era de uma família de quatro proteínas, incluindoEsxJ, EsxW, EsxK e EsxP. Essas proteínas partilham 98% de homologia ediferem apenas em 3 aminoácidos. Há um quinto membro dessa família,EsxM (Rv1792), que não foi incluído na biblioteca genômica de peptídeos.
Os clones foram avaliados em relação aos quinze-mers individu-ais para esses "pools" de peptídeo. Todos os seis clones clássicos reconhe-ceram EsxJ 21-35. Esta é uma região de EsxJ que é idêntica aos outrosquatro membros desta família. A seguir, peptídeos de 9, 10 e 11mers foramfeitos a partir destes 15 mers e avaliados em relação a cada clone. O epíto-po mínimo foi determinado como sendo EsxJ 24-34. Além disso, restriçãopor HLA foi observada como sendo e B5701.Exemplo 4
Varredura adicional de clones de célula T em relação a uma bibliotecaqenômica de peptídeos
Onze clones clássicos de D432B foram avaliados em relação àbiblioteca genômica de peptídeos descrita acima. O antígeno foi determina-do para dois clones, o que levou à identificação de dois novos epítopos,PE_PGRS4247.55 e PE953-67. O epítopo mínimo para um clone foi determina-do como sendo PE_PGRS4247-55 e a restrição por HLA foi observada comosendo B3514. O epítopo mínimo para o outro clone ainda não foi determina-do, mas está contido no PE953-67 de 15 mer. A restrição por HLA para esseclone foi observada como sendo B3905.
Tabela IV. Detalhe de novos epítopos das varreduras da biblioteca genômicade peptídeos (1â parte)
<table>table see original document page 89</column></row><table>
Número de clones reconhecendo epítopo de cada doador em parênteses.
Esta é uma família de proteínas que têm seqüências quase idênticas. Estafamília consiste em Rv1038c, Rv1197, Rv2347, Rv3620c.Tabela V(2ã parte)
<table>table see original document page 90</column></row><table>
<table>table see original document page 90</column></row><table>
* O clone clássico de D454 não reconheceu Mtb por re-expansão e não foiavaliado em relação à biblioteca.** Os clones clássicos de 426 e 431 foram avaliados juntos, então haviauma cavidade positiva entre ambos os clones.Exemplo 5
Varredura de células T CDe+ ex vivo contra uma biblioteca genômica de pep-tídeos
Células T CD8+ de um doador de LTBI1 D610 (SE Asian) foras avaliadas emrelação à biblioteca genômica de peptídeo descrita acima. Cada placa dabiblioteca genômica de peptídeos foi avaliada em duplicata, para um total de18 placas de ELISPOT por varredura. Células T CD8+ foram preparadas apartir de PBMC criopreservada por seleção de CD8+ usando separaçõescom esferas magnéticas. As populações de células resultantes continham>96% de células T CD8+. Células T CD8+ (250.000 células/cavidade), DCsautólogas (20.000 células/cavidade), e IL-2 (0,5ng/ml) foram adicionadas aopeptídeo (5ug/ml final, peptídeos individuais) nas placas de ELISPOT. Cincocavidades de controle com meio são incluídos em cada placa. Para cadaplaca, a média dessas cinco cavidades foi subtraída de cada cavidade da-quela placa para normalização entre as placas. Cada repetição da técnicaem cada placa foi então classificada. Uma cavidade foi classificada positivase as unidades formadoras de "spots" (SFU), menos a média das cavidadescom meio, fosse maior do que ou igual a dez e a SFU fosse maior ou igual aduas vezes e média dos meios de cultura (Hudgens et al., J. Immunol. Me-thods 288: 19-34, 2004). Esse doador respondeu às quatro cavidades compeptídeo contendo EsxJ, EsxW, EsxK e EsxP. Células T CD8+ foram entãoavaliadas em relação a cada 15mer desses "pools" de peptídeo e foram ob-servadas respondendo apenas a EsxJ 21-35, a mesma região de EsxJ,EsxW, EsxK e EsxP que é descrita no exemplo 3 acima.Sete doadores adicionais foram avaliados em relação a biblioteca genômicade peptídeo. As 10 respostas mais altas estão detalhadas na Tabela 7. Osquatro "pools" de peptídeo destacados em amarelo contêm peptídeos deapenas um gene. Esses quatro genes contêm quatro epítopos novos.
Tabela 7. 10 respostas mais altas de varreduras de "pool" de peptídeos desete doadores. Unidades Formadoras de Spot são para 250.000 células TCD 8+<table>table see original document page 91</column></row><table><table>table see original document page 92</column></row><table>
Exemplo 6
Modelos animais
Em pesquisa de tuberculose, o modelo de camundongo tem sidomuito usado para estudar vários aspectos da doença. Camundongos podemser infectados por várias vias, incluindo intravenosa, intraperitoneal e tra-queal. Uma via é a aerossolização do organismo para infecção respiratória.Os camundongos são expostos ao aerossol em uma câmara (infecção pelocorpo inteiro ou apenas pelo nariz). A dose da invenção pode ser alteradapor manipular a concentração de Mtb no nebulizador ou tempo de exposi-ção. Uma baixa dose de infecção, tal como cerca de 50 unidades formado-ras de colônia (CFU) por aerossol resulta em um aumento lento e regularnos números de bactérias nos pulmões, atingindo um pico em quatro sema-nas, o que coincide com o número mais alto de células T nos pulmões. Operíodo inicial é considerado o estágio agudo da infecção. Após a infecção,há uma disseminação de bactérias para os nodos linfáticos mediastínicos.Iniciador de células T é geralmente detectável entre duas e três semanas.Após cerca de quatro semanas, o número de bactérias se estabiliza, e háuma lenta resposta patológica progressiva. Este sistema é usado para mo-delar a infecção ativa. Dessa forma, os polipeptídeos descritos acima, oupolinucleotídeos que codificam estes polipeptídeos podem ser administradosantes da infecção. A capacidade dos polipeptídeos de Mtb (ou polinucleotí-deos que codificam estes polipeptídios) de evitar infecção é então avaliada.Alternativamente, os camundongos são administrados com Mtb, e a habili-dade do polipeptídeo de Mtb (ou polinucleotídeos que codificam estes poli-peptídios) de tratar a infecção por Mtb é monitorada. A eficácia dos polipep-tídeos (ou polinucleotídeos) de Mtb pode ser monitorada por medir a respos-ta de célula T, tal como o número de células T CD8+ ou CD4+, e/ou medir aquantidade de bactérias, e/ou avaliar a patologia.
Protocolos exemplares são fornecidos abaixo (veja também Re-pique et al., Infec. Immun. 70: 3318-3323, 2002, incorporado aqui por refe-rência para um protocolo adicional):
A. Modelo de Camundongo de Curto Prazo:
Camundongos C57BL/6 são vacinados com uma composiçãoque inclui um ou mais polipeptídeos de Mtb, ou um polinucleotídeo que codi-fica esse ou mais polipeptídeos, de acordo com o protocolo apropriado eentão deixados repousar por 4 a 6 semanas. Os camundongos imunizadossão infectados com uma baixa dose de aerossol 50-100 CFU) de M. tubercu-losis virulento e a proteção é avaliada por determinar o número de bacilosviáveis 30 dias após o estímulo.
Contagens viáveis são realizadas nos pulmões e no baço decamundongos por homogeneizar os órgãos e plaquear diluições 10x seria-das sobre placas de ágar 7H11. As placas são incubadas por até 21 dias e onúmero de unidades formadores de colônia por órgão determinado.
Camundongos vacinados com BCG têm proteção de aproxima-damente 1 Log10 nos seus pulmões e baço quando comparados a camun-dongos tratados com PBS.
B. Modelo de porco da guiné de curto prazo
Porcos da guiné Hartley cruzados são vacinados com uma com-posição que inclui um ou mais polipeptídeos de Mtb, ou um polinucleotídeoque codifica esses um ou mais polipeptídeos e então deixados repousar por8 a 10 semanas. Porcos da guiné imunizados são infectados com uma baixadose de aerossol (10-30 CFU) de M. tuberculosis virulento e a proteção éavaliada por determinar o número de bacilos viáveis 30 dias após o estímulo.
Contagens viáveis são realizadas nos pulmões e no baço decamundongos por homogeneizar os órgãos e plaquear diluições 10x seria-das sobre placas de ágar 7H11. As placas são incubadas por até 21 dias e onúmero de unidades formadores de colônia por órgão determinado. Seg-mentos de pulmão e baço também são retirados para análises histológicas.
Porcos da guiné vacinados com BCG têm proteção de aproxi-madamente 2 a 3Log10 nos seus pulmões e baço quando comparados aporcos da guiné tratados com PBS. Além disso, porcos da guiné tratadoscom BCG têm granulomas bem definidos quando comparados com animaisnão vacinados.C. Modelo de porco da guiné de longo prazo
O modelo de porco da guiné é similar ao modelo de camundon-go, mas os experimentos são do tipo aberto e podem durar até 2 anos. Osporcos da guiné desenvolvem granulomas "clássicos" similares aos sereshumanos com tuberculose ativa (TB) e a medida que a necrose tecidualpulmonar progride, eles começam a perder peso e morrem de TB da mesmaforma que seres humanos. O número de unidades formadoras de colônianos pulmões e baço pode ser determinado. Exame histológico também podeser realizado para determinar o grau de envolvimento pulmonar e destruiçãotecidual. Após exposição a baixa dose de aerossol no porco da guiné, o nú-mero de organismos aumenta progressivamente durante as 3 primeiras se-manas e então atinge um platô em um estado crônico. Durante os estágiostardios da infecção a carga bacteriana é aumentada nos pulmões e isto estáassociado com uma piora da condição patológica. Sem tratamento, há umaumento concomitante nas células T CD4 e CD8 nos pulmões de porcos daguiné não infectados.
Porcos da guiné cruzados são vacinados com a vacina experi-mental de acordo com o protocolo apropriado e então são deixados repousarpor 8 a 10 semanas. Porcos da guiné imunizados são infectados com umabaixa dose de aerossol (10-30 CFU) de M. tuberculosis virulento. Os porcosda guiné são pesados semanalmente e monitorados diariamente por sinaisde doença (tal como respiração aumentada e falha no crescimento (failure tothrive). Porcos da guiné não-vacinados sucumbem à infecção 20 a 25 sema-nas após o estímulo, enquanto que porcos da guiné sobrevivem vacinadoscom BCG sobrevivem por 50 a 55 semanas após o estímulo.
Na necropsia, o pulmão e baço são avaliados para o número deCFU e a extensão da patologia. A proteção relativa da composição experi-mental é comparada com a de animais vacinados com BCG.
Ficará claro que os detalhes precisos dos métodos ou composi-ções descritos podem ser alterados ou modificados sem desconsiderar oespírito da invenção descrita. Foram reivindicações tais modificações e vari-ações que estão dentro do escopo e espírito de acordo com as reivindica-ções abaixo.Listagem de Seqüência
<110> Oregon Health and Science UniversityDavid , Lewinsohn M.Deborah, Lewinsohn A.<120> Métodos para produzir uma resposta imune à tuberculose<130> 899-77364-02<150> US 60/782,364<151> 2006-03-14<160> 38
<170> PatentIn versão 3.3<210> 1<211> 97<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2) . . (2)
<223> Xaa pode ser A ou T
<220>
<221> MISC_FEATURE<222> (58)..(58)<223> Xaa pode ser T ou A<220>
<221> MISC_FEATURE<222> (59).. (59)
<223> Xaa qualquer aminoácido ou nenhum aminoácido<400> 1
Met Xaa Ser Arg Phe Met Thr Asp Pro His Ala Met Arg Asp Met Ala1 5 10 15
Gly Arg Phe Glu Val His Ala Gln Thr Val Glu Asp Glu Ala Arg Arg
20 25 30
Met Trp Ala Ser Ala Gln Asn Ile Ser Gly Ala Gly Trp Ser Gly Met35 40 45
Ala Glu Ala Thr Ser Leu Asp Thr
50 55
Arg Asn Ile Val Asn Met Leu His65 70
Asp Ala Asn Asn Tyr Glu Gln Gln85
Ser
45
Met Xaa Xaa Met Asn Gln Ala Phe60
Gly Val Arg Asp Gly Leu Val Arg
75 80
Glu Gln Ala Ser Gln Gln Ile Leu90 95
<210> 2<211> 97<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis<400> 2
Met Ala Ser Arg Phe Met Thr Asp Pro His Ala Met Arg Asp Met Ala1 5 10 15
Gly Arg Phe Glu Val His Ala Gln Thr Val Glu Asp Glu Ala Arg Arg
20 25 30
Met Trp Ala Ser Ala Gln Asn Ile Ser Gly Ala Gly Trp Ser Gly Met
35 40 45
Ala Glu Ala Thr Ser Leu Asp Thr Met Thr Gln Met Asn Gln Ala Phe
50 55 60
Arg Asn Ile Val Asn Met Leu His Gly Val Arg Asp Gly Leu Val Arg65 70 75 80
Asp Ala Asn Asn Tyr Glu Gln Gln Glu Gln Ala Ser Gln Gln Ile Leu85 90 95
Ser
<210> 3
<211> 98
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis<400> 3
Met Ala Ser Arg Phe Met Thr Asp1 5
Gly Arg Phe Glu Val His Ala Gln20
Met Trp Ala Ser Ala Gln Asn Ile
35 40
Ala Glu Ala Thr Ser Leu Asp Thr
50 55
Arg Asn Ile Val Asn Met Leu His65 70
Asp Ala Asn Asn Tyr Glu Gln Gln85
Ser Ser
Pro His Ala Met Arg Asp Met Ala
10 15
Thr Val Glu Asp Glu Ala Arg Arg25 30
Ser Gly Ala Gly Trp Ser Gly Met45
Met Ala Gln Met Asn Gln Ala Phe60
Gly Val Arg Asp Gly Leu Val Arg
75 80
Glu Gln Ala Ser Gln Gln Ile Leu90 95
<210> 4<211> 97<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis<400> 4
Met Ala Ser Arg Phe Met Thr Asp Pro His Ala Met Arg Asp Met Ala1 5 10 15
Gly Arg Phe Glu Val His Ala Gln Thr Val Glu Asp Glu Ala Arg Arg
20 25 30
Met Trp Ala Ser Ala Gln Asn Ile Ser Gly Ala Gly Trp Ser Gly Met
35 40 45
Ala Glu Ala Thr Ser Leu Asp Thr Met Thr Met Asn Gln Ala Phe Arg
50 55 60
Asn Ile Val Asn Met Leu His Gly Val Arg Asp Gly Leu Val Arg Asp65 70 75 80
Ala Asn Asn Tyr Glu Gln Gln Glu Gln Ala Ser Gln Gln Ile Leu Ser85 90 95Ser
<210> 5<211> 98<212> PRT
<213> Mycobacterivun tuberculosis<400> 5
Met Ala Thr Arg Phe Met Thr Asp Pro His Ala Met Arg Asp Met Ala15 10 15
Gly Arg Phe Glu Val His Ala Gln Thr Val Glu Asp Glu Ala Arg Arg
20 25 30
Met Trp Ala Ser Ala Gln Asn Ile Ser Gly Ala Gly Trp Ser Gly Met
35 40 45
Ala Glu Ala Thr Ser Leu Asp Thr Met Ala Gln Met Asn Gln Ala Phe
50 55 60
Arg Asn Ile Val Asn Met Leu His Gly Val Arg Asp Gly Leu Val Arg65 70 75 80
Asp Ala Asn Asn Tyr Glu Gln Gln Glu Gln Ala Ser Gln Gln Ile Leu85 90 95
Ser Ser
<210> 6<211> 98<212> PRT
<213> Myeobacterium tuberculosis<400> 6
Met Thr Ser Arg Phe Met Thr Asp Pro His Ala Met Arg Asp Met Ala15 10 15
Gly Arg Phe Glu Val His Ala Gln Thr Val Glu Asp Glu Ala Arg Arg
20 25 30
Met Trp Ala Ser Ala Gln Asn Ile Ser Gly Ala Gly Trp Ser Gly Met35 40 45Ala Glu Ala Thr Ser Leu Asp Thr Met Thr Gln Met Asn Gln Ala Phe
50 55 60
Arg Asn Ile Val Asn Met Leu His Gly Val Arg Asp Gly Leu Val Arg65 70 75 80
Asp Ala Asn Asn Tyr Glu Gln Gln Glu Gln Ala Ser Gln Gln Ile Leu85 90 95
Ser Ser
<210> 7<211> 144<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis<400> 7
Met Ser Tyr Met Ile Ala Thr Pro Ala Ala Leu Thr Ala Ala Ala Thr1 5 10 15
Asp Ile Asp Gly Ile Gly Ser Ala Val Ser Val Ala Asn Ala Ala Ala
20 25 30
Val Ala Ala Thr Thr Gly Val Leu Ala Ala Gly Gly Asp Glu Val Leu
35 40 45
Ala Ala Ile Ala Arg Leu Phe Asn Ala Asn Ala Glu Glu Tyr His Ala
50 55 60
Leu Ser Ala Gln Val Ala Ala Phe Gln Thr Leu Phe Val Arg Thr Leu65 70 75 80
Thr Gly Gly Cys Gly Val Phe Arg Arg Arg Arg Gly Arg Gln Cys Val
85 90 95
Thr Ala Ala Glu His Arg Ala Ala Gly Ala Gly Arg Arg Gln Arg Arg
100 105 110
Arg Arg Ser Gly Asp Gly Gln Trp Arg Leu Arg Gln Gln Arg His Phe
115 120 125
Gly Cys Gly Gly Gln Pro Glu Phe Arg Gln His Ser Glu His Arg Arg
130 135 140
<210> 8<211> 694<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis<400> 8
Val Ser Leu Val Ile Ala Thr Pro Gln Leu Leu Ala Thr Ala Ala Leu1 5 10 15
Asp Leu Ala Ser Ile Gly Ser Gln Val Ser Ala Ala Asn Ala Ala Ala
20 25 30
Ala Met Pro Thr Thr Glu Val Val Ala Ala Ala Ala Asp Glu Val Ser
35 40 45
Ala Ala Ile Ala Gly Leu Phe Gly Ala His Ala Arg Gln Tyr Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Val Gln Val Ala Ala Phe His Glu Gln Phe Val Gln Ala Leu65 70 75 80
Thr Ala Ala Ala Gly Arg Tyr Ala Ser Thr Glu Ala Ala Val Glu Arg
85 90 95
Ser Leu Leu Gly Ala Val Asn Ala Pro Thr Glu Ala Leu Leu Gly Arg
100 105 110
Pro Leu Ile Gly Asn Gly Ala Asp Gly Thr Ala Pro Gly Gln Pro Gly
115 120 125
Ala Ala Gly Gly Leu Leu Phe Gly Asn Gly Gly Asn Gly Ala Ala Gly
130 135 140
Gly Phe Gly Gln Thr Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ala Gly Leu Ile Gly145 150 155 160
Asn Gly Gly Asn Gly Gly Ala Gly Gly Thr Gly Ala Ala Gly Gly Ala
165 170 175
Gly Gly Asn Gly Gly Trp Leu Trp Gly Asn Gly Gly Asn Gly Gly Val
180 185 190
Gly Gly Thr Ser Val Ala Ala Gly Ile Gly Gly Ala Gly Gly Asn Gly
195 200 205
Gly Asn Ala Gly Leu Phe Gly His Gly Gly Ala Gly Gly Thr Gly Gly210 215 220Ala Gly Leu Ala Gly Ala Asn Gly Val Asn Pro Thr Pro Gly Pro Ala225 230 235 240
Ala Ser Thr Gly Asp Ser Pro Ala Asp Val Ser Gly Ile Gly Asp Gln
245 250 255
Thr Gly Gly Asp Gly Gly Thr Gly Gly His Gly Thr Ala Gly Thr Pro
260 265 270
Thr Gly Gly Thr Gly Gly Asp Gly Ala Thr Ala Thr Ala Gly Ser Gly
275 280 285
Lys Ala Thr Gly Gly Ala Gly Gly Asp Gly Gly Thr Ala Ala Ala Gly
290 295 300
Gly Gly Gly Gly Asn Gly Gly Asp Gly Gly Val Ala Gln Gly Asp Xle305 310 315 320
Ala Ser Ala Phe Gly Gly Asp Gly Gly Asn Gly Ser Asp Gly Val Ala
325 330 335
Ala Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ala Gly Gly Gly Ala Phe Val
340 345 350
His Ile Ala Thr Ala Thr Ser Thr Gly Gly Ser Gly Gly Phe Gly Gly
355 360 365
Asn Gly Ala Ala Ser Ala Ala Ser Gly Ala Asp Gly Gly Ala Gly Gly
370 375 380
Ala Gly Gly Asn Gly Gly Ala Gly Gly Leu Leu Phe Gly Asp Gly Gly385 390 395 400
Asn Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ile Gly Gly Asp Gly Ala Thr
405 410 415
Gly Gly Pro Gly Gly Ser Gly Gly Asn Ala Gly Ile Ala Arg Phe Asp
420 425 430
Ser Pro Asp Pro -Glu Ala Glu Pro Asp Val Val Gly Gly Lys Gly Gly
435 440 445
Asp Gly Gly Lys Gly Gly Ser Gly Leu Gly Val Gly Gly Ala Gly Gly
450 455 460
Thr Gly Gly Ala Gly Gly Asn Gly Gly Ala Gly Gly Leu Leu Phe Gly465 470 475 480Asn Gly Gly Asn Gly Gly Asn Ala Gly Ala Gly Gly Asp Gly Gly Ala
485 490 495
Gly Val Ala Gly Gly Val Gly Gly Asn Gly Gly Gly Gly Gly Thr Ala
500 505 510
Thr Phe His Glu Asp Pro Val Ala Gly Val Trp Ala Val Gly Gly Val
515 520 525
Gly Gly Asp Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Leu Gly Val Gly Gly Val
530 535 540
Gly Gly Ala Gly Gly Val Gly Gly Lys Gly Gly Ala Ser Gly Met Leu
545 550 555 560
Ile Gly Asn Gly Gly Asn Gly Gly Ser Gly Gly Val Gly Gly Ala Gly
565 570 575
Gly Val Gly Gly Ala Gly Gly Asp Gly Gly Asn Gly Gly Ser Gly Gly
580 585 590
Asn Ala Ser Thr Phe Gly Asp Glu Asn Ser Ile Gly Gly Ala Gly Gly
595 600 605
Thr Gly Gly Asn Gly Gly Asn Gly Ala Asn Gly Gly Asn Gly Gly Ala
610 615 620
Gly Gly Ile Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ser Gly Gly Phe Leu Ser Gly
625 630 635 640
Ala Ala Gly Val Ser Gly Ala Asp Gly Ile Gly Gly Ala Gly Gly Ala
645 650 655
Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ser Gly Gly Glu Ala Gly Ala Gly
660 665 670
Gly Leu Thr Asn Gly Pro Gly Ser Pro Gly Val Ser Gly Thr Glu Gly
675 680 685
Met Ala Gly Ala Pro Gly
690<210> 9<211> 325<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis<400> 9
Met His Gln Val Asp Pro Asn Leu Thr Arg Arg Lys Gly Arg Leu Ala1 5 10 15
Ala Leu Ala Ile Ala Ala Met Ala Ser Ala Ser Leu Val Thr Val Ala
20 25 30
Val Pro Ala Thr Ala Asn Ala Asp Pro Glu Pro Ala Pro Pro Val Pro
35 40 45
Thr Thr Ala Ala Ser Pro Pro Ser Thr Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro
50 55 60
Ala Thr Pro Val Ala Pro Pro Pro Pro Ala Ala Ala Asn Thr Pro Asn65 70 75 80
Ala Gln Pro Gly Asp Pro Asn Ala Ala Pro Pro Pro Ala Asp Pro Asn
85 90 95
Ala Pro Pro Pro Pro Val Ile Ala Pro Asn Ala Pro Gln Pro Val Arg
100 105 110
Ile Asp Asn Pro Val Gly Gly Phe Ser Phe Ala Leu Pro Ala Gly Trp
115 120 125
Val Glu Ser Asp Ala Ala His Phe Asp Tyr Gly Ser Ala Leu Leu Ser
130 135 140
Lys Thr Thr Gly Asp Pro Pro Phe Pro Gly Gln Pro Pro Pro Val Ala145 150 155 160
Asn Asp Thr Arg Ile Val Leu Gly Arg Leu Asp Gln Lys Leu Tyr Ala
165 170 175
Ser Ala Glu Ala Thr Asp Ser Lys Ala Ala Ala Arg Leu Gly Ser Asp
180 185 190
Met Gly Glu Phe Tyr Met Pro Tyr Pro Gly Thr Arg Ile Asn Gln Glu
195 200 205
Thr Val Ser Leu Asp Ala Asn Gly Val Ser Gly Ser Ala Ser Tyr Tyr
210 215 220
Glu Val Lys Phe Ser Asp Pro Ser Lys Pro Asn Gly Gln Ile Trp Thr225 230 235 240
Gly Val Ile Gly Ser Pro Ala Ala Asn Ala Pro Asp Ala Gly Pro ProGln Arg Trp
Lys Gly Ala275
Pro Pro Pro
290Ala Pro Ala305
Arg Thr Leu
<210> 10<211> 582<212> PRT<213> Mycobacterium tuberculosis<400> 10
Met Leu Leu Ala Leu Leu Arg Gln His Ile Arg Pro Tyr Arg Arg Leu1 5 10 15
Val Ala Met Leu Met Met Leu Gln Leu Val Ser Thr Leu Ala Ser Leu
20 25 30
Tyr Leu Pro Thr Val Asn Ala Ala Ile Val Asp Asp Gly Val Ala Lys
35 40 45
Gly Asp Thr Ala Thr Ile Val Arg Leu Gly Ala Val Met Leu Gly Val
50 55 60
Thr Gly Leu Gln Val Leu Cys Ala Ile Gly Ala Val Tyr Leu Gly Ser65 70 75 80
Arg Thr Gly Ala Gly Phe Gly Arg Asp Leu Arg Ser Ala Met Phe Glu
85 90 95
His Ile Ile Thr Phe Ser Glu Arg Glu Thr Ala Arg Phe Gly Ala Pro
100 105 110
Thr Leu Leu Thr Arg Ser Thr Asn Asp Val Arg Gln Ile Leu Phe Leu115 120 125
245
Phe Val Val Trp Leu Gly260 265
Ala Lys Ala Leu Ala Glu280
Ala Pro Ala Pro Ala Pro295
Gly Glu Val Ala Pro Thr310
Pro Ala325
250 255
Thr Ala Asn Asn Pro Val Asp270
Ser Ile Arg Pro Leu Val Ala285
Ala Glu Pro Ala Pro Ala Pro300
Pro Thr Thr Pro Thr Pro Gln315 320Val Gln Met Thr Ala Thr Val Leu Val Thr Ala Pro Ile Met Cys Val
130 135 140
Gly Gly Ile Ile Met Ala Ile His Gln Glu Ala Ala Leu Thr Trp Leu145 150 155 160
Leu Leu Val Ser Val Pro Ile Leu Ala Val Ala Asn Tyr Trp Ile Ile
165 170 175
Ser His Met Leu Pro Leu Phe Arg Arg Met Gln Ser Leu Ile Asp Gly
180 185 190
Ile Asn Arg Val Met Arg Asp Gln Leu Ser Gly Val Arg Val Val Arg195 200 205
Ala Phe Thr Arg Glu Gly Tyr Glu Arg Asp Lys Phe Ala Gln Ala Asn
210 215 220
Thr Ala Leu Ser Asn Ala Ala Leu Ser Ala Gly Asn Trp Gln Ala Leu225 230 235 240
Met Leu Pro Val Thr Thr Leu Thr Ile Asn Ala Ser Ser Val Ala Leu
245 250 255
Ile Trp Phe Gly Gly Leu Arg Ile Asp Ser Gly Gln Met Gln Val Gly
260 265 270
Ser Leu Ile Ala Phe Leu Ser Tyr Phe Ala Gln Ile Leu Met Ala Val 275 280 285
Leu Met Ala Thr Met Thr Leu Ala Val Leu Pro Arg Ala Ser Val Cys
290 295 300
Ala Glu Arg Ile Thr Glu Val Leu Ser Thr Pro Ala Ala Leu Gly Asn305 310 315 320
Pro Asp Asn Pro Lys Phe Pro Thr Asp Gly Val Thr Gly Val Val Arg
325 330 335
Leu Ala Gly Ala Thr Phe Thr Tyr Pro Gly Ala Asp Cys Pro Val Leu
340 345 350
Gln Asp Ile Ser Leu Thr Ala Arg Pro Gly Thr Thr Thr Ala Ile Val355 360 365
Gly Ser Thr Gly Ser Gly Lys Ser Thr Leu Val Ser Leu Ile Cys Arg370 375 380Leu Tyr Asp Val Thr Ala Gly Ala Val Leu Val Asp Gly Ile Asp Val385 390 395 400
Arg Glu Tyr His Thr Glu Arg Leu Trp Ser Ala Ile Gly Leu Val Pro
405 410 415
Gln Arg Ser Tyr Leu Phe Ser Gly Thr Val Ala Asp Asn Leu Arg Tyr
420 425 430
Gly Gly Gly Pro Asp Gln Val Val Thr Glu Gln Glu Met Trp Glu Ala
435 440 445
Leu Arg Val Ala Ala Ala Asp Gly Phe Val Gln Thr Asp Gly Leu Gln
450 455 460
Thr Arg Val Ala Gln Gly Gly Val Asn Phe Ser Gly Gly Gln Arg Gln465 470 475 480
Arg Leu Ala Ile Ala Arg Ala Val Ile Arg Arg Pro Ala Ile Tyr Val
485 490 495
Phe Asp Asp Ala Phe Ser Ala Leu Asp Val His Thr Asp Ala Lys Val
500 505 510
His Ala Ser Leu Arg Gln Val Ser Gly Asp Ala Thr Ile Ile Val Val
515 520 525
Thr Gln Arg Ile Ser Asn Ala Ala Gln Ala Asp Gln Val Ile Val Val
530 535 540
Asp Asn Gly Lys Ile Val Gly Thr Gly Thr His Glu Thr Leu Leu Ala545 550 555 560
Asp Cys Pro Thr Tyr Ala Glu Phe Ala Ala Ser Gln Ser Leu Ser Ala
565 570 575
Thr Val Gly Gly Val Gly580
<210> 11<211> 468<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis<400> 11
Met Ser Tyr Val Ile Ala Ala Pro Glu Met Leu Ala Thr Thr Ala Ala15 10 15
Asp Val Asp Gly Ile Gly Ser Ala Ile Arg Ala Ala Ser Ala Ser Ala
20 25 30
Ala Gly Pro Thr Thr Gly Leu Leu Ala Ala Ala Ala Asp Glu Val Ser
35 40 45
Ser Ala Ala Ala Ala Leu Phe Ser Glu Tyr Ala Arg Glu Cys Gln Glu
50 55 60
Val Leu Lys Gln Ala Ala Ala Phe His Gly Glu Phe Thr Arg Ala Leu65 70 75 80
Ala Ala Ala Gly Ala Ala Tyr Ala Gln Ala Glu Ala Ser Asn Thr Ala
85 90 95
Ala Met Ser Gly Thr Ala Gly Ser Ser Gly Ala Leu Gly Ser Val Gly
100 105 110
Met Leu Ser Gly Asn Pro Leu Thr Ala Leu Met Met Gly Gly Thr Gly
115 120 125
Glu Pro Ile Leu Ser Asp Arg Val Leu Ala Ile Ile Asp Ser Ala Tyr
130 135 140
Ile Arg Pro Ile Phe Gly Pro Asn Asn Pro Val Ala Gln Tyr Thr Pro145 150 155 160
Glu Gln Trp Trp Pro Phe Ile Gly Asn Leu Ser Leu Asp Gln Ser Ile
165 170 175
Ala Gln Gly Val Thr Leu Leu Asn Asn Gly Ile Asn Ala Glu Leu Gln
180 185 190
Asn Gly His Asp Val Val Val Phe Gly Tyr Ser Gln Ser Ala Ala Val
195 200 205
Ala Thr Asn Glu Ile Arg Ala Leu Met Ala Leu Pro Pro Gly Gln Ala
210 215 220
Pro Asp Pro Ser Arg Leu Ala Phe Thr Leu Ile Gly Asn Ile Asn Asn225 230 235 240
Pro Asn Gly Gly Val Leu Glu Arg Tyr Val Gly Leu Tyr Leu Pro Phe
245 250 255
Leu Asp Met Ser Phe Asn Gly Ala Thr Pro Pro Asp Ser Pro Tyr Gln260 265 270
Thr Tyr Met Tyr Thr Gly Gln Tyr Asp Gly Tyr Ala His Asn Pro Gln
275 280 285
Tyr Pro Leu Asn Ile Leu Ser Asp Leu Asn Ala Phe Met Gly Ile Arg
290 295 300
Trp Val His Asn Ala Tyr Pro Phe Thr Ala Ala Glu Val Ala Asn Ala305 310 315 320
Val Pro Leu Pro Thr Ser Pro Gly Tyr Thr Gly Asn Thr His Tyr Tyr
325 330 335
Met Phe Leu Thr Gln Asp Leu Pro Leu Leu Gln Pro Ile Arg Ala Ile
340 345 350
Pro Phe Val Gly Thr Pro Ile Ala Glu Leu Ile Gln Pro Asp Leu Arg
355 360 365
Val Leu Val Asp Leu Gly Tyr Gly Tyr Gly Tyr Ala Asp Val Pro Thr
370 375 380
Pro Ala Ser Leu Phe Ala Pro Ile Asn Pro Ile Ala Val Ala Ser Ala385 390 395 400
Leu Ala Thr Gly Thr Val Gln Gly Pro Gln Ala Ala Leu Val Ser Ile
405 410 415
Gly Leu Leu Pro Gln Ser Ala Leu Pro Asn Thr Tyr Pro Tyr Leu Pro
420 425 430
Ser Ala Asn Pro Gly Leu Met Phe Asn Phe Gly Gln Ser Ser Val Thr
435 440 445
Glu Leu Ser Val Leu Ser Gly Ala Leu Gly Ser Val Ala Arg Leu Ile
450 455 460
Pro Pro Ile Ala465
<210> 12<211> 3716<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis<400> 12Met Glu Phe Pro Val Leu Pro Pro Glu Ile Asn Ser Val Leu Met Tyr15 10 15
Ser Gly Ala Gly Ser Ser Pro Leu Leu Ala Ala Ala Ala Ala Trp Asp
20 25 30
Gly Leu Ala Glu Glu Leu Gly Ser Ala Ala Val Ser Phe Gly Gln Val
35 40 45
Thr Ser Gly Leu Thr Ala Gly Val Trp Gln Gly Ala Ala Ala Ala Ala
50 55 60
Met Ala Ala Ala Ala Ala Pro Tyr Ala Gly Trp Leu Gly Ser Val Ala65 70 75 80
Ala Ala Ala Glu Ala Val Ala Gly Gln Ala Arg Val Val Val Gly Val
85 90 95
Phe Glu Ala Ala Leu Ala Ala Thr Val Asp Pro Ala Leu Val Ala Ala
100 105 110
Asn Arg Ala Arg Leu Val Ala Leu Ala Val Ser Asn Leu Leu Gly Gln
115 120 125
Asn Thr Pro Ala Ile Ala Ala Ala Glu Ala Glu Tyr Glu Leu Met Trp
130 135 140
Ala Ala Asp Val Ala Ala Met Ala Gly Tyr His Ser Gly Ala Ser Ala145 150 155 160
Ala Ala Ala Ala Leu Pro Ala Phe Ser Pro Pro Ala Gln Ala Leu Gly
165 170 175
Gly Gly Val Gly Ala Phe Leu Thr Ala Leu Phe Ala Ser Pro Ala Lys
180 185 190
Ala Leu Ser Leu Asn Ala Gly Leu Gly Asn Val Gly Asn Tyr Asn Val
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Gly Leu Gly Asn Val Gly Val Phe Asn Leu Gly Ala Gly Asn Val Gly
210 215 220
Gly Gln Asn Leu Gly Phe Gly Asn Ala Gly Gly Thr Asn Val Gly Phe225 230 235 240
Gly Asn Leu Gly Asn Gly Asn Val Gly Phe Gly Asn Ser Gly Leu Gly245 250 255Ala Gly Leu Ala Gly Leu Gly Asn Ile Gly Leu Gly Asn Ala Gly Ser
260 265 270
Ser Asn Tyr Gly Phe Ala Asn Leu Gly Val Gly Asn Ile Gly Phe Gly
275 280 285
Asn Thr Gly Thr Asn Asn Val Gly Val Gly Leu Thr Gly Asn His Leu
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Thr Gly Ile Gly Gly Leu Asn Ser Gly Thr Gly Asn Ile Gly Leu Phe305 310 315 320
Asn Ser Gly Thr Gly Asn Val Gly Phe Phe Asn Ser Gly Thr Gly Asn
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Phe Gly Val Phe Asn Ser Gly Asn Tyr Asn Thr Gly Val Gly Asn Ala
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Gly Asp Tyr Gln Gly Leu Phe Gly Val Ser Ala Gly Ser Ser Ile Pro
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Ala Ile Pro Ile Gly Leu Val Leu Asn Gly Asp Ile Gly Pro Ile Thr
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<213> Myeobaeterium tuberculosis<400> 15
atggeetegc gttttatgae ggatccgcac gcgatgcggg acatggcggg eegttttgag 60gtgcacgccc agacggtgga ggacgaggct cgecggatgt gggcgtccgc gcaaaacatc 120tcgggcgcgg gctggagtgg catggccgag gcgacctcgc tagacaccat gacccagatg 180aatcaggcgt ttcgcaacat cgtgaacatg ctgcacgggg tgcgtgacgg gctggttcgc 240gacgccaaca actacgaaca gcaagagcag gcc-tcccagc agatcctcag cagctga 297
Ser Gly Ile Leu Asn Arg Gly Ala Gly
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<211> 297
<212> DNA
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 16
atggcctcac gttttatgac ggatccgcac gcgatgcggg acatggcggg ccgttttgag 60
gtgcacgccc agacggtgga ggacgaggct cgccggatgt gggcgtccgc gcaaaacatt 120tccggtgcgg gctggagtgg catggccgag gcgacctcgc tagacaccat ggcccagatg 180aatcaggcgt ttcgcaacat cgtgaacatg ctgcacgggg tgcgtgacgg gctggttcgc 240gacgccaaca actacgagca gcaagagcag gcctcccagc agatcctcag cagctaa 297
<210> 17<211> 297<212> DNA
<213> Mycobacterium tuberculosis<400> 17
atggcctcac gttttatgac ggatccgcat gcgatgcggg acatggcggg ccgttttgag 60
gtgcacgccc agacggtgga ggacgaggct cgccggatgt gggcgtccgc gcaaaacatt 120tccggtgcgg gctggagtgg catggccgag gcgacctcgc tagacaccat gacctagatg 180aatcaggcgt ttcgcaacat cgtgaacatg ctgcacgggg tgcgtgacgg gctggttcgc 240gacgccaaca actacgaaca gcaagagcag gcctcccagc agatcctgag cagctag 297
<210> 18<211> 297<212> DNA
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 18
atggcaacac gttttatgac ggatccgcac gcgatgcggg acatggcggg ccgttttgag 60
gtgcacgccc agacggtgga ggacgaggct cgccggatgt gggcgtccgc gcaaaacatc 120tcgggcgcgg gctggagtgg catggccgag gcgacctcgc tagacaccat ggcccagatg 180aatcaggcgt ttcgcaacat cgtgaacatg ctgcacgggg tgcgtgacgg gctggttcgc 240gacgccaaca actacgagca gcaagagcag gcctcccagc agatcctcag cagctaa 297
<210> 19<211> 297<212> DNA
<213> Mycobacterium tuberculosis<400> 19
atgacctcgc gttttatgac ggatccgcac gcgatgcggg acatggcggg ccgttttgag 60
gtgcacgccc agacggtgga ggacgaggct cgccggatgt gggcgtccgc gcaaaacatt 120tccggcgcgg gctggagtgg catggccgag gcgacctcgc tagacaccat gacccagatg 180aatcaggcgt ttcgcaacat cgtgaacatg ctgcacgggg tgcgtgacgg gctggttcgc 240gacgccaaca actacgaaca gcaagagcag gcctcccagc agatcctcag cagctga 297
<210> 20<211> 435
<212> DNA
<213> Mycobacterium tuberculosis<400> 20
atgtcataca tgattgccac accagcggcg ttgacggcgg cggcaacgga tatcgacggg 60
attggctcgg cggttagcgt tgcgaacgcc gcggcggtcg ccgcgacaac cggagtgctg 120gccgccggtg gcgatgaagt gttggcggcc atcgctaggc tgttcaacgc aaacgccgag 180gaatatcacg ccctcagcgc gcaggtggcg gcgtttcaaa ccctgtttgt gcgcaccttg 240actggggggt gcggagtctt tcgccggcgc cgaggccgcc aatgcgtcac agctgcagag 300catcgcgcgg caggtgcggg gcgccgtcaa cgccgtcgcc ggtcaggtga cgggcaatgg 360cggctccggc aacagcggca cttcggctgc ggcggccaac ccgaattccg acaacacagc 420gagcatcgcc gatag 43 5
<210> 21<211> 2085<212> DNA<213> Mycobacterium tuberculosis<400> 21
gtgtcgttgg tgatcgcgac gccgcagctg ctggcaactg cggctttgga tttagcgagt 60
attggttcgc aggtgagcgc ggctaatgcg gccgcggcga tgccgacgac ggaagtggtg 120gctgcggctg ccgatgaagt gtcggcggcg attgcggggt tgttcggggc ccatgctcgg 180cagtatcagg cgctcagcgt acaggtggca gcgtttcacg agcagtttgt gcaggcgttg 240actgcggccg cgggtcggta tgccagcact gaggccgctg ttgagcggag tctgctgggt 300gcggtgaatg cgcccaccga ggcgcttttg gggcgcccgt tgatcggaaa cggcgccgac 360gggacggcac ccgggcagcc tggcgcggccggcgcggctg gcgggttcgg tcaaaccggcaacggcggca acggcggggc cggtggtaccgggtggttgt ggggcaacgg cggcaacggcatcgggggtg cgggcggtaa cggcggcaacggtaccggcg gcgccggcct cgccggggcagccagcaccg gggacagccc ggcagatgtgggcggcacgg gcggccatgg cactgccggcgccaccgcga cggcaggctc gggcaaggccgccgctgccg gtggcggcgg cggcaacggcgcgagcgcct ttggcggtga tggtggcaacggtggtagcg gcggcgccgg aggcggcgctggtggtagcg gcggtttcgg tggtaacgggggcgcagggg gagctggcgg caatggtggcaacggtggcg ccggtggcgc gggtggtatcggaagcggcg gcaacgctgg catcgcgagggatgtggtcg gcggcaaggg tggtgatggcggcgccggcg ggaccggcgg cgcgggcggcaacggcggca acggcggcaa cgccggggccggggttggcg gtaacggcgg cggtggtggcggtgtctggg cggtcggtgg cgtaggtggtgtcggcgggg tgggcggagc cggtggcgtgatcggcaacg gcggcaacgg tggcagcggcgctggcggtg acggcggcaa cggcggctccaactccatcg gcggggccgg cgggacgggcaacggtggcg ctggcggtat tgccggcggtgccgcaggag tcagcggcgc tgacggtatcggcgcgggcg gtagcggcgg tgaggcaggccctggcgttt ccggcaccga aggcatggcc
<210> 22
<211> 978<212> DNA
ggcgggttgc tgtttggcaa cggtggcaac 420ggcagcggag gcgcggccgg gttgatcggc 480ggcgcggccg gcggtgccgg tgggaacggg 540ggtgtcggcg gcaccagcgt ggccgcaggc 600gccgggctgt tcggccatgg cggcgccggt 660aacggggtca atcccacgcc cggccccgcg 720tccggcatcg gtgatcaaac cggcggcgac 780acgccgaccg gtggcaccgg cggcgacggt 840accggcggtg ccggtggtga cggcggtacc 900ggcgacggcg gagtcgcgca gggcgacatt 960
gggtccgacg gtgtagccgc cggcagtggg 1020
ttcgtacaca tcgccactgc cacctctacc 1080
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ggtggtgacg gcgccacggg ggggcccggg 1260
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ggtggcgcgg gcggcgcagg cggtgccggt 1980
gcggggggcc tcaccaacgg ccccgggtcc 2040
ggcgcgcccg gctag 2085<213> Mycobacterium tuberculosis<400> 22
atgcatcagg tggaccccaa cttgacacgt cgcaagggac gattggcggc actggctatc 60
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ccggagccag cgcccccggt acccacaacg gccgcctcgc cgccgtcgac cgctgcagcg 180
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cctgtcattg ccccaaacgc accccaacct gtccggatcg acaacccggt tggaggattc 360
agcttcgcgc tgcctgctgg ctgggtggag tctgacgccg cccacttcga ctacggttca 420
gcactcctca gcaaaaccac cggggacccg ccatttcccg gacagccgcc gccggtggcc 480
aatgacaccc gtatcgtgct cggccggcta gaccaaaagc tttacgccag cgccgaagcc 540
accgactcca aggccgcggc ccggttgggc tcggacatgg gtgagttcta tatgccctac 600
ccgggcaccc ggatcaacca ggaaaccgtc tcgctcgacg ccaacggggt gtctggaagc 660
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ggcgtaatcg gctcgcccgc ggcgaacgca ccggacgccg ggccccctca gcgctggttt 780
gtggtatggc tcgggaccgc caacaacccg gtggacaagg gcgcggccaa ggcgctggcc 840
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gctccggcgc cggcgccggc cggggaagtc gctcctaccc cgacgacacc gacaccgcag 960
cggaccttac cggcctga 978
<210> 23
<211> 1749<212> DNA
<213> Mycobacterium tuberculosis<400> 23
atgctcctgg ccctgctgcg ccagcacatc cgaccgtacc gccggctggt cgcgatgctg 60
atgatgctgc agctggtcag caccctggct tcgctatacc tcccgacggt caacgccgca 120
atcgtcgacg acggcgtcgc caagggcgac accgccacca tcgtacggct gggtgcggtg 180
atgcttgggg tgaccggatt gcaggtgctg tgcgcgatcg gggcggtcta tctgggctcc 240
cggaccgggg cgggtttcgg ccgtgacctg cgctcggcaa tgttcgaaca catcatcacc 300
ttctcggaac gcgagaccgc ccgattcggc gctccgacgt tgttgacccg cagcaccaac 3 60
gacgtccggc agatcctgtt cctggtccag atgaccgcca ccgtgctggt caccgcaccg 420
atcatgtgcg tcggcggaat catcatggcc atccaccagg aggccgcgct gacatggctg 480ctgctggtca gcgttccgat tctggccgta gcaaactact ggatcatctc ccacatgctg 540
ccgctcttcc gccgcatgca gagcctgatc gacggcatca accgggtgat gcgcgatcag 600
ctgtccgggg tgcgagtggt ccgcgccttc acccgcgaag gctatgaacg cgacaagttc 660
gcgcaggcca atacggcgct gtcgaatgcc gcactgagcg ccggcaactg gcaagcactg 720
atgctgccgg tgaccacgct gaccatcaac gcatccagcg tcgcactgat ctggttcggt 780
gggctacgca tcgacagcgg ccagatgcag gtcggctccc tgatcgcctt cctgtcctac 840
ttcgcccaga tcctgatggc ggtgttgatg gcgaccatga cgctggccgt gctgccacga 900
gcgtcggtct gcgccgaacg catcaccgag gtgctttcca cgcccgccgc actcggtaac 960
cccgacaatc ccaagttccc gacggacggg gtcacgggcg tagtgcgctt ggctggcgca 1020
acctttacct atcctggcgc cgactgcccg gtgctgcagg acatttcgtt gactgcgcgg 1080
cccggtacca ccaccgcgat cgtcggcagt accggttcgg gcaagtcgac actggtgtcg 1140
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cgcgagtacc acaccgagcg gctctggtca gcgatcgggc tggtgcccca gcgcagctac 1260
ctcttctccg gaaccgtcgc ggacaacctg cgctacggcg ggggcccaga ccaggtagtc 1320
accgagcagg agatgtggga ggcgctgcgg gtcgccgcgg ccgacggctt tgtacaaaca 13 80
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ttctccgcac ttgacgtgca caccgacgcc aaagtccacg catcgctgcg acaggtatct 1560
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gattgcccca cctatgccga attcgccgcc tcacaatcgc tgagcgccac ggtcgggggt 1740
gtagggtga 1749<210> 24<211> 1407<212> DNA
<213> Mycobacterium tuberculosis<400> 24
atgtcctacg tcatcgcggc cccggagatg ttggcaacga cggccgcgga cgtggacggg 60
atcggttcgg cgatacgagc ggccagcgcg tccgctgcgg gtccaacgac cggactgctg 120
gccgcggccg ccgatgaggt gtcgtcggcc gctgcagcgc tgttcagcga atacgcgcgc 180
gaatgtcaag aggtcctaaa gcaggctgcg gcgttccatg gcgagttcac ccgggcgctg 240
gctgccgccg gggccgccta tgcccaggct gaagccagca acaocgctgc tatgtcgggc 300accgccgggt ccagcggcgc cctcggttct gtcgggatgc tgtcaggcaa cccgctaacc 360
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gacagcgcat acattcggcc cattttcggg cccaacaacc cggtcgccca gtacacgccc 480
gagcagtggt ggccgtttat cgggaacctg tcactggacc aatccatcgc ccagggtgtc 540
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ttcaacggtg cgactccacc ggattccccc taccagacct acatgtacac cggccaatac 840
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atgggcatca gatgggtgca caacgcgtac cccttcaccg cggccgaggt tgccaatgcc 960
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gagctgattc agcccgacct acgggtgcta gtcgacttgg gctatggcta cggctacgcc 1140
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<210> 25
<211> 11151<212> DNA
<213> Mycobacterium tuberculosis<400> 25
atggagtttc cggtgttgcc accggaaatc aactccgtgc tgatgtattc gggtgcgggg 60
tcgagcccgt tgctggcggc ggccgcggcg tgggatgggc tggctgagga gttggggtcg 120
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ggcggatcgg gcatcggcaa cttgggtgcg ggcgtgtcgg gcctgctcaa ccaggccggc 5580
gcggggtcac tggtggggac actctcgggg ctgggcaatg ccggcaccct ggcctcgggt 5640
gtgctgaact ccggcaccgc catctccggg ctgttcaacg tgagcacgct ggacgccacc 5700
accccggcgg tgatctcggg gttcagcaac ctcggcgacc atatgtcggg ggtgtccatc 5760
gatggcctga tcgcgatcct caccttccca cctgccgagt ccgtgttcga tcagatcatc 5820
gacgcggcca tcgccgagct gcagcacctc gacatcggca acgctttggc cttgggcaat 5880
gtcggcgggg tgaacctcgg tttggctaac gtcggtgagt tcaacctggg tgcgggcaac 5940
gtcggcaaca tcaacgtcgg cgccggcaac ctcggcggca gcaacttggg gttgggcaac 6000
gtcgggaccg gcaacctcgg gttcggcaac atcggtgccg gcaatttcgg attcggcaac 6060
gcgggcctga ccgcgggcgc ggggggcctg ggcaatgtgg ggttgggtaa cgccggcagc 6120
ggcagctggg ggttggccaa cgtgggtgtg ggcaatatcg ggttggccaa caccggcacc 6180
ggcaacatcg ggatcgggct gaccggggac tatcggaccg ggatcggcgg cctgaactcg 6240ggcaccggga acctcgggtt gttcaactcggggaccggga acttcgggct gttcaactcgggcacggcca gcaccgggtt gttcaacgcgggctcctaca acaccggcag cctcaacgtgggcaccgtca acaccggctg gttcaacaccggcaacgtca acaccggcgc gttcaactccggtgactacc acgggctggt cggcttctccctggacctca acgaaaccct caacctgggcggcatgtcgc tgttcgacgt ccacgaaatcgtcgatgttc ccgcgatacc gctagagatcctggtgcccg ccaccacaat tcccgcacagtcacccgggt caaccatgac gcttccgctcatcctcgggt cgaccgcggc gattcccaatggcatcacca ttcacaccgg ccctggccccccgggtttcg agattccgca aatcgctaccggtggtctgc cggccttcac cttgttcgcgccgttaacga tcgatgcgtc cggcgcgctgacgatcgacc cgctgccgct gcacctggcgccgatcatcg atgtcccgcc gacgccaggggggttcttca actccggcgc cggtggggtgtcgggctggt ggaaccaggc ggcgagcgcggtcggcacgc tgggctcggg tgtgctcaacaccagcgtgt tgccgctcgg gacgccggcgcagctgtcgg gcgtgtctgc ggccgggaccgggttggcgg atgtgggcaa cttcaacgtcggcgcggcca acctcggtgc gcaaaacctgggcttcgcca acgtcggcca cggcaatatcgcggccggcc tgggcaacac ggggttcggcaaccagggcg tgcgcaacat cgggttggccctggtggggg acaacctcac cggcatcgggttgttcaact ccggcaccgg caacatcgggatcggtaact cgggcagctt caacaccggc
ggcaccggca acatcgggtt cttcaacacc 6300
ggcagttaca gcaccggtgt ggggaatgcg 63 60
gggaacttca acaccggtct ggccaatgcc 6420
ggcagcttca acaccggcgg cgtcaacccg 6480
ggccacacca acaccggcct gttcaacacc 6540
ggcagcttca acaacggggc gctgtggacc 6600
ttcagcatcg acatcgccgg cagcaccctg 6660
cccatccaca tcgagcagat cgacatcccc 6720
gtcgagatcg gacccttcac catcccgcag 6780
cacgaatcga tccacatgga tcccatcgtc 6840
acgagaacca ttccgctgga catccccgcc 6900
atcagcatgc gcttcgaagg cgaggactgg 6960
ttcggagacc ccttcccggc gcccacccag 702 0
ggaacgaccg gcgagctcaa gatatctatt 7080
acgagattcc tgttggacgt gaacatcagc 7140
ggtggcctga cgatccccac gaacgccatc 7200
gatccgatca cgattttccc gggtgggtac 7260
ctgaatctca ccgtgcccga cagcagcatc 7320
ttcggcaaca ccacggcgac cccgtcgtcg 7380
tcggggttcg gaaacgtcgg gtcgaacctg 7440
ctggcggggt cgggatcggg ggtgttgaat 7500
gtcggctcgg gtgtctcggg gatctacaac 7560
gtgctgtcgg gcctcggcaa cgtcggccat 7620
gcgttgaacc agatccccat cctcaacatc 7680
gggttcggca acgtcgggga cgttaacctg 7740
gggctgggca acgtcggcac cggcaacctc 7800
ggtttcggca attcgggtct gaccgccggc 7860
aatgccggca gcgccaacta tggtttcgcc 7920
aacaccggca ccggcaacat cgggatcggg 7980
ggcctgaact ccggtgccgg caatatcggc 8040
ttcttcaact ccgggaccgg caacttcggc 8100
atcggcaata gcggaacggg cagcactggg 8160ctcttcaatg ccggcagctt caacaccggcagcttcaatg ccggcgacac caacaccgggtggttcaaca ccggccacac caataccggcgcgttcatgt cgggcaactt cagcaacggcttcagcctgt tctacagcct cgacgtgcccggcggcttcg gacccgtggt cctcccgcccaccggaaacg tcgcgatggg cgcattcaccccaaacatca ccggaagcgc cgccttccgcgtgagtgtca ttgtggagca aataatcaaccccttcgaaa tgtggactca aggcactaattcggccgacg gttcgcccta cgccaccggcggaagccatc tcaccatttc cgcgtccagcggcccgatca cgttgggctt ccaggtgcccggtggtttga cgttcccggc gacctcgctgggcgtggaca tcccggccat cacctggccctatgtcctcg ccagcagcat cccgctgatcagcaccatca ccccgtcgtc gggcttcttcggcaacttcg gcgcgggcac ctcgggctgggcgggctcgg gttttgccaa cgttggcacgggtgtctcgg ggatctacaa caccagcacgggcctgggca acgtcggcca ccaactgtcgccggtgaccg ttctgaatat cgggttggccaatgtcgggg aggtcaacct gggcgcggccaatatcggcg ccggcaacct ggggttcggcaactcgggtc tgaccgcggg cgtgccgggcggcaacaact gggggttggc caacgtgggcaccggcaaca ttgggatcgg gctgaccggctccggtgccg gcaacctggg gttgttcaacaccgggaccg gcaacttcgg gttgttcaacagcggaacgg gcagcactgg gctcttcaatgccggcagct acaacacggg cagcttcaatccgggcagca tcaacaccgg ctggctcaac
gtggccaacg ccggcagcta caacaccggc 8220
gggttcaacc cgggcaccat caacaccggc 8280
atcgccaact cgggcaacgt cggcaccggc 8340
ctgttgtggc ggggtgatca cgagggcctg 8400
cggatcacca tcgtggacgc ccacctcgac 8460
atcccggtgc cggccgttaa tgcgcacctg 8520
attccgcaga tcgacatccc cgcactcacc 8580
atcgttgtgg ggtccgtgcg cattccgccg 8640
gcctcggttg gggcggagat gaggatagat 8700
ggccttggta taaccttcta ttcattcgga 8760
ccactcgttt tcggcgccgg cacgagcgac 8820
ggggcgttta ccactccgca gctcgaaact 8880
ggcagcgtca acgcgatcac cctcttcccc 8940
ctgaacctgg acgtgaccgc cggcgccggc 9000
gagatcgcgg cgagcgccga cggctcggtg 9060
aacatcccgc ccaccccggg cattgggaac 9120
aacgccggcg cgggcggggg atcgggcttc 9180
tggaaccagg cgcacaccgc gctggcgggg 9240
ctgcattccg gtgtgctcaa cctgggctcg 9300
ctgggggtgg ggaccccggc gctggtctca 93 60
gggctgcttt ccggcgggtc cgcggtgaac 9420
aacgtcggca gccacaacgc cggtttcggc 9480
aacctcggcg cgcacaacct gggcttcgga 9540
aatattggcc acggcaatgt cggagtcggc 9600
ctgggcaatg tggggttggg caatgccggc 9660
gtgggcaata tcgggttggc caacaccggc 9720
gactaccaga ccggcatcgg cggcctaaat 9780
tccggcgccg gcaacgtcgg gttcttcaac 9840
tccggcagct tcaacaccgg cgtcggcaat 9900
gccggcagtt tcaacaccgg tgtggccaac 9960
gtcggtgaca ccaacaccgg gggcttcaac 10020
gccggcaacg ccaacaccgg ggtggccaac 10080101401020010260103201038010440105001056010620106801074010800108601092010980110401110011151<210> 26<211> 10<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis<400> 26
Ala Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu1 5 10
<210> 27<211> 10<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis<400> 27
Arg Ala Asp Glu Glu Gln Gln Gln Ala Leu15 10
gegggcaatg tcaacaecgg cgccttegtccgcggcgact accagggcct ggccggcttegcggtgggeg ccgacgteag cggcgggatcatcccgccca ttccggtcgg cttcgccgcggacatctctg ttccatccat tcacttgggcaccgtcaacc ccattaccgt caggaccccggtcaccagca cgtccggacc aacctcagagatccggatcg cgccctctag cggcgggggtgggcccatct ccatcccctc cggcacggtgccgatcgaca tcggcctgcc ggtgtcgctgaccctgatcc ccaccctccc gctgggcctcatcccggcca tcgttctcga ccggatcttgccgatcaacg tcccgatcgc cgggttcggcctgccgtcgt cgggcttctt caacaccggaggcgcgggca tgtcgggatt gctcaacgcgggcttcgcca acttcggcac ccagctctccggcgtgtaca acaccggcgc gctgggtgttaacgtcggcc agcaactgtc gggcttgctc
accggcaact tcagcaacgg catcctgtgggccgtgggct acaccctccc gctgttccccggcccgatta ccgtgctgcc gcccatccacgtcggtggca tcggcccgat cgccatcccgctcgaccccg ccgtccatgt cggctccatccccgtgctcg tcagttactc ccaaggagccatttgggtca agcccagctt cttccccggagcaacgtcca cgcaaggggc atactttgtgaccttcccgg gattcaccat ccccctcgacaccatcccgg ggttcaccat cccgggcggcgcgttgtcca atggcatccc gcccgtcgacctggacctgc acgccgacac cactatcggcggggcgccgg gtttcgggaa ctcgaccacggctggcggcg gttcgggctt tagcaacaccatgtcggatc cgctgctcgg gtcggcgtcgggcatcctca accgcggcgc cggcatctcggtcaccgcgg ccgtcgtctc gggtttcggcttcaccggcg tcgggcccta a<210> 28<211> 10<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis<400> 28
Thr Ala Ala Gln Ala Ala Val Val Arg Phe1 5 10
<210> 29<211> 8<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis<400> 29
Ala Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala
1 5
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis<400> 30
Ala Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala1 5 10
<210> 31<211> 9<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis<400> 31
Asn Ile Arg Gln Ala Gly Val Gln Tyr
1 5
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis<400> 32
Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu1 5
<210> 33<211> 10<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis<400> 33
Ala Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu1 5 10
<210> 34<211> 9<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis<400> 34
Leu Leu Asp Ala His Ile Pro Gln Leu
1 5
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis<400> 35
Ala Ala His Ala Arg Phe Val Ala Ala1 5
<210> 36<211> 11<212> PRT
<213> Mycobaeterium tuberculosis<400> 36
Ala Val Ile Asn Thr Thr Cys Asn Tyr Gly Gln1 5 10
<210> 37<211> 9<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis<400> 37
Ala Ser Pro Val Ala Gln Ser Tyr Leu1 5
<210> 38<211> 10<212> PRT
<213> Myeobacterium tuberculosi<400> 38
Glu Leu Pro Gln Trp Leu Ser Ala Asn Arg

Claims (55)

1. Método para produzir uma resposta imune ao Mycobacteriumtuberculosis em um indivíduo, compreendendoadministrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente efi-caz de um polipeptídeo, ou um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo,em que o polipeptídeo compreende:(a) pelo menos uma das seqüências de aminoácido descritascomo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ IDNO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ IDNO: 10, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12; ou(b) pelo menos nove a vinte aminoácidos consecutivos de pelomenos uma das seqüências de aminoácido descritas como SEQ ID NO: 1,SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6,SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:-10, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12, em que os nove a vinte aminoácidosconsecutivos se ligam ao complexo principal de histocompatibilidade (MHC)classe I;induzindo uma resposta imune ao Mycobacterium tuberculosis.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendoadministrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um po-lipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácidos descrita como SEQID NO: 1, ou um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendoadministrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um po-lipeptídeo que compreende pelo menos nove aminoácidos consecutivos deSEQ ID NO: 1 que se liga especificamente a MHC classe I ou um polinucleo-tídeo que codifica o polipeptídeo.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o polipeptí-deo compreende a seqüência de aminoácido QTVEDEARRMW (aminoáci-dos 24 a 34 de SEQ ID NO: 1) ou um polinucleotídeo que codifica o polipep-tídeo.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendoadministrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um po-lipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácidos descrita como SEQID NO: 2 ou um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendoadministrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um po-lipeptídeo que compreende pelo menos nove aminoácidos consecutivos deSEQ ID NO: 2 que se liga especificamente a MHC classe I ou um polinucleo-tídeo que codifica o polipeptídeo.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, compreendendoadministrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um po-lipeptídeo que compreende VSAAIAGLF (aminoácidos 47 a 55 de SEQ IDNO: 2) ou um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo.
8. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendoadministrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um po-lipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácidos descrita como SEQID NO: 3 ou um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo.
9. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendoadministrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um po-lipeptídeo que compreende pelo menos nove aminoácidos consecutivos deSEQ ID NO: 3 que se liga especificamente a MHC classe I ou um polinucleo-tídeo que codifica o polipeptídeo.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, compreendendoadministrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um po-lipeptídeo que compreende os aminoácidos 53 a 67 de SEQ ID NO: 3 ou umpolinucleotídeo que codifica o polipeptídeo.
11. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendoadministrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um po-lipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácidos descrita como SEQID NO: 4 ou um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo.
12. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendoadministrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um po-lipeptídeo que compreende pelo menos nove aminoácidos consecutivos deSEQ ID NO: 4 que se liga especificamente a MHC classe I ou um polinucleo-tídeo que codifica o polipeptídeo.
13. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendoadministrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um po-lipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácidos descrita como SEQID NO: 5 ou um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo.
14. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendoadministrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um po-lipeptídeo que compreende pelo menos nove aminoácidos consecutivos deSEQ ID NO: 5 que se liga especificamente a MHC classe I ou um polinucleo-tídeo que codifica o polipeptídeo.
15. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendoadministrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um po-lipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácidos descrita como SEQID NO: 6 ou um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo.
16. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendoadministrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um po-lipeptídeo que compreende pelo menos nove aminoácidos consecutivos deSEQ ID NO: 6 que se liga especificamente a MHC classe I ou um polinucleo-tídeo que codifica o polipeptídeo.
17. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendoadministrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um po-lipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácidos descrita como SEQID NO: 7 ou um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo.
18. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendoadministrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um po-lipeptídeo que compreende pelo menos nove aminoácidos consecutivos deSEQ ID NO: 7 que se liga especificamente a MHC classe I ou um polinucleo-tídeo que codifica o polipeptídeo.
19. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendoadministrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um po-lipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácidos descrita como SEQID NO: 8 ou um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo.
20. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendoadministrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um po-lipeptídeo que compreende pelo menos nove aminoácidos consecutivos deSEQ ID NO: 8 que se liga especificamente a MHC classe I ou um polinucleo-tídeo que codifica o polipeptídeo.
21. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendoadministrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um po-lipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácidos descrita como SEQID NO: 9 ou um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo.
22. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendoadministrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um po-lipeptídeo que compreende pelo menos nove aminoácidos consecutivos deSEQ ID NO: 9 que se liga especificamente a MHC classe I ou um polinucleo-tídeo que codifica o polipeptídeo.
23. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendoadministrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um po-lipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácidos descrita como SEQID NO: 10 ou um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo.
24. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendoadministrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um po-lipeptídeo que compreende pelo menos nove aminoácidos consecutivos deSEQ ID NO: 10 que se liga especificamente a MHC classe I ou um polinu-cleotídeo que codifica o polipeptídeo.
25. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendoadministrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um po-lipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácidos descrita como SEQID NO: 11 ou um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo.
26. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendoadministrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um po-lipeptídeo que compreende pelo menos nove aminoácidos consecutivos deSEQ ID NO: 11 que se liga especificamente a MHC classe I ou um polinu-cleotídeo que codifica o polipeptídeo.
27. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendoadministrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um po-lipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácidos descrita como SEQID NO: 12 ou um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo.
28. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendoadministrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um po-lipeptídeo que compreende pelo menos nove aminoácidos consecutivos deSEQ ID NO: 12 que se liga especificamente a MHC classe I ou um polinu-cleotídeo que codifica o polipeptídeo.
29. Método de acordo com qualquer uma de acordo com as rei-vindicações 1 a 28, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantida-de terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo.
30. Método de acordo com a reivindicação 29, em que o polipep-tídeo é ligado covalentemente a um veículo.
31. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o polipep-tídeo consiste em:(a) pelo menos uma das seqüências de aminoácido descritascomo uma das SEQ ID NOs: 1 a 12; ou(b) pelo menos nove aminoácidos consecutivos de pelo menosuma das seqüências de aminoácido descritas como SEQ ID NOs: 1 a 12, emque os nove aminoácidos consecutivos se ligam especificamente a MHCclasse I.
32. Método de acordo com qualquer uma de acordo com as rei-vindicações 1 a 31, ainda compreendendo administrar uma quantidade tera-peuticamente eficaz de um adjuvante.
33. Método de acordo com qualquer uma de acordo com as rei-vindicações 1 a 32, em que a resposta imune é uma resposta imune proteto-ra.
34. Método de acordo com qualquer uma de acordo com as rei-vindicações 1 a 32, em que o indivíduo está infectado com Mtb.
35. Método de acordo com qualquer uma de acordo com as rei-vindicações 1 a 32, em que o indivíduo tem risco de uma infecção com Mtb.
36. Método de acordo com qualquer uma de acordo com as rei-vindicações 1 a 32, em que o indivíduo tem uma infecção latente com Mtb.
37. Polipeptídeo isolado que compreende nove a vinte aminoá-cidos consecutivos de pelo menos uma das seqüências de aminoácido des-critas como SEQ ID NOs: 1 a 12, em que os nove a vinte aminoácidos con-secutivos se ligam especificamente ao complexo principal de histocompatibi-lidade (MHC) classe I, em que o polipeptídeo isolado não compreende ne-nhuma das seqüências de aminoácido descritas como SEQ ID NOs: 1 a 12.
38. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 37, con-sistindo em nove a vinte aminoácidos consecutivos de pelo menos uma dasseqüências de aminoácido descritas como SEQ ID NOs: 1 a 12, em que osnove a vinte aminoácidos consecutivos se ligam especificamente ao comple-xo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I.
39. Polinucleotídeo isolado que codifica o polipeptídeo como de-finido em uma de acordo com as reivindicações 37 a 38.
40. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 38, operati-vamente ligado a um promotor.
41. Vetor que compreende o polinucleotídeo como definido nareivindicação 40.
42. Vetor de acordo com a reivindicação 41, em que o vetor éum vetor de plasmídeo.
43. Vetor de acordo com a reivindicação 41, em que o vetor deplasmídeo é expresso em levedura.
44. Vetor de acordo com a reivindicação 41, em que o vetor éum vetor viral.
45. Vetor de acordo com a reivindicação 44, em que o vetor éum vetor de retrovírus, vírus ortopox, avipox, fowlpox, capripox, suipox, ade-noviral, herpes, alfa vírus, baculovírus, vírus Sindbis, vírus da vacínia e poli-ovírus.
46. Célula hospedeira isolada que compreende o vetor comodefinido em qualquer uma de acordo com as reivindicações 41 a 45.
47. Célula hospedeira isolada de acordo com a reivindicação 46,em que a célula hospedeira é uma micobactéria.
48. Composição farmacêutica que compreende o polipeptídeocomo definido em qualquer uma de acordo com as reivindicações 37 a 39 eum veículo farmaceuticamente aceitável.
49. Composição farmacêutica que compreende uma quantidadeterapeuticamente eficaz da célula hospedeira como definida na reivindicação-46 em um veículo farmaceuticamente aceitável.
50. Composição farmacêutica que compreende uma quantidadeterapeuticamente eficaz do polinucleotídeo como definido na reivindicação-39 em um veículo farmaceuticamente aceitável.
51. Método para tratar um indivíduo infectado com Mycobacteri-um tuberculosis, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um polipeptídeo, ou um polinucleotídeo que codi-fica o polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende:(a) pelo menos uma das seqüências de aminoácido descritascomo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ IDNO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ IDNO: 10, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12; ou(b) pelo menos nove a vinte aminoácidos consecutivos de pelomenos uma das seqüências de aminoácido descritas como SEQ ID NO: 1,SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6,SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:-10, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12, em que os nove a vinte aminoácidosconsecutivos se ligam especificamente ao complexo principal de histocom-patibilidade (MHC) classe I;tratando assim o indivíduo infectado com Mycobacterium tuber-culosis.
52. Método de acordo com a reivindicação 51, em que o indiví-duo infectado com Mycobaeterium tuberculosis não tem um sintoma de tu-berculose.
53. Método de acordo com a reivindicação 52, em que tratar oindivíduo compreende evitar o desenvolvimento de tuberculose no indivíduo.
54. Um método de inibir uma infecção com Mycobacterium tu-berculosis, em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo umaquantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo, ou um polinucleotí-deo que codifica o polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende:(a) pelo menos uma das seqüências de aminoácido descritascomo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ IDNO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ IDNO: 10, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12; ou(b) pelo menos nove a vinte aminoácidos consecutivos de pelouma das seqüências de aminoácido descritas como SEQ ID NO: 1, SEQ IDNO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ IDNO: 7, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQID NO: 11 ou SÊQ ID NO: 12, em que os nove a vinte aminoácidos consecu-tivos se ligam especificamente ao complexo principal de histocompatibilidade(MHC) classe I;inibindo assim a infecção com Mycobacterium tuberculosis noindivíduo.
55. Método de acordo com a reivindicação 54, em que adminis-trar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipeptídeo oupolinucleotídeo que codifica o polipeptídeo evita uma infecção com Myeo-baeterium tuberculosis.
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