BRPI0716382B1

BRPI0716382B1 - método para reduzir o teor de porções de fc livres em um fluido compreendendo uma proteína contendo fc, e uso de cromatografia de troca catiônica

Info

Publication number: BRPI0716382B1
Application number: BRPI0716382-7A
Authority: BR
Inventors: Lamproye Alain; Eon-Duval Alex
Original assignee: Ares Trading Sa
Priority date: 2006-08-28
Filing date: 2007-08-27
Publication date: 2019-10-29
Also published as: ZA200900837B; CN101535335A; MY157846A; BRPI0716382A2; NZ574626A; CN101535335B; BRPI0716382B8

Abstract

método para reduzir o teor de porções de fc livres em um fluido compreendendo uma proteína contendo fc, e uso de cromatografia de troca catiônica a presente invenção refere-se a um processo para redução da concentração de porções fc livres em um fluido compreendendo uma proteína contendo fc compreendendo uma etapa de cromatografia de troca catiônica.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se ao campo de purificação proteica. Mais especificamente, refere-se à purificação de uma proteína contendo Fc através de cromatografia de troca catiônica, em particular para a redução da quantidade de proteínas sem porções Fc em uma preparação proteica contendo Fc.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Proteínas tornaram-se comercialmente importantes como fármacos que são geralmente chamados biológicos. Um dos maiores desafios é o desenvolvimento de processos que tenham uma boa relação custo-benefício para purificação de proteínas em uma escala comercial. Apesar de muitos métodos estarem disponíveis hoje em dia para a produção de proteínas em larga escala, produtos brutos, tais como sobrenadantes de culturas celulares, contêm não somente o produto desejado, mas também impurezas, que são difíceis de separar do produto desejado. Embora sobrenadantes de culturas celulares de células que expressam produtos proteicos recombinantes possam conter menos impurezas se as células forem cultivadas em meio sem soro, as proteínas da célula hospedeira (HCPs) ainda permanecem, sendo eliminadas durante o processo de purificação. Adicionalmente, as autoridades de saúde solicitam altos padrões de pureza de proteínas destinadas à administração humana.

Sabe-se que inúmeros sistemas cromatográficos são largamente usados para a purificação proteica.

Os sistemas de cromatografia de troca iônica são usados para a separação de proteínas principalmente segundo as diferenças em carga.

Trocadores aniônicos podem ser classificados como fracos ou fortes. O grupo de carga de um trocador aniônico fraco é uma base fraca, que se torna desprotonada e, então, perde a sua carga em pH alto. DEAE-sefarose é um exemplo de um trocador aniônico fraco, onde o grupo amino pode estar positivamente carregado abaixo do pH~9 e gradual mente perde

Petição 870180167443, de 26/12/2018, pág. 12/21 sua carga em valores de pH mais altos. Dietilaminoetil (DEAE) ou dietil-(2hidróxi propila)aminoetil (QAE) tem o cloreto como contra-íon, por exemplo. Um trocador aniônico forte, por outro lado, contém uma base forte, que permanece positivamente carregada em todas as faixas de pH normalmente usadas em cromatografia de troca iônica (pH 1 a 14). Q-sefarose (Q representa amônio quaternário) é um exemplo de um trocador aniônico forte.

Trocadores catiônicos também podem ser classificados como fracos ou fortes. Um trocador catiônico forte contém um ácido forte (tal como um grupo sulfopropila) que permanece carregado do pH 1 ao 14; enquanto que um trocador catiônico fraco contém um ácido fraco (tal como um grupo carboximetila), que gradualmente perde sua carga de acordo com as reduções de pH abaixo de 4 ou 5. Carboximetila (CM) e sulfopropila (SP) têm o sódio como contra-íon, por exemplo.

Uma resina de cromatografia diferente é baseada em uma matriz de fosfato de cálcio hidroxilado insolúvel chamado de hidroxiapatita. Cromatografia em hidroxiapatita é um método de purificação de proteínas que utiliza um fosfato de cálcio hidroxilado insolúvel (Ca₅(PO4)₃OH)2, que forma a matriz e o ligante. Grupos funcionais consistem em pares de íons de cálcio positivamente carregados (sítios C) e agrupamentos de grupos fosfato negativamente carregados (sítios P). As interações entre hidroxiapatita e proteínas são complexas e multimodais. Em um método de interação, grupos amino carregados positivamente em proteínas associadas com os sítios P carregados negativamente e grupos carboxila da proteína interagem por complexação por coordenação a sítios C (Shepard et al., 2000).

Hidroxiapatita cristalina foi o primeiro tipo de hidroxiapatita usada em cromatografia. Cromatografia em Hidroxiapatita Cerâmica (CHA) é um desenvolvimento adicional em cromatografia em hidroxiapatita. Hidroxiapatita cerâmica tem alta durabilidade, boa capacidade de ligação à proteína, e pode ser usada em velocidade de fluxo e pressões mais altas do que hidroxiapatita cristalina. (Vola et al., 1993).

Hidroxiapatita tem sido usada na separação cromatográfica de proteínas, ácidos nucleicos, bem como anticorpos. Na cromatografia em hi droxiapatita, a coluna é normalmente equilibrada, e a amostra aplicada, a uma baixa concentração de tampão de fosfato e as proteínas adsorvidas são então eluídas em um gradiente de concentração de tampão de fosfato (Giovannini et al., 2000).

Além dessa, uma forma adicional de purificação de proteínas é baseada na afinidade de uma proteína de interesse a outra proteína que é imobilizada em uma resina de cromatografia. Exemplos de tais ligantes imobilizados são as proteínas da parede celular bacteriana Proteína A e Proteína G, tendo especificidade à porção Fc de certas imunoglobulinas. Embora tanto a Proteína A quanto a Proteína G tenham uma forte afinidade para anticorpos IgG, têm afinidades variadas também a outras classes e isotipos de imunoglobulina.

A Proteína A é uma proteína de 43.000 Dalton que é produzida pelas bactérias Staphylcoccus aureus e contém quatro sítios de ligação às regiões Fc da IgG. A Proteína G é produzida a partir do grupo Estreptococos G e tem dois sítios de ligação à região Fc da IgG. Ambas as proteínas têm sido largamente caracterizadas por sua afinidade a vários tipos de imunoglobulinas. Outro desenvolvimento é a Proteína A/G, uma proteína projetada geneticamente, que combina as capacidades de ligação da Proteína A e G. A Proteína L é uma proteína bacteriana adicional, que se origina a partir de Peptostreptococcus, ligando-se a Imunoglobulinas e fragmentos dos mesmos contendo cadeias leves da Ig (Akerstrom e Bjork, 1989).

Cromatografias de afinidade com Proteína A, Proteína G, e Proteína L são largamente usadas para isolamento e purificação de anticorpos.

Uma vez que os sítios de ligação para Proteína A e Proteína G estão presentes na região Fc de uma imunoglobulina, a cromatografia de afinidade com Proteína A e Proteína G (ou Proteína A/G), além disso, permite a purificação das chamadas proteínas fusão Fc. A Proteína L se liga às cadeias leves da Ig e pode então ser usada para a purificação de anticorpos contendo cadeia leve.

Anticorpos, ou imunoglobulinas (Igs) consistem em cadeias leves e cadeias pesadas ligadas em conjunto por ligações de dissulfeto. O primeiro domínio localizado no amino terminal de cada cadeia é variável na sequência de aminoácidos, fornecendo o enorme espectro de especificidade de ligação do anticorpo. Estes domínios são conhecidos como regiões variáveis pesadas (VP) e variáveis leves (VL). Os outros domínios de cada cadeia são relativamente invariáveis na sequência de aminoácidos e são conhecidos como regiões constantes pesadas (CP) e constantes leves (CL).

As principais classes de anticorpos são IgA, IgD, IgE, IgG e IgM; e essas classes podem ser, além disso, divididas em subclasses (isotipos). Por exemplo, a classe IgG tem quatro subclasses, ou seja, IgGi, lgG2, IgGa, e lgG₄.

As diferenças entre as classes de anticorpo são derivadas de diferenças nas regiões constantes da cadeia pesada, contendo entre 1 e 4 domínios constantes (CH1 a CH4), dependendo da classe de imunoglobulina. Uma região chamada de dobradiça está localizada entre os domínios CH1 e CH2. A região de dobradiça é especialmente sensível à divagem proteolítica; tal proteólise produz dois ou três fragmentos dependendo do sítio exato de divagem. A parte da região constante da cadeia pesada que contém os domínios CH2 e CH3 também é chamada a parte Fc da imunoglobulina. Anticorpos são, dessa forma, proteínas contendo Fc. Outro tipo de proteínas contendo Fc são as chamadas proteínas de fusão Fc.

Vários anticorpos que são usados como proteínas terapêuticas são conhecidos. Exemplos de anticorpos recombinantes no mercado são, por exemplo: Abciximabe, Rituximabe, Basiliximabe, Daclizumabe, Palivizumabe, Infliximabe, Trastuzumabe, Alemtuzumabe, Adalimumabe, Cetuximabe, Efalizumabe, Ibritumomabe, Bevacizumabe ou Omalizumabe.

Proteínas de fusão Fc são proteínas quiméricas compostas da região efetora de uma proteína, tal como a região Fab de um anticorpo ou a região de ligação de um receptor, fusionada à região Fc de uma imunoglobulina que frequentemente é uma imunoglobulina G (IgG). Proteínas de fusão Fc são largamente usadas como terapêuticos, uma vez que oferecem vantagens conferidas pela região Fc, tais como:

- A possibilidade de purificação usando cromatografia de afini dade com proteína A ou proteína G com afinidades que variam de acordo com o isotipo IgG. IgGi, lgG2 e lgG4 humanas se ligam fortemente à Proteína A e todas as IgGs humanas, inclusive lgG₃, se ligam fortemente à Proteína G;

- Uma meia-vida aumentada no sistema circulatório, uma vez que a região Fc se liga ao receptor circulante FcRn que protege da degradação lisossomal;

- Dependendo do uso médico da proteína de fusão Fc, as funções efetoras Fc podem ser desejáveis. Tais funções efetoras incluem citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) através de interações com receptores Fc (FcyRs) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC) pela ligação ao componente do complemento 1q (C1q). As isoformas de IgG exercem níveis diferentes de funções efetoras. IgGi e lgG₃ humanas têm efeitos ADCC e CDC fortes, enquanto a lgG₂ humana exerce efeitos ADCC e CDC fracos. lgG₄ humana demonstra efeitos ADCC fraco e nenhum CDC.

A meia-vida sérica e as funções efetoras podem ser moduladas pela engenharia da região Fc para aumentar ou reduzir sua ligação a FcRn, FcyRs e C1q respectivamente, dependendo do uso terapêutico destinado à proteína de fusão Fc.

Em ADCC, a região Fc de um anticorpo se liga a receptores Fc (FcyRs) na superfície de células imunes efetoras, tais como assassinas naturais e macrófagos, levando à fagocitose ou lise das células alvo.

Em CDC, os anticorpos matam as células alvo através da ativação da cascata do complemento na superfície celular. Isoformas de IgG exercem níveis diferentes de funções efetoras que aumentam na ordem de lgG₄ <lgG2 <lgG-i < lgG₃. IgGi humana mostra ADCC e CDC altas, e é a mais adequada para o uso terapêutico contra agentes patogênicos e células de câncer.

Sob certas circunstâncias, por exemplo, quando a depleção da célula alvo é indesejável, abolição ou diminuição das funções efetoras pode ser necessária. Pelo contrário, no caso de anticorpos destinados para uso oncológico, o aumento das funções efetoras pode melhorar sua atividade terapêutica (Carter et al., 2006).

A modificação das funções efetoras pode ser realizada pela engenharia da região Fc para melhorar ou reduzir a ligação de FcyRs ou dos fatores do complemento.

A ligação de IgG aos FcyRs de ativação (FcyRI, FcyRlla, FcyRllla e FcyRlllb) e inibitório (FcyRllb) ou ao primeiro componente do complemento (C1q) depende de resíduos localizados na região de dobradiça e no domínio CH2. Duas regiões do domínio CH2 são críticas para a ligação de FcyRs e complemento C1 q, e têm sequências exclusivas em lgG₂ e lgG₄. Por exemplo, a substituição de resíduos lgG2 em posições 233 a 236 na IgGi humana reduz grandemente ADCC e CDC (Armour et al., 1999 e Shields et al., 2001).

Numerosas mutações têm sido produzidas no domínio CH2 de IgG e o seu efeito sobre ADCC e CDC foi testado in vitro (Shields et al., 2001, Idusogie et al., 2001 e 2000, Steurer et al., 1995). Em particular, uma mutação na alanina em E333 para aumento em ADCC e CDC foi relatada (Idusogie et al., 2001 e 2000).

Aumentar a meia-vida sérica de um anticorpo terapêutico é outro modo de melhorara sua eficácia, permitindo níveis circulantes mais altos, administração menos frequente e doses reduzidas. Isso pode ser alcançado através do aumento da ligação da região Fc à FcR neonatal (FcRn). FcRn, que é expresso na superfície de células endoteliais, liga-se a IgG de uma maneira dependente do pH e as protege da degradação. Foi mostrado que várias mutações localizadas na interface entre os domínios CH2 e CH3 aumentam a meia-vida de IgGi (Hinton et al., 2004 e Vaccaro et al., 2005).

A Tabela 1 seguinte resume algumas mutações da região Fc da IgG conhecidas (extraída do sítio da Invitrogen na rede mundial de computadores).

Aplicações	Vacinação; uso terapêutico	Vacinação; uso terapêutico	Uso terapêutico sem depleção celular	Uso terapêutico com depleção celular	Vacinação; uso terapêutico
Benefícios Potenciais	Localização do alvo melhorada; eficácia aumentada; dose ou frequência de administração reduzida	Localização do alvo melhorada; eficácia aumentada; dose ou frequência de administração reduzida	Eventos adversos reduzidos	Eficácia aumentada	Eventos adversos reduzidos
Propriedades	Meia-vida plasmática aumentada	Meia-vida plasmática aumentada	ADCC e CDC reduzidas	ADCC e CDC aumenta- das	CDC reduzida
Mutações	T250Q/M428L	M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F	E233P/L234V/L235A/ AG236 + A327G/A330S/P331S	E333A	K322A
Isotipo de IgG	lgG1 humana	lgG1 humana	lgG1 humana	lgG1 humana	lgG2 humana
Fc projetada	hlgG1e1	CXI φ vO _O) -C	hlgG1e3	hlgG1e4	T— Φ Csl O σ>

Uma classe de proteínas de fusão Fc que possui utilidade terapêutica, as regiões Fc têm sido fusionadas a domínios extracelulares de certos receptores fazendo parte da superfamília de receptor de fator de necrose tumoral (TNF-R) (Locksley et al., 2001, Bodmer et al., 2002, Bossen et al., 2006). Uma característica dos membros da família TNFR é a presença de pseudorrepetições ricas em cisteína no domínio extracelular, como descrito, por exemplo, por Naismith e Sprang, 1998.

Dois receptores TNF, p55 (TNFR1) e TNFR p75 (TNFR2) são exemplos de tais membros da superfamília TNFR. Etanercept é uma proteína fusão Fc contendo a parte solúvel do TNFR p75 (por exemplo, WO91/03553, WO 94/06476). Sob nome comercial Enbrel®, é vendida para o tratamento de endometriose, infecção por virus da Hepatite C, infecção por HIV, artrite psoriática, psoríase, artrite reumatóide, asma, espondilite anquilosante, insuficiência cardíaca, doença do enxerto contra o hospedeiro, fibrose pulmonar, doença de Crohn. Lenercept é uma proteína de fusão que contém os componentes extracelulares do receptor p55 TNF humano e a porção Fc da IgG humana, e é destinado para o potencial tratamento da sepse severa e esclerose múltipla.

0X40 é também um membro da superfamília TNFR. OX40-lgG1 e proteínas de fusão OX40-hlG4mut têm sido preparadas para o tratamento de doenças inflamatórias e autoimunes, tais como a Doença de Crohn.

Uma proteína de fusão Fc do BAFF-R, também chamada BR3, designada BR3-Fc, é um receptor solúvel de atração de uma série de inibidores de BAFF (fator de ativação de célula B da família TNF), está sendo desenvolvido para o potencial tratamento de doenças autoimunes, tais como artrite reumatóide (RA) e lúpus eritematoso sistêmico (SLE).

BCMA é um receptor adicional pertencente à superfamília TNFR. Uma proteína de fusão BCMA-lg foi descrita para inibição de doença autoimune (Melchers, 2006).

Outro receptor da superfamília TNF-R é TACI, o ativador transmembrana e CAML interagente (von Bulow e Bram, 1997; US 5.969.102, Gross et al., 2000), que tem um domínio extracelular contendo duas pseu dorrepetições ricas em cisteína. TACI se liga a dois membros da família de ligante do fator de necrose tumoral (TNF). O primeiro ligante é designado BLyS, BAFF, neutrocina-α, TALL-1, zTNF4, ou THANK (Moore et al., 1999). O outro ligante foi designado como APRIL, ligante de morte TNRF-1 ou ZTNF2 (Hahne et al., J. Exp. Med. 188: 1185 (1998).

Proteínas de fusão contendo formas solúveis do receptor TACI fusionadas a uma região Fc da IgG são também conhecidas e foram designadas TACI-Fc (WO 00/40716, WO 02/094852). TACI-Fc inibe a ligação de BLyS e APRIL a células B (Xia et al., 2000). Está sendo desenvolvida para o tratamento de doenças autoimunes, inclusive lúpus eritematoso sistêmico (SLE), artrite reumatóide (RA) e malignidades hematológicas, bem como para o tratamento de esclerose múltipla (MS). Além disso, TACI-Fc está sendo desenvolvida em mieloma múltiplo (MM) (Novak et al., 2004; Moreau et al., 2004) e linfoma não-Hodgkin (NHL), leucemia linfocítica crônica (CLL) e macroglobulemia de Waldenstrom (WM).

Considerando a utilidade terapêutica da proteína contendo Fc, em particular anticorpos e proteínas de fusão Fc, há uma necessidade de quantidades significantes da proteína altamente purificada, que é adequada para a administração humana.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um dos problemas que podem ser encontrados durante a produção da proteína contendo Fc é a presença de porções Fc livres, isto é, fragmentos de polipeptídeos derivados da proteína contendo Fc, que não contenham uma porção substancial derivada de uma região variável do anticorpo ou de outra proteína específica ou domínio normalmente presente na proteína de fusão Fc.

A presente invenção dirige-se a este problema. É baseada no desenvolvimento de um processo de purificação de um fluido, composição ou preparação de uma proteína contendo Fc, pela qual pode ser reduzida a quantidade de porções Fc livres que pode estar presente como uma impureza.

Por consequência, a invenção refere-se a um método para re dução da concentração de porções Fc livres em um fluido compreendendo uma proteína contendo Fc, o método que compreende em submeter o dito fluido à cromatografia de troca catiônica.

Em um segundo aspecto, a invenção refere-se ao uso de cromatografia de troca catiônica para redução de Fc livre em uma preparação proteica contendo Fc.

Em um terceiro aspecto, a invenção refere-se a uma proteína purificada contendo Fc, compreendendo menos de 5% ou menos de 2% ou menos de 1% ou menos de 0,5% ou menos de 0,2% ou menos de 0,1% de porções Fc livres.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1 - mostra um SDS-PAGE corado por prata não-reduzida de diferentes frações resultantes da cromatografia de troca catiônica descrita no Exemplo 2. Coluna 1: marcadores de peso molecular, Coluna 2: TACI-Fc purificada, coluna 3: carga, Coluna 4: lavagem 2, Coluna 5: eluído 2, Coluna 6: lavagem 3, Coluna 7: eluído 3, Coluna 8: lavagem 1, Coluna 9: eluído 1, Coluna 10: Fc livre purificada;

Figura 2 - mostra o perfil cromatográfico da cromatografia de troca catiônica descrita no Exemplo 2.

BREVE DESCRIÇÃO DA LISTA DE SEQUÊNCIAS

SEQ ID NO: 1 é uma sequência de impressão digital de cisteína (pseudorrepetição rica em cisteína) comum a membros da superfamília TNFR;

SEQ ID NO: 2 é a sequência inteira do receptor TACI humano (por exemplo, descrito em WO 98/39361);

SEQ ID NO: 3 é um exemplo de uma sequência da Fc humana da invenção (por exemplo, descrita em WO 02/094852);

SEQ ID NO: 4 é uma proteína de fusão Fc preferencial da invenção, compreendendo sequências derivadas da porção extracelular de TACI e uma porção Fc da lgG1 humana (por exemplo, descrita em WO 02/094852);

SEQ ID NO: 5 é um polinucleotídeo de codificação para um po lipeptídeo de SEQ ID NO: 2;

SEQ ID NO: 6 é um polinucleotídeo de codificação para um polipeptídeo de SEQ ID NO: 3;

SEQ ID NO: 7 é um polinucleotídeo de codificação para um polipeptídeo de SEQ ID NO: 4.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção é baseada no achado que cromatografia de troca catiônica pode reduzir a quantidade ou o tamanho de porções Fc livres que podem estar presentes em um fluido ou composição de uma proteína contendo Fc.

A invenção, consequentemente, refere-se a um método para redução da concentração de porções Fc livres em um fluido compreendendo uma proteína contendo Fc, o método que compreende em submeter o dito fluido à cromatografia de troca catiônica.

O fluido compreendendo a proteína contendo Fc pode ser qualquer composição ou preparação, tal como, por exemplo, um fluido corporal derivado de um ser humano ou animal, ou um fluido derivado de uma cultura celular, tal como, por exemplo, um sobrenadante de cultura celular. Também pode ser um fluido derivado de outra etapa de purificação, tal como, por exemplo, o eluído ou fluxo contínuo - através de uma etapa de captura ou qualquer outra etapa de purificação adequada, tal como aquelas explicadas mais detalhadamente abaixo.

O termo proteína contendo Fc, como usado neste pedido, refere-se a qualquer proteína que tenha pelo menos um domínio constante da imunoglobulina selecionado do domínio CH1, dobradiça, CH2, CH3, CH4, ou qualquer combinação dos mesmos, e preferencialmente um domínio de dobradiça, CH2 e CH3. O domínio constante da imunoglobulina pode ser derivado de alguma das IgG, IgA, IgE, IgM, ou combinação ou isotipos das mesmas. Preferencialmente, é IgG, tal como por exemplo, IgG-ι, lgG2, IgGa ou lgG4. Mais preferencialmente, é IgG-i.

Uma proteína contendo Fc, de acordo com a presente invenção, pode ser dessa forma, por exemplo, um anticorpo ou uma proteína de fusão

Fc, ou variantes dos mesmos, tais como fragmentos, muteínas ou derivados funcionais de anticorpos ou proteínas de fusão Fc.

A proteína contendo Fc da invenção pode ser um monômero, dímero ou multímero. A proteína contendo Fc também pode ser um pseudodímero (às vezes chamada de monômero), contendo uma porção Fc dimérica (por exemplo, um dímero de dois construtos de dobradiça-CH2CH3 com ponte de dissulfeto), dos quais somente um é fusionado a uma porção adicional, tal como um domínio variável da imunoglobulina, um composto de coordenação e opcionalmente inibição do fragmento de um receptor, ou qualquer outra proteína. Um exemplo de tal pseudodímero é uma proteína de fusão Fc que tem lnterferon-β fusionado a um dos dois construtos dobradiça-CH2-CH3 da IgG tal como por exemplo, aquele descrito em WO 2005/001025.

A proteína contendo Fc também pode ser um heterodímero, contendo duas porções não-imunoglobulina diferentes ou domínios variáveis da imunoglobulina, ou um homodímero, contendo duas cópias de uma única porção não-imunoglobulina ou domínio variável da imunoglobulina.

Preferencialmente, a proteína contendo Fc é um dímero. Também é preferencial que a proteína contendo Fc da invenção seja um homodímero.

De acordo com a presente invenção, a porção Fc da proteína contendo Fc também pode ser modificada a fim de modular funções efetoras.

Por exemplo, as mutações Fc seguintes, de acordo com posições EU index (Kabat et al., 1991), podem ser introduzidas se a porção Fc for derivada de IgG-,:

T250Q/M428L

M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F

E233P/L234V/L235A/AG236 + A327G/A330S/P331S E333A; K322A.

Mutações de Fc adicionais podem ser, por exemplo, as substituições nas posições EU index selecionadas de 330, 331, 234, ou 235, ou combinações dos mesmos. Uma substituição de aminoácido na posição EU index 297 localizado no domínio CH2 também pode ser introduzido na porção Fc no contexto da presente invenção, eliminando um potencial sítio de ligação a carboidrato N-ligado. Além disso, o resíduo cisteína na posição EU index 220 também pode ser substituído com um resíduo serina, eliminando o resíduo cisteína que normalmente forma pontes de dissulfeto com a região constante da cadeia leve da imunoglobulina.

De acordo com a presente invenção, é preferencial que a porção Fc compreenda ou consista na SEQ ID NO: 3 ou seja codificada por um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO: 6.

Em uma modalidade preferencial, a proteína contendo Fc compreendendo uma região variável da imunoglobulina, por exemplo, um ou mais domínios variáveis de cadeia pesada e/ou um ou mais domínios variáveis de cadeia leve. Preferencialmente, o anticorpo contém um ou dois domínios variáveis de cadeia pesada. Mais preferencialmente, o anticorpo contém adicionalmente um ou dois domínios de cadeia leve constante e/ou variável.

É preferencial que a proteína contendo Fc seja um anticorpo.

O termo anticorpo refere-se a uma imunoglobulina ou fragmento da mesma, e inclui qualquer polipeptídeo compreendendo um sítio de ligação a antígeno. O termo inclui, mas não é limitado a, anticorpos policlonais, monoclonais, monoespecíficos, poliespecíficos, não-específicos, humanizados, humanos, quiméricos, de cadeia única, sintéticos, recombinantes, híbridos, mutados, enxertados ou criados in vitro. O anticorpo pode ser selecionado dentre algum dos isotipos de anticorpos conhecidos, por exemplo, IgA, IgG, IgD, IgE, IgM. O anticorpo pode ser um monômero, dímero, ou multímero, tal como um trímero ou pentâmero.

Exemplos de anticorpos que podem ser purificados de acordo com a presente invenção são Abciximabe, Rituximabe, Basiliximabe, Daclizumabe, Palivizumabe, Infliximabe, Trastuzumabe, Alemtuzumabe, Adalimumabe, Cetuximabe, Efalizumabe, Ibritumomabe, Bevacizumabe ou Omalizumabe. Exemplos adicionais de anticorpos que podem ser submetidos à cromatografia de troca catiônica de acordo com a presente invenção são anticorpos direcionados contra:

CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD11b, CD14, CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80, CD86, CD147, CD164, receptor de IL-2, receptor de IL-4, receptor de IL-6, receptor de IL12, subunidades de receptor de IL-18 (IL-18R-alfa, IL-18R-beta), TACI, BCMA, BAFF-R, receptor de EGF, receptor de VEGF, integrina α4β7, integrina VLA4, integrinas B2, receptores TRAIL 1, 2, 3, e 4, RANK, ligante de RANK, molécula de adesão de célula epitelial (EpCAM), molécula de adesão intercelular 3 (ICAM-3), CTLA4, receptor de Fc-gamma-l, II ou III, HLA-DR 10 beta, antígeno HLA-DR ou L-selectina.

Anticorpos direcionados contra TNF, Blys, ou lnterferon-γ são exemplos adicionais de anticorpos terapeuticamente interessantes.

Proteínas de fusão Fc são também proteínas contendo Fc que são preferencialmente submetidas ao método da invenção.

O termo proteína de fusão Fc, como usado neste pedido, destina-se a englobar proteínas, em particular proteínas terapêuticas, compreendendo uma porção derivada da imunoglobulina, que será chamada neste pedido de porção Fc, e uma porção derivada de uma segunda proteína não-imunoglobulina que será chamada neste pedido de porção terapêutica, independente de ser ou não destinada ao tratamento de doença.

Proteínas de fusão Fc terapêuticas, isto é, proteínas de fusão Fc destinadas ao tratamento ou prevenção da doença de um animal ou preferencialmente para tratamento ou administração humana, são especialmente adequadas para ser purificadas de acordo com a invenção.

Qualquer proteína de fusão Fc pode ser purificada de acordo com a presente invenção, tal como, por exemplo, uma proteína de fusão contendo lnterferon-β. Preferencialmente, o método da invenção é para purificação de uma proteína de fusão Fc compreendendo um fragmento de ligação ao ligante, tal como a totalidade ou parte de um domínio extracelular, de um membro da superfamília do receptor de fator de necrose tumoral (TNFR).

A porção terapêutica de uma proteína de fusão Fc pode, por e xemplo, ser ou ser derivada de EPO, TPO, Hormônio do Crescimento, Interferon-alfa, Interferon-beta, Interferon-gama, PDGF-beta, VEGF, IL-1alfa, IL1beta, IL-2, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, IL-12, IL-18, proteína de ligação à IL-18, TGF-beta, TNF-alfa ou TNF-beta.

A porção terapêutica de uma proteína de fusão Fc também pode ser derivada de um receptor, por exemplo, um receptor de transmembrana, preferencialmente sendo ou sendo derivada do domínio extracelular de um receptor, e em particular, um fragmento de ligação ao ligante da parte ou domínio extracelular de um dado receptor. Exemplos de receptores terapeuticamente interessantes são CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD11b, CD14, CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80, CD86, CD147, CD164, receptor de IL-2, receptor de IL-4, receptor de IL-6, receptor de IL-12, subunidades de receptor de IL-18 (IL-18R-alfa, IL-18R-beta), receptor de EGF, receptor de VEGF, integrina alfa 4 10 beta 7, integrina VLA4, integrinas B2, receptores de TRAIL 1, 2, 3, e 4, RANK, ligante de RANK, molécula de adesão de célula epitelial (EpCAM), molécula de adesão intercelular 3 (ICAM-3), CTLA4 (que é um antígeno associado ao lifócito T citotóxico), receptor Fc-gama-l, II ou III, HLA-DR 10 beta, antígeno de HLA-DR, L-selectina.

É altamente preferencial que a porção terapêutica seja derivada de um receptor pertencente à superfamília TNFR. A porção terapêutica pode, por exemplo, ser ou ser derivada do domínio extracelular de TNFR1 (p55), TNFR2 (p75), 0X40, Osteoprotegerina, CD27, CD30, CD40, RANK, DR3, ligante de Fas, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, TAIL-R4, NGFR, AlTR, BAFFR, BCMA, TACL

De acordo com a presente invenção, a porção terapêutica derivada de um membro da superfamília TNFR preferencialmente compreende ou consiste na totalidade ou parte do domínio extracelular do membro de TNFR, e mais preferencialmente compreende um fragmento de ligação ao ligante de tal membro da TNFR.

A tabela 5 seguinte lista membros da superfamília TNFR da qual uma porção terapêutica de acordo com a presente invenção pode ser deri vada, e os seus respectivos ligantes. Um fragmento de ligação ao ligante de um membro da família TNFR pode ser facilmente determinado pela pessoa versada na técnica, por exemplo, em um ensaio simples in vitro medindo a ligação entre o fragmento de proteína de um dado receptor e o respectivo ligante. Tal ensaio pode ser, por exemplo, um simples ensaio in vitro tipo sanduíche RIA ou ELISA em que uma das proteínas, por exemplo, o fragmento do receptor, é imobilizado em um carregador (por exemplo, uma placa de ELISA) e é incubada, depois do bloqueio apropriado dos sítios de ligação à proteína no carregador, com a segunda proteína, por exemplo, o ligante. Após a incubação, a ligação ao ligante é detectada, por exemplo, através da marcação radioativa do ligante e determinação da radioatividade ligada, depois da lavagem apropriada, em um contador de cintilação. A ligação ao ligante também pode ser determinada com um anticorpo marcado, ou um anticorpo primário específico para o ligante e um anticorpo secundário marcado, direcionado contra a parte constante do anticorpo primário. A ligação ao ligante pode ser dessa forma facilmente determinada, dependendo do marcador usado, por exemplo, em uma reação colorida.

Preferencialmente, o método da presente invenção é para purificação de uma proteína de fusão Fc compreendendo uma porção terapêutica derivada de um membro da superfamília TNFR selecionado daqueles listados na Tabela 5.

Tabela 5: A superfamília TNFR (de acordo com Locksley et al., 2001 e Bossen et al., 2006)

Membro da superfamília TNFR	Ligante
NGFR	NGF
EDAR	EDA-A1
XEDAR	EDA-A2
CD40	CD40L

Membro da superfamília TNFR	Ligante
Fas	FasL
0x40	OX40L
AITR	AITRL
GITR	GITRL
CD30	CD30L
CD40	CD40L
HveA	LIGHT, LT-alfa
4-1 BB	4-1BBL
TNFR2	TNF-alfa, LT-alfa, LT-alfa-beta
LT-betaR	LIGHT, LT-alfa, LT-alfa-beta
DR3	TL1A
CD27	CD27L
TNFR1	TNF-alfa, LT-alfa, LT-alfa-beta
LTBR	LT-beta
RANK	RANKL
TACI	BlyS, APRIL
BCMA	BlyS, APRIL
BAFF-R	BAFF (= BlyS)
TRAILR1	TRAIL

Membro da superfamília TNFR	Ligante
TRAILR2	TRAIL
TRAILR3	TRAIL
TRAILR4	TRAIL
Fn14	TWEAK
OPG	RANKL, TRAIL
DR4	TRAIL
DR5	TRAIL
DcR1	TRAIL
DcR2	TRAIL
DcR3	FasL, LIGHT, TL1A

Em uma modalidade preferencial, a proteína de fusão Fc compreende uma porção terapêutica selecionada de um domínio extracelular de TNFR1, TNFR2, ou um fragmento de ligação a TNF dos mesmos.

Em uma modalidade preferencial adicional, a proteína de fusão

Fc compreende uma porção terapêutica selecionada de um domínio extracelular de BAFF-R, BCMA, ou TACI, ou um fragmento dos mesmos, de ligação a pelo menos Blys ou APRIL.

Um ensaio para testar a capacidade de ligação a Blys ou APRIL está descrito, por exemplo, em Hymowitz et al., 2006.

Ainda em uma modalidade preferencial adicional, a porção tera- pêutica de uma proteína de fusão Fc compreende a pseudorrepetição rica em cisteína da SEQ ID NO: 1.

Se for mais preferencial, que a porção terapêutica seja derivada de TACI. TACI é preferencialmente TACI humana. A SEQ ID NO: 2, que cor15 responde à sequência de aminoácidos inteira do receptor TACI (também entrada 014836 no SwissProt). Mais preferencialmente, a porção terapêutica compreende uma porção solúvel de TACI, preferencialmente derivada do domínio extracelular de TACI. Preferencialmente, a porção terapêutica derivada de TACI compreende pelo menos 33 a 67 aminoácidos da SEQ ID NO: 2 e/ou 70 a 104 aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade preferencial, o domínio extracelular TACI incluído na porção terapêutica, de acordo com a invenção, compreende ou consiste em 1 a 166 aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou 30 a 166 aminoácidos da SEQ ID NO: 2, ou 30 a 119 aminoácidos da SEQ ID NO: 2, ou 30 a 110 aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Todas aquelas porções terapêuticas são preferenciais para a preparação da proteína de fusão Fc a ser purificada através do método da invenção e são combinadas com as porções Fc descritas detalhadamente acima, e em particular com uma porção Fc compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO: 3. Uma proteína de fusão Fc altamente preferencial a ser purificada de acordo com a presente invenção que compreende ou consiste na SEQ ID NO: 4 ou é codificada pelo polinucleotídeo da SEQ ID NO: 7.

Portanto, é altamente preferencial que a proteína de fusão Fc compreenda um polipeptídeo selecionado a partir de

a. 34 a 66 aminoácidos da SEQ ID NO: 2;

b. 71 a 104 aminoácidos da SEQ ID NO: 2;

c. 34 a 104 aminoácidos da SEQ ID NO: 2;

d. 30 a 110 aminoácidos da SEQ ID NO: 2;

e. SEQ ID NO: 3;

f. SEQ ID NO: 4;

g. um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo de hibridização ao complemento da SEQ ID NO: 5 ou 6 ou 7 sob condições altamente estringentes; e

h. uma muteína de qualquer um (c), (d), (e), ou (f) tendo pelo menos identidade de sequência de 80% ou 85% ou 90% ou 95% ao polipeptídeo (c), (d), (e) ou (f);

em que o polipeptídeo se liga a pelo menos Blys ou APRIL.

De acordo com a presente invenção, a proteína contendo Fc é submetida à cromatografia de troca catiônica a fim de reduzir, diminuir, ou eliminar porções Fc livres, preferencialmente pelo menos de 50, 40, 30, 20 ou 10% da concentração de proteína total, ou mais preferencialmente menos de 10%.

O termo porções Fc livres, porção Fc livre, ou simplesmente Fc livre, como usado neste pedido, destina-se a englobar qualquer parte da proteína contendo Fc a ser purificada de acordo com a presente invenção, a qual é derivada do domínio ou domínios constantes da imunoglobulina sem compreender domínios completos adicionais. Dessa forma, se a proteína contendo Fc compreende domínios variáveis da imunoglobulina, Fc livre não contém porções significantes dos domínios variáveis. Se a proteína contendo Fc for uma proteína de fusão Fc, Fc livre não contém porções significantes da porção terapêutica da proteína de fusão Fc. Fc livre pode conter, por exemplo, dímeros dos domínios de dobradiça, CH2 e CH3 da IgG que não são ligados ou acoplados a porções significantes de uma porção terapêutica ou domínios variáveis da imunoglobulina, tal como, por exemplo, a porção Fc que é gerada pela divagem por papaína. Uma porção significante pode ser, por exemplo, não menos de 80, 85, 90, 95, 98 ou 99% do domínio variável inteiro ou porção terapêutica presente na proteína contendo Fc.

Monômeros derivados da porção Fc também podem estar contidos na fração Fc livre. Subentende-se que Fc livre pode ainda conter um número de resíduos de aminoácidos da porção terapêutica ou dos domínios variáveis da Ig, tal como, por exemplo, um para cinquenta ou um para vinte, ou um para dez, ou um para cinco aminoácidos, ou um ou dois aminoácidos simples, pertencendo à porção terapêutica ou domínio variável, ainda fusionado à porção Fc.

A cromatografia de troca catiônica pode ser realizada em qualquer resina de troca catiônica adequada, tal como, por exemplo, trocadores catiônicos fracos ou fortes como explicado acima nos Antecedentes da Invenção.

Preferencialmente, a cromatografia de troca catiônica é realizada em uma resina de troca catiônica forte. Mais preferencialmente, o materi al de troca catiônica compreende um metacrilato reticulado modificado com grupos SO₃'. Uma coluna comercialmente disponível sob o nome Fractogel EMD SO3· (da Merck) é um exemplo de uma resina de troca catiônica que é especialmente adequada no contexto do presente método.

Preferencialmente, o fluido ou composição compreendendo a proteína contendo Fc é carregado em uma resina de troca catiônica a um pH de pelo menos uma unidade abaixo do ponto isoelétrico (pl) da dita proteína de fusão Fc.

Em uma modalidade preferencial, a resina de troca catiônica é lavada com um tampão que tem uma condutividade de 6 a 10 mS/cm e a um pH de 5,5 a 7,5.

O tampão pode ter, por exemplo, uma condutividade de 6,1,6,2,

6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1,9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, ou 9,9 mS/cm.

Mais preferencialmente, a condutividade varia de 7,6 a 9,2, isto é, 8,4 + 0,8 mS/cm. A etapa de lavagem é preferencialmente realizada a um pH variando de 5,5 a 7,5, preferencialmente de 6,0 a 7,0.

O pH do tampão pode estar, por exemplo, a 5,5, 5,6, 5,7, 5,8,

5,9, 6,0, 6,1,6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1,7,2, 7,3, 7,4, ou 7,5.

Em uma modalidade preferencial adicional, a etapa de lavagem é realizada em um tampão compreendendo fosfato de sódio a 60 a 140, preferencialmente 70 a 130, mais preferencialmente 75 a 125 mM. O tampão pode compreender fosfato de sódio, por exemplo, a 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135 ou 140 mM.

Em uma modalidade preferencial adicional, a coluna de troca catiônica é eluída em uma faixa de pH de 7,0 a 8,5, preferencialmente 7,25 ou 7,3 ou 7,35 ou 7,4 ou 7,45 ou 7,5 ou 7,55 ou 7,6 ou 7,65 ou 7,7 ou 7,75 ou 7,8 ou 7,85 ou 7,9 ou 7,95 ou 8,0 ou 8,05 ou 8,1 ou 8,15 ou 8,2 ou 8,25 ou 8,3 ou 8,35 ou 8,4 ou 8,45 ou 8,5.

A eluição pode ser preferencialmente realizada em uma faixa de condutividade de 15 a 22 mS/cm. Por exemplo, a condutividade pode ser selecionada a partir de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 mS/cm.

Um tampão de eluição preferencial é um tampão de fosfato.

De acordo com a presente invenção, cromatografia de troca catiônica pode ser preferencialmente usada para eliminação ou redução de Fc livre na faixa de 5 a 15 vezes. Dessa forma, uma redução da concentração de Fc livre na proteína contendo Fc compreendendo fluido, preparação ou composição a menos de 20% ou menos de 15% ou menos de 10% ou menos de 5% ou menos de 2% ou menos de 1 % ou menos de 0,8% ou menos de 0,5% ou menos de 0,3% ou menos de 0,2% ou menos de 0,1% da concentração de proteína total, pode ser alcançada.

Em uma modalidade preferencial, a cromatografia de troca catiônica pode ser usada em um método de purificação que tem uma ou várias etapas adicionais, preferencialmente selecionadas de cromatografia de afinidade, cromatografia de troca aniônica e cromatografia em hidroxiapatita.

Em uma modalidade altamente preferencial, o método da invenção é usado como uma segunda etapa de um esquema de purificação de uma proteína contendo Fc, compreendendo as seguintes etapas:

a. Submissão de um fluido compreendendo a dita proteína contendo Fc à cromatografia de afinidade com Proteína A ou Proteína G ou Proteína L;

b. Submissão do eluído da etapa (a) à cromatografia de troca catiônica;

c. Submissão do eluído da etapa (b) à cromatografia de troca aniônica;

d. Submissão do fluxo contínuo da etapa (c) à cromatografia em hidroxiapatita e coleta do eluído para obtenção da proteína contendo Fc purificada.

De acordo com a presente invenção, um fluido compreendendo uma proteína contendo Fc é primeiro submetido à cromatografia de afinidade com Proteína A ou Proteína G ou Proteína L ou Proteína A/G. O fluido pode ser preferencialmente material de cultura celular, por exemplo, células solubilizadas, mais preferencialmente o sobrenadante de cultura celular. O termo sobrenadante de cultura celular, como usado neste pedido, refere-se a um meio no qual as células são cultivadas e no qual as proteínas são secretadas contanto que contenham sinais celulares apropriados, chamados peptídeos de sinal. É preferencial que as células expressando a proteína contendo Fc sejam cultivadas sob condições de cultura sem soro. Dessa forma, preferencialmente, o sobrenadante de cultura celular é desprovido de componentes derivados do soro animal. Mais preferencialmente ainda, o meio de cultura celular é um meio quimicamente definido.

A Proteína A, G, A/G ou L usada para cromatografia de afinidade pode ser, por exemplo, recombinante. Também pode ser modificada a fim de melhorar suas propriedades (tal como, por exemplo, na resina chamada MabSelect SuRe, comercialmente disponível na GE Healthcare). Em uma modalidade preferencial, a etapa (a) é realizada em uma resina compreendendo agarose reticulada modificada com a Proteína A recombinante. Uma coluna comercialmente disponível sob o nome Mabselect Xtra (da GE Healthcare) é um exemplo de uma resina de afinidade que é especialmente adequada para a etapa (a) do presente método.

A cromatografia de afinidade com Proteína A ou G ou L é preferencialmente usada como uma etapa de captura, e dessa forma serve para a purificação da proteína contendo Fc, em particular, para eliminação de proteínas da célula hospedeira e agregados de proteína contendo Fc, e para a concentração da preparação de proteína contendo Fc.

O termo agregados, como usado neste pedido, é destinado a referir-se a agregados proteicos, e engloba multímeros (tais como dímeros, tetrâmeros ou agregados de ordens mais altas) da proteína contendo Fc a ser purificada e pode resultar em, por exemplo, agregados de alto peso molecular.

A cromatografia de afinidade tem a vantagem adicional de reduzir níveis de agregados de 2 a 4 vezes.

Na utilização da cromatografia de afinidade com Proteína A ou G ou A/G ou L, os níveis de proteína da célula hospedeira podem ser reduzidos de 100 a 300 vezes.

Em uma modalidade preferencial da invenção, a eluição na etapa (a) é realizada em uma faixa de pH de 2,8 a 4,5, preferencialmente de 3,0 a 4,2, mais preferencialmente de 3,5, 3,55, 3,6, 3,65, 3,7, 3,75, 3,8, 3,85,

3,9, 3,95, 4,0, 4,05, 4,1 ou 4,15. A eluição na etapa (a) também pode ser realizada com um gradiente de pH, preferencialmente um gradiente de pH

4,5 a 2,8.

Em uma modalidade preferencial adicional, a eluição na etapa (a) é realizada em um tampão selecionado de citrato de sódio ou acetato de sódio. As concentrações adequadas de tampões são, por exemplo, selecionadas a partir de 50 mM ou 100 mM ou 150 mM ou 200 mM ou 250 mM.

De acordo com a presente invenção, o eluído da cromatografia com Proteína A ou Proteína G ou Proteína A/G ou a Proteína L é submetido à cromatografia de troca catiônica, como explicado detalhadamente acima.

Preferencialmente, o eluído da cromatografia de troca catiônica, isto é, da etapa (b), é diluído ou dialisado em um tampão de carregamento apropriado antes de carregá-lo na coluna de troca aniônica. A coluna de troca aniônica é também preferencialmente equilibrada com o tampão de carregamento.

Um pH preferencial do tampão de carregamento é uma unidade abaixo do pl. Os valores adequados de pH variam de 6,0 a 8,5, preferencialmente de 7,0 a 8,0, por exemplo, 7,0, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35,

7,4, 7,45, 7,5, 7,55, 7,6, 7,65, 7,7, 7,75, 7,8, 7,85, 7,9, 7,95 ou 8,0. Uma condutividade preferencial do tampão de carregamento está na faixa de 3,0 a 4,6 mS/cm.

Um tampão de equilíbrio/carregamento apropriado pode ser, por exemplo, fosfato de sódio em uma faixa de concentração de 5 a 35, preferencialmente de 20 a 30 mM. A concentração do tampão pode ser, por exemplo, 10, 15, 20, 25, 30 mM. No âmbito da presente invenção, fluxo contínuo (chamado curva de ruptura) da cromatografia de troca aniônica, compreendendo a proteína contendo Fc de interesse, é coletado.

A etapa (c) do método da invenção, além disso, reduz 3 a 5 vezes os agregados e 30 a 70 vezes as proteínas da célula hospedeira.

De acordo com a presente invenção, o fluxo contínuo da cromatografia de troca aniônica da etapa (c) é então usado para purificação adicional por cromatografia em hidroxiapatita. Qualquer resina de hidroxiapatita pode ser usada para realizar a etapa (d) do método de acordo com a invenção. Em uma modalidade preferencial, a etapa (d) é realizada em uma resina de hidroxiapatita cerâmica, tal como uma resina de hidroxiapatita do tipo I ou tipo II. A resina de hidroxiapatita pode ter partículas de qualquer tamanho, tais como 20, 40 ou 80 pm. Em uma modalidade altamente preferencial, a resina de hidroxiapatita cerâmica compreende partículas que têm um tamanho de 40 pm. Uma resina de hidroxiapatita que é especialmente adequada para a etapa (d) do presente método é uma coluna comercialmente disponível sob o nome CHT Hidroxiapatita Cerâmica Tipo I, 40 pm.

Em uma modalidade preferencial, o fluxo contínuo da etapa (c) é diretamente carregado na resina de hidroxiapatita, isto é, sem diluição ou diálise prévias, em um tampão de carregamento apropriado. O carregamento é preferencialmente realizado a um pH de 6,5 a 7,5, tal como 6,6, 6,7, 6,8,

6,9, 7,1, 7,2, 7,3, ou 7,4, e preferencialmente 7,0.

Em uma modalidade preferencial adicional, a eluição na etapa (d) é realizada na presença de fosfato de sódio variando de 2 a 10 mM, preferencialmente nas faixas de 2,75 a 5,25 mM, tais como, por exemplo, em 3, 3,25, 3,5, 3,75, 4, 4,25, 4,5, 4,75, 5.

Em mais uma modalidade preferencial, a eluição na etapa (d) é realizada em uma faixa de pH de 6,0 a 7,0, por exemplo, em 6,1, 6,2, 6,3,

6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9.

Em outra modalidade preferencial, a eluição na etapa (d) é realizada na presença de cloreto de potássio variando de 0,4 a 1 M, preferencialmente em 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95 M, mais preferencialmente ainda em 0,6 M.

De acordo com a presente invenção, o eluído da cromatografia em hidroxiapatita é coletado, contendo a preparação de proteína contendo Fc finalmente purificada.

Materiais de matriz adequados, isto é, materiais de carregado res das resinas cromatográficas usados nas etapas (a) a (c), que podem ser usados com ligação à presente invenção podem ser, por exemplo, agarose (sefarose, superose), dextrana (sefadex), polipropileno, metacrilato de celulose, poliestireno/divinila benzeno, ou similar. Os materiais da resina podem estar presentes em diferentes formas reticuladas, dependendo do uso específico.

O volume da resina, o comprimento e o diâmetro da coluna a ser usada, bem como a capacidade dinâmica e velocidade de fluxo dependem de vários parâmetros, tais como, volume de fluido a ser tratado, concentração da proteína no fluido a ser submetido ao processo da invenção, etc. A determinação desses parâmetros em cada etapa é bem-conhecida dentro da média das competências da pessoa versada na técnica.

Em uma modalidade preferencial do presente processo de purificação, uma ou mais etapas de ultrafiltração são realizadas. A ultrafiltração é útil para a remoção de pequenas moléculas orgânicas e sais no eluído resultante das etapas cromatrográficas prévias, para equilibrar a proteína contendo Fc em massa por volume de tampão, ou para concentrar a proteína contendo Fc à concentração desejada. Tal ultrafiltração pode ser, por exemplo, realizada em membranas de ultrafiltração, com poro de tamanhos que permitam a remoção de componentes que tenham pesos moleculares inferiores a 5, 10, 15, 20, 25, 30 ou mais kDa.

Preferencialmente, a ultrafiltração é realizada entre as etapas (b) e (c), e/ou após a etapa (d). Mais preferencialmente, duas etapas de ultrafiltração são realizadas, uma entre as etapas (b) e (c) e uma após a etapa (d).

Se a proteína purificada de acordo com o processo da invenção destina-se à administração em humanos, é vantajoso incluir uma ou mais etapas de remoção de vírus no processo. Preferencialmente, uma etapa de filtração para remoção de vírus é realizada após a etapa (d). Mais preferencialmente, a etapa de filtração para remoção de vírus é uma etapa de nanofiltração onde o filtro tem um poro de tamanho nominal de 20nm. O método da presente invenção, e em particular as etapas (a), (c), (d) em combinação com nanofiltração elimina eficientemente a carga viral a um LRV combinado (valor de redução logarítmica) de até aproximadamente 15 a 25.

A fim de facilitar o armazenamento ou o transporte, por exemplo, o material pode ser congelado e descongelado antes e/ou após qualquer etapa de purificação da invenção.

De acordo com a presente invenção, a proteína contendo Fc recombinante pode ser produzida em sistemas de expressão eucarióticos, tais como leveduras, insetos, ou células mamíferas, resultando em proteínas contendo Fc glicosiladas.

De acordo com a presente invenção, o mais preferencial é expressar a proteína contendo Fc em células mamíferas, tais como linhagens celulares animais, ou em linhagens celulares humanas. Células de ovário de hamster chinês (CHO) ou a linhagem celular de mieloma murino NSO são exemplos de linhagens celulares que são especialmente adequadas para a expressão da proteína contendo Fc a ser purificada. A proteína contendo Fc também pode ser preferencialmente produzida em linhagens celulares humanas, tais como, por exemplo, a linhagem celular de fibrossarcoma humano HT1080, a linhagem celular de retinoblastoma humano PERC6, ou a linhagem celular embrionária de rim humano 293, ou uma linhagem celular de amniócito permanente como descrito, por exemplo, na patente EP 1 230 354.

Se a proteína contendo Fc a ser purificada for expressa por células mamíferas que a secretam, o material inicial do processo de purificação da invenção é o sobrenadante da cultura celular, também chamado colheita ou colheita bruta. Se as células forem cultivadas em um meio contendo soro animal, o sobrenadante da cultura celular também contém as proteínas séricas como impurezas.

Preferencialmente, células expressando e secretando a proteína contendo Fc são cultivadas sob condições sem soro. A proteína contendo Fc também pode ser produzida em um meio quimicamente definido. Nesse caso, o material inicial do processo de purificação da invenção é o sobrenadante da cultura celular sem soro que contém principalmente proteínas da célula hospedeira como impurezas. Se fatores de crescimento forem adicionados ao meio de cultura celular, tal como insulina, por exemplo, esta proteína também será eliminada durante o processo de purificação.

A fim de criar proteína solúvel contendo Fc secretada, que é lançada no sobrenadante da cultura celular, o peptídeo de sinal natural da porção terapêutica da proteína contendo Fc é usado, ou preferencialmente um peptídeo de sinal heterólogo, isto é, um peptídeo de sinal derivado de outra proteína secretada que é eficiente no sistema particular de expressão usado, tal como, por exemplo, o peptídeo de sinal Hormônio do Crescimento bovino ou humano, ou peptídeo de sinal da imunoglobulina.

Como mencionado acima, uma proteína contendo Fc preferencial a ser purificada, de acordo com a presente invenção, é uma proteína de fusão que tem uma porção terapêutica derivada de TACI humano (SEQ ID NO: 2), e em particular um fragmento derivado do seu domínio extracelular (1 a 165 aminoácidos da SEQ ID NO: 2). Um fragmento preferencial compreende 30 a 110 aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Subsequentemente, as porções terapêuticas derivadas do domínio extracelular TACI serão chamadas TACI solúvel ou sTACI. Uma porção Fc preferencial compreende a SEQ ID NO: 3, resultando em uma proteína de fusão Fc de acordo com a SEQ ID NO: 4, subsequentemente chamada TACI-Fc. O termo TACI-Fc, como usado neste pedido, também engloba muteínas de TACI-Fc.

O termo muteínas, como usado neste pedido, refere-se a análogos de sTACI ou TACI-Fc, nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos de sTACI ou TACI-Fc são substituídos por resíduos de aminoácidos diferentes, ou são deletados, ou um ou mais resíduos de aminoácidos são acrescentados à sequência original de sTACI ou TACI-Fc sem modificar consideravelmente a atividade dos produtos resultantes quando comparados com as sTACI ou TACI-Fc originais. Essas muteínas são preparadas através de sínteses conhecidas e/ou por técnicas de mutagênese direcionadas ao sítio, ou qualquer outra técnica conhecida adequada para tal.

Muteínas, de acordo com a presente invenção, incluem proteínas codificadas por um ácido nucleico, tal como DNA ou RNA, que se hibri diza ao complemento de um DNA ou RNA, que codifica uma sTACI ou TACIFc de acordo com qualquer uma das SEQ ID NO: 2 ou 4 sob condições estringentes. Um exemplo de uma sequência de DNA que codifica uma TACIFcéaSEQIDNO: 7.

O termo condições estringentes refere-se às condições de hibridização e de lavagem subsequentes, às quais aqueles versados na técnica usual convencionalmente referem-se como estringente. Vide Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., §§6.3 and 6.4 (1987, 1992). Sem restrição, os exemplos de condições estringentes incluem condições de lavagem 12 a 20°C abaixo da Tm calculada para o híbrido sob estudo em, por exemplo, SSC 2x e SDS 0,5% durante 5 minutos, SSC 2x e SDS 0,1% durante 15 minutos; SSC 0,1 x e SDS 0,5% a 37°C durante 30 a 60 minutos e então, uma SSC 0,1 x e SDS 0,5% a 68°C durante 30 a 60 minutos. Aqueles versados na técnica usual entendem que condições estringentes também dependem do tamanho das sequências de DNA, sondas de oligonucleotídeo (tais como 10 a 40 bases) ou sondas de oligonucleotídeos mistas. Se as sondas mistas forem usadas, é preferível usar cloreto de tetrametilamônio (TMAC) em vez de SSC. Vide Ausubel, supra.

Em outra modalidade, tais muteínas têm pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% de identidade ou homologia a essas.

Identidade reflete uma relação entre duas ou mais sequências de polipeptídeo ou duas ou mais sequências de polinucleotídeo, determinadas pela comparação das sequências. Em geral, a identidade refere-se a uma correspondência exata nucleotídeo para nucleotídeo ou aminoácido para aminoácido dos dois polinucleotídeos ou duas sequências de polipeptídeo, respectivamente, sobre o comprimento das sequências que são comparadas.

Para sequências onde não há uma correspondência exata, uma porcentagem de identidade pode ser determinada. Em geral, as duas sequências a serem comparadas são alinhadas para fornecer uma correia ção máxima entre as sequências. Isso pode incluir a inserção de lacunas em uma ou em ambas as sequências, para melhorar o grau de alinhamento. Uma porcentagem de identidade pode ser determinada sobre o comprimento inteiro de cada uma das sequências que são comparadas (chamado alinhamento global), que é particularmente adequado para sequências do mesmo comprimento ou muito similares, ou sobre comprimentos definidos mais curtos, (chamado alinhamento local), que é mais adequado para sequências de comprimento desigual.

Métodos para comparação da identidade e da homologia de duas ou mais sequências são bem-conhecidos na técnica. Dessa forma, por exemplo, programas disponíveis no Pacote de Análise de Sequência Wisconsin, versão 9.1 (Devereux J et ai., 1984), por exemplo, os programas BESTFIT e GAP, podem ser usados para determinar a porcentagem de identidade entre dois polinucleotídeos e a porcentagem de identidade e a porcentagem de homologia entre duas sequências polipeptídicas. BESTFIT usa o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (1981) e encontra a melhor região de similaridade única entre duas sequências. Outros programas para determinação da similaridade e/ou da identidade entre sequências também são conhecidos na técnica, por exemplo, a família BLAST de programas (Altschul S F e al, 1990, Altschul S F e al, 1997, acessível através da página principal do NCBI em www.ncbi.nlm.nih.gov) e FASTA (Pearson W R, 1990).

Tais muteínas preferencialmente têm uma sequência de aminoácidos adequadamente duplicada daquela sTACI ou TACI-Fc, assim como, têm atividade de ligação ao ligante substancialmente similar a uma proteína da SEQ ID NO: 2 ou 4. Por exemplo, atividade de TACI é sua capacidade de ligação a Blys ou APRIL (Hymowitz et al., 2006). Enquanto a muteína tem substancial atividade de ligação a APRIL ou Blys, pode considerar-se que tem a atividade substancialmente similar a TACI. Dessa forma, pode ser facilmente determinada pela pessoa versada na técnica se alguma muteína fornecida tem substancialmente a mesma atividade que uma proteína da SEQ ID NO: 2 ou 4 por meio da experimentação usual.

Modificações preferenciais das muteínas, de acordo com a presente invenção, são o que é conhecido como substituições conservativas. As substituições conservativas de aminoácidos de sTACI ou TACI-Fc, podem incluir aminoácidos sinônimos dentro de um grupo que tenha propriedades físico-químicas adequadamente similares de modo que a substituição entre membros do grupo conserve a função biológica da molécula (Grantham, 1974). Está claro que inserções e deleções de aminoácidos também podem ser feitas nas sequências acima definidas sem alterar a sua função, em particular se as inserções ou deleções envolverem somente alguns aminoácidos, por exemplo, abaixo de trinta, abaixo de vinte, ou preferencialmente abaixo de dez, e não removerem ou deslocarem aminoácidos que são críticos para uma conformação funcional, por exemplo, resíduos de cisteína. Proteínas e muteínas produzidas por tais deleções e/ou inserções vêm dentro do escopo da presente invenção.

Preferencialmente, os grupos de aminoácidos conservativos são aqueles definidos na Tabela 2. Mais preferencialmente, os grupos de aminoácidos sinônimos são os definidos na Tabela 3; e mais preferencialmente ainda os grupos de aminoácidos sinônimos são os definidos na Tabela 4.

TABELA 2

Grupos Preferenciais de Aminoácidos Sinônimos

Aminoácido	Grupo Sinônimo
Ser	Ser, Thr, Gly, Asn
Arg Leu	Arg, Gin, Lys, Glu, His He, Phe, Tyr, Met, Vai, Leu
Pro	Gly, Ala, Thr, Pro
Thr	Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin, Thr
Ala	Gly, Thr, Pro, Ala
Vai	Met, Tyr, Phe, He, Leu, Vai
Gly lie	Ala, Thr, Pro, Ser, Gly Met, Tyr, Phe, Vai, Leu, He
Phe	Trp, Met, Tyr, He, Vai, Leu, Phe
Tyr	Trp, Met, Phe, He, Vai, Leu, Tyr

TABELA 2 - Continuação Grupos Preferenciais de Aminoácidos Sinônimos
Aminoácido	Grupo Sinônimo
Cys	Ser, Thr, Cys
His	Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, His
Gin	Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gin
Asn	Gin, Asp, Ser, Asn
Lys	Glu, Gin, His, Arg, Lys
Asp	Glu, Asn, Asp
Glu	Asp, Lys, Asn, Gin, His, Arg, Glu
Met	Phe, He, Vai, Leu, Met
Trp	Trp
	TABELA 3
Grupos Mais Preferenciais de Aminoácidos Sinônimos
Aminoácido	Grupo Sinônimo
Ser	Ser
Arg	His, Lys, Arg
Leu	Leu, He, Phe, Met
Pro	Ala, Pro
Thr	Thr
Ala	Pro, Ala
Vai	Vai, Met, He
Gly	Gly
lie	He, Met, Phe, Vai, Leu
Phe	Met, Tyr, He, Leu, Phe
Tyr	Phe, Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His, Gin, Arg
Gin	Glu, Gin, His
Asn	Asp, Asn
Lys	Lys, Arg
Asp	Asp, Asn

TABELA 3 - Continuação

Grupos Mais Preferenciais de Aminoácidos Sinônimos Aminoácido Grupo Sinônimo

Glu Glu, Gin

Met Met, Phe, He, Vai, Leu

Trp Trp

TABLE 4

Grupos Mais Preferenciais Ainda de Aminoácidos Sinônimos

Aminoácido	Grupo Sinônimo
Ser	Ser
Arg Leu	Arg Leu, lie, Met
Pro	Pro
Thr	Thr
Ala	Ala
Vai	Vai
Gly lie	Gly He, Met, Leu
Phe	Phe
Tyr Cys His	Tyr Cys, Ser His
Gin	Gin
Asn	Asn
Lys Asp Glu	Lys Asp Glu
Met	Met, He, Leu
Trp	Met

Um derivativo funcional pode ser preparado a partir de uma proteína de fusão Fc purificada de acordo com a presente invenção. Derivativos funcionais, como usado neste pedido abrangem os derivados da proteí na contendo Fc a ser purificada, de acordo com a presente invenção, que podem ser preparados a partir dos grupos funcionais que ocorrem como cadeias laterais nos resíduos ou grupos N- ou C-terminal, por meios conhecidos na técnica, e são incluídos na invenção enquanto permanecem farmaceuticamente aceitáveis, isto é, não destroem a atividade da proteína que é substancialmente similar à atividade da proteína contendo Fc não-modificada, como definido acima, e não confere propriedades tóxicas a composições que os contêm.

Os derivativos funcionais de uma proteína contendo Fc podem ser, por exemplo, conjugados a polímeros para melhorar as propriedades da proteína, tais como a estabilidade, meia-vida, biodisponibilidade, tolerância pelo corpo humano, ou imunogenicidade. Para alcançar esta meta, a proteína contendo Fc pode ser ligada, por exemplo, ao polietilenoglicol (PEG). A peguilação pode ser realizada por métodos conhecidos, descritos em WO 92/13095, por exemplo.

Derivativos funcionais também podem incluir, por exemplo, ésteres alifáticos dos grupos carboxila, amidas dos grupos carboxila pela reação com amônia ou com aminas primárias ou secundárias, derivativos de N-acila de grupos amino livres dos resíduos de aminoácidos formados com porções acila (por exemplo, alcanoíla ou grupos aroíla carbocíclicos) ou derivativos O-acila de grupos livres de hidroxila (por exemplo, aqueles resíduos serila ou treonila) formados com porções acila.

Em um terceiro aspecto, a invenção refere-se a uma proteína purificada pelo processo de purificação de acordo com a invenção. Subsequentemente, tal proteína é também chamada proteína contendo Fc purificada.

Tal proteína contendo Fc purificada é preferencialmente a proteína contendo Fc altamente purificada. Proteína de fusão Fc altamente purificada é determinada, por exemplo, pela presença de uma única banda em um gel de SDS-PAGE corado por prata não-reduzida após carregamento da proteína na quantidade de 2 mcg por coluna. A proteína de fusão Fc purificada também pode ser definida como um pico único de eluição em HPLC.

A preparação de proteína contendo Fc obtida a partir do processo de purificação da invenção pode conter menos de 20% de impurezas, preferencialmente menos de 10%, 5%, 3%, 2% ou 1% de impurezas, ou pode ser purificada à homogeneidade, isto é, ser livre de quaisquer contaminantes proteicos detectáveis como determinado, por exemplo, por SDSPAGE corado por prata ou HPLC, como explicado acima.

A proteína contendo Fc purificada pode ser destinada para uso terapêutico, em particular para a administração a pacientes humanos. Se a proteína contendo Fc purificada for administrada a pacientes, é preferencialmente administrada sistemicamente, e preferencialmente subcutaneamente ou intramuscularmente, ou topicamente, isto é, localmente. Administração retal ou intratecal também pode ser adequada, dependendo do uso médico específico da proteína contendo Fc purificada.

Com esta finalidade, em modalidade preferencial da presente invenção, a proteína contendo Fc purificada pode ser formulada em composição farmacêutica, isto é, em conjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável, excipientes ou similar.

A definição de farmaceuticamente aceitável destina-se a englobar qualquer veículo, que não interfira na eficácia da atividade biológica do ingrediente ativo e não seja tóxico ao hospedeiro ao qual é administrado. Por exemplo, para administração parenteral, a(s) proteína(s) ativa(s) pode(m) ser formulada(s) em uma forma de dosagem de unidades para injeção em veículos, tais como solução salina, solução de glicose, albumina sérica e solução de Ringer.

Os ingredientes ativos da composição farmacêutica, de acordo com a invenção, podem ser administrados a um indivíduo de vários modos. As vias da administração incluem a intradérmica, transdérmica (por exemplo, em formulações de liberação lenta), intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, oral, intracraniana, epidural, vias tópicas, retais e intranasais. Qualquer outra via de administração terapeuticamente eficaz pode ser usada, por exemplo, absorção por tecidos epiteliais ou endoteliais ou pela terapia gênica em que uma molécula de DNA que codifica o agente ativo é administrada ao paciente (por exemplo, através de um vetor), que induz a expressão e secreção do agente ativo in vivo. Além disso, a(s) proteína(s), de acordo com a invenção, pode ser administrada em conjunto com outros componentes de agentes biologicamente ativos, tais como tensoativos farmaceuticamente aceitáveis, excipientes, transportadores, diluentes e veículos.

Para administração parenteral (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intramuscular), a(s) proteína(s) ativa(s) pode ser formulada como uma solução, suspensão, emulsão ou pó liofilizado em associação com um veículo parenteral farmaceuticamente aceitável (por exemplo, água, solução salina, solução de glicose) e aditivos que mantenham a isotonicidade (por exemplo, manitol) ou a estabilidade química (por exemplo, conservantes e tampões). A formulação é esterilizada por técnicas comumente usadas.

As quantidades terapeuticamente eficazes da(s) proteína(s) ativais) serão uma função de muitas variáveis, inclusive o tipo de proteína contendo Fc, a afinidade da proteína contendo Fc ao seu ligante, a via de administração, a condição clínica do paciente.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz é tal que quando administrada, a proteína contendo Fc resulta na inibição do seu ligante da porção terapêutica da proteína de fusão Fc, como explicado acima e referindo-se em particular a Tabela 5 acima.

A dosagem administrada, como doses únicas ou múltiplas, a um indivíduo será modificada dependendo de uma variedade de fatores, incluindo propriedades farmacocinéticas da proteína de fusão Fc, via de administração, condições e características do paciente (sexo, idade, peso corporal, saúde, tamanho), extensão de sintomas, tratamentos simultâneos, frequência do tratamento e o efeito desejado. Ajuste e manipulação de faixas de dosagem estabelecidas estão dentro das competências dos versados na técnica, bem como métodos in vitro e in vivo para determinação da inibição do ligante natural da porção terapêutica em um indivíduo.

A proteína contendo Fc purificada pode ser usada em uma quantidade de 0,001 a 100 mg/kg ou 0,01 a 10 mg/kg de peso corporal, ou

0,1 a 5 mg/kg de peso corporal ou 1 a 3 mg/kg de peso corporal ou 2 mg/kg de peso corporal.

Em modalidades preferenciais adicionais, a proteína contendo Fc purificada é administrada diariamente ou dia sim dia não ou três vezes por semana ou uma vez por semana.

As doses diárias são normalmente dadas em doses fracionadas ou em forma de liberação prolongada eficaz para obter os resultados desejados. Administrações auxiliares ou subsequentes podem ser realizadas em uma dosagem que é a mesma, menor ou maior do que a dose inicial ou prévia administrada ao indivíduo. Uma administração auxiliar ou subsequente pode ser feita durante ou antes do aparecimento da doença.

A presente invenção, além disso, refere-se ao uso de cromatografia de troca catiônica para redução da concentração de porções Fc livres em uma composição compreendendo uma proteína contendo Fc.

Em uma modalidade preferencial, a concentração de Fc livre é reduzida a menos de 20% ou menos de 15% ou menos de 10% ou menos de 5% ou menos de 2% ou menos de 1% ou menos de 0,8% ou menos de 0,5 % ou menos de 0,2 % ou menos de 0,1% da concentração de proteína total da dita composição.

Tendo descrito agora totalmente esta invenção, será apreciado por aqueles versados na técnica que a mesma pode ser realizada dentro de uma larga faixa de parâmetros, concentrações e condições equivalentes sem se afastar do espírito e do escopo da invenção e sem experimentação indevida.

Enquanto esta invenção foi descrita em ligação com modalidades específicas da mesma, será entendido que é capaz de modificações adicionais. Este pedido é destinado a cobrir quaisquer variações, usos ou adaptações da invenção seguinte, em geral, princípios da invenção e inclusive tais partidas da presente descrição como vem dentro da prática conhecida ou usual dentro da técnica à qual a invenção pertence e como pode ser aplicada às características essenciais acima apresentadas como se segue no escopo das reivindicações anexadas.

Todas as referências citadas neste pedido, inclusive artigos ou resumos de jornal, pedidos de patente estrangeiros ou dos Estados Unidos publicados ou inéditos, patentes estrangeiras ou publicadas nos Estados Unidos ou quaisquer outras referências, são inteiramente incorporadas por referência neste pedido, inclusive todos os dados, tabelas, números e texto apresentados nas referências citadas. Adicionalmente, os conteúdos completos das referências citadas dentro das referências citadas neste pedido também estão completamente incorporados por referência.

Referência a etapas de método conhecido, etapas de métodos convencionais, métodos conhecidos ou métodos convencionais não é de nenhum modo uma admissão que qualquer aspecto, descrição ou modalidade da presente invenção são descritos, ensinados ou sugeridos na técnica relacionada.

A descrição precedente de modalidades específicas irá descrever totalmente a natureza geral da invenção, que outros podem, aplicando conhecimento dentro da competência da técnica (inclusive os conteúdos das referências citadas neste pedido), prontamente modificar e/ou adaptar a várias aplicações tais modalidades específicas, sem experimentação indevida, sem partir do conceito geral da presente invenção. Por isso, tais adaptações e as modificações são destinadas a estar dentro da significação de uma variedade de equivalentes de modalidades descritas, baseadas no ensinamento e orientação apresentados neste pedido. Deve-se entender que a fraseologia ou terminologia neste pedido é para fins de descrição e não de limitação, tal que a terminologia ou fraseologia do presente relatório devem ser interpretadas pelo versado na técnica à luz dos ensinamentos e orientação apresentados neste pedido, em combinação com o conhecimento de uma pessoa versada na técnica.

EXEMPLOS:

PURIFICAÇÃO DE TACI-Fc HUMANA RECOMBINANTE, A PARTIR DE

SOBRENADANTE DE CÉLULA CHO SEM SORO

Glossário usado em todos os Exemplos

BV:	Volume de leito
CHO:	Ovário de Hamster chinês
DSP:	Processo a jusante
EDTA:	Ácido de Etileno Diamino Tetracético
ELISA:	Ensaio Imunoabsorvente ligado à Enzima
HAC:	Cromatografia em hidroxiapatita
HCP:	Proteína da Célula Hospedeira
HPLC:	Cromatografia Líquida de Alto Desempenho
id:	diâmetro interno
K:	potássio
kD:	kilo Dalton
MES:	Ácido 2-Morfolinoetanossulfônico
Na:	sódio
NaAc:	Acetato de Sódio
n/d:	não determinado
PA-SE-HPLC:	Cromatografia Líquida de Alto Desempenho por Exclusão de Tamanho em Proteína A
ppm:	partes por milhão
RO:	Osmose Reversa
RT:	Temperatura ambiente
SDS-PAGE:	Eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio
SE-HPLC:	Cromatografia Líquida de Alto Desempenho por Exclusão de Tamanho
T°C:	Temperatura
TMAC:	Cloreto de Tetrametilamônio
UV:	Ultravioleta
WFI:	Água de Injeção

WRO Osmose Reversa da Água

Exemplo 1: Etapa de Captura: purificação por afinidade com Proteína A

O material inicial foi purificado da colheita de um clone de célula CHO cultivado sob condições sem soro expressando TACI-Fc e armazenado congelado até o uso.

A etapa de captura em uma coluna MabSelect Xtra™ (GE Healthcare 17-5269-03) foi realizada de acordo com o seguinte protocolo, em uma coluna que tem uma altura de leito de 17 cm. Todas as operações foram realizadas à temperatura ambiente, exceto a solução de carga, que foi mantida a uma temperatura abaixo de 15°C. O sinal UV foi registrado em 280 nm.

Sanitização

A coluna foi sanitizada com pelo menos 3BV de ácido acético a 0,1 M + etanol 20% em fluxo reverso a 250 cm/h. O fluxo foi interrompido durante 1 hora.

Etapa de lavagem

A coluna foi lavada com pelo menos 2BV de água RO em fluxo reverso a 250cm/h.

Eguilíbrio

A coluna foi equilibrada com pelo menos 5BV de fosfato de sódio a 25 mM + NaCI a 150 mM pH 7,0 (até que a condutividade e os parâmetros de pH estejam dentro da faixa especificada: pH 7,0 ± 0,1, condutividade 18 ± 2 mS/cm) em fluxo descendente a 450 cm/h.

Carregamento

A coluna foi carregada com a colheita purificada mantida a uma temperatura abaixo de 15°C para uma capacidade de até 15 mg de TACI-Fc total por ml da resina empacotada como determinado pelo ensaio Biacore em uma velocidade de fluxo de 350 cm/h.

Etapa de Lavagem

Lavagem da coluna com pelo menos 2BV do tampão de equilíbrio a 350 cm/h e então com pelo menos 4BV do tampão de equilíbrio (até que o sinal UV volte à linha de base) a 450 cm/h.

Eluição

O material foi eluído com diferentes tampões de eluição como mostrado na Tabela I a uma velocidade de fluxo de 350 cm/h. A fração eluída foi coletada a partir do início do aumento do sinal UV a 6,0 ± 0.5BV de eluição. O eluído foi incubado durante 1 hora à temperatura ambiente a um pH abaixo de 4,1 (ajustado pela adição da solução de ácido cítrico, se necessário) e então o pH foi ajustado a 5,0 ±0,1 pela adição da solução de NaOH a 32%.

Regeneração

A coluna foi regenerada com pelo menos 3BV de NaOH a 50 mM + NaCI a 1M em fluxo reverso a 450cm/h, o fluxo interrompido por 15 minutos, então reiniciado o fluxo a 450cm/h a pelo menos 3BV (até que o sinal UV volte à linha de base).

A partir dessa etapa, a coluna foi operada em modo de fluxo reverso.

Etapa de lavagem

A coluna foi lavada com pelo menos 2BV de água RO a 450cm/h.

Sanitização

A coluna foi sanitizada com pelo menos 3BV do tampão de sanitização a 250 cm/h, o fluxo interrompido e a coluna incubada por 60 minutos. Etapas finais de lavagem

A coluna foi lavada com pelo menos 1BV de água RO a 250cm/h, então com pelo menos 3BV do tampão de equilíbrio a 250cm/h e finalmente com pelo menos 2BV de água RO a 250cm/h.

Finalmente, a coluna foi guardada depois de enxaguada com pelo menos 3BV do etanol 20% a 250cm/h.

Resultados

Tabela I: Resultados usando diferentes tampões de eluição

Número da corrida	Tampão de Eluição	Rendimento de TACI-Fc (%)	Agregados (%)	HCPs (ppm)
1	acetato de sódio a 50mM pH3,7	47,7	30,3	5558
2	acetato de sódio a 100mM pH3,8	55,7	25,2	n/d
3	acetato de sódio a 200mM pH3,8	58,0	28,2	n/d
4	acetato de sódio a 100mM pH3,7	68	30,0	n/d
5	acetato de sódio a 0,2M + cloreto de sódio a 150mM pH4	75,1	3,8	n/d
6	acetato de sódio a 100mM pH3,7	84,6	22	3491
7	acetato de sódio a 250mM pH3,7	82,8	18,7	3318
8	citrato de sódio a 100mM pH3,7	79,2	8,8	4710
9	citrato de sódio a 250mM pH3,7	71,9	23	2347
10	citrato de sódio a 100mM pH3,75	82,8	8,5	1576
11	citrato de sódio a 100mM pH3,75	66,6	9,0	664
12	acetato de sódio a 100mM pH3,85	83,3	15,0	n/d
13	citrato de sódio a 100mM pH3,75	81,0	9,1	3490
14	citrato de sódio a 100mM pH3,65	75,1	14,6	2580
14	citrato de sódio a 100mM pH3,75	44,7	18,4	3783
16	citrato de sódio a 100mM pH3,75	47,1	15,8	3217
17	citrato de sódio a 100mM pH3,75	50,7	9,4	2349
18	citrato de sódio a 100mM pH3,75	58,0	10,4	2550
19	citrato de sódio a 100mM pH3,75	67,1	28,7	2372
20	citrato de sódio a 100mM pH3,75	65,6	17,5	2353
21	citrato de sódio a 100mM pH3,75	75,6	19,4	1807
22	citrato de sódio a 100mM pH3,75	57,1	20,7	2465
23	citrato de sódio a 100mM pH3,75	51,9	18,4	2030
24	citrato de sódio a 100mM pH3,75	58	11,5	1746
25	citrato de sódio a 100mM pH3,75	41,8	22,9	3029
26	citrato de sódio a 100mM pH3,9	39,4	6,0	2424
27	citrato de sódio a 100mM pH3,9	31,0	8,8	2936
28	acetato de sódio a 100mM pH4,1	28,3	25,0	3311

Número da corrida	Tampão de Eluição	Rendimento de TACI-Fc (%)	Agregados (%)	HCPs (PPm)
29	citrato de sódio a 100mM pH3,9	46,4	9,1	n/d
30	acetato de sódio a 100mM pH4,1	42,8	13,4	n/d
31	citrato de sódio a 100mM pH3,75	57,5	26,5	n/d
32	acetato de sódio a 100mM pH4,2	38,1	10,1	n/d
33	citrato de sódio a 100mM pH3,9	43,3	8,3	2011
34	citrato de sódio a 100mM pH3,9	63,6	6,6	1749
35	citrato de sódio a 100mM pH3,9	65,7	7,3	1689
36	citrato de sódio a 100mM pH3,9	62,7	7,4	1609
37	citrato de sódio a 100mM pH3,9	61,6	7,4	1479
38	citrato de sódio a 100mM pH3,9	60,6	7,4	1623
39	citrato de sódio a 100mM pH3,9	64,6	8,0	1497

Conclusões

TACI-Fc5 purificada na colheita foi capturada diretamente em uma coluna MabSelect Xtra a uma capacidade dinâmica total de 15g de TACl-Fc5 por L da resina empacotada a uma velocidade de fluxo de 350 cm/h. As condições de eluição, especialmente pH, foram otimizadas para maximizar a recuperação do produto fornecendo redução significante nos níveis de agregados. Um tampão de eluição de citrato de sódio a 0,1 M pH 3,9 foi selecionado fornecendo níveis de agregados de aproximadamente 5 a 10% começando de aproximadamente 25 a 40% purificada na colheita e sem turbidez observada. Os níveis de HCP foram tipicamente a 1500 a 2000ppm. Os níveis de HCP foram medidos por ELISA usando anticorpos policlonais. A mistura de anticorpos foi gerada contra proteínas da célula hospedeira derivada do sobrenadante purificado e concentrado de culturas celulares de células de CHO não transfectadas.

Exemplo 2: Cromatografia de troca catiônica

O eluído da etapa de captura com proteína A, dialisado no tampão de carregamento adequado, foi usado como um material inicial para cromatografia de troca catiônica.

Uma coluna Fractogel EMD SO₃' (Merck 1.16882.0010) tendo uma altura de leito de 10 cm foi usada nesta etapa. Uma coluna Fractogel

SO3· com uma altura de leito de 15 cm também pode ser usada. No último caso, a capacidade dinâmica e a velocidade de fluxo podem precisar de adaptação, que está dentro dos conhecimentos de rotina da pessoa versada na técnica.

Todas as operações foram realizadas à temperatura ambiente e a velocidade de fluxo foi mantida constante a 150 cm/h. O sinal UV em 280 nm foi registrado em todo o tempo.

Etapa de Lavagem

A coluna foi lavada com pelo menos 1BV de WRO (osmose reversa de água).

Sanitização

Então, a coluna foi sanitizada com pelo menos 3BV de NaOH a 0,5M + NaCI a 1,5M no modo de fluxo descendente.

Enxague

A coluna foi enxaguada com pelo menos 4BV de WRO no modo de fluxo descendente.

Eguilíbrio

A coluna foi equilibrada com pelo menos 4BV de citrato de sódio a 100 mM pH 5,0 (ou até a condutividade alvo de 12±1 mS/cm e pH 5,0 ± 0,1 serem alcançados).

Carregamento

A coluna foi carregada com o material da pós-captura em pH 5,0 (pH a 5,0±0,1, condutividade a 12±1 mS/cm) e a uma capacidade de não mais do que 50 mg de TACI-Fc, por ml da resina empacotada como determinado pelo ensaio de SE-HPLC.

Etapa de Lavagem

A coluna foi então lavada com pelo menos 5BV de fosfato de sódio a 100 mM pH 6,5.

Eluição

A coluna foi eluída com diferentes tampões e sob diferentes condições como mostrado nas tabelas II a IV abaixo.

Regeneração e sanitização

A coluna foi regenerada e sanitizada com 4BV de NaOH a 0,5M + NaCI a 1,5M no modo de fluxo ascendente. Então, o fluxo foi interrompido por 30 minutos.

Enxague

A coluna foi enxaguada com pelo menos 4BV de WRO. Armazenamento

A coluna foi guardada em pelo menos 3BV de etanol 20%. Resultados

Tabela II: Efeito do pH e da condutividade na eluição

Níveis de HCP na carga: 189ppm

pH	Condutividade (mS/cm)	Recuperação de TACI-Fc	HCPs (ppm)	Depuração de HCP (x)
6,5	15,0	25%	118	1,6
7,3	22,5	100%	50	3,8
8,0	15,0	95%	34	5,5
7,3	22,5	100%	56	3,4
7,3	33,0	98%	133	1,4
7,3	22,5	96%	45	4,2
7,3	22,5	97%	53	3,6
7,3	12,0	54%	79	2,4
6,3	22,5	83%	47	4,1
8,0	30,0	96%	108	1,8
8,2	22,5	97%	46	4,2
6,5	30,0	91%	116	1,6
7,3	22,5	93%	48	3,9
7,3	22,5	95%	40	4,8

A tabela III mostra a recuperação de TACI-Fc e a depuração de

HCP quando carregada a uma capacidade de 10 e 32 mg de TACI-Fc por ml de resina e a eluição em um tampão de fosfato a uma condutividade entre 15 12 a 33 mS/cm. A coleta do pico foi feita no começo do aumento de UV por + 0,5 BV.

Tabela III: Efeito do pH e da condutividade na eluição ótima quando carregada a uma capacidade

Níveis de HCP na carga: 201 ppm

Capacidade de carregamento (mg/ml)	PH	Condutividade (mS/cm)	Recuperação de TACI-Fc	HCPs (ppm)	Depuração de HCP (x)
10	8,0	15,0 20,7	91% 93%	67 61	3,0 3,3
32	8,0	20,7	88%	54	3,7

A tabela IV mostra o efeito de uma etapa de lavagem com fosfato de sódio a 50, 100 ou 150 mM pH 6,5 na recuperação de TACI-Fc e depuração de HCP.

Tabela IV: Efeito das condições da etapa de lavagem no desempenho da coluna

Níveis de HCP na carga: 190ppm e níveis de agregados: 2,0 %

Concentração de fosfato de sódio na lavagem (mM)	Rendimento de TACI-Fc na lavagem	Rendimento de TACI-Fc no eluído	Agregados no eluído	HCPs no eluído (PPm)
lavagem 1	50	0,7%	99%	2,8%	62
lavagem 2	100	2,1%	98%	2,9%	59
lavagem 3	150	9,1%	90%	2,7%	49

O tampão usado na lavagem 2, contendo fosfato de sódio a 100 mM pH 6,5, tinha uma condutividade de 8,4 mS/cm.

Figura 1 mostra um gel de SDS-PAGE corado por prata nãoreduzida de amostras derivadas de experimentos usando as três condições da etapa de lavagem mostradas na Tabela IV na depuração de Fc livre.

Figura 2 mostra cromatogramas sobrepostos de experimentos da etapa de lavagem com fosfato de sódio em diferentes concentrações.

A etapa de lavagem foi otimizada em pH 6,5 com concentrações crescentes de fosfato de sódio a (50 a 150 mM). Como pode ser visto na Figura 1, uma concentração do tampão de lavagem a 150 mM (lavagem 3, coluna 6) resultou em perdas de TACI-Fc. Uma concentração do tampão de lavagem a 50 mM (lavagem 1, coluna 8) resultou em um pico de TACI-Fc puro, contudo, o eluído continha traços de Fc livre. Uma etapa de lavagem com fosfato de sódio a 100 mM pH 6,5, resultou na recuperação de 98% no pico principal de eluição e perdas de somente 2% na lavagem (Figura 2). A depuração de HCP foi de 3,2 vezes. A análise por SDS-PAGE da lavagem e das frações eluídas mostra que a etapa de lavagem continha Fc livre com algum TACIFc intacto na concentração de tampão de 100 mM ou acima (Figura 1, colunas 4 e 6). Uma concentração de 100 mM ou mais é necessária para remover completamente Fc livre da fração eluída (Figura 1, colunas 5 e 7). Conclusões

Uma etapa de troca catiônica foi desenvolvida como uma segunda etapa de purificação, após a etapa de captura. A captura foi eluída a baixo pH (5,0) e baixa condutividade e podería ser diretamente carregada em um trocador catiônico. Uma resina Fractogel EMD SO₃' foi selecionada com uma capacidade de carregamento de 50 mg/ml. O produto de degradação não-bioativo Fc livre podería ser eficientemente removido em uma etapa de lavagem com fosfato de sódio a 0,1 M pH 6,5. As condições de eluição foram otimizadas para melhor depuração de HCPs e alta recuperação de TACI-Fc (fosfato de sódio a 179 mM pH 8,0, condutividade 20,7 mS/cm).

Por outro lado, a eluição pode ser realizada em 10 BV de fosfato de sódio a 20 mM e NaCI a 180 mM pH8,0 a partir do início do aumento da absorvância em 280 nm.

Exemplo 3: Cromatografia de Troca aniônica

O material inicial usado para esta etapa de purificação foi o eluído da etapa de troca catiônica em Fractogel SOa’ (vide Exemplo 2), dialisado ou diluído no tampão de carregamento adequado.

Esta etapa da cromatografia de troca aniônica foi realizada em uma coluna SOURCE 30Q (GE Healthcare 17-1275-01) com uma altura de leito de 10 cm. Uma coluna SOURCE 30Q com uma altura de leito de 15 cm pode também ser usada nesta etapa. Neste último caso, a capacidade dinâmica e a velocidade de fluxo podem necessitar de adaptação, que está dentro do conhecimento de rotina da pessoa versada na técnica.

Todas as operações foram realizadas à temperatura ambiente e o sinal UV foi registrado em 280 nm. As etapas foram realizadas a uma velo48 cidade de fluxo de 150 ou de 200cm/h.

Enxague

Em primeiro lugar, a coluna foi enxaguada com pelo menos 1BV de água RO a uma velocidade de fluxo de 150cm/h.

Sanitização

Então, a coluna foi sanitizada com pelo menos 3BV de NaOH a 0,5M + NaCla 1,5M.

Etapa de lavagem

A coluna foi lavada com pelo menos 3BV, preferencialmente 4 a 10BV de fosfato de sódio a 0,5M pH 7,5 a uma velocidade de fluxo de 200cm/h. Eguilíbrio

A coluna foi equilibrada com pelo menos 5 BV de fosfato de sódio a 10, 15, 20, 25, ou 30 mM pH 7,5. Opcionalmente, a coluna pode ser pré-equilibrada com 3 BV de fosfato de sódio a 0,5M pH 7,5.

Carga, lavagem e coleta concomitantes de TACI-Fc em fluxo contínuo

A coluna foi carregada com o material de troca pós-catiônica diluído para obter uma concentração de fosfato de 10 a 30 mM, pH 7,5, em uma capacidade não mais do que 50 mg de TACI-Fc por ml da resina empacotada como determinado pelo ensaio de SE-HPLC, coletando o fluxo contínuo do início do aumento de UV até o fim da etapa de lavagem, que é realizada em 4±0,5 BV do tampão de equilíbrio.

Regeneração/Sanitização

A coluna foi regenerada e sanitizada com pelo menos 3BV de NaOH a 0,5M + NaCI a 1,5M no modo de fluxo reverso (até que o sinal UV volte à linha de base) a uma velocidade de fluxo de 150cm/h. No fim da regeneração, a bomba é interrompida por 30 minutos.

Etapa de lavagem

A coluna foi lavada com pelo menos 3BV de água RO a uma velocidade de fluxo de 200cm/h.

Armazenamento

A coluna é guardada com pelo menos 3BV de etanol 20% (v/v) a uma velocidade de fluxo de 150cm/h.

Resultados

A Tabela V seguinte resume os resultados obtidos com o processo de purificação descrito acima.

Tabela V: Efeito da concentração de fosfato no carregamento

pH do carregamento	Concentração de fosfato no carregamento (mM)	Concentração de TACI-Fc no carregamento (mg/L)	Capacidade de carregamento (mg/ml)	Recuperação de TACI-Fc	Agregados	HCPs (PPm)
7,5	30	773	39	94%	10,4%	82,8
7,5	25	639	39	90%	6,9%	50,4
7,5	20	651	49	90%	5,6%	43,9
7,5	15	437	46	88%	3,4%	45,0
7,5	10	283	n./d.	82%	2,8%	26,3

Conclusões

A etapa de troca aniônica em uma coluna Source 30Q em modo de fluxo contínuo foi otimizada para maximizar a depuração de HCPs e agregados. O eluído do carregamento de troca catiônica diluído ou diafiltrado em tampão de fosfato de sódio a 20 mM em pH 7,5 forneceu o melhor ajuste entre recuperação do produto (90%) e depuração de HCPs (de aproximadamente 2000ppm a 44ppm) e agregados (de aproximadamente 25% a 5,6%). A capacidade dinâmica de 50 mg de TACI-Fc por ml de resina empacotada a uma velocidade de fluxo de 150 a 200cm/h foi usada.

Exemplo 4: Cromatografia em hidroxiapatita

O material inicial usado para esta etapa de purificação foi o fluxo contínuo da cromatografia de troca aniônica (vide Exemplo 3).

Uma coluna de 40 pm de Hidroxiapatita Cerâmica CHT Tipo I (Biorad 157-0040) com uma altura de leito de 10 cm foi usada.

Todas as operações foram realizadas à temperatura ambiente. A velocidade de fluxo foi mantida constante a 175 cm/h e o sinal UV foi registrado em 280 nm. Todas as soluções foram filtradas em condições estéreis e o equipamento sanitizado com hidróxido de sódio antes do uso. A coluna foi guardada em solução de NaOH a 0,5M quando não usada.

Etapas Iniciais de lavagem (Enxague e pré-eguilíbrio)

A coluna foi lavada com pelo menos 1BV de tampão de fosfato de sódio a 20 mM pH 7,5, e então, com pelo menos 3BV de tampão de fosfato de sódio a 0,5M pH 7,5 para redução do pH.

Equilíbrio

A coluna foi equilibrada com pelo menos 5BV de fosfato de sódio a 20 mM pH 7,5 (ou até que a condutividade alvo de 3,0±0,3 mS/cms e pH 7,5 ± 0,1 fossem alcançados).

Carregamento

A coluna foi carregada com SOURCE 30Q fluxo contínuo com cloreto de cálcio adicionado à concentração final de 0,1 mM de uma solução estoque a 0,5M e pH ajustado para 7,0 pela adição de ácido ortofosfórico 85%, em uma capacidade NMT de 50 mg de TACI-Fc por ml da resina empacotada como determinado pelo ensaio de SE-HPLC. É também possível carregar a SOURCE 30Q fluxo contínuo sem cloreto de cálcio, ajustado ao pH 7,0, na coluna de hidroxiapatita.

Etapas de lavagem

A coluna foi lavada com pelo menos 4BV de fosfato de sódio a 3, 4 ou 5 mM, MES 10 mM, CaCb 0,1 mM pH 6,5. É também possível usar o mesmo tampão sem cloreto de cálcio.

Eluição

A coluna foi eluída com fosfato de sódio a 5, 4, 3 ou 2 mM (vide Tabela VI), MES a 10 mM, CaCh _a 0,1 mM, e tampão KCI a 0,6, 0,7, 0,8 ou 0,9 M pH 6,5 (vide Tabela VII) do começo do aumento de UV para diferente BV (vide Tabelas VI e VII). É também possível usar o mesmo tampão sem cloreto de cálcio para eluição.

Enxague

A coluna foi enxaguada com:

- pelo menos 1BV de tampão de fosfato de sódio a 20 mM pH 7,5;

- pelo menos 3BV de tampão de fosfato de sódio a 0,5M pH 7,5; e

- com pelo menos 1BV de tampão de fosfato de sódio a 20 mM pH 7,5.

Armazenamento

A coluna foi guardada em pelo menos 3BV de NaOH a 0,5M. Resultados

A tabela VI mostra o efeito da concentração de fosfato no tam5 pão de eluição (de 2 a 5 mM) na depuração de agregados e recuperação do produto. As frações de pico de eluição foram agrupadas e analisadas por SE-HPLC para concentração de TACI-Fc e níveis de agregados. Tabela VI: Efeito da concentração de fosfato no tampão de eluição

Concentração de fosfato (mM)	BV da eluição	Rendimento de TACI-Fc	Agregados
	12	73%	0,49%
	13	74%	0,52%
	14	68%	0,65%
5	15	77%	0,67%
	16	77%	0,70%
	17	70%	0,73%
	18	76%	0,85%
	12	68%	0,34%
	13	67%	0,29%
	14	66%	0,36%
4	15	67%	0,39%
	16	66%	0,38%
	17	66%	0,32%
	18	66%	0,40%
	12	70%	0,46%
	13	76%	0,42%
	14	73%	0,51%
3	15	71%	0,52%
	16	69%	0,55%
	17	69%	0,50%
	18	70%	0,53%

Concentração de fosfato (mM)	BV da eluição	Rendimento de TACI-Fc	Agregados
	12	65%	0,19%
	13	66%	0,00%
	14	66%	0,18%
2	15	68%	0,14%
	16	66%	0,17%
	17	71%	0,19%
	18	65%	0,16%

A tabela VII mostra o efeito da concentração de KCI no tampão de eluição na depuração de agregados e na recuperação do produto. Duas concentrações de fosfato de sódio foram investigadas: a 2 e 3 mM. As frações de pico de eluição foram agrupadas e analisadas por SE-HPLC para 5 concentração de TACI-Fc e níveis de agregados.

Tabela VII: Efeito da concentração de cloreto de potássio no tampão de Eluição

Concentração de fosfato (mM)	Concentração de KCI (M)	BVda eluição	Rendimento de TACI-Fc	Agregados
		10	102%	0,48%
		11	109%	0,46%
3	0,6	12	106%	0,43%
		13	105%	0,42%
		14	103%	0,43%
		10	96%	0,42%
		11	97%	0,40%
3	0,7	12	98%	0,41%
		13	96%	0,40%
		14	96%	0,43%
		10	106%	0,58%
		11	110%	0,55%
3	0,8	12	112%	0,57%
		13	101%	0,59%
		14	110%	0,57%

Concentração de fosfato (mM)	Concentração de KCI (M)	BVda eluição	Rendimento de TACI-Fc	Agregados
		10	71%	0,29%
		11	79%	0,28%
2	0,6	12	80%	0,29%
		13	80%	0,29%
		14	81%	0,26%
		10	64%	0,27%
		11	72%	0,25%
2	0,9	12	73%	0,29%
		13	70%	0,33%
		14	66%	0,24%

Conclusões:

Cromatografia em hidroxiapatita fornece um modo confiável, eficiente para redução dos níveis de agregados em TACI-Fc. Começando da cromatografia de troca aniônica purificou-se o material (vide Exemplo 3) com níveis de agregados de aproximadamente 5 a 8%, a cromatografia em hidroxiapatita pode reduzir estes níveis para menos de 0,8% com uma recuperação de TACI-Fc de 85 a 90%.

Listagem de Referência

1. Akerstrom and Bjork, J Biol Chem. 1989 Nov 25;264(33): 19740-6.

2. Altschul S F et al, J Mol Biol, 215, 403-410, 1990.

3. Altschul S F et al, Nucleic Acids Res., 25:389-3402, 1997.

4. Armour KL. et al., 1999. Recombinant human IgG molecules lacking Fcgamma receptor I binding and monocyte triggering activities. Eur J Immunol. 29(8):2613-24.

5. Bodmer et al., TIBS 27(1), 19-24.

6. Boschetti, E., Jungbauer, Sep. Sei. & Tech. 2 No. 15, Acad. Press (2000) 53.

7. Boschetti et al., Genetic Engineering Vol. 20, No. 13, July, 2000.

8. Bossen et al.,JBC 281(2), 13964-13971.

9. Bram and von Bulow, US 5,969,102 (1999).

10. Bram et al., WO 98/39361.

11. Carter PJ., 2006. Potent antibody therapeutics by design. Nature Reviews Immunology. Advance online publication.

12. Devereux J et al, Nucleic Acids Res, 12, 387-395, 1984.

13. Feng et al., Bioprocessing 2005, 1-7.

14. Giovannini, Biotechnology and Bioengineering 73:522-529 (2000).

15. Grantham et al., Science, Vol. 185, pp. 862-864 (1974).

16. Gross et al., Nature 404(27), 995-999.

17. Gross et al., WO 00/40716.

18. Hinton PR. et al., 2004. Engineered human IgG antibodies with longer 10 serum half-lives in primates. J Biol Chem. 279(8):6213-6.

19. Hymowitz et al., JBC 280(8), 7218-7227.

20. Idusogie EE. et al., 2000. Mapping of the C1q binding site on rituxan, a chimeric antibody with a human lgG1 Fc. J Immunol. 164(8):4178-84.

21. Idusogie EE. et al., 2001. Engineered antibodies with increased activity 15 to recruit complement. J Immunol. 166(4):2571-5.

22. Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, Η. M., Gottesman, K. S., and Foeller, C. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., National Institutes of Health, Bethesda, MD.

23. Kochanek et al., EP 1 230 354.

24. Locksley et al., Cell 104, 487-501,2001.

25. Melchers, Ann. Rheum. Dis 2003, 62, 25-27.

26. Moore et al., Science 285: 260-3.

27. Moreau et al., Blood 103(8), 3148-3157.

28. Naismith and Sprang, TIBS 23, 74-79, 1998.

29. Novak et al., Blood 103(2), 689-694.

30. Parker et al., WO 02/094852.

31. Pearson, Methods Enzymol. 1990;183:63-98.

32. Porath, J. Carlsson, I. Olsson, and G. Belfrage, Nature (London) 258, 598-599 (1975).

33. Porath and B. Olin, Biochemistry 22, 1621-1630 (1983).

34. Puren et al., Proc Natl Acad Sei USA. 1999 Mar 2;96(5):2256-61

35. Shepard, J. of Chromatography 891:93- 98 (2000).

36. Shields RL. et al., 2001. High resolution mapping of the binding site on human lgG1 for Fc gamma RI, Fc gamma RH, Fc gamma Rlll, and FcRn and design of lgG1 variants with improved binding to the Fc gamma R. J Biol Chem. 276(9):6591-604.

37. Smith et al., WO 91/03553.

38. Smith et al., WO 94/06476.

39. Stanker, J. Immunological Methods 76:157-169 (1985) (10 mM to 30 mM sodium phosphate elusion gradient).

40. Steurer W. et al., 1995. Ex vivo coating of islet cell allografts with muri10 ne CTLA4/Fc promotes graft tolerance. J Immunol. 155(3):1165-74.

41. Sun et al., WO 2005/044856.

42. Tarditi, J. Chromatography 599:13-20 (1992).

43. Vaccaro C. et al., 2005. Engineering the Fc region of immunoglobulin G to modulate in vivo antibody leveis. Nat Biotechnol. 23(10):1283-8.

44. Vigers et al., Nature. 1997 Mar 13;386(6621 ):190-4.

45. Vedantham et al., WO 03/59935.

46. Vola et al., BioTechniques 14:650-655 (1993).

47. von Bulow and Bram, Science 228 : 138 (1997).

48. Xia et al., J. Exp. Med. 2000, 137-143.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Método para reduzir o teor de porções de Fc livres em um fluido compreendendo uma proteína contendo Fc, caracterizado pelo fato de que compreende submeter o referido fluido à cromatografia de troca catiônica em uma resina de troca catiônica em um pH de uma unidade ou mais abaixo do ponto isoelétrico (pI) da proteína contendo Fc, e lavar a resina de troca catiônica com um tampão que tem uma condutividade de 8,2 a 8,6 mS/cm e a um pH de 5,5 a 7,5.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de lavagem é conduzida a um pH de 6,0 a 7,0.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a etapa de lavagem é conduzida em um tampão que compreende de 75 a 125 mM de fosfato de sódio.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

3, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de:

eluir a proteína contendo Fc em um pH que varia de 7,0 a 8,5, em que a etapa de eluição é conduzida a uma condutividade de 15 a 22 mS/cm.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

4, caracterizado pelo fato de que a cromatografia de troca catiônica é conduzida em uma resina de troca catiônica que compreende grupos SO3^-.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a resina compreende uma matriz de metacrilato reticulado.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

6, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma etapa de purificação selecionada a partir de cromatografia de afinidade, cromatografia de troca aniônica e cromatografia de hidroxiapatita.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

7, caracterizado pelo fato de que a proteína contendo Fc compreende uma região constante de imunoglobulina (Ig).

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a região constante é uma região constante humana.

10. Método, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado

Petição 870190062858, de 05/07/2019, pág. 13/24 pelo fato de que a imunoglobulina é uma IgGi.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a

10, caracterizado pelo fato de que a região constante compreende um domínio CH2 e um CH3.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

11, caracterizado pelo fato de que a proteína contendo Fc compreende uma região variável de imunoglobulina.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a proteína contendo Fc é um anticorpo.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a proteína contendo Fc é uma proteína de fusão Fc.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a proteína de fusão de Fc compreende uma porção de ligação ao ligante de um membro da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral (TNFR).

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a porção de ligação ao ligante é selecionada de um domínio extracelular de TNFR1 ou TNFR2.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a porção de ligação ao ligante é selecionada de um domínio extracelular de BAFF-R, BCMA ou TACI.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a proteína de fusão de Fc compreende um polipepitídeo selecionado a partir de

a. aminoácidos de 34 a 66 da SEQ ID NO: 2;

b. aminoácidos de 71 a 104 da SEQ ID NO: 2;

c. aminoácidos de 34 a 104 da SEQ ID NO: 2;

d. aminoácidos de 30 a 110 da SEQ ID NO: 2;

e. SEQ ID NO: 3; e

f. SEQ ID NO: 4;

em que o polipeptídeo se liga a pelo menos um dentre Blys ou

Petição 870190062858, de 05/07/2019, pág. 14/24

APRIL.

19. Uso de cromatografia de troca catiônica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que é para a redução da concentração de porções de Fc livres em uma composição 5 compreendendo uma proteína contendo Fc, em que a concentração de Fc livre é reduzida para menos de 5% da concentração de proteína total da referida composição.