BRPI0716438B1 - Proteínas de ligação a il-13, anticorpo anti-il-13 recombinante, construto de anticorpo, composições farmacêuticas e usos dos mesmos para reduzir a atividade e função biológica da il-13 e tratar distúrbios respiratórios - Google Patents

Abstract

proteínas ligantes a interleucina-13, anticorpo isolado, construto e conjugado anticorpo, ácido nucléico isolado, vetor célula hospedeira, método para produzir proteína ligante, composição e uso. a presente invenção abrange proteínas ligantes a il-13. especificamente, a invenção está relacionada a anticorpos que são quiméricos, enxertados de cdr e anticorpos humanizados. os anticorpos preferidos têm alta afinidade para hil-13 e neutralizam a atividade da hil-13 in e in vivo anticorpo da invenção pode ser um anticorpo de comprimento completo ou uma sua parte antígeno-ligante. método de produzir e o método de utilizar os anticorpos da invenção são também providos. os anticorpos, ou porção anticorpos, da invenção são úteis para detectar hil-13 e para inibir a ativ da hil-13 atividade, por exemplo, em um individuo humano que sofre de um distúrbio em que a atividade da hil-13 é prejudicial.

Description

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados

[001]Esse pedido reivindica o benefício de prioridade ao pedido provisório US 60/843.249 emitido em 8 de setembro de 2006.

Campo da Invenção

[002]A presente invenção está relacionada a proteínas ligantes a IL-13, e especificamente aos seus usos na prevenção e/ou tratamento de diversas doenças incluindo asma, alergia, DPOC, fibrose, e câncer.

Referência ao acordo de pesquisa conjunta

[003]Os conteúdos desse pedido estão sob um acordo de pesquisa conjunta entre Proteína Design Labs, Inc. e Abbott Laboratories datado de 14 de dezembro de 2005, e direcionado um anticorpos a IL-13 produzidos artificialmente de forma recombinante.

Fundamentos da invenção

[004]IL-13 humana é uma glicoproteína de 17-kDa clonada a partir de células-T ativadas (Zurawski e de Vries 1994 Immunol Today 15 19-26), e é produzida por células-T ativadas da linhagem Th2, embora células-T CD4+ ThO e ThI, células-T CD8+, e diversas populações de células não-T tais como mastócitos também produzam IL-13 (Zurawski e de Vries 1994 Immunol loday 13 19-26). A função da IL-13 inclui isotipo imunoglobulina que muda para IgE em células B humanas (Punnonen, Aversa et al. 1993 Proc Natl Acad Sci U S A 90 3730-4) e suprimem a produção de citocina inflamatória em ambos humanos e ratos (de Waal Malefyt, Figdor et al. 1993 J Immunol 151 6370- 81; Doherty, Kastelein et al. 1993 J Immunol 151 7151-60). A IL-13 se liga aos seus receptores na superfície da célula, IL-13Ralfal e IL-13Ralfa2. O IL-13Ralfal interage com IL-13 com uma baixa afinidade (KD -10 nM), seguido pelo recrutamento de IL-4Ra para formar a alta afinidade (KD ~ 0,4 nM) sinalizando complexo receptor heterodimérico (Aman, Tayebi et al. 1996 J Biol Chem 271 29265-70; Hilton, Zhang et al. 1996 Proc Natl Acad Sci U S A 93 497501). O complexo IL-4R/IL-13Ralfal é expresso em muitos tipos de células tais como células B, monócitos/macrófagos, células dendríticas, eosinófilos, basófilos, fibroblastos, células endoteliais, células epiteliais das vias respiratórias, e células da musculatura lisa das vias respiratórias (Graber, Gretener et al. 1998 Eur J Immunol 28 4286-98; Murata, Husain et al. 1998 Int Immunol 10 1103-10; Akaiwa, Yu et al. 2001 Citocina 13 75-84). A ligação do complexo receptor IL-13Ralfal/IL-4R resulta na ativação de uma variedade de rotas sinal-transdução incluindo transdutor de sinal e ativador de transcrição (ST AT6) e as rotas receptor insulina substrato-2 (IRS-2) (Wang, Michieli et al. 1995 Blood 864218-27; Takeda, Kamanaka et al. 1996 J Immunol 157 3220-2). A cadeia IL-13Ralfa2 sozinha tem uma alta afinidade (KD ~ 0,25-0,4 nM) para IL-13, e funciona como ambos um receptor de atração que regula negativamente a ligação a IL-13 (Donaldson, Whitters et al. 1998 J Immunol 161 2317-24), e um receptor de sinalização que induz a síntese de TGF-b e fibrose por meio da rota AP-I em macrófagos e possivelmente outros tipos de células (Fichtner- Feigl, Strober et al. 2006 Nat Med 12 99-106).

[005]Diversos estudos conduzidos em modelos pré-clínicos animais para asma indicam que a IL-13 desempenha um papel importante na asma. Esses dados incluem a resistência a asma nos ratos nocauteados por IL-13 bem como a inibição do fenótipo da asma com antagonistas da IL-13 (receptores IL-13 solúveis, mAbs anti-IL-13, etc.) em diversos modelos rato (Sela 1999 Harefuah 137 317-9; Wills- Karp e Chiaramonte 2003 Curr Opin PuIm Med 9 21-7; Wills-Karp 2004 Immunol Rev 202 175-90). Estudos múltipls demonstraram que a administração farmacológica da IL-13 recombinante aos pulmões de ratos bem como em porcos da Índia induz a hiper-secreção de muco nas vias respiratórias, eosinofilia e AHR (Grunig, Warnock et al. 1998 Science 282 2261-3; Wills-Karp, Luyimbazi et al. 1998 Science 282 225861; Kibe, Inoue et al. 2003 Am J Respir Crit Care Med 167 50-6; Vargaftig e Singer 2003 Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 284 L260-9; Vargaftig e Singer 2003 Am J Respir Cell Mol Biol 28 410-9). Esses efeitos da IL-13 são reproduzidos em sistemas de ratos transgênicos com uma ou outra da expressao consitutiva ou indutiva da IL- 13 (Zhu, Homer et al. 1999 J Clin Invest 103 779-88; Zhu, Lee et al. 2001 Am J Respir Crit Care Med 164 S67- 70; Lanone, Zheng et al. 2002 J Clin Invest 11046374). A superespressão transgênica cronica da IL-13 também induz a fibrose subepitelial e enfizema. Ratos deficientes na molécula de sinalização de IL-13 (e IL- 4) STAT6 falham em desenvolver AHR alergênio-induzida e superprodução de muco (Kuperman, Huang et al. 2002 Nat Med 8 885-9). Estudos usando proteína de fusão de receptor de IL-13 solúvel (sIL-13Ralfa2Fc) demonstraram o papel essencial dessa citocina em doença das vias respiratórias induzida por alergênio ovalbumina (OVA) experimental (Grunig, Warnock et al. 1998 Science 282 2261-3; Wills-Karp, Luyimbazi et al. 1998 Science 282 2258-61; Taube, Duez et al. 2002 J Immunol 169 6482-9). A eficácia do tratamento anti-IL-13 foi também demonstrada em um modelo crônico de asma murina. Adicionalmente a apresentar características de hiper- secreção de muco e AHR, esse modelo de asma crônica demonstra diversas marcas importantes da doença humana que são ausentes nos modelos mais precisos. Estas incluem eosinofilia do tecido pulmonar situada nos espaços inter-epiteliais bem como fibrose da musculatura lisa como medido pelos aumentos da deposição de colágeno. O modelo asma crônica é induzido com repetidas provocações aerossol com OVA em ratos sensibilizados com OVA 1x/semana durante um total de 4 semanas. Anticorpo anti-IL-13 administrado para as duas semanas finais das provocações OVA (do dia 36 com leitura da eficácia no dia 53 do estudo) inibiu significativamente a AHR, inflamação pulmonar, hiperplasia das células cálices, hipersecreção de muco, e fibrose das vias respiratórias (Yang, Li et al. 2005 J Pharmacol Exp Ther). Além disso, o efeito terapêutico do antagonista da IL-13 foi também demonstrado inibir AHR em um modelo primata da asma [Abstract, American Thoracic Society 2005].

[006]A IL-13 está implicada na patogênese da asma humana na medida que níveis elevados de mRNA e proteína da IL-13foram detectados em pulmões de pacientes asmáticos, o que se correlaciona com a gravidade da doença (Huang, Xiao et al. 1995 J Immunol 155 2688-94). Adicionalmente, os polimorfismos da IL-13 humana, que leva aos elevados níveis de IL-13, foram identificados e estão associados com asma e atopia (Heinzmann, Mao et al. 2000 Hum Mol Genet 9 54959; Hoerauf, Kruse et al. 2002 Microbes Infect 4 37-42; Vercelli 2002 Curr Opin Alergia Clin Immunol 2 389-93; Heinzmann, Jerkic et al. 2003 J Alergia Clin Immunol 112 735-9; Chen, Ericksen et al. 2004 J Alergia Clin Immunol 114 553-60; Vladich, Brazille et al. 2005 J Clin Invest), e níveis elevados da IL-13 foram detectados nos pulmões de pacientes asmáticos (Huang, Xiao et al. 1995 J Immunol 155 2688-94; Arima, Umeshita-Suyama et al. 2002 J Alergia Clin Immunol 109 980-7; Berry, Parker et al. 2004 J Alergia Clin Immunol 114 1106-9). Uma ligação genética entre IL-13 e asma tem sido também demonstrado na medida que indivíduos com um polimorfismo no gene da IL-13 que causa maiores níveis plasmáticos de IL-13 possuem aumentado risco para atopia e asma (Wills-Karp 2000 Respir Res 1 19-23).

[007]Devido ao papel da IL-13 humana numa variedade de distúrbios humanos, as estratérias terapêuticas têm sido projetadas para inibir ou contra-reagir a atividade da IL-13. Em particular, anticorpos que se ligam a, e neutralizam IL-13 têm sido vistos como um meio para inibir a atividade da IL-13. Todavia, existe uma necessidade na arte quanto a aprimorados anticorpos capazes de se litar a IL-13. Preferivelmente os anticorpos se ligam a IL-13 humana. Preferivelmente os anticorpos são capazes de neutralizar a IL-13 humana. A presente invenção proporciona uma nova família de proteínas ligantes, anticorpos CDR enxertados, anticorpos humanizados, e fragmentos desses, capazes de se ligar a IL-13 humana, ligação com alta afinidade, e ligação e neutralização da IL-13 humana.

Sumário da invenção

[008]Essa invenção está relacionada às proteínas ligantes a IL-13. Proteínas ligantes da invenção incluem, mas não estão limitadas a, anticorpos, partes ligantes a antígenos, e outras proteínas ligantes a antígenos capazes de ligação à IL-13 humana. Além disso, a invenção proporciona métodos de produção e de utilização das proteínas ligantes a IL-13.

[009]Um aspecto da invenção está relacionada a uma proteína de ligação capaz de se ligar a IL-13. Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação se liga a IL-13 humana. Preferivelmente a proteína de ligação é capaz de modular uma função biológica da IL-13. Mais preferivelmente a proteína de ligação é capaz de neutralizar a IL-13.

[0010]Em um aspecto da invenção, a proteína de ligação é capaz de se ligar a IL-13, e impedir a ligação da IL-13 ao receptor IL-13α1. Num outro aspecto da invenção, a proteína de ligação é capaz de se ligar a IL-13, e impedir a ligação da IL- 13 ao receptor IL-13α2. Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação é capaz de se ligar a IL-13, e impedir a ligação da IL-13 a ambos o receptor de IL- 13α1 e de IL-13a2.

[0011]Uma modalidade da invenção proporciona um anticorpo éolado, ou seu fragmento antígeno-ligante, em que o referido anticorpo, ou seu fragmento antígeno-ligante se liga a IL-13 humana e inibe a ligação da referida IL-13 ao receptor de IL-13α2 em um ensaio ligante ao receptor baseado na superfície da célula com uma IC50 selecionada a partir do grupo que consiste de cerca de 1,5x10-8 a 1x10-8M, 1x10-8 a 1x10-8 M, 1x10-8 a 1x10-9 M, 10-9 a 10-10M e 10-10 a 10-11 M ou em um ensaio de ligação ao receptor baseado em ELISA com uma IC50 selecionada a partir do grupo que consiste de cerca de 1,8x10-8 a 1x10-8 M, 1x10-8 a 1x10-9 M, 109 a 10-10M e 10-10 a 10-11 M. Preferivelmente o anticorpo se liga a IL-13 humana e inibe a ligação da referida IL-13 ao receptor de IL-13α2 em um ensaio ligante ao receptor baseado na superfície da célula com uma IC50 de 2,7 x10-9M e em um ensaio de ligação ao receptor baseado em ELISA com uma IC50 de 1,1x10-9 M. Preferivelmente o anticorpo, ou seu fragmento antígeno-ligante se liga a IL-13 humana e inibe a ligação da referida IL-13 ao receptor de IL-13α2 em um ensaio ligante de receptor baseado na superfície da célula ou em um ensaio de ligação ao receptor baseado em ELISA em cerca de 70-100% numa concentração de 100 nM. Preferivelmente o anticorpo é 13C5.5. Mais preferivelmente o anticorpo não é BAK502G9, mAbl3.2 ou MJ2-7.

[0012]Num outro aspecto, a invenção proporciona um anticorpo isolado, ou um seu fragmento antígeno-ligante, em que o referido anticorpo, ou seu fragmento antígeno-ligante se liga a IL-13 humana e inibe a AHR em cerca de 50 %, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% em um modelo asma induzido por IL-13 humana. Preferivelmente, o anticorpo inibe a AHR por mais de 86% em um modelo asma induzido por IL-13 humana. Em uma outra modalidade, o anticorpo isolado, ou seu fragmento antígeno-ligante, se liga a IL-13 humana e inibe a AHR em cerca de 50 %, 60%, 70%, 80% 90% ou 100% e inibe a produção de muco em cerca de 40%, 50 %, 60%, 70%, 80% 90% ou 100% em um modelo asma induzido por IL-13 humana. Preferivelmente o anticorpo é 13C5.5. Mais preferivelmente o anticorpo não é BAK502G9, mAb13.2 ou MJ2-7.

[0013]Em uma modalidade, a proteína de ligação da invenção possui uma constante de associação (Icon) para IL-13 de pelo menos cerca de 102M-1S-1; pelo menos cerca de 103M-1S-1; pelo menos cerca de 104M-1S-1; pelo menos cerca de 105M-1S-1; ou pelo menos cerca de 106M-1S-1, como medido por ressonância plásmon de superfície. Preferivelmente, a proteína de ligação da invenção possui uma constante de associação (kon) para IL-13 entre 102M-1S-1 a 103M-1S-1; entre 103M-1S-1 a 104M-1S-1; entre 104M-1S”1 a 105M-1S-1; ou entre 105M-1S-1 a 106M-1S-1, como medido por ressonância plásmon de superfície.

[0014]Em uma outra modalidade, a proteína de ligação da invenção tem uma constante de dissociação (koff) para IL-13 de no máximo cerca de 10-3S-1; no máximo cerca de 10-4S-1; no máximo cerca de 10-5S-1; ou no máximo cerca de 10-6S-1, como medido por ressonância plásmon de superfície. Preferivelmente, a proteína de ligação da invenção tem uma constante de dissociação (Koff) para IL-13 de 10-3S-1 a 10-4S-1; de 10-4S-1 a 10-5S-1; ou de 10-5S-1 a 10-6S-1, como medido por ressonância plásmon de superfície.

[0015]Em uma outra modalidade, a proteína de ligação da invenção tem uma constante de dissociação (KD) para IL-13 de no máximo cerca de 10-7 M; no máximo cerca de 10-8 M; no máximo cerca de 10”9 M; no máximo cerca de 10-10 M; no máximo cerca de 10-11 M; no máximo cerca de 10-12 M; ou no máximo 10-13 M. Preferivelmente, a proteína de ligação da invenção tem uma constante de dissociação (KD) para IL-13 de 10-7 M a 10-8 M; de 10-8 M a 10-9 M; de 10-9 M a 10-10 M; de 10-10 a 10-11 M; de 10-11 M a 10-12 M; ou de 10-12 a M 10-13M. Preferivelmente o anticorpo ou seu fragmento antígeno-ligante, se liga a IL-13 com características ligantes selecionadas a partir do grupo que compreende: a) uma constante de associação (Icon) entre cerca de 105M-1S-1 a 106M-1S-1 ou cerca de 106M-1S-1 a 107M- 1S-1,ou b) uma constante de dissociação (koff) de cerca de 10-4S-1 a 10-5S-1; ou de cerca de 10-5S-1 a 10-6S-1, como medido por ressonância plásmon de superfície; ou c) uma constante de dissociação (KD) de cerca de 1,5x10-10 a 1x10-10 M ou cerca de 10-10 a 10-11 M. Preferivelmente o anticorpo, ou seu fragmento antígeno-ligante possui uma constante de associação (Icon) para IL-13 selecionada a partir do grupo que compreende: 6,68X105M-1S-1, 7,86X105M-1S-1, 8,35X105M-1S-1, 8,69X105M-1S-1, 9,15X105M-1S-1, 1,26X106M-1S-1, 1,7X106M 1S”1, e 2,51x106M”V. Preferivelmente o anticorpo, ou seu fragmento antígeno-ligante tem uma constante de dissociação (koff) para IL-13 selecionado a partir do grupo que compreende: 1,23X10-4S-1; 1,76x10-4S- 1; 4,74x10-4S-1; 1,91x10-5S-1; 2,14X10-5S-1, 3,82X10-5S-1; 8,81x10-5s-1 e 9,65X10-5S-1, como medido por ressonância plásmon de superfície. Preferivelmente o anticorpo, ou seu fragmento antígeno-ligante tem uma constante de dissociação (KD) para IL- 13 selecionado a partir do grupo que compreende: 1,05xl0-10 M; 7,10x10-10 M; 1x10- 11 M; 2,20x10-11 M; 2,72x10-11 M; 4,17x10-11 M; 5,68x10-11M; 7,01x10-11 M; 7,10x10- 11 M; e 9,79x10-11 M.

[0016]Um aspecto da invenção está relacionada a proteínas ligantes capazes de um epitopo específico na IL-13. Preferivelmente o epitopo específico compreende o C-terminal da região D-helicóide da IL-13 humana. Mais preferivelmente, o epitopo específico compreende a sequência aminoácido VRDTK IEVAQ I7VKDL LL HLK KLFRE GR, correspondente a aminoácido 104-130 da SEQ ID NO. 1. Num outro aspecto o anticorpo ou parte antígeno-ligante, se liga a um epitopo que compreende o C-terminal da região D-helicóide e N-terminal da região A-helicóide da IL-13 humana. Preferivelmente o anticorpo, ou seu fragmento antígeno-ligante se liga a IL-13 humana tal que IL-13 com o referido anticorpo, ou seu fragmento antígeno-ligante, se ligam ao epitopo definidos pelas regiões topográficas Ser26- Thr27-Ala28-Leu29-Arg30-Glu31-Leu32-Ile33-Glu34-Glu35- Leu36-Val37-Asn38 e Lysl23- Lysl24-Leul25-Phel26-Argl27-Glu-128-Glyl29-Argl30 da SEQ ID No. 1 é inibida de se ligar ao receptor de IL-13. Preferivelmente o anticorpo, ou seu fragmento antígeno-ligante se liga a IL-13 humana tal que IL-13 com o referido anticorpo, ou seu fragmento antígeno-ligante, ligados ao epitopo definidos pelas regiões topográficas Arg30-Glu31-Leu32-Ile33-Glu34-Glu35-Leu36- Val37-Asn38 e Lysl23-Lysl24-Leul25-Phel26-Argl27 da SEQ ID No. 1 é inibido de se ligar ao receptor de IL-13. Preferivelmente o anticorpo, ou seu fragmento antígeno- ligante se liga a IL-13 humana tal que IL-13 com o referido anticorpo, ou seu fragmento antígeno-ligante, ligado ao epitopo definidos pelas regiões topográficas Ser26-Thr27-Ala28-Leu29-Arg30-Glu31-Leu32-Ile33-Glu34-Glu35-Leu36-Val37- Asn38 e Lys 123-Lys 124-Leu 125-Phe 126-Arg 127-Glu- 128- GIy 129-Argl30 da SEQ ID No. 1 é inibido de se ligar ao receptor de IL-13α2. Mais preferivelmente o anticorpo, ou seu fragmento antígeno-ligante se liga a IL-13 humana tal que IL-13 com o referido anticorpo, ou seu fragmento antígeno-ligante, ligado ao epitopo definidos pelas regiões topográficas Ser26-Thr27-Ala28-Leu29-Arg30-Glu31-Leu32- Ile33-Glu34-Glu35-Leu36- Val37-Asn38 e Lys123-Lys124-Leu125-Phe126-Arg127- Glu-128-Gly129-Arg130 da SEQ ID No. 1 é inibido de se ligar ao receptor de IL- 13α2, contanto que o referido anticorpo não seja BAK502G9 ou MJ2-7. Muito preferivelmente o anticorpo é 13C5.5.

[0017]Em um aspecto o anticorpo isolado, ou seu fragmento antígeno- ligante, se liga a IL-13 e impede a ligação da IL-13 ao receptor de IL-13α2 com características ligantes selecionadas a partir do grupo que compreende ligação a um epitopo na IL-13 incluindo Helicóide A e D; uma constante de associação (Icon) entre cerca de 105M-1S-1 a 106M-1S-1 ou cerca de 106M-1S-1 a 107M-1S-1; uma constante de dissociação (koff) de cerca de 10-4S-1 a 10-5S-1; ou de cerca de 10-5S-1 a 10-6S-1, como medido por ressonância plásmon de superfície; e uma constante de dissociação (KD) de cerca de 1,5x10~10 a 1x10-10 M ou cerca de 10-10 a 10-11 M. Num outro aspecto o anticorpo isolado, ou seu fragmento antígeno-ligante, se liga a variante de IL-13 e impede a ligação da variante de IL-13 ao receptor de IL-13α2 com características ligantes selecionadas a partir do grupo que compreende ligação a um epitopo em IL- 13 incluindo Helicóide A e D; uma constante de associação (Icon) entre cerca de 105M-1S-1 a 106M-1S-1 ou cerca de 106M-1S-1 a 107M-1S-1; uma constante de dissociação (koff) de cerca de 10-4S-1 a 10-5S-1; ou de cerca de 10-5S-1 a 10-6S-1, como medido por ressonância plásmon de superfície; e uma constante de dissociação (KD) de cerca de 1,5x10-10 a 1x10-10 M ou cerca de 10-10 a 10-11 M.

[0018]Em um aspecto a proteína de ligação da invenção é capaz de se ligar a IL-13, o referido domínio antígeno-ligante compreendendo pelo menos um CDR compreendendo uma sequência aminoácido selecionada a partir do grupo que compreende: CDR-H1.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7 ( SEQ ID NO : 64 ), em que; X1 é T, D, G, ou S ; X2 é S ; X3 é D; X4 é M, S , Y, L, ou H ; X5 é G, W, Y, A, S, ou N; X6 é V, I, ou M; e X7 é D, H, S, Y, N, ou G; CDR-H2.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9—X10—X11-X12—X13—X14—X15—X16-X17 (SEQ ID NO: 65), em que; X1 é M, E, H, R, S, G, ou L; X2 é I ou não presente; X3 é H, Y, A, D, S, ou W; X4 é P, S, W, ou G; X5 é S, G, E, ou D; X6 é D, G, S, E, ou N; X7 é S, Y ou G; X8 é E, N, Y, V, ou R; X9 é T, I, ou K; X10 é R, Y, I, D, ou A; X11 é L, Y, D, ou F; X12 é N, P, S, ou D; X13 é Q, E, D, P, ou S; X14 é K, M, S, T, A, ou V; X15 é F, L, V, ou M; X16 é K, R, ou Q; e X17 é D, G, ou S; CDR-H3.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9—X10—X11-X12—X13—X14 (SEQ ID NO: 66), em que; Xi é W, T, G, Y, D, ou I; X2 é R, A, S, G, ou V; X3 é T, F, Y, ou S; X4 é S, T, ou Y; X5 é Y, F, ou G; X6 é F, ou Y; X7 é S, Y, I, ou F; X8 é D, L, Y, ou P; X9 é Y; X10 é G; X11 é Y, A, P, ou E; X12 é F, M, S, L, ou I; Xi3 é D, V, N, ou K; e X14 é Y, ou F; CDR-L1.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9—X10—X11-X12—X13—X14—X15—X16-X17 (SEQ ID NO: 67), em que; X1 é K, ou R; X2 é S, ou A; X3 é S ou T; X4 é Q, K, ou I; X5 é N, S, T, G, ou E; X6 é L, T, ou S; X7 é L, Q, ou V; X8 é Y, N, H, D, ou T; X9 é S, I, ou T; X10 é S, D, N, H, ou Y; X11 é N, ou G; X12 é Q; X13 é K, F, N, E, ou S; X14 é N, T, ou S; X15 é Y, ou F; X16 é L, A, ou M; e X17 é A, D, E, H, ou N CDR-L2.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7 (SEQ ID NO: 68), em que; X1 é L, S, K, T, W, ou Y; X2 é V, T, ou A; X3 é S, ou N; X4 é N, K, T, M, ou R; X5 é R, K, ou L; X6 é F, D, E, H, P, ou A; e X7 é S, R, ou P; e CDR-L3.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 69), em que; X1 é F, W, Q ou A; X2 é Q ou L; X3 é H, G, Y, W, ou N; X4 é N, S, T, L, ou Y; X5 é Y, T, S, E, ou H; X6 é L, V, F, Y, N, G, P, ou D; X7 é P, ou, H; X8 é L, F, Y, W, ou R; e X9 é T, ou V.

[0019]Preferivelmente, o domínio antígeno-ligante compreende pelo menos um CDR compreendendo uma sequência aminoácido selecionada a partir do grupo que compreende:

[0020]Em uma modalidade preferida, a proteína de ligação compreende pelo menos 3 CDRs que são selecionados a partir de um conjunto de CDR de domínio variável consistindo de:

[0021]Preferivelmente a proteína de ligação compreendendo pelo menos dois conjuntos CDR de domínio variável. Preferivelmente pelo menos dois conjuntos CDR de domínio variável são selecionados a partir do grupo que consiste de: Conjunto VH 25C8 CDR & Conjunto VL 25C8 CDR; Conjunto VH 9C 11 CDR & Conjunto VL 9C 11 CDR ; Conjunto VH 21D9 CDR & Conjunto VL 21D9 CDR ; Conjunto VH 22D10 CDR & VL 22D10 CDR ; Conjunto VH 5Fl CDR & Conjunto VL SFl CDR ; Conjunto VH 5G1 CDR & Conjunto VL 5G1 CDR ; Conjunto VH 3H7 CDR & Conjunto VL 3H7 CDR ; Conjunto VH 14B2 CDR & Conjunto VL 14B2 CDR ; Conjunto VH 13C5 CDR & Conjunto VL 13C5 CDR ; Conjunto VH 29G5 CDR & Conjunto VL 29G5 CDR ; Conjunto VH 33C3 CDR & Conjunto VL 33C3 CDR ; Conjunto VH 4A8 CDR & Conjunto VL 4A8 CDR ; Conjunto VH 1B6 CDR & Conjunto VL 1B6 CDR ; Conjunto VH 3E5CDR & Conjunto VL 3E5 CDR ; Conjunto VH 6C8 CDR & Conjunto VL 6C8 CDR ; Conjunto VH 5D3 CDR & Conjunto VL 5D3 CDR ; e Conjunto VH 8B6 CDR & Conjunto VL 8B6 CDR.

[0022]Em uma outra modalidade a proteína de ligação revelado acima adicionalmente compreende uma cadeia estrutural (framework) aceitadora humana. Preferivelmente a cadeia estrutural aceitadora humana compreende uma sequência aminoácido selecionada a partir do grupo que compreende:

[0023]Em uma modalidade preferida a proteína de ligação é um anticorpo CDR-enxertado ou sua parte antígeno-ligante capaz de se ligar a IL-13. Preferivelmente o anticorpo CDR-enxertado ou sua parte antígeno-ligante compreende um ou mais CDRs revelado acima. Preferivelmente o anticorpo CDR- enxertado ou sua parte antígeno-ligante compreende uma cadeia estrutural aceitadora humana. Mais preferivelmente a cadeia estrutural aceitadora humana é qualquer das armações estruturais aceitadoras humanas reveladas acima.

[0024]Em uma modalidade preferida a proteína de ligação é um anticorpo humanizado ou sua parte antígeno-ligante capaz de se ligar a IL-13. Preferivelmente o anticorpo humanizado ou sua parte antígeno-ligante compreende um ou mais CDRs revelados acima incorporados em um domínio variável de anticorpo humano de uma cadeia estrutural aceitadora humana. Preferivelmente o domínio variável de anticorpo humano é um domínio humano variável de consenso. Mais preferivelmente a cadeia estrutural aceitadora humana compreende pelo menos uma substituição aminoácido na Região da Cadeia estrutural como um resíduo chave, em que o resíduo chave é selecionado a partir do grupo que compreende um resíduo adjacente a um CDR; um resíduo do sítio de glicosilação; um resíduo raro; um resíduo capaz de interagir com a IL-13 humana; um resíduo capaz de interagir com a CDR; um resíduo canônico; um resíduo de contato entre a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve; um resíduo contido numa zona de Vernier; e um resíduo numa região que se sobrepõe entre um CDR1 de cadeia pesada variável definido por Chothia e uma primeira cadeia estrutural de cadeia pesada definida por Kabat. Preferivelmente a cadeia estrutural aceitadora humana cadeia estrutural aceitadora humana compreende pelo menos uma substituição aminoácido na Região da Cadeia estrutural, em que a sequência aminoácido da cadeia estrutural é pelo menos 65% idêntica à sequência da referida cadeia estrutural aceitadora humana e compreende pelo menos 70 resíduos aminoácidos idênticos a referida cadeia estrutural aceitadora humana. Preferivelmente a substituição aminoácido na Região da Cadeia estrutural em um resíduo chave é selecionada a partir do grupo que compreende 2L, 15L, 22L, 41L, 42L, 44L, 49L, 50L, 51L, 62L, 71L, 73L, 10H, 44H, 46H, 48H, 67H, 68H, 70H, 72H, 74H, 76H, 83H, 84H, 86H, 87H, e 97H.

[0025]Em uma modalidade preferida a proteína de ligação é um anticorpo humanizado ou sua parte antígeno-ligante capaz de se ligar a IL-13. Preferivelmente o anticorpo humanizado, ou sua parte antígeno-ligante compreende um ou mais CDRs revelados acima. Mais preferivelmente o anticorpo humanizado, ou sua parte antígeno-ligante compreende três ou mais CDRs revelados acima. Muito preferivelmente o anticorpo humanizado, ou sua parte antígeno-ligante, compreende seis CDRs revelados acima.

[0026]Em uma outra modalidade da invenção reivindicada, o anticorpo humanizado ou sua parte antígeno-ligante compreende pelo menos um domínio variável possuindo uma sequência aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste de; SEQ ID NO. : 70 SEQ ID NO. : 77 SEQ ID NO. : 84 SEQ ID NO. : 71 SEQ ID NO. : 78 SEQ ID NO. : 85 SEQ ID NO. : 72 SEQ ID NO. : 79 SEQ ID NO. : 92 SEQ ID NO. : 73 SEQ ID NO. : 80 SEQ ID NO. : 93 SEQ ID NO. : 74 SEQ ID NO. : 81 e SEQ ID NO. : 75 SEQ ID NO. : 82 SEQ ID NO. : 94 SEQ ID NO. : 76 SEQ ID NO. : 83 Mais preferivelmente o anticorpo humanizado ou sua parte antígeno-ligante compreende dois domínios variáveé selecionados a partir do grupo revelado acima. Mais preferivelmente a proteína de ligação compreende dois domínios variáveis, em que os referidos dois domínios variáveis have sequências aminoácidos selecionados a partir do grupo que compreende; SEQ ID NO. : 70 & SEQ ID NO. 71, SEQ ID NO. : 72 & SEQ ID NO. 73, SEQ ID NO. : 74 & SEQ ID NO. 75, SEQ ID NO. : 76 & SEQ ID NO. 77, SEQ ID NO. : 78 & SEQ ID NO. 79, SEQ ID NO. : 80 & SEQ ID NO. 81, SEQ ID NO. : 82 & SEQ ID NO. 83, SEQ ID NO. : 84 & SEQ ID NO. 85 SEQ ID NO. : 80 & SEQ ID NO. 92, SEQ ID NO. : 80 & SEQ ID NO. 93, E SEQ ID NO. : 80 & SEQ ID NO. 94.

[0027]Uma modalidade da invenção proporciona um construto anticorpo compreendendo qualquer uma das proteínas ligantes reveladas acima e um polipeptídio ligador ou uma imunoglobulilna. Em uma modalidade preferida o construto anticorpo é selecionado a partir do grupo que compreende uma molécula imunoglobulina, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo CDR-enxertado, um anticorpo humanizado, um Fab, um Fab', um F(ab')2, um Fv, um Fv dissulfeto-ligado, um scFV, um anticorpo de domínio único, um diacorpo, um anticorpo multiespecífico, um anticorpo dual específico, e um anticorpo bi-específico. Em uma modalidade preferida o construto anticorpo compreende a imunoglobulina de cadeia pesada de domínio constante selecionada a partir do grupo que compreende uma IgM humana de domínio constante, uma IgG1 humana de domínio constante, uma IgG2 humana de domínio constante, uma IgG3 humana de domínio constante, uma IgG4 humana de domínio constante, uma IgE humana de domínio constante, e uma IgA humana de domínio constante. Mais preferivelmente, o construto anticorpo compreende SEQ ID NO.: 2; SEQ K) NO.: 3; SEQ ID NO.: 4; e SEQ K) NO.: 5. Em uma outra modalidade a invenção proporciona um conjugado anticorpo compreendendo um do construto anticorpo revelado acima e um agente selecionado a partir do grupo que compreende; uma molécula de imunoaderência, um agente de imageamento, um agente terapêutico, e um agente citotóxico. Em uma modalidade preferida o agente de imageamento é selecionado a partir do grupo que compreende uma rádio-marcação, uma enzima, uma marcação fluorescente, uma marcação bioluminescente, uma marcação magnética, e biotina. Mais preferivelmente o agente de imageamento é uma rádio-marcação selecionada a partir do grupo que compreende: 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho, e 153Sm. Em uma modalidade preferida o agente terapêutico ou citotóxico é selecionado a partir do grupo que compreende; um anti-metabolito, um agente de alquilação, um antibiótico, um fator de crescimento, uma citocina, um agente anti- angiogênico, um agente anti-mitótico, uma antraciclina, toxina, e um agente apoptótico.

[0028]Em uma outra modalidade o construto anticorpo é glicosilado. Preferivelmente a glicosilação é um padrão de glicosilação humano.

[0029]Em uma outra modalidade a proteína de ligação, construto anticorpo ou conjugado anticorpo revelado acima existem como um cristal. Preferivelmente o cristal é um cristal farmacêutico de liberação controlada livre de veículo. Em uma modalidade preferida a proteína de ligação cristalizada, construto anticorpo cristalizado ou conjugado anticorpo cristalizado possui uma maior meia-vida in vivo que sua contraparte solúvel. Numa outra modalidade preferida a proteína de ligação cristalizada, construto anticorpo cristalizado ou conjugado anticorpo cristalizado mantém a atividade biológica após a cristalização.

[0030]Um aspecto da invenção está relacionada a uma Proteína DVD-ligante compreendendo proteínas ligantes capazes de se ligar a IL-13. Preferivelmente a proteína DVD-ligante é capaz de se ligar a IL-13 e a um segundo alvo. O segundo alvo é selecionado a partir do grupo que compreende CSF1 (MCSF), CSF2 (GM- CSF), CSF3 (GCSF), FGF2, IFNαl, IFNβl, IFNy, histamina e receptores histamina, DL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, DL-5, EL-6, EL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL11, IL-12α, IL-12β, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, KITLG, PDGFB, IL-2Rα, IL-4R, IL-5Rα, IL- 8Rα, IL-8Rβ, IL- 12Rβ1, IL-12Rβ2, IL-13Rα1, IL-13Rα2, IL-18R1, TSLP, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL13, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL22, CCL24,CX3CL1, CXCL1, CXCL2, CXCL3, XCL1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CX3CR1, GPR2, XCR1, FOS, GATA3, JAK1, JAK3, STAT6, TBX21, TGFB1, TNFSF6, YY1, CYSLTR1, FCER1A, FCER2, LTB4R, TB4R2, LTBR, e quitinase. Mais preferivelmente, a proteína DVD é capaz de reconhecer a IL-13 e IL-lβ, IL-13 e IL-9; IL-13 e IL-4; IL-13 e IL-5; IL-13 e IL-25; IL-13 e TARC; IL-13 e MDC; IL-13 e MIF; IL-13 e TGF-β; IL-13 e agonista LHR; IL-13 e CL25; IL-13 e SPRR2a; IL-13 e SPRR2b; ou IL-13 e ADAM8. Muito preferivelmente, a proteína DVD é capaz de se ligar a IL-13 e TNFα. .

[0031]Um aspecto da invenção está relacionada a um ácido nucleico isolado que codifica qualquer um da proteína de ligação, construto anticorpo ou conjugado anticorpo revelado acima. Uma modalidade adicional proporciona um vetor compreendendo o ácido nucleico isolado revelado acima em que o referido vetor é selecionado a partir do grupo que compreende pcDNA; pTT (Durocher et al., Ácidos nucleicos Research 2002, Vol 30, No.2); pTT3 (pTT com additional multiple cloning site; pEFBOS (Mizushima, S. e Nagata, S., (1990) Ácidos nucleicos Research Vol 18, No. 17); pBV; pJV; e pBJ.

[0032]Num outro aspecto uma célula hospedeira é transformada com o vetor revelado acima. Preferivelmente a célula hospedeira é uma célula procariótica. Mais preferivelmente a célula hospedeira é E.Coli. Numa modalidade correlata a célula hospedeira é uma célula eucariótica. Preferivelmente a célula eucariótica é selecionada a partir do grupo que compreende célula protista, célula animal, célula vegetal e célula fúngica. Mais preferivelmente a célula hospedeira é um célula de mamífero incluindo, mas não limitado a, CHO e COS; ou a célula fúngica tal como Saccharomyces cerevisiae; ou uma célula de inseto tal como Sf9.

[0033]Um outro aspecto da invenção proporciona um método de produzir uma proteína de ligação que se liga a IL-13, compreendendo cultivar qualquer uma das células hospedeiras reveladas acima em um meio de cultura sob condições suficientes para produzir uma proteína de ligação que se liga a IL-13. Uma outra modalidade proporciona uma proteína de ligação produzida de acordo com o método revelado acima.

[0034]Uma modalidade proporciona uma composição para a liberação da proteína de ligação em que a composição compreende uma formulação que por sua vez compreende uma proteína de ligação cristalizada, construto anticorpo cristalizado ou conjugado anticorpo cristalizado como revelado acima e um ingrediente; e pelo menos um veículo polimérico. Preferivelmente o veículo polimérico é um polímero selecionado a partir de um ou mais do grupo que consiste de: poli (ácido acrílico), poli (cianoacrilatos), poli (aminoácidos), poli (anidridos), poli (depsipeptídeo), poli (ésteres), poli (ácido lático), poli (ácido látivco-co-glicólico) ou PLGA, poli (b-hidroxibutirato), poli (caprolactona), poli (dioxanona); poli (etileno glicol), poli ((hidroxipropil) metacrilamida, poli [(organo)fosfazeno], poli (orto-ésteres), poli (álcool vinílico), poli (vinilpirrolidona), copolímeros de anidrido maleico-éter alquil vinílico, polióis plurônicos, albumina, albumina, alginato, celulose e derivados de celulose, colágeno, fibrina, gelatina, ácido hialurônico, oligossacarídeos, glicaminoglicans, polissacarídeos sulfatados, mesclas e copolímeros desses mencionados. Preferivelmente o ingrediente é selecionado a partir do grupo que compreende albumina, sacarose, trealose, lactitol, gelatina, hidroxipropil-β- ciclodextrina, metoxipolietileno glicol e polietileno glicol. Uma outra modalidade proporciona um método para tratar um mamífero compreendendo a etapa de administrar ao mamífero uma quantidade eficaz da composição revelada acima.

[0035]A invenção também proporciona uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína de ligação, construto anticorpo ou conjugado anticorpo como revelado acima e um veículo farmaceuticamente aceitável. Numa modalidade adicional, a composição farmacêutica compreende pelo menos um agente terapêutico adicional para tratar um distúrbio no qual a atividade da IL-13 é prejudicial. Preferivelmente o agente adicional é selecionado a partir do grupo que compreende: Agente terapêutico, agente de imageamento, agente citotóxido, inibidores da angiogênese (incluindo mas não limitado um anticorpos anti-VEGF ou VEGF-trap); inibidores quinase (incluindo mas não limitado a inibidores de KDR e TIE-2); bloqueadores da molécula da co-estimulação (incluindo mas não limitado a anti-B7.1, anti-B7.2, CTLA4-Ig, anti-CD20); bloqueadores da molécula de adesão (incluindo mas não limitado a anti-LFA-1 Abs, anti-E/L selectin Abs, inibidores de moléculas pequenas); anticorpo anti-citocina ou seu fragmento funcional (incluindo mas não limitado um anticorpos anti-IL-18, anti-TNF, anti-IL-6/receptor citocina); metotrexato; ciclosporina; rapamicina; FK506; marcador ou repórter detectável; um antagonista de TNF; um antirreumático; um relaxante muscular, um narcótico, um fármaco anti-inflamatório não esteroidal (NSAID), um analgésico, um anestésico, um sedativo, um anestésico local, um bloqueador neuromuscular, um antimicrobiano, um antipsorriático, um corticosteróide, um esteróide anabólico, uma eritropoietina, uma imunização, uma imunoglobulina, um imunossupressor, um hormônio do crescimento, um fármaco de substituição hormonal, um radiofarmacêutico, um antidepressivo, um antipsicótico, um estimulante, uma medicação contra asma, um beta-agonista, um esteróide inalado, uma epinefrina ou análogo, uma citocina, e um antagonista citocina.

[0036]Num outro aspecto, a invenção proporciona um método para inibir a atividade da IL-13 humana que compreende contatar a IL-13 humana com uma proteína de ligação revelada acima tal que a atividade da IL-13 humana é inibida. Em um aspecto correlato a invenção proporciona um método para inibir a atividade da IL-13 humana em um indivíduo humano que sofre de um distúrbio em que a atividade da IL-13 é prejudicial, compreendendo administrar ao indivíduo humano uma proteína de ligação revelada acima tal que a atividade da IL-13 humana no indivíduo humano é inibida e o tratamento é conseguido.

[0037]Num outro aspecto, a invenção proporciona um método de tratar (por exemplo, curar, suprimir, melhorar, retardar, ou prevenir o início de, ou de prevenir a recorrência ou a recidiva de) ou de prevenir um distúrbio associado com a IL-13, em um indivíduo. O método inclui: administrar ao indivíduo um agente ligante a IL-13 (particularmente um antagonista); por ex., um anticorpo anti-IL-13 ou seu fragmento como aqui descrito, numa quantidade suficiente para tratar ou prevenir o distúrbio associado com a IL-13. O antagonista de IL-13, por exemplo, o anticorpo anti-IL-13 ou seu fragmento, pode ser administrado ao indivíduo, sozinho ou em combinação com outras modalidades terapêuticas como aqui descrito.

[0038]Em uma modalidade, o indivíduo é um mamífero, por exemplo, um humano que sofre de um ou mais distúrbios associados a IL-13, incluindo, por exemplo, distúrbios respiratórios (por exemplo, asma (por exemplo, asma alérgica e não alérgica), doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), e outras condições envolvendo inflamação das vias respiratórias, eosinofilia, fibrose e excesso de produção de muco; distúrbios atópicos (por exemplo, dermatite atópica e rinite alérgica); condições inflamatórias e/ou autoimunes de, da pele, órgaos gastrintestinais (por exemplo, doenças inflamatórias dos intestinos (IBD), tal como colite ulcerativa e/ou doença de Crohn), e fígado (por exemplo, cirrose, fibrose), eescleroderma; tumores ou cânceres, por exemplo, linfoma de Hodgkin como aqui descrito. Consequentemente, a revelação inclui o uso de um agente ligante a IL-13 (tal como um anticorpo anti-IL-13 ou seu fragmento descrito aqui) para um tratamento descrito aqui e o uso de um agente ligante a IL-13 (tal como um anticorpo anti-IL-13 ou seu fragmento descrito aqui) para a preparação de um medicamento para um tratamento descrito aqui. Exemplos de distúrbios associados a IL-13 incluem, mas não estão limitados a, um distúrbio escolhido de um ou mais de: distúrbios respiratórios, por exemplo, asma (por exemplo, asma alérgica e não alérgica (por exemplo, asma devido a infecção com, por exemplo, vírus respiratório sincicial (RSV), por exemplo, em crianças mais jovens)), doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), e e outras condições envolvendo inflamação das vias respiratórias, eosinofilia, fibrose e excessiva produção de muco, por exemplo, fibrose cística e fibrose pulmonar; distúrbios atópicos, por exemplo, resultantes de uma aumentada sensibilidade a IL-13 (por exemplo, dermatite atópica, urticária, eczema, rinite alérgica, e enterogastrite alérgica); condições inflamatórias e/ou autoimunes de, da pele (por exemplo, dermatite atópica), órgãos gastrintestinais (por exemplo, doenças inflamatórias dos intestinos (IBD), tal como colite ulcerativa e/ou doença de Crohn), fígado (por exemplo, cirrose, carcinoma hepatocelular), e escleroderma; tumores ou cânceres (por exemplo, tumores sólidos ou do tecido mole), tal como leucemia, glioblastoma, e linfoma, por exemplo, linfoma de Hodgkin; infecções virais (por exemplo, de HTLV-1); fibrose de outros órgãos, por exemplo, fibrose do fígado, (por exemplo, fibrose causada por um vírus da hepatite B e/ou C); e suppressão da expressão de imuno-respostas protetoras tipo-1, (por exemplo, durante a vacinação), como aqui descrito.

[0039]Em outras modalidades, esse pedido proporciona um método de tratar (por exemplo, reduzir, melhorar) ou prevenir um ou mais sintomas associados com um distúrbio respiratório, por exemplo, asma (por exemplo, asma alérgica e não alérgica); alergias; doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC); uma condição envolvendo inflamação das vias respiratórias, eosinofilia, fibrose e excessiva produção de muco, por exemplo, fibrose cística e fibrose pulmonar. Por exemplo, sintomas da asma incluem, mas não estão limitados a, respiração ofegante e falta de ar, broncoconstrição, hiper-reatividade das vias respiratórias, reduzida capacidade pulmonar, fibrose, inflamação das vias respiratórias, e produção de muco. O método compreende administrar ao indivíduo um antagonista da IL-13, por exemplo, um anticorpo da IL-13 ou um seu fragmento, numa quantidade suficiente para tratar(por exemplo, reduzir, melhorar) ou prevenir um ou mais sintomas. O anticorpo de IL-13 pode ser administrado terapeuticamente ou profilaticamente, ou ambos. O antagonista de IL-13, por exemplo, o anticorpo anti-IL-13, ou seu fragmento, pode ser administrado ao indivíduo, sozinho ou em combinação com outras modalidades terapêuticas como aqui descrito. Preferivelmente, o indivíduo é um mamífero, por exemplo, um humano que sofre de um distúrbio associado com a IL-13 como aqui descrito.

[0040]Num outro aspecto, esse pedido proporciona um método para detectar a presença da IL-13 em uma amostra in vitro (por exemplo, uma amostra biológica, tal como soro, plasma, tecido, biópsia). O método em questão pode ser usado para diagnosticar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio associado com imuno-células. O método inclui: (i) contactar uma amostra ou uma amostra controle com o anticorpo anti-IL-13 ou seu fragmento como aqui descrito; e (ii) detectar a formação de um complexo entre o anticorpo anti-IL-13 ou seu fragmento, e a amostra ou a amostra controle, em que uma alteração estatisticamente significativa na formação do complexo numa amostra relativamente a uma amostra controle é indicativo da presença da IL-13 na amostra.

[0041]Em ainda um outro aspecto, esse pedido proporciona um método para detectar a presença da IL-13 in vivo (por exemplo, no imageamento in vivo de um indivíduo). O método em questão pode ser usado para diagnosticar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio associado com a IL-13. O método inclui: (i) administrar o anticorpo anti-IL-13 ou seu fragmento como aqui descrito a um indivíduo ou a um indivíduo controle sob condições que permitam a ligação do anticorpo ou fragmento a IL-13; e (ii) detectar a formação de um complexo entre o anticorpo ou fragmento e IL-13, em que uma alteração estatisticamente significativa na formação do complexo no indivíduo relativamente ao indivíduo controle é indicativo da presença da IL-13.

[0042]Num outro aspecto, as proteínas ligantes da invenção são úteis para tratar um distúrbio selecionado a partir do grupo que compreende artrite reumatóide, osteoartrite, artrite juvenil crônica, artite séptica, artrite de Lyme, psoriatic artrite, reactive artrite, spondyloartropatia, lúpus sistêmico eritematoso, doença de Crohn, colite ulcerativa, doença inflamatória dos intestinos, diabetes mellitus insulino- dependente, tireoidite, asma, doenças alérgicas, psoríase, dermatite escleroderma, doença de enxerto versus hospedeiro, rejeição ao transplante de órgaos, imuno- doenças crônicas ou agudas associadas com transplante de órgãos, sarcoidose, aterosclerose, coagulação intravascular disseminada, doença de Kawasaki, doença de Grave, síndrome nefrótica, síndrome da fadiga crônica, Granulomatose de Wegener, Púrpura de Henoch-Schoenlein, vasculite microscópica dos rins, hepatite ativa crônica, uveíte, choque séptico, síndrome do choque tóxico, síndrome de sépse, caquexia, doenças infecciosas, doenças parasitárias, síndrome da imunodeficiência adquirida, mielite transversa aguda, coréia de Huntington, doença de Parkinson, doença de Alzheimer, derrame, dirrose biliar primária, anemia hemolítica, malignidades, insuficiência cardíaca, infarto do miocárdio, Doença de Addison, esporádica, deficiência poliangular tipo I e deficiência poliangular tipo II, Síndrome de Schmidt, síndrome da agonia respiratória adulta (aguda), alopecia, alopecia areata, artropatia soronegativa, artropatia, Doença de Reiter, artropatia psoriática, atropatia ulcerativa colítica, sinovite enteropática, clamídia, artropatia associada com iersinia e salmonela, espondiloartropatia, doença/aterosclerose ateromatosa, alergia atópica, doença bulosa autoimune, pênfigo vulgaris, pênfigo foliáceo, penfigóide, doença IgA linear, anemia hemolítica autoimune, Anemia hemolítica positiva de Coombs, anemia perniciosa adquirida, anemia perniciosa juvenil, encefalite miálgica/Doença Royal Free, candidíase mucocutânea crônica, arterite de células gigantes, hepatite primária esclerosante, hepatite autoimune criptogênica, Síndrome da Doença da Imunodeficiência Adquirida, Doenças Relacionadas com a imunodeficiência Adquirida, Hepatite B, Hepatite C, imunodeficiência variada comum (hipoglamaglobulinemia variável comum), cardiomiopatia dilatada, infertilidade feminina, deficiência ovariana, deficiência ovariana prematura, doença fibrótica pulmonar, alveolite criptogênica fibrosante, doença pulmonar intersticial pós-inflamatória, pneumonite intersticial, doença do tecido conectivo associada com doença pulmonar intersticial, doença do tecido conectivo misto associada com doença pulmonar, esclerose sistêmica associada com doença pulmonar intersticial, artrite reumatóide associada com doença pulmonar intersticial, lúpus sistêmico eritematoso associado com doença pulmonar, dermatomiosite/polimiosite associada com doença pulmonar, Doença de Sjogren associada com doença pulmonar, espondilite anquilosante associada com doença pulmonar, doença pulmonar vasculite difusa, hemosiderose associada com doença pulmonar, doença pulmonar intersticial fármaco-induzida, fibrose, fibrose por radiação, bronquiolite obliterante, pneumonia eosinofílica crônica, doença pulmonar linfocítica infiltrante, doença pulmonar intersticial pós-infecciosa, artrite de gota, hepatite autoimune, hepatite autoimune tipo-1 (hepatite lupóide ou autoimune clássica), hepatite autoimune tipo-2 (hepatite de anticorpo anti-LKM), hipoglicemia autoimune-mediada, insulino-resistência tipo B com acanthosis nigricans, doenças autoimune agudas associada com transplante de órgãos, doenças imune crônicas associadas com transplante de órgãos, osteoartrose, colangite esclerosante primária, psoríase Tipo 1, psoríase Tipo 2, leucopenia idiopática, neutropenia autoimune, doença renal NOS, glomerulonefrites, vasulite microscópica dos rins, doença de Lyme, lúpus discóide eritematoso, autoimunidade a esperma, esclerose múltipla (todos os subtipos), oftalmia simpatética, hipertensao pulmonar secundária à doença do tecido conectivo, síndrome de Goodpasture, manifestação pulmonar da poliarterite nodosa, febre reumática aguda, espondilite reumatóide, doença de Still, esclerose sistêmica, síndrome de Sjorgren, doença de Takayasu/arterite, trombocitopenia autoimmune, trombocitopenia idiopática, doença autoimune da tireóide, hipertireoidismo, hipotireiodismo autoimune papular (Doença de Hashimoto), hipotireiodismo autoimune atrófico, mixodema primário, uveíte facogênica, vasculite primária, doença hepática vitiligo agudo, doenças hepáticas crônicas, cirrose alcoólica, danos hepáticos induzidos por álcool, coleosatatis, doença hepática idiosincrática, hepatite Fármaco-induzida, esteato-hepatite não alcoólica, alergia e asma, infecção por estreptococus grupo B (GBS), distúrbios mentais (por exemplo, depressão e esquizofrenia), doenças mediadas por tipo Th2 e tipo Th1, dor aguda e crônica (diferentes formas de dor), e cânceres tal como de pulmão, mama, estômago, bexiga, cólon, pâncreas, ovário, próstata, e câncer retal e malignidades hematopoiéticas (leucemia e linfoma), Abetalipoprotemia, Acrocianose, processos parasitários ou infecciosos agudos ou crônicos, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mielóide aguda (AML), infecção bacteriana aguda ou crônica, pancreatite aguda, deficiência renal aguda, adenocarcinomas, batimentos ectópicos aéreos, complexo demência ADDS, hepatite induzida por álcool, conjuntivite alérgica, dermatite alérgica de contato, rinite alérgica, rejeição a alo-enxerto, deficiência de antitripsina-alfa-1, esclerose lateral amiotrófica, anemia, angina pectoris, degeneração de célula chifre anterior, terapia anti cd3, síndrome antifosfolipídio, reações de hipersensibilidade a anti-receptor, aneurismas aórticos e periféricos, dessecação aórtica, hipertensão arterial, arteriosclerose, fístulas arteriovenosas, ataxia, fibrilação atrial (sustentada ou paroximal), palpitação atrial, bloqueio atrioventricular, linfoma de célula B, rejeição a enxerto ósseo, rejeição a transplante de medula óssea (BMT), bloqueio de ramos, linfoma de Burkitt, queimaduras, aritmias cardíacas, síndrome de paralisia cardíaca, tumores cardíacos, cardiomiopatia, resposta de inflamação por bypass cardiopulmonar, rejeição a transplante de cartilagem, degenerações corticais cerebelares, distúrbios cerebelares, taquicardia atrial caótica ou multifocal, distúrbios associados com quimioterapia, leucemia mielocítica crônica (CML), alcoolismo crônico, patologias inflamatórias crônicas, leucemia linfocítica crônica (CLL), doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), intoxicação crônica por salicilato, carcinoma colo-retal, insuficiência cardíaca congestiva; conjuntivite, dermatite de contato, cor pulmonale, doença arterial coronariana, doença de Creutzfeldt-Jakob, sépse negativa de cultura, fibrose cística, distúrbios associados com terapia por citocina, Demência pugilística, doenças desmielinizantes, febre da dengue hemorrágica, dermatite, condições dermatológicas, diabetes, diabetes mellitus, doença diabética aterosclerótica, doença de corpo de Lewy difusa, cardiomiopatia congestiva dilatada, distúrbios do gânglio basal, singrome de Down na meia idade, distúrbios de movimento induzido por fármacos que bloqueiam os receptores dopamina do CNS, sensibilidade a fármacos, eczema, encefalomielite, endocardite, endocrinnopatia, epiglotite, infecção por vírus epstein-barr, eritromelalgia, distúrbios extrapiramidais e cerebelares, linfohistocitose hematofagocítica familiar, rejeição a implante de timo fetal, ataxia de Friedreich, distúrbios arterial periféricos funcional, sépse fúngica, gangrena por gás, úlcera gástrica, nefrite glomerular, rejeição a enxerto de qualquer órgão ou tecido, sépse gram negativa, sépse gram positiva, granulomas devido a organismoos intracelulares, leucemia de células pilosas, doença de Hallerrorden- Spatz disease, febre de tireoidite de Hasshimoto, rejeição a transplante cardíaco, hemacromatose, hemodiálise, síndrome urêmica hemolítica/púrpura trobocitopênica trombolítica, hemorragia, hepatite (A), arritimias de feixe HIS, infecção por HIV/neuropatia por HIV, doença de Hodgkin, distúrbios hipercinéticos de movimento, reações de hipersensibilidade, pneumonite de hipersensibilidade, hipertensão, distúrbios hipocinéticos de movimento, avaliação do eixo hipotalâmico-pituitário- adrenal, doença idiopática de Addison, fibrose pulmonar idiopática, citotoxicidade mediada por anticorpo, astenia, atrofia muscular espinhal infantil, inflamação da aorta, influenza a, exposição a radiação ionizante, iridociclite/uveíte/neurite ótica, danos isquemia-reperfusão, derrame isquêmico, artrite reumatóide juvenil, atrofia muscular espinhal juvenil, sarcoma de Kaposi, rejeição a transplante renal, legionela, leishmaniose, lepra, lesões do sistema corticospinhal, lipedema, rejeição a transplante de fígado, linfederma, malária, linfoma maligno, histiocitose maligna, melanoma maligno, meningite, miningococemia, metabólica/idiopática, enxaqueca, distúrbio multi-sistema mitocondrial, doença do tecido conectivo misto, gamopatia monoclonal, mieloma múltiplo, degenerações sistêmicas múltiplas (Mencel Dejerine- Thomas Shi-Drager e Machado-Joseph), miastenia grave, micobactéria aviária intracelular, micobactéria da tuberculose, síndrome mielodisplásica, infarto do miocárdio, distúrbios isquêmicos do miocárdio, carcinoma nasofaringeal, doença pulmonar crônica neonatal, nefrite, nefrose, doenças neurodegenerativas, atrofias musculares neurogênicas I, febre neutropênica, linfoma não-hodgkins, oclusão da aorta abdominal e suas ramificações, distúrbios oclusivos arteriais, terapia de okt3, orquite/epidimite, procedimentos de reversão de orquite/vasectomia, organomegalia, osteoporose, rejeição ao transplante de pâncreas, carcinoma pancreático, síndrome paraneoplásica/hipercalcemia de malignidade, rejeição a transplante paratireóide, doença inflamatória pélvica, rinite perene, doença pericardial, doença aterosclerótica periférica, doença vascular periférica, peritonite, anemia perniciosa, pneumonia pneumociste carinii, pneumonia, síncrome POEMS (polineuropatia, organomegalia, endocrinopatia, gainopatia monoclonal, e sindrome de medições de pele), síndrome pós-perfusão, síndrome pós-bombeio, síndrome cardiotomia pós-MI, preeclâmpsia, paralisia progressiva supranuclear, hipertensao pulmonar primária, terapia por radiação, fenômeno e doença de Raynoud, doença de Refsum, taquicardia QRS estreita regular, hipertensão renovascular, danos de reperfusão, cardiomiopatia restritiva, sarcomas, escleroderma, coreia senil, demência senil do tipo corpo de Lewy, atropatias soronegativas, choque, anemia falsiforme, alore~jeição a enxerto de pele, síndrome de medições de pele, rejeição a transplante de intestino delgado, tumores sólidos, arritmias específicas, ataxia espinhal, degenerações spinocerebelares, miosite estreptocócica, lesões estruturais do cerebelo, panencefalite esclerosante subaguda, síncope, sífilis do sistema cardiovascular, anafalaxia sistêmica, síndrome da resposta inflamatória sistêmica, início sistêmico da artrite reumatóide juvenil, ALL de célula-T ou FAB, Telangiectasia, tromboangite obliterante, trombocitomenia, toxicidade, transplantes, trauma/hemorragia, reações de hipersensibilidade tipo III, hipersensilibidade tipo IV, angina instável, uremia, urosépse, urticária, doenças cardíacas valvulares, veias varicoses, vasculite, doenças venosas, trombose venosa, fibrilação ventricular, infecções virais e fúngicas, encefalite vital/meningite asséptica, síndrome hematofagocítica vital- associada, síndrome de Wernicke-Korsakoff, doença de Wilson, xeno-rejeição a enxerto de qualquer órgão ou tecido, síndromes coronarianas agudas, polineurite idiopática aguda, poliradiculoneuropatia desmielinizante inflamatória aguda, isquemia aguda, doença de Still adulto, alopecia areata, anafilaxia, síndrome anticorpo anti-fosfolipídio, anemia aplásica, arteriosclerose, eczema atópico, Dermatite atópica, dermatite autoimmune, distúrbios autoimune associados com infecção por streptococus, enteropatia autoimune, perda auditiva autoimune, síndrome linfoproliferativa autoimune (ALPS), miocardite autoimune, deficiência ovariana autoimune prematura, blefarite, broncoectasia, penfigóide Bullous, doença cardiovascular, síndrome antifosfolipídio catastrófica, doença celíaca, espondilose cervical, isquemia crônica, penfigóide cicatricial, síndrome clinicamente isolada (CIS) com risco para Esclerose múltipla, Conjuntivite, distúrbio psiquiátrico com início na adolescência, Doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), Dacriocistite, dermatomiosite, retinopatia diabética, Diabetes mellitus, hérnia de disco, prolapso de disco, anemia imuno hemolítica induzida por fármacos, endocardite, endometriose, endoftalmite, episclerite, eritema multiforme, eritema multiforme major, penfigóide gestacional, síndrome de Guillain-Barre (GBS), febre do feno, síndrome de Hughes, doença de Parkinson idiopática, pneumonia idiopática intersticial, alergia IgE- mediada, anemia imuno hemolítica, miosite corpórea de inclusão, doença inflamatória ocular infecciosa, doença inflamatória desmielinizante, doença cardíaca inflamatória, doença renal inflamatória, IPF/UIP, irite, ceratite, ceratoconjuntivite sicca, doença de Kussmaul ou doença de Kussmaul-Meier, paralisia de Landry, histocitose de células de Langerhan, Livedo reticularis, degeneração macular, poliangiite microscópica, Morbus Bechterev; distúrbio neuro-motor, penfigóide da membrana mucosa, deficiência orgânica múltipla, miastenia grave, síndrome mielodisplásica, miocardite, distúrbios da raíz nervosa, neuropatia, hepatite não-A, neurite ótica, osteolise, JRA pauciarticular, doença oclusiva arterial periférica (PAOD), doença vascular periférica (PVD), doença arterial periférica (PAD), flebite, poliarterite nodosa (ou periarterite nodosa), policondrite, Polimialgia reumática, Poliose, JRA Poliarticular, Síndrome de deficiência poliendócrina, polimiosite, polimialgia reumática (PMR), síndrome pós-bombeio, parksonismo primário, prostatite, aplasia de células vermelhas puras, insuficiência adrenal primária, Neuromielite ótica recorrente, restenose, doença cárdio-reumática, SAPHO (sinovite, acne, pustulose, hiperostose, e osteíte), Escleroderma, amiloidose secundária, comoção pulmonarm, esclerite, ciática, insuficiência adrenal secundária, doença do tecido conectivo associada a silicone, dermatose de Sneddon-Wilkinson, espondilite anquilosante, síndrome de Stevens-Johnson (SJS), síndrome da resposta sistêmica inflamatória, arterite temporal, retinite toxoplásmica, necrólise epidérmica tóxica, mielite transversa, TRAPS (receptor do fator de necrose tumoral, reação alérgica Tipo 1, diabetes tipo U, urticária, pneumonia intersticial usual (UIP), vasculite, conjuntivite vernal, retinite viral, síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada (síndrome VKH), degeneração macular úmida, e cura de ferimentos.

[0043]Num outro aspecto, as proteínas ligantes da invenção são úteis para tratar um distúrbio selecionado a partir do grupo que compreende leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielóide aguda, carcinoma adrenocortical, câncer anal, câncer de apêndice, astrocitoma cerebelar, astrocitoma cerebral, carcinoma de célula basal, câncer do duto da bile, extraepático, câncer de bexiga, câncer ósseo, osteosarcoma/histocitoma fibroso malignizante, glioma do tronco cerebral, tumor de cérebro, estrocitoma cerebral/glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodérmico primitivo supratentorial, glioma da rota visual e hipotalâmica, câncer de mama, adenomas/carcinoides bronquiais, tumor carcinóide, carcinoma gastrintestinal primário desconhecido, linfoma do sistema nervoso central, astrocitoma cerebelar primário, câncer cervical, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielogenosa crônica, distúrbios meilproliferativos crônicos, câncer de cólon, câncer colo-retal, linfoma e célula-T cutânea, câncer endometrial, ependimoma, câncer de esôfago, família de tumores de Ewing, tumor de célula terminal extracraniana, tumor de célula germinal extragonadal, câncer do duto biliar extraepático, câncer de olho, melanoma intraocular, retinoblastoma, câncer de vesícula biliar, câncer gástrico (estômago), tumor carcinóide gastrintestinal, tumor estromal gastrintestinal (GIST), tumor de célula germinal extracraniana, tumor de célula germinal extragonadal, tumor de célula germinal ovariana, tumor trofoblástico gestacional, glioma, glioma do tronco cerebral, glioma astrocitoma cerebral, glioma da rota visual e hipotalâmica da adoslescência, leucemia de célula pilosa, câncer de cabeça e pescoço, câncer hepatocelular (fígado), linfoma de Hodgkin, câncer hipofaringeal, melanoma intraocular, carcinoma de célula ilhota (pâncreas endócrino), sarcoma de Kaposi, câncer dos rins (célula renal), câncer de laringe, leucemia linfoblástica aguda, Leucemia mielóide aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielogenosa crônica, leucemia de célula pilosa, câncer da cavidade labial e oral, câncer de fígado, câncer pulmonar de célula pequena, câncer, linfoma relacionado com AIDS, linfoma de Burkitt Linfoma, linfoma de célula-T cutânea, linfoma de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin, linfoma do sistema nervoso central primário, macroglobulinemia de Waldenstrom, histiocitoma fibroso malignizante dos ossos/osteossarcoma, meduloblastoma, melanoma, melanoma intraocular (olho), carcinoma de célula de Merkel, mesotelioma maligno, câncer de pescoço metastásico escamoso com ocultação primária, câncer de boca, síndrome da neoplasia endócrina múltipla, mieloma múltiplo/neoplasma de célula plasmática, micoses fúngicas, síndromes mielodisplásicas, doenças mielodisplásicas/mieloproliferativas, leucemia mielogenosa, leucemia mielóide crônica, mieloma múltiplo, distúrbios mieloproliferativos, câncer da cavidade nasal e sino paranasal, câncer nasofaringeal, neuroblastoma, câncer da cavidade oral, canceer labial e orofaringeal, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno dos ossos, câncer de ovário, câncer epitelial ovariano, tumor de célula germinal ovariana, tumor ovariano de baixo potencial de malignidade, câncer de pâncreas, câncer pancreático de célula ilhota, câncer do sino paranasal e cavidade nasal, câncer paratireóide, câncer de pênis, câncer de faringe, feocromocitoma, pineoblastoma e tumores neuroectodérmicos primitivos supratentorial, tumor pituitário, neoplasma de célula plasmática/mieloma múltiplo, blastoma pleuropulmonar, câncer de próstata, câncer retal, câncer de célula renal (rim), pelvis renal e ureter, câncer de célula transicional, Retinoblastoma, câncer da glândula salivar, sarcoma, tumores da família Ewing, sarcoma de Kaposi Sarcoma, sarcoma do tecido mole, sarcoma uterino, síndrome de Sezary, câncer de pele (nonmelanoma), câncer de pele (melanoma), carcinoma de pele de célula de Merkel, câncer do intestino delgado, carcinoma de célula escamosas, câncer de pescoço escamoso metastásico com ocultação primária, câncer de estômago (gástrico), tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriais, linfoma de célula-T cutânea, câncer de testículo, câncer de garganta, timoma, carcinoma timoma e tímico, câncer de tireóide, câncer de célula transicional da pelvis renal e ureter, tumor trofoblástico gestacional, ureter e pelvis renal, câncer de célula transicional, câncer de uretra, câncer uterino, sarcoma uterino endometrial, câncer vaginal, glioma da rota visual e hipotalâmica, câncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom, tumor de Wilms.

[0044]Num outro aspecto a invenção proporciona um método de tratar um paciente que sofre de um distúrbio em que IL-13 humana é prejudicial compreendendo a etapa de administrar qualquer uma das proteínas ligantes reveladas acima antes, concomitante, ou após a administração de um segundo agente, como discutido acima. Em uma modalidade preferida o agente terapêutico adicional que pode ser co-administrados e/ou co-formulados com um ou mais antagonistas de IL-13, (por ex., anticorpos anti-IL-13 ou seus fragmentos), incluem, mas não estão limitados a, um ou mais de: esteróides inalados; esteróides orais; beta-agonistas, por exemplo, beta-agonistas de curta duração e de longa duração; antagonistas de leucotrienos ou receptores de leucotrieno; fármacos de combinação tal como ADVAIR; Inibidores de IgE, por exemplo, anticorpos anti-IgE (por ex., XOLAIR); inibidores fosfodiesterase (por ex., inibidores PDE4); xantinas; fármacos anticolinérgicos; agentes estabilizantes de mastócitos tal como cromolina; Inibidores de IL-4; Inibidores de IL-5; inibidores eotaxin/CCR3; antagonistas de histamina ou seus receptores incluindo H1, H2, H3, e H4, e antagonistas de prostaglandina D ou seus receptores (DPI e CRTH2). Tais combinações podem ser usadas para tratar asma e outros distúrbios respiratórios. Exemplos adicionais de agentes terapêuticos que podem ser coadministrados e/ou coformulados com um ou mais anticorpos anti- IL-13 ou seus fragmentos incluem um ou mais de: antgonistas de TNF (por exemplo, um fragmento solúvel de um receptor do TNF, por exemplo, receptor do TNF p55 ou p75 humano ou seus derivados, por exemplo, 75 kD TNFR-IgG (75 kD receptor do TNF-Proteína de fusão IgG, ENBREL)); antagonistas de enzima de TNF, por exemplo, inibidores da enzima de conversão TNF (TACE); antagonistas de receptor muscarínico; TGF-beta antagonistas; interferon gamma; perfenidona; agentes quimioterápicos, por exemplo, metotrexato, leflunomida, ou um sirolimus (rapamicina) ou um seu análogo, por exemplo, CCI-779; inibidores COX2 e cPLA2; NSAIDs; immunomoduladores; inibidores p38 inibidors, inibidores TPL-2, MK-2 e NFkB, entre outros. Agente secundário adicional é selecionado a partir do grupo que compreende budenosida, fator de crescimento epidérmico, corticosteróides, ciclosporina, sulfasalazina, aminosalicilatos, 6- mercaptopurina, azatioprina, metronidazol, inibidores lipoxigenase, mesalamina, olsalazina, balsalazida, antioxidantes, inibidores tromboxano, antagonistas de receptor IL-1, anticorpos monoclonais anti-EL-1β, anticorpos monoclonais anti-IL-6, fatores de crescimento, inibidores elastase, compostos piridinil-imidazol, anticorpos ou agonistas de TNF, LT, IL-1, EL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-H, GM-CSF, FGF, e PDGF, anticorpos de CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 ou seus ligandos, metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenolato de mofetila, leflunomida, NSAIDs, ibuprofeno, corticosteróides, prednisolona, inibidores fosfodiesterase, agonistas adensosine, agentes antitrombóticos, inibidores complementares, agentes adrenérgicos, inibidores quinase IRAK, NIK, IKK, p38, MAP, inibidores de enzima de conversão IL-1β, inibidores da enzima de conversão TNFα, inibidores de sinalização célula-T, inibidores metaloproteinase, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inibidores de enzima de conversão angiotensin, receptor citocinas solúveis, receptor do TNF p55 solúvel, receptor do TNF p75 solúvel, sIL-1R1, sIL-lRII, sIL-6R, citocinas antiinflamatórias, IL-4, IL-10, IL11, e TGFβ.

[0045]Em uma modalidade preferida as composições farmacêuticas reveladas acima são administradas ao indivíduo por pelo menos um modo selecionado de parenteral, subcutâneo, intramuscular, intravenoso, intrarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavitário, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intraepático, intramiocardial, intraosteal, intrapélvico, intrapericárdico, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intraretal, intrarenal, intraretinal, intraspinal, intrasinovial, intratoráxico, intrauterino, intravesical, bolus, vaginal, retal, bucal, sublingual, intranasal, e transdérmico.

[0046]Um aspecto da invenção proporciona pelo menos um anticorpo anti- idiotipo IL-13 a pelo menos uma proteína de ligação a IL-13 da presente invenção. O anticorpo anti-idiotipo inclui qualquer molécula proteína ou peptídeo que compreende pelo menos uma parte de uma molécula imunoglobulina tal como, mas não limitado a, pelo menos uma região determinante complementar (CDR) de uma cadeia pesada ou leve ou um ligando que se liga a uma sua parte, uma região variável de cadeia pesada ou de cadeia leve, uma região constante de cadeia pesada ou de cadeia leve, uma região de cadeia estrutural, ou; qualquer parte desses, que possa ser incorporada numa proteína de ligação da presente invenção.

Descrição Detalhada da invenção

[0047]Essa invenção está relacionada a Proteínas ligantes a IL-13 humana, particularmente anticorpos anti-IL-13, ou suas partes antígeno-ligantes, que se ligam a IL-13. Diversos aspectos da invenção estão relacionados um anticorpos e fragmentos de anticorpos, e suas composições farmacêuticas, bem como a ácidos nucleicos, vetores recombinantes de expressão e células hospedeiras para produzir tais anticorpos e fragmentos. Métodos de utilizar os anticorpos da invenção para detectar a IL-13 humana, para inibir a atividade da IL-13 humana, ou in vitro ou in vivo; e regular a expressão genética são também abrangidos pela invenção.

[0048]A menos que de outro modo definido aqui, os termos técnicos e científicos usados no contexto da presente invenção terão os significados que são comumente entendidos por aqueles usualmente versados na técnica. O significado e escopo dos termos devem ser claros, todavia, na eventualidade de qualquer ambiguidade latente, as definições aqui providas têm precedência sobre qualquer definição extrínseca ou advinda de dicionários. Além disso, a menos que de outro modo exigido pelo contexto, os termos no singular devem incluir pluralidades e os termos plurais devem incluir o singular. Nesse pedido, o uso de “ou” significa “e/ou” a menos que de outro modo estabelecido. Além disso, o uso do termo “incluindo”, bem como as outras formas, tal como “inclui” e “incluído”, não é limitante. Também, termos tal como “elemento” ou “componente” abrangem ambos elementos e componentes compreendendo uma unidade e elementos e componentes que compreendem mais que uma subunidade a menos que especificamente estabelecido de outro modo.

[0049]No geral, as nomenclaturas usadas no contexto, e técnicas de cultura de células e de tecido, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e química e hibridização de proteína e ácido nucleico descritos aqui são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na arte. Os métodos e técnicas da presente invenção are geralmente realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na arte e como descrito em diversas referências gerais e mais específicas que são mencionadas e discutidas no transcurso da presente especificação a menos que de outro modo indicado. As reações enzimáticas e as técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante, como usualmente realizado na arte ou como aqui descrito. As nomenclaturas usadas no contexto, e os procedimentos de laboratório e técnicas de química analítica, química de síntese orgânica, e química medicinal e farmacêutica descritas aqui são aqueles bem conhecidos e comumente usados na arte. Técnicas padrões são usadas para as sínteses químicas, análises químicas, preparações farmacêuticas, formulação, e aplicação e tratamento aos pacientes.

[0050]Para que a presente invenção possa ser mais facilmente entendida, termos selecionados são definidos adiante.

[0051]O termo “Polipeptídeo” como usado aqui, se refere a qualquer cadeia polimérica de aminoácidos. O termos “peptídeo” e “proteína” são usados de modo intercambiável com o termo polipeptídeo e também se refere a uma cadeia polimérica de aminoácidos. O termo “polipeptídeo” abrange proteínas naturais ou artificiais, fragmentos de proteínas e análogos de polipeptídio de uma sequência protéica. Um polipeptídeo pode ser monomérico ou polimérico.

[0052]O termo “proteína isolada” ou “polipeptídio isolado” é uma proteína ou polipeptídio que devido a sua origem ou fonte de derivação não está associada com componentes naturalmente associados que as acompanham em seu estado natural; é substancialmente livre de outras proteínas da mesma espécie; é expressa por uma célula a partir de diferentes espécies; ou não ocorre na natureza. Desse modo, um polipeptídio que é qumicamente sintetizado ou sintetizado num sistema celular diferente do da célula a partir do qual ele se origina naturalmente será “isolado” de seus componentes naturalmente associados. Uma proteína pode ser também tornada substancialmente livre de componentes naturalmente associados mediante separação, usando técnicas de purificação de proteínas bem conhecidas na arte.

[0053]O termo “recuperação”, como usado aqui, se refere ao processo de tornar uma espécie química tal como um polipeptídeo substancialmente livre de componentes naturalmente associados por separação, por exemplo, usando técnicas de purificação de proteínas bem conhecidas na arte.

[0054]Os termos “IL-13 humana” e “IL-13 humana tipo natural” (abreviado aqui como h IL-13, h IL-13wt), como usado aqui, inclui a citocina humana que é secretada primariamente pelas células 2 ajudadoras T. O termo inclui uma proteína monomérica de polipeptídio de 13 kDa. A estrutura da IL-13 humana é descrita também em, por exemplo, (Moy, Diblasio et al. 2001 J Mol Biol 310 219-30). O termo IL-13 humana é pretendida incluir a IL-13 humana recombinante (rh IL-13), que pode ser preparadas através de métodos padrões de expressão recombinante. A tabela 1 mostra a sequência aminoácido da IL-13 humana, SEQ ID No. 1, que é bem conhecida na arte. Ta bela 1: Sequência da IL-13 humana

[0055]O termo “variante da IL-13 humana” (abreviada aqui como h IL-13 v), como usado aqui, inclui uma variante da IL-13 humana em que o resíduo aminoácido 130 da SEQ ED NO. 1 é alterado de Arginina para Glutamina (R130Q).

[0056]“Atividade biológica” como usado aqui, se refere a todas as propriedades biológicas inerentes da citocina. As propriedades biológicas da IL-13 incluem mas não estão limitadas a ligação a receptor de IL-13; (outros exemplos incluem isotipo imunoglobulina que mudam para IgE em células B humanas e suprimem a produção de citocina inflamatória).

[0057]O termos “ligação específica” ou “especificamente ligante”, como usado aqui, em referência à interação de um anticorpo, uma proteína, ou um peptídeo com uma segunda espécie química, significa que a interação é dependente da presença de uma estrutura particular (por exemplo, um determinante antigênico ou epitopo) nas espécies químicas; por exemplo, um anticorpo identifica e se liga a uma estrutura protéica específica preferentemente que geralmente a proteínas. Se um anticorpo é específico para o epitopo “A”, a presença de uma molécula contendo epitopo A (ou livre, não marcada A), numa reação contendo “A” marcado e o anticorpo, irá reduzir a quantidade de A marcado ligado ao anticorpo.

[0058]O termo “anticorpo”, como usado aqui, em sua forma ampla se refere a qualquer molécula de imunoglobulina (Ig) compreendida de quatro cadeias de polipeptídios, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L), ou qualquer seu fragmento funcional, mutante, variante, ou derivação desses mencionados, que mantenha as características epitopo-ligantes essenciais de uma molécula de Ig. Tais mutantes, variantes, ou formatos derivados de anticorpo são conhecidos na arte. Modalidades não limitantes das quais são discutidas adiante.

[0059]Em um anticorpo de comprimento completo, cada cadeia pesada é compreendida de uma região variável de cadeia pesada (abreviado aqui como HCVR ou VH) e uma região constante de cadeia pesada. Uma região constante de cadeia pesada é compreendida de três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é compreendida de uma região variável de cadeia leve (abreviado aqui como LCVR ou VL) e uma região constante de cadeia leve. Uma região constante de cadeia leve é compreendida de um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser também subdivididas em regiões de hipervariabilidae, denominados regiões determinantes de complementaridade (CDR), regiões interdispersas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões da cadeia estrutural (FR). Cada VH e VL é composta de três CDRs e quatro FRs, dispostas a partir do terminal amino até o terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As moléculas de imunoglobulina podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG 3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse. O termo “porção antígeno-ligante” de um anticorpo (ou simplesmente “porção anticorpo”), como usado aqui, se refere a um ou mais fragmentos de um anticorpo que pode manter a capacidade para se ligar especificamente a um antígeno (por exemplo, hIL-13). Foi demonstrado que a função antígeno-ligante de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento completo. Tais modalidades de anticorpos podem ser também de formatos bi-específicos, dual-específicos, multi-específicos; que se ligam especificamente a dois ou mais diferentes antígenos. Exemplos de fragmentos ligantes abrangidos pelo termo “porção antígeno-ligante” de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo dos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bi-valente compreendendo dois fragmentos Fab vinculados a uma ponte dissulfeto na região de articulação; (iii) um fragmento Fd consistindo dos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv consistindo dos domínios VL e VH de um braço único de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al, (1989) Nature 341: 544-546, Winter et al., PCT publicação WO 90/05144 A1, aqui incorporado por referência), que compreendem um único domínio variável; e (vi) uma isolada região determinante de complementaridade (CDR). Além disso, embora os dois domínios dos fragmentos Fv, VL e VH, estejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos, usando métodos recombinantes, através de um ligador sintético que permite a eles serem produzidos como uma cadeia de proteína única em que as regiões VL e VH se juntam para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única (scFv); ver, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. ScL USA 85: 5879-5883). Tais anticorpos de cadeia única são também pretendidos a estarem abrangidos pelo termo “porção antígeno-ligante” de um anticorpo. Outras formas de anticorpos de cadeia única, tal como diacorpos estão também abrangidos. Diacorpos sãos anticorpos bivalentes, biespecíficos em que os domínios VH e VL estão expressos numa única cadeia polipeptídio, mas utilizando um ligador que é bastante curto para permitir o emparceiramento dos dois domínios na mesma cadeia, forçando desse modo os domínios a se emparelharem com domínios complementares de uma outra cadeia e criando dois sítios antígeno-ligante (ver por exemplo, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. ScL USA 90: 6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123). Tais porções ligantes do anticorpo são conhecidas na arte (Kontermann e Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5).

[0060]O termo “construto anticorpo” como usado aqui se refere a um polipeptídeo compreendendo uma ou mais da parte antígeno-ligantes da invenção ligada a um articulador polipeptídeo ou uma imunoglobulina de domínio constante. Polipeptídios articuladores compreendem dois ou mais resíduos aminoácidos unidos por ligações peptídios e são usados ligar uma ou mais partes antígeno-ligantes. Tais articulações polipeptídios são polipeptídios articuladores são bem conhecidas na arte (ver por exemplo, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. ScL USA 90: 6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123). Um domínio constante de imunoglobulina se refere a um domínio constante de cadeia pesada ou leve. Sequências aminoácidas de domínio constante de cadeia pesada e de cadeia leve de IgG humana são conhecidas na arte e representadas na Tabela 2. Tabela 2: Sequência de domínio constante de cadeia pesada e de domínio constante de cadeia leve da IgG humana

[0061]Ainda adicionalmente, um anticorpo ou uma sua porção antígeno- ligante pode ser parte de moléculas maiores de imunoadesão, formadas por associação covalente ou não covalente do anticorpo ou porção do anticorpo com uma ou mais outras proteínas ou peptídios. Exemplos de tais moléculas de imunoadesão incluem uso da região núcleo estreptavidina para produzir molécula scFV tetramérica (Kipriyanov, S.M., et al. (1995) Humum antibodies and Hibridomas 6: 93-101) e o uso de um resíduo cisteína, um peptídeo marcador e uma etiqueta poli-histidina C-terminal para produzir moléculas scFV bivalentes e biotiniladas (Kipriyanov, S.M., et al. (1994) Mol. Immunol. 3k 1047-1058). Porções anticorpos, tal como fragmentos Fab e F(ab')2, podem ser preparados a partir de anticorpos integrais usando técnicas convencionais, tal como digestão por papaína ou pepsina, respectivamente, dos anticorpos integrais. Além disso, os anticorpos ou porções de anticorpos e moléculas de imunoadesão podem ser obtidas usando técnicas DNA recombinantes padrões, como aqui descrito. Um “anticorpo isolado”, como usado aqui, é pretendido referir a um anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos possuindo diferentes especificidades antigênicas (por exemplo, um anticorpo isolado que especificamente se ligam a hIL-13 é substancialmente livre de anticorpos que especificamente se ligam a antígenos outros que hIL-13). Um anticorpo isolado que especificamente se liga a hIL-13 pode, todavia, ter reatividade cruzada a outros antígenos, tais como moléculas de IL-13 provenientes de outras espécies. Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente livre de outros materiais celulares e/ou químicos.

[0062]O termo “anticorpo humano”, como usado aqui, é pretendido incluir anticorpos que possuem regiões variáveis e constantes derivados a partir sequências imunoglobulina de linhas genéticas humanas. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos aminoácidos não codificados pelas sequências imunoglobulina de linhas genéticas humanas (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese randômicas ou sítio-específicas in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplo nos CDRs e em particular CDR3. Todavia, o termo “anticorpo humano”, como usado aqui, não é pretendido a incluir anticorpos em que sequências de CDR derivadas om the linhas genéticas de outras espécies de mamíferos, tal como de rato, foram enxertadas por sobre sequências de cadeia estrutural humana.

[0063]O termo “anticorpo humano recombinante”, como usado aqui, é pretendido incluir todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais comos anticorpos expressos usando um vetor de expressão recombinante transfectado numa célula hospedeira (descrito mais adiante na Seção II C, adiante), anticorpos isolados a partir de uma biblioteca combinatorial de anticorpo humano, recombinante (Hoogenboom H.R., (1997) TIB Tech. 15: 62-70; Azzazy H., e Highsmith W.E., (2002) Clin. Biochem. 35: 425-445; Gavilondo J.V., e Larrick J.W. (2002) BioTechniques 29: 128-145; Hoogenboom H., e Chames P. (2000) Immunology Today 21: 371- 378 ), anticorpos isolados a partir de um animal (por exemplo, um rato) que é transgênica para genes da imunoglobulina humana (ver por exemplo, Taylor, L. D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295; Kellermann S-A., e Green L.L. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13: 593-597; Little M. et al (2000) Immunology Today 21: 364-370) ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por meio de quaisquer outros meios que envolvam combinação de sequências genéticas da imunoglobulina humana a outras sequências DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes possuem regiões constantes e variáveis derivadas de sequências imunoglobulina de linhas genéticas humanas. Em certas modalidades, todavia, tais anticorpos humanos recombinantes são submetidos a mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico para sequências Ig humana é usado, na mutagênese somática in vivo) e desse modo as sequências aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas de e correlatas a sequências VH e VL de linhas genéticas humanas, podem não existir naturalmente no repertório das linhas genéticas de anticorpos humanos in vivo. Uma modalidade proporciona anticorpos humanos completos capazes de se ligar a IL-13 humana que podem ser gerados usando técnicas bem conhecidas na arte, tal como, mas não limitado a, usando bibliotecas fago Ig humanas tal como aqueles descritos em Jermutus et al., PCT publicação No.WO 2005/007699 A2.

[0064]O termo “anticorpo quimérico” se refere um anticorpos que compreende sequências de regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve de uma espécie e sequências de região constante de outras espécies, tal comos anticorpos possuindo regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve murina ligadas a regiões constantes humanas.

[0065]O termo “anticorpo CDR-enxertado” se refere anticorpos que compreendem sequências de regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve de uma espécie mas em que as sequências de uma ou mais das regiões do CDR de VH e/ou VL estão substituídas com sequências de CDR de outras espécies, tal comos anticorpos possuindo regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve murina em que um ou mais dos CDRs murina (por exemplo, CDR3) foi substituído com sequências de CDR humano.

[0066]O termo “anticorpo humanizado” se refere anticorpos que compreendem sequências de regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve provenientes de espécies não humanas (por exemplo, um rato) mas em que pelo menos uma porção da sequência VH e/ou VL foi alterada para ser mais “parecida a humana”, isto é, mais similar às sequências variáveis de linhas genéticas humanas. Um tipo de anticorpo humanizado é um anticorpo CDR-enxertado, em que sequências de CDR humano são introduzidas em sequências VH e VL não humanas para substituir as correspondentes sequências de CDR não humanas. Em uma modalidade, anticorpos IL-13 anti-humanos humanizados e porções antígeno- ligantes são providas. Tais anticorpos foram gerados mediante obter anticorpos monoclonais anti-hIL-13 murinos usando tecnologia hibridoma tradicional seguida por humanização usando engenharia genética in vitro, tal como aquelas reveladas em Kasaian et al PCT publicação No. WO 2005/123126 A2.

[0067]O termos “numeração Kabat”, “definições Kabat” e “marcação Kabat” são usados aqui de modo intercambiável. Esses termos, que são reconhecidos na arte, se referem a um sistema de numeração de resíduos aminoácidos que são mais variáveis (isto é, hipervariável) que outros resíduos aminoácidos nas regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve de um anticorpo, ou uma sua porção antígeno-ligante (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190: 382-391 e , Kabat, E.A., et al. (1991) Sequências de proteínas of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health e Humano Services, NIH Publication No. 91-3242). Para uma região variável de cadeia pesada, a região hipervariável varia desde posições aminoácidos 31 a 35 para CDR1, posições aminoácidos 50 a 65 para CDR2, e posições aminoácidos 95 to 102 for CDR3. Para uma região variável de cadeia leve, a região hipervariável varia de posições aminoácidos 24 a 34 para CDR1, posições aminoácidos 50 a 56 para CDR2, e posições aminoácidos 89 a 97 para CDR3.

[0068]Como usado aqui, o termos “aceitador” e “anticorpo aceitador” se referem ao anticorpo ou sequência de ácido nucleico que proporciona ou codifica pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou 100% das sequências de aminoácidos de uma ou mais das regiões da cadeia estrutural. Em algumas modalidades, o termo “aceitador” se refere a sequência de aminoácido ou ácido nucleico do anticorpo que proporciona ou codifica a(s) região(s) constante(s). Em ainda uma outra modalidade, o termo “aceitador” se refere a sequência de aminoácido ou ácido nucleico do anticorpo que proporciona ou codifica uma ou mais regiões da cadeia estrutural e a(s) região(s) constante(s). Numa modalidade específica, o termo “aceitador” se refere a uma sequência de aminoácido ou ácido nucleico de anticorpo humano que proporciona ou codifica pelo menos 80%, preferivelmente, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou 100% das sequências de aminoácidos de um ou mais das regiões da cadeia estrutural. De acordo com essa modalidade, um aceitador pode conter pelo menos 1, pelo menos 2; pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, ou pelo menos 10 resíduos de aminoácidos que não ocorre(m) numa ou mais posições específicas de um anticorpo humano. Uma região de cadeia estrutural aceitadora e/ou região(s) constante aceitadora pode ser, por exemplo, derivada ou obtida a partir de um gene anticorpo de linhagem germinativa, um gene de anticorpo maduro, um anticorpo funcional (por exemplo, anticorpos bem conhecidos na arte, anticorpos em desenvolvimento, ou anticorpos comercialmente disponíveis).

[0069]Como usado aqui, aqui, o termo “CDR” se refere a uma região determinante de complementaridade contida nas sequências variáveis do anticorpo. Existem três CDRs em cada uma das regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve, que são designadas CDR1, CDR2 e CDR3, para cada uma das regiões variáveis. O termo “conjunto CDR” como usado aqui se refere a um grupo de três CDRs que ocorrem numa única região variável capaz de se ligar ao antígeno. Os exatos limites desses CDRs têm sido definidos diferentemente de acordo com os diferentes sistemas. O sistema descrito por Kabat (Kabat et al., Sequências de proteínas of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) e (1991)) não apenas proporciona um sistema de numeração não ambíguo de resíduo aplicável a qualquer região variável de um anticorpo, mas também proporciona limites precisos do resíduo que define os três CDRs. Esses CDRs pode ser referido como CDRs de Kabat CDRs. Chothia e colaboradores (Chothia &Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987) e Chothia et al., Nature 342: 877-883 (1989)) descobriram que certas sub-porções nos CDRs de Kabat adotam conformações da cadeia estrutural peptídeo quase idênticas, a despeito de possuírem maior diversidade ao nível da sequência aminoácido. Essas sub-porções foram designadas como L1, L2 e L3 ou H1, H2 e H3 onde o L” e o “H” designa as regiões de cadeia leve e as regiões de cadeia pesada, respectivamente. Essas regiões podem ser referidas como Chothia CDRs, que possuem limites que se sobrepões com os Kabat CDRs. Outros limites que definem CDRs que se sobrepõem com os Kabat CDRs foram descritos por Ptfdlan (FASEB J. 9: 133-139 (1995)) e MacCallum (J Mol Biol 262(5): 732-45 (1996)). Ainda outras definições dos limites CDR podem não seguir estritamente um dos sistemas acima, mas irão não obstante se sobrepor com os CDRs de Kabat, embora eles possam ser encurtados ou ampliados à luz da predição ou das descobertas experimentais de que resíduos ou grupos de resíduos particulares ou ainda CDRs inteiros não impactam significativamente a ligação ao antígeno. Os métodos usados aqui podem utilizar os CDRs usados de acordo com desses sistemas, embora as modalidades preferidas usem CDRs definidos por Kabat ou Chothia.

[0070]Como usado aqui, o termo resíduo “canônico” se refere a um resíduo em um CDR ou cadeia estrutural que define uma estrutura canônica CDR particular como definido por Chothia et al. (J. Mol. Biol. 196: 901-907 (1987); Chothia et al., J. Mol. Biol. 227: 799 (1992), ambos são aqui incorporados por referência). De acordo com Chothia et al., porções críticas dos CDRs de muitos anticorpos s possuem confirmações de cadeia estrutural peptídeo quase idênticas a despeito da grande diversidade ao nível da sequência aminoácido. Cada estrutura canônica especifica primariamente um conjunto de ângulos de torsão da cadeia estrutural peptídeo para um segmento adjacente formando um laço.

[0071]Como usado aqui, o termos “doador” e “anticorpo doador” se refere a um anticorpo que proporciona um ou mais CDRs. Em uma modalidade preferida, o anticorpo doador é um anticorpo proveniente de uma espécie diferente do anticorpo a partir do qual as regiões da cadeia estrutural são obtidas ou derivadas. No contexto de um anticorpo humanizado, o termo “anticorpo doador” se refere a um não anticorpo humano que proporciona um ou mais CDRs.

[0072]Como usado aqui, o termo “cadeia estrutural” ou “sequência da cadeia estrutural” se refere às sequências remanescentes da região variável menos os CDRs. Devido à definição exata de uma sequência CDR poder ser determinada através de sistemas diferentes, o significado de uma sequência da cadeia estrutural é submetida às correspondentes diferentes interpretações. Os seis CDRs (CDR-L1, CDR-L2, e CDR-L3 de cadeia leve e CDR-Hl, CDR-H2, e CDR-H3 de cadeia pesada) também dividem as regiões da cadeia estrutural na cadeia leve e na cadeia pesada em quatro sub-regiões (FR1, FR2, FR3 e FR4) em cada cadeia, em que CDR1 está posicionado entre FR1 e FR2, CDR2 entre FR2 e FR3, e CDR3 entre FR3 e FR4. Sem especificar as particulares sub-regiões como FR1, FR2, FR3 ou FR4, a região da cadeia estrutural, como referido por outros, representa as combinadas FR's contidas na região variável de uma única, cadeia imunoglobulina naturalmente ocorrente. Como usado aqui, uma FR representa duas ou mais das quatro sub-regiões, e as FRs representam duas ou mais das quatro sub-regiões que constituem uma região da cadeia estrutural.

[0073]Sequências aceitadoras humanas de cadeia pesada e de cadeia leve são conhecidas na arte. Em uma modalidade da invenção as sequências aceitadoras humanas de cadeia pesada e de cadeia leve são selecionadas a partir das sequências descritas na Tabela 3 e Tabela 4. Tabela 3: Sequências aceitadoras de cadeia pesada

TABELA 4: Sequências aceitadoras de cadeia leve

[0074]Como usado aqui, o termo “gene de anticorpo de linhas genéticas” ou “fragmento genético” se refere a uma sequência imunoglobulina codificada por células não linfóides que não experimentaram processo de maturação que leva ao rearranjo genético e mutação para a expressão de uma imunoglobulina particular. (Ver, por exemplo, Shapiro et al., Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200 (2002); Marchalonis et al., Adv Exp Med Biol. 484: 13-30 (2001)). Uma das vantagens providas pelas diversas modalidades da presente invenção deriva do reconhecimento que os genes de anticorpos de linhas genéticas são mais prováveis que genes de anticorpos maduros a conservar as essenciais estruturas da sequência aminoácido características dos indivíduos nas espécies, portanto menos passíveis de serem identificadas como uma fonte estranha quando usado terapeuticamente naquela espécie.

[0075]Como usado aqui, o termo resíduos “chaves” se refere a certos resíduos dentro da região variável que possuem mais impacto sobre a especificidade e/ou afinidade de ligação de um anticorpo, em particular um anticorpo humanizado. Um resíduo chave inclui, mas não está limitado a, um ou mais dos seguintes: um resíduo que é adjacente a um CDR, um potencial sítio de glicosilação (pode ser um sítio de glicosilação N- ou O-), um resíduo raro, um resíduo capaz de interagir com o antígeno, um resíduo capaz de interagir com um CDR, um resíduo canônico, um resíduo de contato entre a região variável de cadeia pesada e região variável de cadeia leve, um resíduo contido na zona de Vernier, e um resíduo na região que se sobrepõe entre a definição de Chothia de um CDR1 de cadeia pesada variável e a definição de Kabat da primeira cadeia estrutural de cadeia pesada.

[0076]Como usado aqui, o termo “anticorpo humanizado” é um anticorpo ou uma variante, derivado, análogo ou fragmento desses mencionados que imunoespecificamente se liga a um antígeno de interesse e que compreende uma região da cadeia estrutural (FR) que possui substancialmente a sequência aminoácido de um anticorpo humano e a região determinante de complementaridade (CDR) possuindo substancialmente a sequência aminoácido de um anticorpo não humano. Como usado aqui, o termo “substancialmente” no contexto de um CDR refere a um CDR que possui uma sequência aminoácido pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência aminoácido de um CDR de anticorpo não humano. Um anticorpo humanizado compreende substancialmente a totalidade de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis (Fab, Fab', F(ab') 2, FabC, Fv) em que a totalidade ou substancialmente a totalidade das regiões de CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana (isto é, anticorpo doador) e a totalidade ou substancialmente a totalidade das regiões da cadeia estrutural são aquelas de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. Preferivelmente, um anticorpo humanizado também compreende pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado contém ambos a cadeia leve bem como pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada. O anticorpo também podem incluir as regiões CH1, articulação, CH2, CH3, e CH4 da cadeia pesada. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado apenas contém uma cadeia leve humanizada. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado somente contém uma cadeia pesada humanizada. Em modalidades específicas, um anticorpo humanizado somente contém um domínio variável humanizado de uma cadeia leve e/ou cadeia pesada humanizada.

[0077]O anticorpo humanizado pode ser selecionado a partir de qualquer classe de imunoglobulinas, incluindo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, e qualquer isotipo, incluindo sem limitação IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. O anticorpo humanizado pode compreender sequências de mais que uma classe ou isotipo, e domínios constantes particulares podem ser selecionados para otimizar as desejadas funções efetoras usando técnicas bem conhecidas na arte.

[0078]A cadeia estrutural e regiões CDR de um anticorpo humanizado não necessitam corresponder precisamente às sequências parentais, por exemplo, o CDR do anticorpo doador ou a cadeia estrutural de consenso pode ser mutagenizada pela substituição, inserção e/ou apagamento de pelo menos um resíduo aminoácido tal que o CDR ou resíduo da cadeia estrutural naquele sítio não corresponda a um ou outro do anticorpo doador ou a cadeia estrutural de consenso. Em uma modalidade preferida, tais mutações, todavia, não serão extensivas. Usualmente, pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, e muito preferivelmente pelo menos 95% do anticorpo humanizado resíduos irão corresponder àqueles da FR parental e sequências de CDR. Como usado aqui, o termo “cadeia estrutural de consenso” se refere à região da cadeia estrutural na sequência de consenso imunoglobulina de consenso. Como usado aqui, o termo “sequência imunoglobulina de consenso” se refere à sequência formada a partir dos aminoácidos mais frequentemente ocorrentes (ou nucleotídios) numa família de sequências imunoglobulinas correlatas (Ver por exemplo, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987). Numa família de imunoglobulinas, cada posição na sequência de consenso está ocupada pelo aminoácido muito mais frequentemente ocorrente naquela posição na família. Se dois aminoácidos ocorrem de modo igualmente freqüente, um ou outro pode ser incluso na sequência de consenso.

[0079]Como usado aqui, zona de “Vernier” se refere a um subconjunto de resíduos da cadeia estrutural que possam se ajustar na estrutura do CDR e se ajustar de modo preciso ao antígeno como descrito por Foote e Winter (1992, J. Mol. Biol. 224: 487-499, que é aqui incorporado por referência). Resíduos da zona de Vernier formam uma camada subjacente dos CDRs e podem impactar sobre a estrutura dos CDRs e a afinidade do anticorpo.

[0080]O termo “proteína de ligação multivalente” é usada nessa especificação para denotar uma proteína de ligação compreendendo dois ou mais sítios antígeno-ligantes. A proteína de ligação multivalente é preferivelmente produzida para possuir os três ou mais sítios antígeno-ligantes, e é geralmente um anti não naturalmente ocorrente. O termo “proteína de ligação multiespecífica” se refere a uma proteína de ligação capaz de se ligar a dois ou mais alvos correlatos ou não correlatos. Proteínas ligantes de domínios variáveis dual (DVD) como usado aqui, são proteínas ligantes que compreendem dois ou mais sítios antígeno-ligantes e são proteínas ligantes tetravalentes ou multivalentes. Tais DVDs podem ser monoespecíficas, isto é, capazes de se ligar a um antígeno ou multispecíficas, isto é, capazes de se ligar a dois ou mais antígenos. Proteínas ligantes DVD compreendendo dois polipeptídios DVD de cadeia pesada e dois polipeptídios DVD de cadeia leve são referidas como uma Ig DVD. Cada metade de uma Ig DVD compreende um polipeptídio DVD de cadeia pesada, e um polipeptídio DVD de cadeia leve, e dois sítios antígeno-ligantes. Cada sítio ligante compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve com um total de 6 CDRs envolvidos no antígeno-ligante por sítio antígeno-ligante.

[0081]Como usado aqui, o termo “neutralização” se refere a neutralização da atividade biológica de uma citocina quando a proteína de ligação se liga especificamente à citocina. Preferivelmente a proteína de ligação de neutralização é um anticorpo neutralizante cuja ligação a hIL-13 e/ou hIL-13 resulta na inibição da atividade biológica da hIL-13 e/ou hIL-13. Preferivelmente a proteína de ligação de neutralização se liga a hIL-13 e/ou hIL-13 e reduz uma atividade biológica da IL-13 e/ou hIL-13 em pelo menos cerca de 20%, 40%, 60%, 80%, 85% ou mais. A inibição da atividade biológica da hIL-13 e/ou hIL-13 pela proteína de ligação de neutralização pode ser avaliada mediante medir um ou mais indicadores da atividade biológica da IL-13 e/ou hIL-13 bem conhecida na arte. Por exemplo inibição da IL-13 humana induziu a produção de TARC (CCL-17) pelas células A-549 (ver Exemplo l.l.C).

[0082]O termo “atividade” inclui atividades tal como a especificidade/ afinidade ligante de um anticorpo quanto a um antígeno, por exemplo, um anticorpo anti-hIL-13 que se liga a um antígeno IL-13 e/ou a potência de neutralização de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo anti-hIL-13 cuja ligação a hIL-13 inibe a atividade biológica da hIL-13, por exemplo, a produção de TARC (Cálculo-17) induzida por IL-13 humana por células A-549 (ver Exemplo l.l.C).

[0083]O termo “epitopo” inclui qualquer determinante polipeptídeo capaz de ligação específica a uma imunoglobulina ou receptor de célula-T. Em certas modalidades, determinantes epitopo incluem agrupamentos de superfície quimicamente ativos tal como aminoácidos, cadeias laterais açúcar, fosforila, ou sulfonila, e em certas modalidades, podem ter características estruturais tridimensionais específicas, e/ou características específicas de carga. Um epitopo é uma região de um antígeno que está ligada por um anticorpo. Em certas modalidades, um anticorpo é dito especificamente se ligar a um antígeno quando ele preferivelmente reconhece seu antígeno alvo numa mistura complexa de proteínas e/ou macromoléculas.

[0084]O termo “ressonância plásmon de superfície”, como usado aqui, se refere a um fenômeno ótico que permite a análise de interações bioespecíficas em tempo real mediante a detecção ou alterações nas concentrações protéicas dentro de uma matriz biosensora, por exemplo usando o sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden e Piscataway, NJ). For further descriptions, ver Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51.: 19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotécnicas 11: 620-627; Johnsson, B., et al (1995) J. Mol. Recognit. 8: 125-131; e Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198: 268-277.

[0085]O termo “ Icon”, como usado aqui, é pretendido referir à constante de associação para a associação de um anticorpo ao antígeno para formar o complexo anticorpo/antígeno como é conhecido na arte. O termo “ koff”, como usado aqui, é pretendido referir à constante de dissociação para a dissociação de um anticorpo a partir do complexo anticorpo/antígeno como é conhecido na arte.

[0086]O termo “KD”, como usado aqui, é pretendido referir à constante de dissociação de uma particular interação anticorpo-antígeno, como é bem conhecido na arte.

[0087]O termo “proteína de ligação marcada” como usado aqui, se refere a uma proteína com uma etiqueta incorporada que proporciona a identificação da proteína de ligação. Preferivelmente, a etiqueta é um marcador detectável, por exemplo, a incorporação de um aminoácido rádio-marcado ou anexação a um polipeptídio de frações biotinila que pode ser detectado por uma avidina marcada (por exemplo, streptavidina contendo um marcador fluorescente ou atividade enzimática que pode ser detectada através de métodos óticos ou colorimétricos). Exemplos de etiquetas para polipeptídios incluem, mas não estão limitados a, os seguintes: radioisótopos ou radionuclídeos (por exemplo, 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho, ou 153Sm); etiquetas fluorescentes (por exemplo, FTTC, ródioaminas, lantnidas fosforescentes), etiquetas enzimáticas (por exemplo, horseradish peroxidase, luciferase, fosfatase alcalina); marcadores quimioluminescentes; grupos biotinila; epitopos polipeptídio predeterminados reconhecidos por um mensageiro secundário (por exemplo, sequências pares ziper leucina, leucine zipper pair sequências, sítios ligantes para anticorpos secundários, domínios ligantes metálicos, etiquetas epitopo); e agentes magnéticos, tal como quelatos de gadolínio.

[0088]O termo “conjugado anticorpo” se refere a uma proteína de ligação, tal como um anticorpo, quimicamente ligado a uma segunda fração química, tal como um agente terapêutico ou citotóxico. O termo “agente” é usado aqui para denotar um composto químico, uma mistura de compostos químicos, uma macromolécula biológica, ou um extrato produzido a partir de materiais biológicos. Preferivelmente os agentes terapêuticos ou citotóxicos incluem, mas não estão limitados a, toxina da coqueluche, taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, diidroxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1- deidrotestosterona, glucocorticóides, protaína, tetracaína, lidocaína, propanolol, e puromicina e seus análogos ou homólogos. O termos “cristal”, e “cristalizado” como usado aqui, se refere a um anticorpo, ou sua parte antígeno-ligante, que existe na forma de um cristal. Os cristais são uma forma do estado sólido da matéria, que é distinta das outras formas tal como o estado sólido amorfo ou o estado cristalino líquido. Os cristaos são compostos de arranjos regulares, repetitivos, tridimensionais de átomos, íons, moléculas (por exemplo, proteínas tal comos anticorpos), ou montagens moleculares (por exemplo, complexos antígeno/anticorpo). Esses arranjos tridimensionais são dispostos de acordo com relações matemáticas específicas que são bem entendidas no âmbito. A unidade fundamental, ou bloco de construção, que é repetido em um cristal é chamada unidade assimétrica. A repetição da unidade assimétrica em um arranjo que se conforma a uma dada simetria cristalográfica bem definida proporciona a “célula unitária” do cristal. A repeticao da célula unitária através de translações regulares em todas as três dimensoes proporciona o cristal. Ver Giege, R. e Ducruix, A. Barrett, Cristalização of Ácidos nucleicos e Proteins, a Practical Approach, 2nd ea., pp. 20 1-16, Oxford University Press, New York, New York, (1999).”

[0089]O termo “polinucleotídeo” como referido aqui significa uma forma polimérica de dois ou mais nucleotídios, ou ribonucleotídios ou desoxinucleotídios ou uma forma modificada proveniente de um ou outro tipo de nucleotídeo. O termo inclui formas de fitas simples e duplas de DNAS mas pfr é DNA de dupla fita.

[0090]O termo “polinucleotídeo isolado” como usado aqui deverá significar um polinucleotídeo (por exemplo, de origem genômica, cDNA, ou origem sintética, ou alguma combinação desses mencionados), que, em virtude de sua origem, o polinucleotídeo isolado: não está associado com a totalidade ou uma parte de um polinucleotídeo com o qual o “polinucleotídeo isolado” é encontrado na natureza; está operativamente ligado a um polinucleotídeo que não está ligado a ele na natureza; ou não ocorre na natureza como parte de uma sequência maior.

[0091]O termo “vetor” como usado aqui, é pretendido referir a uma molécula ácido nucleico capaz de transportar um outro ácido nucleico ao qual ela tenha sido ligada. Um tipo de vetor é um “plasmídeo”, que se refere a um laço DNA circular de fita dupla no qual segmentos adicionais de DNA podem ser ligados. Um outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma numa célula hospedeira para dentro da qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos que possuem uma origem bacteriana de vetores mamíferos de replicação e epissomal). Outros vetores (por exemplo, vetores mamíferos não epissomais) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira quando da introdução na célula hospedeira, e desse modo são replicados juntamente com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionarem a expressão de genes aos quais eles estejam operativamente ligados. Tais vetores são referidos aqui como “vetores de expressão recombinantes” (ou simplesmente, “vetores de expressão”). No geral vetores de expressão de utilidade nas técnicas DNA recombinantes estão frequentemente na forma de plasmídeos. Na presente especificação, “plasmídeo” e “vetor” pode ser usado de modo intercambiável na medida que o plasmídeo é a forma muito mais comumente usada do vetor. Todavia, a invenção é pretendida a incluir tais outras formas de vetores de expressão, tal como vetores virais (por exemplo, retrovírus, adenovírus de replicação defeituosa e vírus adeno-associados), os quais servem como funções equivalentes.

[0092]O termo “operativamente ligado” se refere a uma justaposição em que os componentes descritos estão em um relacionamento que permite a eles funcionar em seus modos pretendidos. Uma sequência controle “operativamente ligada” a uma sequência codificadora está ligada em um modo que a expressão da sequência codificadora é conseguido sob condições compatíveis com as sequências controle. Sequências “Operativamente ligadas” incluem ambas expressões sequências controle que são contíguas com o gene de interesse e sequências controle da expressão que atuam em trans ou numa distância para controlar o gene de interesse. O termo terest. O termo “sequência controle da expressão” como usado aqui se refere a sequências polinucleotídeo que são necessárias para efetuar a expressão e o processamento de sequências codificadoras às quais elas estejam ligadas. As ed. As sequências controle da expressão incluem apropriadas sequências de iniciação, terminação, promotora e melhoradora da transcrição; eficiente sinais de processamento de RNA tal como sinais de enlaçamento e poliadenilação; sequências que estabilizam o mRNA citoplásmico; sequências que melhoram a eficiência da translação (isto é, sequência de consenso de Kozak); sequências que melhoram a estabilidade da proteína; e quando desejado, sequências que melhoram a secreção da proteína. A natureza de tais sequências controle difere dependendo do organismoo hospedeiro; em procariotes, tais sequências controle geralmente incluem promotor, sítio ligante ribosomal, e sequência de terminação de transcrição; nos eucariotes, geralmente tais sequências controle incluem promotores e sequência de terminação da transcrição. O termo “sequências controle” é pretendido a incluir componentes cuja presença é essencial para a expressão e processamento, e pode também incluir componentes adicionais cuja presença é vantajosa, por exemplo, sequência condutoras e sequências parceiras de fusão. Construtos protéicos da presente invenção podem ser expressos, e purificados usando vetores de expressão e células hospedeiras conhecidas na arte, incluindo cassets de expressão, vetores, células hospedeiras recombinantes e métodos para a expressão recombinante e processamento proteolítico das poliproteínas e pré-proteínas recombinantes a partir de um único quadro aberto de leitura (por exemplo, WO 2007/014162 aqui incorporado por referência).

[0093]“Transformação”, como definido aqui, se refere a qualquer processo pelo qual DNA exógeno adentra numa célula hospedeira. Transformação pode ocorrer sob condições naturais ou artificiais usando diversos métodos bem conhecidos na arte. Transformação pode se basear em qualquer método conhecido na arte para a inserção de sequências de ácidos nucleicos estranhas numa célula hospedeira procariótica ou eucariótica. O método é selecionado com base numa célula hospedeira que é transformada e pode incluir, mas não está limitado a, infecção viral, eletroporação, lipofecção, e bombardeamento por partícula. Tais células “transformadas” incluem células transformadas de modo estável em que o DNA inserido é capaz de replicação ou como um plasmídeo antonomamente replicante ou como parte do cromossomo hospedeiro. Elas também incluem células que expressao de modo transiente o DNA ou RNA inseridos por períodos limitados de tempo.

[0094]O termo “célula hospedeira recombinante” (ou simplesmente “célula hospedeira”), como usado aqui, é pretendido referir a uma célula para dentro da qual DNA exógeno foi introduzido. Deverá ser entendido que tais termos são pretendidos referir não apenas à célula particular em questão, mas, à progenia de uma tal célula. Pelo fato de que certas modificações podem ocorrer em sucessivas gerações devido a uma ou outra de mutação ou influências ambientais, tal progenia pode, de fato, não ser idêntica à da célula geradora, mas estão ainda inclusas no escopo do termo “célula hospedeira” como usado aqui. Preferivelmente células hospedeiras incluem células procarióticas e eucarióticas selecionadas a partir de qualquer dos reinos de vida. Células eucarióticas preferidas incluem células protistas, fúngicas, vegetais e animais. Muito preferivelmente células hospedeiras incluem mas não estão limitadas a, à linhagem de célula procariótica E.Coli; linhagens de células de mamíferos CHO, HEK 293 e COS; a linhagem de células de insetos Sf9; e a célula fúngica Saccharomyces cerevisiae.

[0095]Técnicas padrões podem ser usadas para DNA recombinante, síntese de oligonucleotídios, e cultura e transformação de tecidos (por exemplo, electroporação, lipofecção). Reações enzimáticas e técnicas de purificação podem ser realizadas de acordo com as especificações do fabricante ou como comumente realizado na arte ou como aqui descrito. As técnicas e procedimentos mencionados até o momento podem ser geralmente realizados de acordo com os métodos convencionais bem conhecidos na arte e como descrito em diversas referências gerais e mais específicas que são mencionadas e discutidas no transcurso da presente invenção. Ver por exemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)), que é aqui incorporado por referência para qualquer propósito.

[0096]“Organismoo transgênico”, como conhecido na arte e como usado aqui, se refere a um organismoo que possui células que contêm um transgênico, em que o transgênico introduzido dentro do organismoo (ou um ancestral do he organismo) expressa um polipeptídeonao naturalmente expresso no organismo. Um “transgênico” é um construto DNA, que é integrado de modo estável e operativo no genoma de uma célula a partir do que um organismo transgênico se desenvolve, direcionando a expressão de um produto geneticamente codificado em um ou mais tipos de célula ou tecidos do organismo transgênico.

[0097]O termo “regular”e “modular” são usados de modo intercambiável, e, como usado aqui, se refere a uma medição ou alteração na atividade de uma molécula de interesse (por exemplo, a atividade biológica da hIL-13). A modulação pode ser um aumento ou uma diminuição na magnitude de uma certa atividade ou função da molécula de interesse. Atividades e funções representativas de uma molécula incluem, mas não estão limitados a, características ligantes, atividade enzimática, ativação de receptor celular, e transdução de sinal.

[0098]Correspondentemente, o termo “modulador,” como usado aqui, é um composto capaz de mudar ou alterar uma atividade ou função de uma molécula de interesse (por exemplo, a atividade biológica da hIL-13). Por exemplo, um modulador pode induzir um aumento ou diminuição na magnitude de uma certa atividade ou função de uma molécula comparada com a magnitude de uma atividade ou função observada na ausência do modulador. Em certas modalidades, um modulador é um inibidor, que diminui a magnitude de pelo menos um atividade ou função de uma molécula. Inibidores representativos incluem, mas não estão limitados a, proteínas, peptídios, anticorpos, pepticorpos, carboidratos ou moléculas pequenas orgânicas. Os pepticorpos são descritos, por exemplo, em WO01/83525.

[0099]O termo “agonista”, como usado aqui, se refere a um modulador que, quando contatado com a molécula de interesse, induz um aumento na magnitude de uma certa atividade ou função da molécula comparada com a magnitude de uma atividade ou função observada em ausência do agonista. Agonistas particulares de interesse de interesse podem incluir, mas não estão limitados a, polipeptídios IL-13 ou polipeptídios, ácidos nucleicos, carboidratos, ou qualquer outras moléculas que se ligam a hIL-13.

[00100]O termo “antagonista” ou “inibidor”, como usado aqui, se refere a um modulador que, quando contatado com a molécula de interesse causes uma diminuição na magnitude de uma certa atividade ou função da molécula comparado com a magnitude de uma atividade ou função observada em ausência do antagonista. Particular antagonistas de interesse incluem aqueles que bloqueiam ou modulam a atividade biológica ou imunológica da hIL-13 e/ou hIL-13. Antagonistas e inibidores de hIL-13 e/ou hIL-13 podem incluir, mas não estão limitados a, proteínas, ácidos nucleicos, carboidratos, ou qualquer outras moléculas, que se ligam a WL- 13 e/ou hIL-13. O termo “inibem a ligação ao receptor” se refere a capacidade da proteína de ligação em impedir a ligação da IL-13 a um ou mais de seus receptores. Tal inibição da ligação ao receptor pode resultar numa diminuição ou abolição da atividade biológica mediada pela ligação da IL-13 ao seu receptor ou receptores.

[00101]Como usado aqui, o termo “quantidade eficaz” se refere à quantidade de uma terapia que seja suficiente para reduzir ou melhorar a gravidade e/ou duração de um distúrbio ou um ou mais sintomas dele, impedir o avanço de um distúrbio, induzir regressão de um distúrbio, impedir a recorrência, desenvolvimento, início ou progressão de um ou mais sintomas associados com um distúrbio, detectar um distúrbio, ou melhorar ou aprimorar o efeito profilático ou terapêutico de uma outra terapia (por exemplo , agente profilático ou agente terapêutico). O termo “amostra”, como usado aqui, é usado em um sentido amplo. Uma “amostra biológica”, como usado aqui, inclui, mas não se limita a, qualquer quantidade de uma substância proveniente de ser vivo ou ser anteriormente vivo. Tais seres vivos incluem, mas não estão limitados a, humanos, camundongo, ratos, macacos, cães, coelhos e outros animais. Tais substâncias incluem, mas não estão limitados a, sangue, soro, urina, fluido sinovial, células, órgãos, tecidos, medula óssea, nodos linfáticos, e baço.

I. Anticorpos que se ligam a IL-13 humana.

[00102]Um aspecto da presente invenção proporciona anticorpos monoclonais murinos isolados, ou suas partes antígeno-ligante, que se ligam a IL-13 com alta afinidade, uma baixa taxa de inatividade e alta capacidade neutralizante. Um segundo aspecto da invenção proporciona anticorpos quiméricos que se ligam a IL-13. Um terceiro aspecto da invenção proporciona anticorpos humanizados, ou suas partes antígeno-ligantes, que se ligam a IL-13. Preferivelmente, os anticorpos, ou suas partes, são anticorpos isolados. Preferivelmente, os anticorpos da invenção são anticorpos anti-IL-13 neutralizantes e/ou anti-IL-13 humanos.

A. Método de produzir anticorpos anti-IL-13.

[00103]Os anticorpos da presente invenção podem ser produzidos mediante qualquer de um número de técnicas conhecidas na arte.

1. Anticorpos monoclonais anti-IL-13 usando tecnologia Hibridoma

[00104] Anticorpos monoclonais podem ser preparados usando uma ampla variedade de técnicas conhecidas na arte incluindo o uso detecnologia hibridoma, recombinante, e exibição fago, ou uma combinação desses mencionados. Por exemplo, anticorpos monoclonais podem ser produzidos usando técnicas hibridoma incluindo aquelas conhecidas na arte e orientadas, por exemplo, em Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Gold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); w ,• Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies e T-CeIl Hibridomas 563681 (Elsevier, N.Y., 1981) (as referidas referências incorporadas aqui em suas totalidades). O termo “anticorpo monoclonal” como usado aqui não está limitado aos anticorpos produced através de through tecnologia hibridoma. O termo “anticorpo monoclonal” se refere a um anticorpo que é derivado a partir de um único clone, incluindo qualquer clone eucariótico, procariótico, ou fago, e não ao método por meio do qual ele é produzido. Métodos para produzir e classificar anticorpos específicos usando tecnologia hibridoma são rotineiros e bem conhecidos na arte. Em uma modalidade, a presente invenção proporciona métodos de gerar anticorpos monoclonais bem como anticorpos produzidos através do método compreendendo cultivar uma célula hibridoma que secrete um anticorpo da invenção em que, preferivelmente, o hibridoma é gerado mediante fundir esplenócitos isolados a partir de um rato immunizado com um antígeno da invenção com células mieloma e em seguida classificar os hibridomas resultantes da fusão quanto a clones hibridoma que secretem um anticorpo capaz de se ligar a um polipeptídeo da invenção (Ver Exemplo 1.2). Em resumo, os ratos podem ser imunizados com um antígeno IL-13. Em uma modalidade preferida, o antígeno IL-13 é administrado com um adjuvante para estimular a imuno-resposta. Tais adjuvantes incluem adjuvante de Freund completo ou incompleto, RIBI (dipeptídeos muramila) ou ISCOM (complexos de imunoestimulação). Tais adjuvantes podem proteger o polipeptídeo da rápida dispersão mediante sequestra-lo em um depósito local, ou eles podem conter substâncias que estimulem o hospedeiro a secretar fatores que sejam quimiotáticos para os macrófagos e outros componentes do sistema imuno. Preferivelmente, se um polipeptídeo está sendo administrado, a programação de imunização irá envolver duas ou mais administrações do polipeptídeo, dispersas durante várias semanas.

[00105]Após a imunização de um animal com um antígeno IL-13, anticorpos e/ou células produtoras de anticorpos podem ser obtidos do animal. Um soro contendo anticorpo anti-IL-13-é obtido do animal mediante sangria ou sacrifício do animal. O soro pode ser usado como ele é obtido do animal, uma fração imunoglobulina pode ser obtida do soro, ou os anticorpos anti-IL-13 podem ser purificados a partir do soro. O soro ou imunoglobulinas obtidas desse modo são policlonais, possuindo assim um arranjo heterogêneo de propriedades.

[00106]Uma vez a imuno-resposta seja detectada, por exemplo, anticorpos specíficos para o antígeno IL-13 são detectados no soro do rato, o baço do rato é colhido e os esplenócitos isolados. Os esplenócitos são então fundidos através de técnicas bem conhecidas a quaisquer células mieloma adequadas, por exemplo, células da linhagem celular SP20 disponível da ATCC. Os hibridomas são selecionados e clonados através de diluição limitada. Os clones hibridoma são então testados através de métodos métodos conhecidas na arte para células que secretem anticorpos capazes de se ligar a IL-13. Fluidos ascitos que geralmente contêm altos níveis de anticorpos, podem ser gerados mediante imunizar ratos com clones hibridoma positivos.

[00107]Em uma outra modalidade, hibridomas imortalizados produtores de anticorpos podem ser preparados a partir dos animais imunizados. Após imunização, o animal é sacrificado e as células B esplênicas são fundidas a células mieloma imortalizadas como é bem conhecido na arte. Ver, por exemplo, Harlow e Lane, supra. Em uma modalidade preferida, as células mieloma não secretam polipeptídios imunoglobulina (uma linhagem de células não-secretantes). Após fusão e seleção antibiótica, os hibridomas são classificados usando IL-13, ou uma sua porção, ou uma célula expressando IL-13. Em uma modalidade preferida, a classificação inicial é realizada usando um imunoensaio vinculado a enzima (ELISA) ou um radioimunoensaio (RIA), preferivelmente um ELISA. Um exemplo de classificação por ELISA é provido em WO 00/37504, aqui incorporado por referência.

[00108]Hibridomas produtores de anticorpo anti-IL-13 são selecionados, clonados e adicionalmente classificado quanto às características desejáveis, que incluem crescimento robusto de hibridoma, alta produção de anticorpo e desejáveis características de anticorpo, como discutido mais adiante. Os hibridomas podem ser cultivados e expandidos in vivo em animais singeneicos, em animais carentes de um sistema imuno, por exemplo, ratos pelados, ou em cultura celular in vitro. Métodos de selecionar, clonar e expandir hibridomas são bem conhecidos por aqueles usualmente versados na técnica.

[00109]Numa modalidade preferida, os hibridomas são hibridomas de rato, como descrito acima. Numa outra modalidade preferida, os hibridomas são produzidos em espécies não humana, não camundongos, tal como ratos, ovinos, porcos, caoprinos, bovinos, ou equinos. Em uma outra modalidade, os hibridomas são hibridomas humanos, em que um mieloma humano não secretório é fundido com um célula humana que expressa um anticorpo anti-IL-13.

[00110]Fragmentos anticorpo que reconhecem epitopos específicos podem ser gerados através de técnicas conhecidas. Por exemplo, fragmentos Fab e F(ab')2 da invenção podem ser produzidos mediante clivagem proteolítica de moléculas imunoglobulinas, usando enzimas tal como papaína (para produzir fragmentos Fab) ou pepsina (para produzir fragmentos F(ab')2). Os fragmentos F(ab')2 contêm a região variável, uma região constante de cadeia leve e o CHI domínio da cadeia pesada.

2. Anti-IL-13 anticorpos monoclonais usando SLAM

[00111]Num outro aspecto da invenção, anticorpos recombinantes são gerados a partir de linfócitos simples, isolados, usando um procedimento referido na arte como método anticorpo linfócito selecionado (SLAM), como descrito em Patente U.S. No.. 5.627.052, Publicação PCT WO 92/02551 e Babcock, J.S. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. ScL USA 93: 7843-7848. Nesse método, células simples que secretam anticorpos de interesse, por exemplo, linfócitos derivados de qualquer um dos animais imunizados descritos na Seção 1, são classificados usando um ensaio placa hemolítica antígeno-specifico, em que o antígeno IL-13, uma subunidade da IL-13, ou um seu fragmento, é acoplado a células vermelhas de ovino, usando um ligador, tal como biotina, e usada para identificar cesls simples que secretem anticorpos com especificidade para IL-13. Em seguida da identificação das células secretantes de anticorpo de interesse, cDNAS da região variável de cadeia pesada e cadeia leve são resgatadas das células por transcriptase reversa-PCR e essas regiões variáveis podem ser expressas, no contexto das apropriadas regiões constantes de imunoglobulina (por exemplo, regiões constantes humanas), em células hospedeiras de mamíferos, tal como células de COS ou de CHO. A células hospedeiras transfectadas com as sequências imunoglobulinas ampliadas, derivadas de linfócitos selecionados in vivo podem então experimentar adicional análise e seleção in vitro, por exemplo, mediante cozimento das células transfectadas para isolar as células que expressam anticorpos para IL-13. As sequências imunoglobulinas ampliadas também podem ser manipuladas in vitro, tal como mediante métodos de maturação por afinidade in vitro tal como aqueles descritos na Publicação PCT WO 97/29131 e Publicação PCT WO 00/56772.

3. Anticorpos monoclonais anti-IL-13 usando animais transgênicos.

[00112]Em uma outra modalidade da presente invenção, os anticorpos são produzidos mediante imunizar um animal não humano compreendendo parte, ou a totalidade, do local da imunoglobulina humana com um antígeno IL-13. Em uma modalidade preferida, o animal não humano é um camundongo transgênico XENOMOUSE, uma linhagem de camundongo produzido por engenharia que compreende grandes fragmentos do local de imunoglobulina humana e é deficiente na produção de anticorpo de camundongo. Ver, por exemplo, Green et al. Nature Genetics 7: 13-21 (1994) e United States Patents 5,916,771, 5,939,598, 5,985,615, 5,998,209, 6,075,181, 6,091,001, 6,114,598 e 6,130,364. Ver também WO 91/10741, publicado em 25 de julho de 1991, WO 94/02602, publicação em 3 de fevereiro de 1994, WO 96/34096 e WO 96/33735, ambos publicados em 31 de outubro de 1996, WO 98/16654, publicado em 23 de abril de 1998, WO 98/24893, publicado em 11 de junho de 1998, WO 98/50433, publicado em 12 de novembro de 1998, WO 99/45031, publicado em 10 de setembro de 1999, WO 99/53049, publicado em 21 de outubro de 1999, WO 00 09560, publicado em 24 de fevereiro de 2000 e WO 00/037504, publicado em 29 de junho de 2000. O camundongo transgênico XENOMOUSE produz um repertório humano tipo adulto de anticorpos humanos completos, e gera Mabs humanos antígenos-específicos. Os camundongos transgênicos XENOMOUSE contêm aproximadamente 80% do repertorio do anticorpo humano através da introdução fragmentos YAC da configuração das linhas genéticas, megabase dimensionadas, dos locais da cadeia pesada x local de cadeia leve humanas. Ver Mendez et al., Nature Genetics 15: 146-156 (1997), Green e Jakobovits J. Exp. Med. 188: 483-495 (1998), as revelações da quais são aqui incorporadas por referência.

4. Anti-IL-13 anticorpos monoclonais usando bibliotecas de anticorpo recombinante

[00113]Métodos in vitro também podem ser usados para produzir os anticorpos da invenção, em que uma biblioteca do anticorpo é classificada para identificar um anticorpo que possui a desejada especificidade ligante. Métodos para tal classificação das bibliotecas do anticorpo recombinante são bem conhecidas na arte e incluem métodos descritos em, por exemplo, Ladner et al. Patente U.S. No.. 5,223,409; Kang et al. Publicação PCT No. WO 92/18619; Dower et al. Publicação PCT No. WO 91/17271; Winter et al. Publicação PCT No. WO 92/20791; Markland et al. Publicação PCT No. WO 92/15679; Breitling et al. Publicação PCT No. WO 93/01288; McCafferty et al. Publicação PCT No. WO 92/01047; Garrard et al. Publicação PCT No. WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 13701372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hibridomas 3: 81-85; Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; McCafferty et al, Nature (1990) 348: 552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12: 725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226: 889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89: 35763580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19: 4133-4137; e Barbas et al. (1991) PNAS 88: 7978-7982, Publicação de pedido de patente U.S. 20030186374, e Publicação PCT No. WO 97/29131, os conteúdos de cada um dos quais são aqui incorporados por referência.

[00114]A biblioteca de anticorpo recombinante pode ser proveniente de um indivíduo imunizado com IL-13 ou IL-13, ou uma porção da IL-13 ou IL-13. Alternativamente, a biblioteca de anticorpo recombinante pode ser proveniente de um indivíduo jovem, isto é, um que não tenha sido imunizado com IL-13, tal como uma biblioteca anticorpo humano proveniente de um indivíduo humano que não tenha sido imunizado com IL-13 humana. Anticorpos da invenção são selecionados mediante classificação da biblioteca de anticorpo recombinante com o peptídeo compreendendo IL-13 humana para desse modo selecionar aqueles anticorpos que reconhecem a IL-13. Métodos para conduzir tal classificação e seleção são bem conhecidos na arte, tal como descrito nas referências no parágrafo precedente. Para selecionar anticorpos da invenção que possuem particulares afinidades ligantes para hIL-13, tal como aqueles que se dissociam a partir da IL-13 humana com uma particular constante de dissociação koff o conhecido método de ressonância plásmon de superfície pode ser usado para selecionar anticorpos que possuem a desejada constante de dissociação koff. Para selecionar anticorpos da invenção que possuam uma particular atividade neutralizante para hIL-13, tal como aquelas com um particular IC50, métodos padrões conhecidos na arte para avaliar a inibição da atividade da hIL-13 podem ser usados.

[00115]Em um aspecto, a invenção está relacionada a um anticorpo isolado, ou uma sua parte antígeno-ligante, que se liga a IL-13 humana. Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo neutralizante. Em diversas modalidades, o anticorpo é um anticorpo recombinante ou um anticorpo monoclonal.

[00116]Por exemplo, os anticorpos da presente invenção podem ser também gerados usando diversos métodos de exibição fago conhecidos na arte. Nos métodos de apresentação fago, os domínios funcionais do anticorpo se apresentam na superfície das partículas fago que conduzem as sequências polinucleotídeo que as codificam. Numa situação particular, tal fago pode ser utilizado para exibir domínios antígeno-ligantes expressos a partir de um repertório ou biblioteca combinatorial de anticorpos (por ex., humana ou murina). Fago que expresa um domínio antígeno-ligante que se liga ao antígeno de interesse pode ser selecionado ou identificado com o antígeno, por exemplo, usando antígeno marcado ou antígeno ligado ou capturado a uma superfície sólida ou microesfera. Fago usado nesses métodos são tipicamente fagos filamentosos que incluem domínios ligantes Fab, Fv ou domínios de anticorpo Fv estabilizado em dissulfito fundidos de modo recombinante a um ou outro do fago gene III ou gene VIII proteína. Exemplos de métodos de exibição fago que podem ser usados para produzir os anticorpos da presente invenção incluem aqueles revelados em Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182: 41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Meghods 184: 177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24: 952-958 (1994); Persic et al., Gene 187 918 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57: 191-280 (1994); Pedido PCT No. PCT/GB91/01134; Publicação PCTs WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; e U.S. Pat. Nos. 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780. 225; 5.658.727; 5.733.743 e 5.969.108; cada um dos quais é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

[00117]Como descrito em the nas referências acima, após a seleção do fago, as regiões codificadoras do anticorpo proveniente do fago podem ser isoladas e usadas para gerar anticorpos integrais incluindo anticorpos humanos ou qualquer outro fragmento antígeno-ligante desejado, e expressos em qualquer hospedeiro desejado, incluindo células de mamíferos, células de insetos,células vegetais, leveduras, e bactérias, por exemplo, como descrito em detalhes adiante. Por exemplo, técnicas para produzir de modo recombinante fragmentos Fab, Fab' e F(ab')2 podem ser também empregadas usando métodos conhecidos na arte tal como aqueles revelados na Publicação PCT WO 92/22324; Mullinax et al., BioTéchniques 12(6): 864-869 (1992); e Sawai et al., AJRI 34: 26-34 (1995); e Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988) (as referidas referências aqui incorporadas em suas totalidades). Exemplos de técnicas que podem ser usadas para produzir Fv de cadeia única e anticorpos incluem aquelas descritas na Patente U.S. No. 4.946.778 e 5.258. 498; Huston et al., Methods in Enzymology 203: 46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90: 7995-7999 (1993); e Skerra et al., Science 240: 1038-1040 (1988).

[00118]Alternativo à classificação das bibliotecas do anticorpo recombinante por exibição fago, outras metodologias conhecidas na arte para classificar grandes bibliotecas combinatoriais podem ser aplicadas para a identificação dos anticorpos de especifidade dual da invenção. Um tipo de sistema de expressão alternativo é um em que a biblioteca de anticorpo recombinante é expressa comofusões RNA- proteína, como descrito na Publicação PCT No. WO 98/31700 de Szostak e Roberts, e em Roberts, R. W. e Szostak, J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. ScL USA 94: 1229712302. Nesse sistema, uma fusão covalente é criada entre um an mRNA e o peptídeo ou proteína que ela codifica por tradução in vitro dos mRNA sintéticos que portam puromicina, um antibiótico aceitador da peptidila, em sua em sua terminação 3’. Desse modo, um mRNA específico pode ser enriquecido a partir de uma mistura complexa de mRNAs (por exemplo, uma biblioteca combinatorial) com base nas propriedades do peptídeo ou proteína codificados, por exemplo, anticorpo, ou parte dele, tal comothereof, tal como a ligação do anticorpo, ou parte dele, ao antígeno de especificidade dual. Sequências de ácido nucleicos que codificam anticorpos, ou partes deles, recuperadas a partir da classificação de tais bibliotecas podem ser expressos através de meios recombinantes como descrito acima (por exemplo, nas células hospedeiras de mamíferos) e, além disso, podem ser submetidos a posterior maturação da afinidade por uma ou outra rodadas adicionais de classificação das fusões mRNA-peptídeo em que as mutações tenham sido introduzidas dentro da(s) sequência(s) originalmente selecionadas, ou através de outros métodos para maturação da afinidade in vitro de anticorpos recombinantes, como descrito anteriormente.

[00119]Numa outra abordagem os anticorpos da presente invenção podem ser também gerados usando métodos de apresentação levedura conhecidos na arte. Nos métodos de apresentação levedura, métodos genéticos são usados para amarrar os domínios do anticorpo às paredes da célula de levedura e exibilos na superfície da levedura. Em particular, tal levedura pode ser utilizada para apresentar os domínios antígeno-ligantes expressos a partir de um repertorio ou biblioteca combinatorial do anticorpo (por ex., humana ou murina). Exemplos de métodos de exibição levedura que podem ser usados para produzir os anticorpos da presente invenção incluem aqueles revelados em Wittrup, et al. Patente U.S. No. 6.699.658 aqui incorporado por referência.

B. Produção de anticorpos IL-13 recombinantes

[00120]Anticorpos da presente invenção podem ser produzidos através de qualquer de um número de técnicas conhecidas na arte. Por exemplo, expressão a partir de células hospedeiras, em que o(s) vetor(s) de expressão que codificam as cadeias pesada e leve é (são) transfectados numa célula hospedeira através de técnicas padrões. As diversas formas do termo “transfecção” são pretendidas abranger uma ampla variedade de técnicas comumnete usadas para a introdução de DNA exógeno numa célula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, electroporação, precipitação cálcio-fosfato, transfecçção DEAE-dextrano e semelhantes. Embora seja possível expressar os anticorpos da invenção em uma ou outra de células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, a expressão de anticorpos em células eucarióticas é preferível, e muito preferível nas células hospedeiras de mamíferos, porque tais células eucarióticas (e em particular células de mamíferos) são mais prováveis que células procarióticas de serem reunidas e secretar um anticorpo apropriadamente incluso e imunologicamente ativo. Células hospedeiras de mamíferos preferidas para expressar os anticorpos recombinantes da invenção incluem de ovário de hamster chinês (células CHO) (incluindo células dhfr- CHO, descritas em Urlaub e Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. ScL USA 77: 4216-4220, usadas com um marcador DHFR selecionável, por exemplo, como descrito em RJ. Kaufman e P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601-621), células mieloma NOS, células COS, células SP2. Quando os vetores de expressão recombinante que codificam genes anticorpos são introduzidos nas células hospedeiras de mamíferos, os anticorpos são produzidos mediante cultivo das células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferivelmente, a secretação do anticorpo para dentro do meio de cltura no qual as células hospedeiras são desenvolvidas. Os anticorpos podem ser recuperados a partir do meio de cultura usando métodos padrões de purificação.

[00121]As células hospedeiras lulas hospedeiras podem ser também usadas para produzir fragmentos anticorpo funcionais, tal como fragmentos Fab ou moléculas scFv. Será entendido que variacos dos procedimentos acima estão inseridos no escopo da presente invenção. Por exemplo, pode ser desejável transfectar uma célula hospedeira com fragmentos funcionais codificadores do DNA de um ou outro de anticorpo de cadeia leve e/ou de cadeia pesada dessa invenção. A tecnologia DNA recombinante pode ser também usada para remover parte, ou a totalidade do DNA codificador de um ou outro ou de ambos as cadeias leve e pesada que não seja necessária para a ligação ao antígeno de interesse. As moléculas expressas a partir de tais moléculas truncadas de DNA estão também abrangidas pelos anticorpos da invenção. Em adição, anticorpos bifuncionais podem ser produzidos em uma cadeia pesada e uma cadeia leve são um anticorpo da invenção e e a outra cadeia pesada pesada e leve são específicas para um antígeno outro que os antígenos de interesse mediante reticulação de um anticorpo da invenção a um segundo anticorpo através de métodos padrões de reticulação química.

[00122]Em um sistema preferido para a expressão recombinante de um anticorpo, ou sua parte antígeno-ligante, da invenção, o vetor de expressão recombinante que codifica ambos o anticorpo de cadeia pesada e o anticorpo de cadeia leve é introduzido nas células dhfr- CHO mediante transfecção mediada por cálcio-fosfato. Dentro do vetor de expressão recombinante, o os genes do anticorpo de cadeia pesada e de cadeia leve estão cada um operativamente ligados aos elementos regulatórios melhorador CMV/promotor AdMLP para compelir altos níveis de transcrição dos genes. O vetor de expressão recombinante também porta um gene DHFR, que permite a seleção de células CHO que tenham sido transfectadas com o vetor usando seleção metotrexato/amplificação. As células hospedeiras transformantes selecionadas são cultivadas para permitir a expressão dos anticorpos de cadeias pesada e leve e o anti intacto é recuperado do meio de cultura. Técnicas padrões de biologia molecular são usadas para preparar o vetor de expressão recombinante, transfectar as células hospedeiras, selecionar transformantes, cultivar as células hospedeiras e recuperar o anticorpo do meio de cultura. Ainda adicionalmente, a invenção proporciona um método de sintetizar um anticorpo recombinante da invenção mediante cultivar uma célula hospedeira da invenção em um meio de cultura adequado até que um anticorpo recombinante da invenção seja sintetizado. O método pode também compreender isolar o anticorpo recombinante do meio de cultura. 1. Anticorpos anti-IL-13 A Tabela 5 é uma lista de sequências aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos anti-hIL-13 da invenção. Tabela 5. Lista das Sequências Aminoácidos das Regiões VH e VL

[00123]As sequências CDR de anticorpo anti-IL-13 isoladas estabelecem uma nova família de proteínas ligantes a IL-13, isolated de acordo com essa invenção, e compreende polipeptídios que incluem as sequências de CDR listadas na Tabela 6 adiante. Para gerar e para selecionar os CDRs da invenção que possuem preferidas atividade ligante e/ou neutralizante a IL-13 com respeito a hIL- 13 e/ou hIL-13, métodos padrões conhecidos na arte para geração das proteínas ligantes da presente invenção e a avaliação das características ligantes e/ou neutralizantes de IL-13 e/ou hIL-13 dessas proteínas ligantes podem ser usadas, incluindo mas não limitado àquelas especificamente descritas aqui. Tabela 6. Ligandos de afinidade CDR IL-13 de consenso (resíduos alternativos são listados adiante abaixo de cada posição aminoácido; - indica que o resíduo pode estar ausente)

2. Anticorpos Quiméricos anti-IL-13

[00124]Um anticorpo quimérico é uma molécula em que diferentes porções do anticorpo são derivadas de diferentes espécies animais, tal comos anticorpos possuindo uma região variável derivada de anticorpo monoclonal murino e uma região constante da imunoglobulina humana. Métodos para produzir anticorpos quiméricos são conhecidos na arte e discutidos em detalhes no Exemplo 2.1. Ver por exemplo, Morrison, Science 229: 1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4: 214 (1986); Gillies et al., (1989) J. Immunol. Method 125: 191-202; U.S. Pat. Nos. 5.807.715; 4.816.567; e 4.816.397, que são aqui incorporado por referência em suas totalidades. Adicionalmente, técnicas desenvolvidas para a produção de “anticorpos quiméricos” (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312: 604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314: 452-454 que são aqui incorporados por referência em suas totalidades) mediante unir genes proveniente de uma molécula anticorpo de rato de apropriada especificidade antígeno juntamente com genes provenientes de uma com genes from um molécula de anticorpo humano de apropriada atividade bilógica, podem ser usadas.

[00125]Em uma modalidade, o anticorpos quiméricos da invenção são produzidos mediante substituir uma região constante de cadeia pesada dos anticorpos anti-hIL-13 humano monoclonal murino descritos na seção 1 com uma região constante da IgG1 humana. Numa modalidade específica o anticorpo quimérico da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo a sequência aminoácido da SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 46 e a região variável de cadeia leve (VL) compreendendo a sequência aminoácido da SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 43;ou SEQ E) NO: 47.

3. Anti IL-13 Anticorpos humanizados

[00126]Anticorpos humanizados são moléculas de anticorpos provenientes de anticorpos de espécies não humanas que ligam o antígeno desejado possuindo uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) provenientes de espécies não humanas e regiões da cadeia estrutural provenientes de uma molécula de imunoglobulina humana. Sequências de Ig humanas são reveladas, em por exemplo, www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez- /query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html; www.mgen.uni- heidelberg.de/SD/IT/IT.html; www.whfreeman.com/immunology/CH- 05/kuby05.htm; www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Anticorpo.html; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; www.path.cam.ac. uk/.cerca de.mrc7/m- ikeimages.html; www.antibodyresource.com/; mcb.harvard.edu/BioLinks/Immuno- logy.html.www.immunologylink.com/; pathbox.wustl.edu/.cerca de.hcenter/index.- html; www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html- ; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www.m.ehime-u.acjp/.cerca de.yasuhito- /Elisa.html; www.biodesign.com/tabela.asp; www.icnet.uk/axp/facs/davies/lin- ks.html; www.biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html; www.isac- net.org/sites_geo.html; aximtl.imt.uni- marburg.de/.cerca de.rek/AEP- Start.html; baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html; www.recab.uni- hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/pu- blic/INTRO.html; www.ibt.unam.mx/vir/V_camundongos.html; imgt.cnusc.fr: 8104/; www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www.unizh.ch/.about.honegger/AHOsem- inar/SlideOl.html; www.cryst.bbk.ac. uk/.about.ubcg07s/; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/h- umanisation/T AHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc.cam.ac. uk/.abo- ut.fmolina/Web- pages/Pept/spottech.html; www.jerini.de/fr roducts.htm; www.patents.ibm.com/ibm.html.Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983), cada um inteiramente aqui incorporado por referência. Tais sequências importadas podem ser usadas para reduzir a imunogenicidade ou reduzir, melhorar ou modificar a ligação, afinidade, atividade, inatividade, avidez, especificidade, meia-vida, ou qualquer outra característica adequada, como conhecidas na arte.

[00127]Resíduos da cadeia estrutural nas regiões da cadeia estrutural humana podem ser substituídos com o correspondente resíduo proveniente do anticorpo doador do CDR para alterar, preferivelmente melhorar, a ligação ao antígeno. Essas substituições na cadeia estrutural são identificadas através de métodos bem conhecidos na arte, por exemplo, mediante modelagem das interações do CDR e resíduos da cadeia estrutural para identificar resíduos da cadeia estrutural importantes para a ligação antígeno e comparação da sequência para identiricar resíduos não usuais da cadeia estrutural em posições particulares. (Ver, por exemplo, Queen et al., U.S. Pat. No. 5,585,089; Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988), que são aqui incorporados por referência em suas totalidades). Modelos tridimensiionais de imunoglobulina são comumente disponíveis e são familiares para aqueles usualmente versados na arte. Programas de computador são disponíveis os quais ilustram e apresentam estruturas tridimensionais conformacionais possíveis de sequências imunoglobulinas candidatas selecionadas. A inspeção dessas exibições permite a análise do possível papel dos resíduos no funcionamento da sequência candidata imunoglobulina, isto é, a análise dos resíduos que influenciam a capacidade da imunlglobulina candidata a se ligar ao seu antígeno. Desse modo, resíduos da FR podem ser selecionados e combinados a partir das sequências de consenso e importadas tal que as desejadas características do anticorpo, tal como aumentada afinidade ao antígeno alvo, seja conseguida. No geral, os resíduos do CDR estão diretamente e muito substancialmente envolvidos em influenciar a ligação antígeno. Os anticorpos podem ser humanizados usando uma variedade de técnicas conhecidas na arte, tal como mas não limitado àquelas descritas em Jones et al., Nature 321: 522 (1986); Verhoeyen et al., Science 239: 1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151: 2623 (1993), Padlan, Molecular Immunology 28i;4/5): 489498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6): 805-814 (1994); Roguska. et al. , PNAS 91: 969-973 (1994); Publicação PCT WO 91/09967, PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246, EP 592,106; EP 519,596, EP 239,400, U.S. Pat. Nos. 5.565.332, 5.723.323, 5.976.862, 5.824.514, 5.817.483, 5.814.476, 5.763.192, 5.723.323, 5.766.886, 5.714.352, 6.204.023, 6.180.370, 5.693.762, 5.530.101, 5.585.089, 5.225.539; 4.816.567, cada um inteiramente aqui incorporado por referência, incluídas as referências neles mencionadas.

C. Produção de anticorpos e linhagens de células produtoras de Anticorpos.

[00128]Preferivelmente, anticorpos anti-IL-13 da presente invenção, apresentam uma alta capacidade para reduzir ou neutralizar a atividade da IL-13, por exemplo, como avaliado por qualquer um dos ensaios in vitro e in vivo conhecidos na arte (por exemplo, ver Exemplo 1.1.C). Por exemplo, esss anticorpos neutralizam a produção de TARC IL-13 induzida pelas células A-549 com valores de IC50 na faixa de pelo menos cerca de 10-8 M, cerca de 10-9 M, ou cerca de 10-10 M.

[00129]In modalidades preferidas, o anticorpo isolado, ou sua parte antígeno-ligante, se liga a IL-13 humana, em que o anticorpo, ou sua parte antígeno- ligante, se dissocia da IL-13 humana com uma constante de dissociação a koff de cerca de 0,1s-1 ou menos, como determinado por ressonância plásmon de superfície, ou que inibe a IL-13 humana e/ou a atividade da IL-13 humana atividade com uma IC50 de cerca de 1 x 10-6M ou menos. Alternativamente, o anticorpo, ou uma sua parte antígeno-ligante, pode se dissociar da IL-13 humana com uma constante de dissociação koff de cerca de 1 x 10-3s-1 ou menos, como determinado por ressonância plásmon de superfície, ou pode inibir IL-13 humana e/ou a atividade da IL-13 humana com uma IC50 de cerca de 1 x 10-7M ou menos. De modo alternativo, o anticorpo, ou uma sua parte antígeno-ligante, pode se dissociar da IL- 13 humana com a kA rate constant de cerca de 1 x 10-3S-1 ou menos, como determinado por ressonância plásmon de superfície, ou pode inibir IL-13 humana e/ou IL-13 humana com uma IC50 de cerca de 1 x 10”8M ou menos . De modoalternativo, o anticorpo, ou uma sua parte antígeno-ligante, pode se dissociar da IL-13 humana com uma constante de dissocciação koff de cerca de 1 x 10-4S-1 ou menos, como determinado por ressonância plásmon de superfície, ou pode inibir IL- 13 e/ou a atividade da IL-13 humana com uma IC50 de cerca de 1 x 10-9M ou menos . De modoalternativo, o anticorpo, ou uma sua parte antígeno-ligante, pode se dissociar da IL-13 humana com uma constante de dissociação a koff de cerca de 1 x 10-5S 1 ou menos, como determinado por ressonância plásmon de superfície, ou pode inibir IL-13 e/ou a atividade da IL-13 humana com uma IC50 de cerca de 1 x 1010M ou menos . De modoalternativo, o anticorpo, ou uma sua parte antígeno-ligante, pode se dissociar da IL-13 humana com uma constante de dissociação koff de cerca de 1 x 10”5S 1Or less, como determinado por ressonância plásmon de superfície, ou pode inibir IL-13 e/ou a atividade da IL-13 humana com uma IC50 de cerca de 1 x 1011M ou menos.

[00130]IL-13 exerce suas ações mediante se ligar ao receptor de IL-13 (IL- 13R) na superfície da célula, o heterodímiro compreendido da cadeia IL-13Rα1 (IL- 13Rα1) e a cadeia IL-4R chain (EL-4R). IL-13 se liga a IL-13Rα1 primeiramente com baixa afinidade (KD = 2-10 nM) e em seguida convoca EL-4R ao complexo, gerando um receptor de alta afinidade receptor (KD = 0,03-0,4 nM) (Aman, M. J., et al . 1996 J. Biol. Chem. 271, 29265-29270; Miloux, et al . 1997 FEBS Lett. 401, 163-166; Andrews, et al 2002 J. Biol. Chem. 277, 46073-46078). A heterodimerização da IL- 13R induz a ativação das quinases de Janus, TYK2 e JAKl, constitutivamente associadas com IL-13Rα1 e IL-4R, respectivamente, seguido pela ativação do transdutor de sinal e ativador da transcrição 6 (STAT6) (Izuhara, K., e Arima, K. 2004 Drug News Perspect. 17, 91-98). Existe uma outra unidade ligante a IL-13, a cadeia IL-13Rα2 (IL-13Rα2), que se liga a IL-13 com alta afinidade (0,25-1,2 nM) (Caput, et al 1996 J. Biol. Chem. 271, 16921-16926; Donaldson et al 1998 J. Immunol. 161, 2317-2324). Nenhuma outra molécula receptora é conhecida estar envolvida no complexo IL-13-IL-13R2 complex. IL-13R2 é inicialmente considerada atuar como um receptor “chamariz” não sinalizante. Todavia, foi posteriormente descoberto que ele pode se ligar a IL-13 e sinalizar através da via do AP-I, levando à produção de TNF-beta em certos tipos celulares incluindo macrófagos, que por sua vez leva a fibrose pulmonar (Fichtner-Feigl, 2006 Nat Med 12: 99-106). Portanto ambas as vias IL-13Rα1/IL-4Rα e IL-13Rα2 contribuem para a fisiopatologia geral da asma e outras condições inflamatórias pulmonares. Portanto, um anticorpo terapêutico anti-IL-13 que bloqueia a ligação de IL-13 a ambos os receptores será mais eficaz do que aqueles que bloqueiam apenas um receptor.

[00131]Foram isolados anticorpos monoclonais que bloqueiam a ligação IL13 a ambos IL-13Rα1 e IL-13Rα2. Ambos ensaio de ligação ao receptor baseado em ELISA e ensaio de ligação a IL-13 marcado por 125-I on cell surface demonstrated que 13C5, em ambas as versões murina e humanizada (isto é 13C5.5), foram capazes de efetivamente bloquear a ligação IL13 a ambos os receptores. Anticorpos na mesma linhagem como 13C5, incluindo 25C8 e 33C3, foram também capazes de bloquear a ligação IL13 a ambos os receptores. O mapeamento do epitopo de 13C5 indicou que seu(s) sítio(s) ligante(s) incluia o C- terminal da região D-helicóide da IL-13 humana (resíduos VRDTK IEVAQ FVKDL LLHLK KLFRE GR, correspondente a aminoácido 104-130 da SEQ ID NO. 1). O C- terminal da região D-helicóide foi proposto estar envolvido nas iterações com o receptor de IL-13 (Zuegg et al 2001 Immunol Cell Biol. 79: 332-9). A estrutura cristalina da IL-13 humana complexaca com a parte Fab do anticorpo 13C5.5 indicou que 13C5.5 se liga ao C-terminal da região D-helicóide bem como ao N-terminal da região A-helicóide da IL-13 humana. Preferivelmente o anticorpo, ou seu fragmento antígeno-ligante se liga a IL-13 humana tal que IL-13 com o referido anticorpo, ou seu fragmento antígeno-ligante, ligado ao epitopo definidos pelas regiões topográficas Ser26-Thr27-Ala28-Leu29-Arg30-Glu31-Leu32-Ile33-Glu34- Glu35- Leu36-Val37-Asn38 e Lysl23-Lysl24-Leul25-Phel26-Argl27-Glu-128-Glyl29-Argl30 da SEQ ID No. 1 é inibido de se ligar ao receptor de IL-13. Preferivelmente o anticorpo, ou seu fragmento antígeno-ligante se liga a IL-13 humana tal que IL-13 com o referido anticorpo, ou seu fragmento antígeno-ligante, ligado ao epitopo definido pelas regiões topográficas Arg30- Glu31-Leu32-Ile33-Glu34-Glu35-Leu36-Val37- Asn38 e Lysl23-Lysl24-Leul25-Phel26- Argl27 da SEQ ID No. 1 é inibido de se ligar ao receptor de IL-13α2.

[00132]Em certas modalidades, o anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada, tal como uma IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD região constante. Preferivelmente, a região constante de cadeia pesada é uma região constante de cadeia pesada IgGl ou uma região constante de cadeia pesada IgG4. Além disso, o anticorpo pode compreender uma região constante de cadeia leve, uma ou outra de uma região constante de cadeia leve kappa ou a região constante de cadeia leve lambda. Preferivelmente, o anticorpo compreende a kappa região constante de cadeia leve kappa. De modo alternativo, a porção anticorpo pode ser, por exemplo, um fragmento Fab ou um fragmento Fv de cadeia simples.

[00133]As substituições dos resíduos aminoácidos na porção Fc para alterar a função efetora do anticorpo são conhecidos na arte (Winter, et al Patentes U.S. Nos. 5.648.260; 5.624.821). A porção Fc de um anticorpo media diversas funções efetoras importantes, por exemplo, indução da citocina, ADCC, fagocitose, citotoxicidade complemento-dependente (CDC) e meia-vida/taxa de eliminação do anticorpo e complexos antígeno-anticorpo. Em alguns casos essas funções efetoras são desejáveis para o anticorpo terapêutico mas em outros casos podem ser desnecessárias ou mesmo prejudiciais, dependendo dos objetivos terapêuticos. Certos isotipos IgG, particularmente IgGl e IgG3, mediam ADCC e CDC mediante ligação a FcyRs e complemento CIq, respectivamente. Receptores Fc neonatais são os componentes críticos que determinam a meia-vida de circulação de anticorpos. Em ainda uma outra modalidade pelo menos um resíduo aminoácido está substituído na região constante do anticorpo, por exemplo a região Fc do anticorpo, tal que funções efetoras do anticorpo são alteradas.

[00134]Uma modalidade proporciona uma proteína de ligação marcada em que um anticorpo ou porção anticorpo da invenção é derivada ou articulada a uma outra molécula funcional (por exemplo, um outro peptídeo ou proteína). Por exemplo, unma proteína de ligação marcada pode ser derivada mediante ligar funcionalmente um anticorpo ou porção anticorpo da invenção (mediante acoplamento químico, fusão genética, associação monovalente, ou de outro modo) a uma ou mais outras entidades molceulares, tal como um outro anticorpo (por exemplo, um anticorpo não específico ou um diacorpo), um agente detectável, um agente citotóxico, um agente farmacêutico,e/ou uma proteína peptídeo que possam mediar a associação do anticorpo ou porção anticorpo com uma outra molécula (tal como uma região de núcleo estreptavidina ou uma etiqueta poli-histidina).

[00135]Agentes úteis detectáveis com os quais um anticorpo ou porção anticorpo da invenção pode ser derivado incluem compostos fluorescentes. Agentes fluorescentes detectáveis representativos incluem fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloreto de 5-dimetilamina-1-naftalenosulfonila, ficoeritrina e semelhantes. Um anticorpo pode ser também derivado com enzimas detectáveis, tal como fosfatase alcalina, horseradish peroxidase, glucose oxidase e semelhantes. Quando um anticorpo é derivado com uma enzima detectável, ele é detectado mediante adicionar reagentes que adicionais que a enzima utiliza para produzir um detectável produto de reação. Por exemplo, quando o agente detectável horseradish peroxidase está presente, a adição de peróxido de hidrogênio e diaminobenzidina leva a um produto de reação colorido, que é detectável. Um anticorpo pode ser também derivado com biotina, e detectado através da medição indireta da ligação avidina ou estreptavidina.

[00136]Uma outra modalidade da invenção proporciona uma proteína de ligação cristalizada. Preferivelmente a invenção está relacionada a cristais de anticorpos anti-IL-13 integrais e seus fragmentos como revelado aqui, e formulações e composições compreendendo tais cristais. Em uma modalidade a proteína de ligação cristalizada tem uma maior meia-vida in vivo que a contraparte solúvel da proteína de ligação. Em uma outra modalidade a proteína de ligação mantém a atividade biológica após cristalização. A proteína de ligação cristalizada da invenção pode ser produced de acordo com métodos conhecidos na arte e como revelados em WO 02072636, aqui incorporado por referência.

[00137]Uma outra modalidade da invenção proporciona uma proteína de ligação glicosilada em que o anticorpo ou sua parte antígeno-ligante compreende um ou mais resíduos carboidrato. A produção de proteína nascente in vivo pode experimentar processamento posterior, conhecido como modificação pós- translacional. Em particular, resíduos açúcar (glicosila) podem ser acrescentados enzimáticamente, um processo comnhecido como glicosilação. As proteínas resultantes que abrigam cadeias laterais oligossacarídeos ligadas de modo covalente são conhecidas como proteínas glicosiladas ou glicoproteínas. Os anticorpos são glicoproteínas com um ou mais resíduos carboidrato no domínio Fc, bem como no domínio variável. Resíduos carboidratos no domínio Fc têm um importante efeito efetor sobre a função efetora do domínio Fc, com mínimo efeito sobre a ligação antígeno ou meia-vida do anticorpo (R. Jefferis, Biotechnol. Prog. 21 (2005), pp. 11-16). Em contraste, glicosilação of the domínio variável pode ter um efeito sobre a atividade antígeno-ligante atividade do anticorpo. A glicosilação no domínio variável pode ter um efeito negativo sobre a afinidade de ligação ao anticorpo, possivelmente devido a impedimento estérico (Co, M.S., et al., Mol. Immunol. (1993) 30: 1361- 1367), ou resultar numa aumentada afinidade para o antígeno (Wallick, S.C., et al., Exp. Med. (1988) 168: 1099-1109; Wright, A., et al., EMBO J. (1991) 10: 2717 2723).

[00138]Um aspecto da presente invenção está direcionado para gerar mutantes do sítio de glicosilação em que o sítio de glicosilação ligado a O- ou N- da da proteína de ligação foi mutado. Aqueles usualmente versados na técnica podem gerar tais mutantes usando tecnologias padrões bem conhecidas. Os mutantes do sítio de glicosilação que mantêm a atividade biológica, mas possuem aumentada ou reduzida atividade ligante, são um outro objetivo da presente invenção.

[00139]Em ainda uma outra modalidade, a glicosilação do anticorpo ou parte antígeno-ligante da invenção é modificada. Por exemplo, um anticorpo não glicosilado pode ser produzido (isto é, o anticorpo é faltante de glicosilação). A glicosilação pode ser alterada para, por exemplo, aumentar a afinidade do anticorpo quanto a antígeno. Tais modificações carboidrato podem ser obtidas, por exemplo, mediante alterar um ou mais sítios de glicosilação na sequência anticorpo. Por exemplo, uma ou mais substituições aminoácido podem ser feitas as quais resultem na eliminação de um ou mais sítios de glicosilação da região variável para desse modo eliminar a glicosilação naquele sítio. Tal glicosilação pode aumentar a afinidade do anticorpo quanto ao antígeno. Uma tal abordagem está descrita em mais detalhes na Publicação PCT WO2003016466A2, e Patentes U.S. Nos. 5.714.350 e 6.350.861, cada um dos quais é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

[00140]Adicionalmente ou alternativamente, um anticorpo modificado da invenção pode ser produzido que possua um tipo alterado de glicosilação, tal como um anticorpo hipofucosilado possuindo reduzidas quantidades de resíduos fucosila ou um anticorpo possuindo aumentadas estruturas bisessoras GIcNAc. Tais padrões alterados de glicosilação têm demonstrado aumentar a capacidade ADCC dos anticorpos. Tais modificações carboidratos podem ser conseguidas mediante, por exemplo, expressar o anticorpo numa célula hospedeira com alterado mecanismo de glicosilação. As células com mecanismo de glicosilação alterado têm sido descritas na arte e podem ser usadas como células hospedeiras nas quais se expressam os anticorpos recombinantes da invenção para desse para desse modo produzir um anticorpo com glicosilação alterada. Ver, por exemplo, Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277: 26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17: 176-1, bem como, Patente Européia No: EP 1.176.195; Publicação PCTs WO 03/035835; WO 99/54342 80, cada um dos quais é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

[00141]A glicosilação da proteína depende da sequência aminoácido da proteína de interesse, bem como da célula hospedeira em que a proteína está expressa. Diferentes organismos podem produzirdifts enzimas de glicosilação (por exemplo, glicosiltransferases e glicosidases), e possuem diferentes substratos (açúcares nucleotídeos) disponíveis. Devido a tais fatores, o padrão de glicosilação da proteína, e a composição dos resíduos glicosila, podem diferir dependendo do sistema hospedeiro no qual a proteína particular está expressa. Resíduos glicosila úteis na invenção podem incluir, mas não estão limitados a, glicose, galactose, manose, fucose, n-acetilglicosamina e ácido siálico. Preferivelmente the proteína de ligação glicosilada compreende resíduos glicosila tal que o padrão de glicosilação seja humano.

[00142]É conhecido por aqueles usualmente versados na técnica que diferentes glicosições de proteína podem resultar diferentes características de proteína. Por exemplo, a eficácia de uma proteína terapêutica produzida em um microorganismo hospedeiro, tal como uma levedura, e glicosilada utilizando a via endógena de levedura pode ser reduzido comparado com aquele da mesma proteína expressa em uma célula de mamífero, tal como uma linhagem de células CHO. Tais glicoproteínas podem ser também imunogênicas em humanos e apresentar reduzidas meias-vidas in vivo após administração. Receptores específicos em humanos e outros animais podem reconhecer resíduos glicosila específicos e promover a rápida eliminação da proteína da corrente sanguínea. Outros efeitos adversos podem incluir alterações na multiplicação protéica, solubilidade, suscetibilidade a proteases, diapedese, transporte, compartimentalização, secretação, reconhecimento por parte de outras proteínas ou fatores, antigenicidade, ou alergenicidade. Consequentemente, um profissional pode preferir uma proteína terapêutica com específicos composição e padrão de glicosilação, por exemplo, composição e padrão de glicosilação idênticos, ou pelo menos similares, àqueles produzidos nas células humanas ou em células de espécies específicas do indivíduo animal pretendido.

[00143]A expressão de proteínas glicosiladas diferentes daquelas de uma célula hospedeira pode ser conseguida mediante modificar geneticamente a célula hospedeira para expressar enzimas heterólogas de glicosilação. Usando técnicas conhecidas na arte um profissional pode gerar anticorpos ou suas partes antígeno- ligantes apresentando glicosilação de proteína humana. Por exemplo, linhagens de leveduras foram geneticamente modificadas para expressar enzimas de glicosilação não naturalmente ocorrentes tal que as proteínas glicosiladas (glicoproteínas) produzidas nessas linhagens de leveduras apresentassem glicosilação protéica idêntica àquela das células animais, especialment as células humanas (Pedidos de Patente U.S. No. 20040018590 e 20020137134 e Publicação PCT WO2005100584 A2).

[00144]Adicionalmente às proteínas ligantes, a presente invenção está também direcionada a um anticorpo anti-idiotípico (anti-Id) específico para tais proteínas ligantes da invenção. Um anticorpo anti-Id é um anticorpo, que reconhece determinantes únicos geralmente associados com a região antígeno-ligante de um outro anticorpo. O anti-Id pode ser preparado mediante imunizar um animal com uma proteína de ligação ou uma sua região contendo CDR. O animal imunizado irá reconhecer, e responder aos determinantes idiotípicos do anticorpo imunizante e produzir um anticorpo anti-Id. O anticorpo anti-Id pode ser também usado como um “imunogênio” para induzir uma resposta imuno em ainda um outro animal, produzindo um assim chamado anti-anticorpo anti-Id.

[00145]Também, será notado por aqueles usualmente versados na técnica que uma proteína de interesse pode ser expressa usando uma biblioteca de células hospedeiras produzidas geneticamente para expressar diversas enzimas de glicosilação, tal que células hospedeiras membros da biblioteca produzam uma proteína de interesse com modelos variantes de glicosilação. Um profissional pode então selecionar e isolar a proteína de interesse com particulares novos modelos de glicosilação. Preferivelmente, a proteína que possui um novo modelo de glicosilação particularmente selecionado apresenta aprerfeiçoadas ou alteradas propriedades biológicas.

D. Usos de anticorpos anti-IL-13

[00146]Dadas às suas capacidades de se ligar a IL-13 humana, os anticorpos anti-IL-13 humanos, ou suas partes, da invenção podem ser usados para detectar IL-13 humana (por exemplo, numa amostra biológica, tal como soro ou plasma), usando um imunoensaio convencional, tal como ensaios imunoabsorventes vinculados a enzima (ELISA), um radioimunoensaio (RIA) ou imunoistoquímica tecidual. A invenção proporciona um método para detectar IL-13 humana numa amostra biológica compreendendo contar uma amostra biológica com um anticorpo, ou porção anticorpo, da invenção e detectar um ou outro do anticorpo (ou porção anticorpo) unida a IL-13 humana ou anticorpo não ligado (ou porção do anticorpo), para desse modo detectar a IL-13 humana na amostra biológica. O anticorpo é diretamente ou indiretamente marcado com uma substância detectável para facilitar a detecção do anticorpo ligado ou não ligado.

[00147]Adequadas substâncias detectáveis incluem diversas enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, e materiais radioativos. Exemplos de adequadas enzimas incluem horseradish peroxidase, fosfatase alcalina, β-galactosidase, ou acetilcolinesterase; exemplos de adequados complexos grupos prostéticos incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos de adequados materiais fluorescentes incluem umbelliferone, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansila ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui luminol; e exemplos de adequados materiais radioativos incluem 3H 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho, ou 153Sm.

[00148]Alternativamente à etiquetagem do anticorpo, a IL-13 humana pode ser ensaiada em fluidos biológicos através de um imunoensaio de competição utilizando padroes rhIL-13 marcados com uma substância detectável e um anticorpo anti-IL-13 humano não marcado. Nesse ensaio, a amostra biológica os padrões rhIL- 13 marcados e o anticorpo anti-IL-13 humano estão combindos e a quantidade de rhIL-13 padrão marcada unida ao anticorpo não marcado é determinada. A quantidade da IL-13 humana na amostra biológica é inversamente proporcional à quantidade do padrão rhIL-13 marcado ligada ao anticorpo anti-IL-13. De modo similar, a IL-13 humana podem ser também ensaiada em fluidos biológicos através de um imunoensaio de competição utilizando padrões rhIL-13 marcados com uma substância detectável e um anticorpo anti-IL-13 humano não marcado.

[00149]Os anticorpos e porção anticorpos da invenção preferivelmente são capazes de neutralizar a atividade da IL-13 humana tento in vitro e in vivo. Consequentemente, tais anticorpos e porção anticorpos da invenção podem ser usados para inibir a atividade da hIL-13, por exemplo, numa cultura de células contendo hIL-13, em indivíduos humanos ou em outros indivíduos mamíferos possuindo IL-13 com o qual um anticorpo da invenção daça reação cruzada. Em uma modalidade, a invenção proporciona um método para inibir a atividade da hIL- 13 compreendendo contactar hIL-13 com um anticorpo ou porção anticorpo da invenção tal que atividade da hIL-13 é inibida. Por exemplo, numa cultura celular contendo, ou suspeita de conter hIL-13, um anticorpo ou porção anticorpo da invenção pode ser acrescentada ao meio de cultura para inibir a atividade da hIL-13 na cultura.

[00150]Em uma outra modalidade, a invenção proporciona um método para reduzir a atividade da hIL-13 em um indivíduo, advantageously de um indivíduo que sofre de uma doença ou distúrbio em que a atividade da IL-13 é prejudicial. A invenção proporciona métodos para reduzir a atividade IL-13 em um indivíduo que sofre de uma tal doença ou distúrbio, cujo método compreende administrar ao indivíduo um anticorpo ou porção anticorpo da invenção tal que a atividade da IL-13 no indivíduo seja reduzida. Preferivelmente, a IL-13 é IL-13 humana, e o indivíduo é um indivíduo humano. De modo alternativo, o indivíduo pode ser um mamífero que expressa uma IL-13 para a qual um anticorpo da invenção é capaz de se ligar. Ainda adicionalmente o indivíduo pode ser um mamífero no qual a IL-13 foi introduzida (por exemplo, mediante administração da IL-13 ou pela expressão de uma IL-13 transgênica). Um anticorpo da invenção pode ser administrado a um indivíduo humano para propósitos terapêuticos. Além disso, um anticorpo da invenção pode ser administrado a um mamífero não humano que expressa uma IL-13 com a qual o anticorpo é capaz de se ligar para propósitos veterinários ou como modelo animal de doença humana. Com respeito ao último, tais modelos animais podem ser úteis para avaliar a eficácia terapêutica de anticorpos da invenção (por exemplo, testagem de dosagens e posologia de administração). Como usado aqui, o termo “um distúrbio em que a atividade da IL-13 é prejudicial” é pretendido a incluir doenças e outros distúrbios em que a presença da IL-13 em um indivíduo que sofre do distúrbio se apresenta ser ou é suspeita de ser ou responsável pela patofisiologia do distúrbio ou um fator que contribui para uma piora do distúrbio. Consequentemente, um distúrbio em que atividade IL-13 é prejudicial é um distúrbio em que a redução da atividade IL-13 é esperada aliviar os sintomas e/ou progressão do distúrbio. Tais distúrbios podem ser evidenciados, por exemplo, por um aumento na concentração da IL-13 em um fluido biológico de um indivíduo que sofre do distúrbio (por exemplo, um aumento na concentração da IL-13 no soro, plasma, fluido sinovial, etc., do indivíduo), que pode ser detectad, por exemplo, usando um anticorpo anti-IL-13 como descrito anteriormente. Exemplos não limitantes de distúrbios que podem ser tratados com os anticorpos da invenção incluem aqueles distúrbios discutidos na seção adiante relacionada com composições farmacêuticas dos anticorpos da invenção.

[00151]A IL-13 está afeta como possuindo um papel importante em provocar respostas patológicas associadas com a asma. Todavia outros mediadores de diferentes rotas imunológicas estão também envolvidos na patogênese da asma, e o bloqueio desses mediadores, adicionalmente ao da IL-13, podem oferecer benefícios terapêuticos adicionais. Desse modo, as proteínas ligantes da invenção podem ser incorporadas nas proteínas DVD-Ig onde no DVD é capaz de se ligar a pares alvos incluindo, mas não limitado a, IL-13 e uma citocina pró-inflamatória, tal como fator de necrose tomoral-α (TNF-α). O TNF-α pode amplificar a resposta inflamatória na asma e pode estar vinculado à gravidade da doença (McDonnell, et al., Progress in Respiratory Research (2001), 31(New Drugs for Asma, Allergy and COPD), 247250.). Isso sugere que o bloqueio de ambos IL-13 e TNF-α pode ter efeitos benéficos, particularmente em doenças graves das vias respiratórias. Numa modalidade preferida o DVD-Ig da invenção se liga aos alvos IL-13 e TNF-α e é usado para tratar asma.

[00152]Em uma outra modalidade proteínas ligantes da invenção podem ser usadas para gerar moléculas DVD-Ig que se ligam a IL-13 e IL-beta, IL-13 e IL-9; IL- 13 e IL-4; IL-13 e IL-5; IL-13 e DL-25; IL-13 e TARC; IL-13 e MDC; IL-13 e MIF; IL-13 e TGF-β; IL-13 e LHR agonista; IL-13 e CL25; IL-13 e SPRR2a; IL-13 e SPRR2b; e IL-13 e ADAM8. A presente invenção também proporciona DVD-Igs capaz de se ligar a IL-13 e um ou mais alvos envolvidos na asma selecionados a partir do grupo que compreende CSF1 (MCSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (GCSF), FGF2, IFNAl, IFNBl; IFNG, histamina e receptores histamina, IL1A, IL1B, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12A, IL12B, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18, IL19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, KITLG, PDGFB, IL2RA, IL4R, IL5RA, IL8RA, IL8RB, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL18R1, TSLP, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL13, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL22, CCL24, CX3CL1, CXCL1, CXCL2, CXCL3, XCL1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CX3CR1, GPR2, XCRl, FOS, GATA3, JAK1, JAK3, STAT6, TBX21, TGFB1, TNFSF6, YY1, CYSLTR1, FCER1A, FCER2, LTB4R, TB4R2, LTBR, e quitinase.

D. Composição farmacêutica

[00153]A invenção também proporciona composições farmacêuticas compreendendo um anticorpo, ou sua parte antígeno-ligante, da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. As composições farmacêuticas compreendendos anticorpos da invenção são para uso em, mas não limitado a, diagnose, detecção, ou monitoramento de um distúrbio, na prevenção, tratamento, gerenciamento, ou melhoria de distúrbio ou um ou mais sintomas dele proveniente, e/ou em pesquisa. Numa modalidade específica, uma composição compreende um ou mais anticorpos da invenção. Em uma outra modalidade, a composição farmacêutica compreende um ou mais anticorpos da invenção e um ou mais agentes terapêuticos ou profiláticos outros que os anticorpos da invenção para tratar um distúrbio em que a atividade da IL-13 é prejudicial. Preferivelmente, os agentes profiláticos ou terapêuticos são aqueles conhecidos serem úteis para, ou que tenham sido concomitantemente usados na prevenção, tratamento, gerenciamento, ou melhoria de um distúrbio ou um ou mais de seus sintomas. De acordo com essas modalidades, a composição pode adicionalmente compreender um veículo, diluente ou excipiente.

[00154]Os anticorpos e partes de anticorpos da invenção podem ser incorporados nas composições farmacêuticas adequadas para administração a um indivíduo. Tipicamente, a composição farmacêutica compreende um anticorpo ou porção anticorpo da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Como usado aqui, “veículo farmaceuticamente aceitável” inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardadores de absorção, e semelhantes que sejam fisiologicamente compatíveis. Exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem um ou mais de água, salino, salino tamponado em fosfato, glicerol, etanol e semelhantes, bem como combinações desses mencionados. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como mannitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. Veículos farmaceuticamente aceitáveis podem também compreender quantidades menores e substâncias auxiliares tal como agentes umectantes ou emulsificantes, conservantes ou tampões, que melhorem a vida de prateleira ou a eficácia do anticorpo ou porção anticorpo.

[00155]Diversos sistemas de aplicação são conhecidos e podem ser usados para administrar um ou mais anticorpos da invenção ou a combinação de um ou mais anticorpos da invenção e a prophylactic agente ou agente terapêutico útil para prevenir, gerenciar, tratar, ou melhorar um distúrbio ou um ou mais sintomas dele proveniente, por exemplo, encapsulação em lipossomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes , capazes de expressar o anticorpo ou anticorpo fragmento, endocitose receptor-mediada (ver, por ex., Wu e Wu, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987)), construção de um ácido nucleico como parte de um vetor retroviral ou outro vetor, etc. Métodos de administrar um agente terapêutico ou profilático da invenção incluem, mas não estão limitados a, administração parenteral (por exemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa e subcutânea), administração epidural, administração intratumoral, e administração mucosal (por exemplo, rotas intranasal e oral). Em adição, a administração pulmonar pode ser empregada, por exemplo, pelo uso de um inalador ou nebulizador, e formulação com um agente aerossolizante. Ver, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 6.019.968, 5.985.320, 5.985.309, 5.934.272, 5.874.064, 5,855,913, 5,290, 540, e 4,880,078; e Publicação PCT Nos. WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, e WO 99/66903, cada um dos quais é aqui incorporado por referência em suas totalidades. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção, terapia de combinação, ou uma composição da invenção é administrado usando tecnologia de aplicação de fármacos de uso pulmonar da Alkermes AIR® (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.). Numa modalidade específica, agentes terapêuticos ou profiláticos da invenção são administradas de modo intramuscular, intravenoso, intratumoral, oral, intranasal, pulmonar, ou subcutâneo. Os agentes profiláticos ou terapêuticos podem ser administrados mediante qualquer rota conveniente, por exemplo por infusão ou injeção de bolus, mediante absorção através do epitélio ou revestimentos mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, retal e mucosa intestinal, etc.) e pode ser administrado juntamente comm outros agentes biologicamente ativos. A administração pode ser sistêmica ou local.

[00156]Numa modalidade específica, pode ser desejável administrar os agentes profiláticos ou terapêuticos da invenção de modo local à área com necessidade de tratamento; isso pode ser conseguido por, por exemplo, e não como limitação, infusão local, por injeção, ou mediante um implante, o referido implante sendo de um material poroso ou não poroso, incluindo membranas e matrizes, tal como membranas sialástica, polímeros matrizes fibrosas (por exemplo, Tissuel®), ou matrizes colagenosas. Em uma modalidade, uma quantidade eficaz de um ou mais antagonistas de anticorpos da invenção é administrada de modo local à área afetada em um indivíduo para prevenir, tratar, gerenciar, e/ou melhorar um distúrbio ou um sintoma dele proveniente. Em uma outra modalidade, uma quantidade eficaz de um ou mais anticorpos da invenção é administrada de modo local à área afetada em combinação com uma quantidade eficaz de uma ou mais terapias (por ex., um ou mais agentes terapêuticos ou profiláticos) outras que um anticorpo da invenção a um indivíduo para o prevenir, tratar, gerenciar, e/ou melhorar um distúrbio ou um ou mais sintomas dele proveniente.

[00157]Em uma outra modalidade, o agente terapêutico ou profilático da invenção pode ser aplicado em um sistema de liberação controlada ou de liberação prolongada. Em uma modalidade, uma bomba pode ser usada para conseguir a liberação controlada ou prolongada (ver Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88: 507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574). Em uma outra modalidade, materiais poliméricos podem ser usados para conseguir a liberação controlada ou prolongada das terapias da invenção (ver por exemplo, Medical Applications of Controlled Release, Langer e Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, FIa. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design e Performance, Smolen e Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger e Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61; ver também Levy et al., 1985, Science 228: 190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25: 351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1: 105); Patente U.S. No. 5.679.377; Patente U.S. No. 5.916.597; Patente U.S. No. 5.912.015; Patente U.S. No. 5.989.463; Patente U.S. No. 5.128.326; Publicação PCT No. WO 99/15154; e Publicação PCT No. WO 99/20253. Exemplos de polímeros usados nas formulações de liberação prolongada incluem, mas não estão limitados a, poli(2-hidróxi- metacrilato de etila), poli(metil metacrilato), poli(ácido acrílico), poli(acetato de etileno-co-binila), poli(ácido metacrílico), poliglicolidas (PLG), polianidridos, poli(N- vinil pirrolidona), poli(álcool vinílico), poliacrilamida, poli(etilene glicol), polilactides (PLA), poli(lactida-co-glicolidas) (PLGA), e poliortoésteres. Em uma modalidade preferida, o polímero usado na formulação de liberação prolongada é inerte, livre de impurezas possíveis de serem lixiviadas, estável quando do armazenamento, estéril, e biodegradável. Em ainda uma outra modalidade, um sistema de liberação controlada ou prolongada pode ser colocado nasproximidades do alvo profilático ou terapêutico, requerendo desse modo apenas uma fração da dose sistêmica (ver, por exemplo, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). Sistemas de liberação controlada são discuticos na pesquisa de Langer (1990, Science 249: 1527-1533). Qualquer técnica conhecida por aqueles usualmente versados na técnica pode ser usado para produzir as formulações de liberação prolongada compreendendo um ou mais agentes terapêuticos da invenção. Ver, por exemplo, U. S. Pat. No. 4,526, 938, Publicação PCT WO 91/05548, Publicação PCT WO 96/20698, Ning et al. , 1996, “Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Humano Colon Cancer Xenograft Using a Sustained- Release Gel,” Radiotherapy &Oncology 39: 179-189, Song et al., 1995, “Antibody Mediated Lung Targeting of Long- Circulating Emulsões,” PDA Journal of Pharmaceutical Science &Technology 50: 372-397, Cleek et al., 1997, “Biodegradable Polimeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application,” Pro. Intl. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24: 853-854, e Lam et al., 1997, “Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery,” Proc. Intl. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24: 759-760, cada um dos quais é aqui incorporado por referência em suas totalidades.

[00158]Numa modalidade específica, onde a composição da invenção é um ácido nucleico que codifica um agente terapêutico ou profilático, o ácido nucleico pode ser administrado in vivo para promover a expressão de seu agente terapêutico ou profilático codificado, mediante sua construção como parate de um apropriado vetor da expressão ácido nucleico e sua administração de modo a ele se tornar intracelular, por exemplo, pelo uso de um vetor retroviral (ver U. S. Pat. No. 4.980.286), ou mediante a injeção direta, ou pelo uso do bombardeamento por micropartículas (por exemplo, uma pistola genética; Biolistic, Dupont), ou revestimento com lipídios ou receptores da superfície celular ou agentes transfectantes, ou mediante sua administração em vinculação a um peptídeo do tipo homeobox que é conhecido adentrar ao núcleo (ver, por exemplo, Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1864-1868). De modo alternativo, um ácido nucleico pode ser introduzido de modo intracelular e incorporado dentro do DNA da célula hospedeira para expressão através da recombinação homóloga.

[00159]Uma composição farmacêutica da invenção é formulada para ser compatível com sua rota de administração pretendida. Exemplos of rotas de administração incluem, mas não estão limitados a, parenteral, por exemplo, intravenosa, intradérmica, subcutânea, oral, intranasal (por exemplo, inalação), transdérmico (por exemplo, topical), transmucosal, e administração retal. Numa modalidade específica, a composição é formulada de acordo com procedimentos rotineiros como uma composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa, subcutânea, intramuscular, oral, intranasal, ou tópica a seres humanos. Tipicamente, as composições para administração intravenosa são soluções em tampão aquoso isotônico. Onde necessário, a composição pode também incluir um agente solubilizante e um anestésico local, tal como a local anesthetic tal como lignocamne para aliviar a dor no local da injeção.

[00160]Se as composições da invenção são para serem administradas de modo tópico, as composições podem ser formuladas na forma de uma pomada, creme, atadura transdérmica, loção, gel, xampu, spray, aerossol, solução, emulsão, ou outras formas bem conhecidas por aqueles usualmente versados na técnica. Ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences e Introduction to Pharmaceutical Formas de dosagens, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995). Para formas de dosagem tópica não spray, formas viscosas a semi-sólidas ou sólidas compreendendo um veículo ou um ou mais excipients compatíveis com aplicação tópica e possuindo uma viscosidade cinamica preferivelmente maior que a da água são tipicamente empregadas. Formulações adequadas incluem, sem limitação, soluções, suspensões, emulsões, cremes, pomadas, pós, linimentos, unguentos, e semelhantes, os quais são, se desejado, esterilizados ou mistos com agentes auxiliares (por exemplo, conservantes, estabilizantes, agentes umectantes, tampões, ou sais) para influenciar diversas propriedades, tal como, por exemplo, pressão osmótica. Outras formas de dosagem tópicas adequadas incluem preparações aerossóis possíveis de serem aspergidas nas quais o ingrediente ativo, preferivelmente em combinação com um veículo inerte sólido ou líquido, é embalado numa mistura com um volátil pressurizado (por exemplo, um propelente gasoso, tal como freon) ou num frasco de apertar. Hidratantes ou umectantes podem ser também acrescentados às composições farmacêuticas e formas de dosagem se desejado. Exemplos de tais ingredientes adicionais são bem conhecidos na arte.

[00161]Se o método da invenção compreende administração intranasal de uma composição, a composição pode ser formulada numa forma aerossol, spray, névoa ou na forma de gotas. Em particular, agentes terapêuticos ou profiláticos para uso de acordo com a presente invenção podem ser convenientemente aplicados na forma uma apresentação spray aerossol a partir de embalagens pressurizadas ou um nebulizador, com o uso de um propelente adequado (por exemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono ou outros gases adequados). No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada mediante prover uma válvula para aplicar uma quantidade medida. Cápsulas e cartuchos (compostos de, por exemplo, gelatina) para uso em um inalante ou insuflador, podem ser formulados contendo uma mistura em pó do composto e uma adequada base pó tal como lactose ou amido.

[00162]Se o método da invenção compreende administração oral, as composições podem ser formuladas para uso oral, na forma de comprimidos, cápsulas, pequenas cápsulas, cápsulas de gel, soluções, suspensões, e semelhantes. Comprimidos ou cápsulas podem ser preparadas através de meios convencionais com excipientes farmaceuticamente aceitáveis tal como agentes aglutinantes (por exemplo, amido de milho pré-gelatinizado, polivinilpirrolidona, ou hidroxipropil metilcelulose); cargas (por exemplo, lactose, celulose microcristalina, ou hidrogeno fosfato de cálcio); lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, talco, ou sílica); desintegrantes (por exemplo, amido de batata ou amido glicolato de sódio); ou agentes umectantes (por exemplo, lauril sulfato de sódio). Os comprimidos podem ser revestidos através de métodos bem conhecidos na arte. Preparações líquidas para administração oral podem assumir a forma de, mas não limitado a, soluções, xaropes ou suspensões, ou elas podem ser apresentadas como um produto seco para constituição com água ou outro veículo adequado antes do uso. Tais preparações líquidas podem ser preparadas através de meios convencionais com aditivos farmaceuticamente aceitáveis tal como agentes de suspensão (por exemplo, xarope de sorbitol, derivados celulose, ou gorduras comestíveis hidrogenadas); agentes emulsificantes (por exemplo, lecitina ou acácia); veículos não aquosos (por exemplo, óleo de amêndoas, ésteres oleosos, álcool etílico, ou óleos vegetais fracionados); álcool etílico, ou óleos vegetais fracionados); e conservantes (por exemplo, metil ou propil-p-hidroxibenzoatos ou ácido sórbico). As preparações podem também conter sais de tamponamento, agentes colorantes, e agentes adocicantes, como apropriado. As preparações para appropriate. As preparações para administração oral podem ser adequadamente formuladas para liberação lenta, liberação controlada, ou liberação prolongada de um agente ou agentes terapêutico ou profilático.

[00163]O método da invenção pode compreender administração pulmonar, por exemplo, pelo uso de um inalador ou nebulizador, de uma composição formulada com um agente aerossolizante. Ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 6.019.968, 5.985.320, 5.985.309, 5.934.272, 5.874.064, 5.855.913, 5.290.540, e 4.880.078; e Publicação PCT Nos. WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, e WO 99/66903, cada um dos quais é aqui incorporado por referência em suas totalidades. Numa modalidade específica, um anticorpo da invenção, terapia por combinação, e/ou composição da invenção é administrado usando tecnologia de aplicação de fármacos por via pulmonar Alkermes AIR® (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.).

[00164]O método da invenção pode compreender administração de uma composição formulada para administração parenteral por injeção (por ex., através da injeção de bolus ou infusão contínua). Formulações para injeção podem ser apresentadas numa forma de dosagem unitária (por exemplo, em ampolas ou recipientes multidose) com um conservante acrescentado). As composições podem assumir quaisquer formas como suspensões, soluções ou emulsões em veículos aquosos ou oleosos, e podem conter agentes de formulação tais como agentes de suspensão, estabilizantes e/ou de dispersão. De modo alternativo, the ingrediente ativo pode estar na forma de pó para constituição com um veículo adequado (por exemplo, água estéril livre de pirogênio) antes do uso.

[00165]Os métodos da invenção podem adicionalmente compreender a administração das composições formuladas como preparações depósito. Tais formulações de ação prolongada podem ser administradas mediante implante (por exemplo, de forma subcutânea ou intramuscular) ou pela injeção intramuscular. Desse modo, por exemplo, as composições podem ser formuladas com materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequados (por exemplo, como uma emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de troca iônica, ou como derivados esparsamente solúveis (por exemplo, como um sal esparsamente solúvel).

[00166]Os métodos da invenção abrangem a administração das composições formuladas como formas neutras ou salinas. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem aqueles formados com anions tal como aqueles derivados de ácidos clorídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., e aqueles formados com cátions tais como aqueles derivados de sódio, potássio, amônio, cálcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.

[00167]No geral, os ingredientes das composições são fornecidos ou separadamente ou misturados numa forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó seco liofilizado ou concentrado livre de água num recipiente hermeticamente selado, tal como uma ampola ou sachet indicando a quantidade do agente ativo. Onde o modo de administração é por infusão, a composição pode ser dispensada com uma garrafa de infusão contendo água de classificação farmacêutica ou salino. Onde o modo de administração é por injeção, uma ampola de água estéril para injeção ou salino pode ser provido tal que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.

[00168]Em particular, a invenção também proporciona que um ou mais de os agentes profiláticos ou terapêuticos, ou composições farmacêuticas da invenção sema embalado num recipiente hermeticamente selado tal como an ampola ou sachet indicando uma quantidade do agente. Em uma modalidade, um ou mais dos agentes profiláticos ou terapêuticos, ou composições farmacêuticas da invenção é fornecido como um pó liofilizado esterilizado ou concentrado livre de água num recipiente hermeticamente selado e pode ser reconstituído (por exemplo, com água ou salino) até a apropriada concentração para administração a um indivíduo. Preferivelmente, um ou mais dos agentes profiláticos ou terapêuticos ou composições farmacêuticas da invenção é fornecido como um pó seco esterilizado liofilizado em um recipiente hermeticamente selado numa dosagem unitária de pelo menos 5 mg, mais preferivelmente de pelo menos 10 mg, pelo menos 15 mg, pelo menos 25 mg, pelo menos 35 mg, pelo menos 45 mg, pelo menos 50 mg, pelo menos 75 mg, ou de pelo menos 100 mg. Os agentes profiláticos ou terapêuticos liofilizados ou as composições farmacêuticas da invenção devem ser armazenadas entre 2 °C e 8 °C em seu recipiente original e os agentes profiláticos ou terapêuticos, ou composições farmacêuticas da invenção devem ser administradas dentro de 1 semana, preferivelmente dentro de 5 dias, dentro de 72 horas, dentro de 48 horas, dentro de 24 horas, dentro de 12 horas, dentro de 6 horas, dentro de 5 horas, dentro de 3 horas, ou dentro de 1 hora após serem reconstituídos. Numa modalidade alternativa, um ou mais dos agentes profiláticos ou terapêuticos ou composições farmacêuticas da invenção é fornecido em forma líquida em um recipiente hermeticamente selado indicando a quantidade e concentração do agente. Preferivelmente, a forma líquida da composição administrada é fornecida em um recipiente hermeticamente selado de pelo menos 0,25 mg/mL, mais preferivelmente pelo menos 0,5 mg/mL, pelo menos 1 mg/mL, pelo menos 2,5 mg/mL, pelo menos 5 mg/mL, pelo menos 8 mg/mL, pelo menos 10 mg/mL, pelo menos 15 mg/kg, pelo menos 25 mg/mL, pelo menos 50 mg/mL, pelo menos 75 mg/ml ou pelo menos 100 mg/mL. A forma líquida deverá ser armazenada entre 2 °C e 8 °C em seu recipiente original.

[00169]Os anticorpos e partes-anticorpos da invenção podem ser incorporados numa composição farmacêutica adequada para administração parenteral. Preferivelmente, o anticorpo ou partes-anticorpos serão preparadas como uma solução injetável contendo 0,1-250 mg anticorpo/mL. 50 mg/mL anticorpo. A solução injetável pode ser composed de um ou outro de uma forma de dosagem líquida ou liofilizada em um flaconete, ampola ou seringa pré-carregada. O tampão pode ser de L-histidina (1-50 mM), optimamente de 5-10 mM, a pH 5,0 a 7,0 (otimamente pH 6.0). Outros tampões adequados incluem mas não estão limitados a, succinato de sódio, citrato de sódio, fosfato de sódio, ou fosfato de potássio. O cloreto de sódio pode ser usado para modificar a toxicidade da solução numa concentração de 0-300 mM (otimamente 150 mM para uma forma de dosagem laq). Crioprotetores podem ser inclusos numa forma de dosagem liofilizada, principalmente de 0-10% sacarose (otimamente 0,5-1,0%). Outros adequados criprotetores incluem trehalose e lactose. Agentes voluminosos podem ser inclusos numa forma de dosagem liofilizada, principalmente 1-10% manitol (otimamente 24%). Estabilizantes podem ser usados em ambas as formas de dosagem líquido e liofilizada, principalmente 1-50 mM L-Metionina (otimamente 5-10 mM). Outros adequados agentes voluminosos incluem glicina, arginina, que podem ser inclusos como 0-0,05% polisorbate-80 (otimamente 0,005-0,01%). Tensoativos adicionais incluem, mas não estão limitados a, tensoativos polisorbate 20 e BRIJ. A composição farmacêutica compreendendo os anticorpos e partes-anticorpos da invenção preparada como uma solução injetável para administração parenteral, pode adicionalmente compreender um agente útil como um adjuvante, tal como aquele usado para o aumento da absorção, ou dispersão de uma proteína terapêutica (por exemplo, anticorpo). Um adjuvante particularmente útil é a hialuronidase, tal como Hylenex® (hialuronidase humana recombinante). A adição de hialuronidase numa solução injetável melhora a biodisponibilidade humana em seguida da administração parenteral, particularmente administração subcutânea. Ela também permite a injeção de volumes maiores no local (isto é, maiores que 1 mL) com menos dor e desconforto, e mínima incidência de reações no local da injeção, (ver WO2004078140, US2006104968 aqui incorporado por referência).

[00170]As composições dessa invenção podem estar numa variedade de formas. Estas incluem, por exemplo, formas de dosagens líquidas, sólidas ou semi- sólidas, tal como soluções líquidas (por exemplo, soluções injetáveis e infundíveis), dispersões ou suspensões, comprimidos, pílulas, pós, lipossomas e supositórios. A forma preferida depende do modo de administração pretendido e da aplicação terapêutica. Composições preferidas típicas estão na forma de soluções injetáveis ou infundíveis, tal como composições similares àquelas usadas para imunização passiva de humanos com outros anticorpos. O modo preferido de administração é o parenteral (por exemplo, intravenoso, subcutâneo, intraperitoneal, intramuscular). Em uma modalidade preferida, o anticorpo é administrado por infusão ou injeção intravenosa. Numa outra modalidade preferida, o anticorpo é administrado por injeção intramuscular ou subcutânea.

[00171]As composições terapêuticas tipicamente precisam ser estéreis e estáveis sob as condições de fabricação e de armazenamento. A composição pode ser formulada com uma solução, microemulsão, dispersão, lipossoma, ou outras estruturas ordenadas para alta concentração do fármaco. Soluções estéreis injetáveis podem ser preparadas mediante incorporar o composto ativo (isto é, anticorpo ou porção anticorpo) na quantidade requerida e num solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, como requerido, seguido por esterilização por filtração. No geral, as dispersões são preparadas mediante incorporar o composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos a partir daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis, liofilizados, para a preparação das soluções estéreis injetáveis, os métodos preferidos de preparação são or secagem em vácuo e secagem por aspersão que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado proveniente de uma sua solução filtrada previamente esterilizada. A apropriada fluidez de uma solução pode ser maintida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do requerido tamanho de partícula no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser obtida mediante incluir na composição, um agente que retarde a absorção, por exemplo, sais monoestearato e gelatina.

[00172]Os anticorpos e partes-anticorpos da presente invenção pode ser administrados através de uma variedade de métodos conhecidos na, embora para muitas aplicações terapêuticas, a rota/modo preferido de administração seja injeção subcutânea, injeção intravenosa ou infusão. Como será notado por aqueles usualmente versados na técnica, a rota e/ou modo de administração irá variar dependendo do resultado desejado. Em certas modalidades, o composto ativo pode ser preparado com um veículo que irá proteger o composto contra liberação rápida, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, ataduras transdérmicas, e sistemas de aplicação microencapsulados. Polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem ser usados, tal como acetato de etileno vinila, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, e ácido polilático. Muitos métodos para a preparação de tais formulações são patenteados ou geralmente conhecidos por aqueles usualmente versados na técnica. Ver, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

[00173]Em certas modalidades, um anticorpo ou porção anticorpo da invenção pode ser administrado de modo oral, por exemplo, com um diluente inerte ou um veículo comestível assimilável. O composto (e outros ingredientes, se desejado) pode ser também confinada numa cápsula de gelatina dura ou macia, comprimida na forma de comprimidos, ou incorporados diretamente na diteta do indivíduo. Para administração terapêutica oral, os compostos dministração, os compostos podem ser incorporados com excipientes e usados na forma de comprimidos ingeríveis, comprimidos bucal, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, bolachas, e semelhantes. Para administrar um composto da invenção mediante outros métodos que o da administração parenteral, pode ser necessário revestir o composto com, ou co-administrar o composto com, um material para impedir sua inativação.

[00174]Compostos ativos suplementares podem ser também incorporados nas composições. Em certas modalidades, um anticorpo ou porção anticorpo da invenção é co-formulado com e/ou co-administrado com um ou mais agente terapêuticos adicionais que são úteis para tratar distúrbios em que a atividade da IL- 13 é prejudicial. Por exemplo, um anticorpo anti-hIL-13 ou porção anticorpo da invenção pode ser co-formulado e/ou co-administrado com um ou mais additional anticorpos que se ligam a outros alvos (por exemplo, anticorpos que que se ligam a outras citocinas ou que se ligam a moléculas na superfície da célula). nes ou que bind cell surface moléculas). Além disso, um ou mais anticorpos da invenção pode ser usado em combinação com dois ou mais dos agentes terapêuticos mencionados até o momento. Tais terapias de combinação podem vantajosamente utilizar dosagens mais baixas dos afts terapêuticos administrados, evitando desse modo possíveis toxidaades ou complicações associadas com as diversas monoterapias.

[00175]Em certas modalidades, um anticorpo a IL-13 ou seu fragmento está vinculado a um veículo que amplia a meia-vida, conhecido na arte. Tais veículos incluem, mas não estão limitados a, domínio Fc, polietilene glicol, e dextrano. Tais veículos são descritos, por exemplo, no Pedido U.S. No. Série 09/428.082 e publicado em Pedido PCT No. WO 99/25044, que são aqui incorporadas por referência para qualquer propósito.

[00176]Numa modalidade específica, sequências de ácido nucleicos compreendendo sequências nucleotídicas que codificam um anticorpo da invenção ou um outro agente terapêutico ou profilático da invenção são administradas para tratar, prevenir, gerenciar, ou melhorar um distúrbio ou um ou mais sintomas dele proveniente por meio da terapia genética. A terapia genética se refere à terapia realizada pela administração a um indivíduo de um ácido nucleico expresso ou possível de ser expresso. Nessa modalidade da invenção, o ácidos nucleicos produzem seus codificados anticorpos ou agentes terapêuticos ou profiláticos da invenção que mediam um efeito profilático ou terapêutico.

[00177]Qualquer dos métodos para terapia genética disponível na arte pode ser usado de acordo com a presente invenção. Para pesquisa geral dos métodos de terapia genética, ver Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12: 488-505; Wu e Wu, 1991, Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596; Mulligan, Science 260: 926- 932 (1993); e Morgan e Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; May, 1993, TIBTECH 11(5): 155-215.

[00178]Métodos comumente conhecidas na arte da tecnologia de DNA recombinante que podem ser usados são descritos em Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, NY (1993); e Kriegler, Gene Transfer e Expressão, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990). Descrição detalhada dos diversos métodos de terapia genética são revelados em US20050042664 A1 que é aqui incorporado por referência.

[00179]Num outro aspecto, esse pedido apresenta um método de tratar (por exemplo, curar, suprimir, melhorar, retardar ou prevenir o início de, ou de prevenir a recorrência ou recidiva de) ou de prevenir um distúrbio associado com a IL-13, em um indivíduo. O método inclui: administrar ao indivíduo um agente ligante a IL-13 (particularmente um antagonista), por exemplo, um anticorpo anti-IL-13 ou seu fragmento como aqui descrito, numa quantidade suficiente para tratar ou prevenir o distúrbio associado com a IL-13. O antagonista de IL-13, por exemplo, o anticorpo anti-IL-13 ou seu fragmento, pode ser administrado ao indivíduo, sozinho ou em combinação com outras modalidades terapêuticas como aqui descrito.

[00180]Em uma modalidade, o indivíduo é um mamífero, por exemplo, um humano que sofre de um ou mais distúrbios associados a IL-13, incluindo, por exemplo, distúrbios respiratórios (por exemplo, asma (por exemplo, asma alérgica e não alérgica), doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), e e outras condições envolvendo inflamação das vias respiratórias, eosinofilia, fibrose e excessiva produção de muco; distúrbios atópicos (por exemplo, dermatite atópica e rinite alérgica); condições inflamatórias e/ou autoimunes, da pele, órgãos gastrintestinais (por exemplo, doenças inflamatórias dos intestinos (IBD), tal como colite ulcerativa e/ou doença de Crohn), e fígado (por exemplo, cirrose, fibrose); escleroderma; tumores ou cânceres, por exemplo, linfoma de Hodgkin como aqui descrito. Consequentemente, a revelação inclui o uso de um agente ligante a IL-13 (tal como um anticorpo anti-IL-13 ou seu fragmento descrito aqui) para um tratamento descrito aqui e o uso de um agente ligante a IL-13 (tal como um anti-anticorpo de IL-13 ou seu fragmento descrito aqui) para a peparação de um medicamento para um tratamento descrito aqui.

[00181]Exemplos de distúrbios associados a IL-13 incluem, mas não estão limitados a, um distúrbio escolhido de um ou mais de: distúrbios respiratórios, por exemplo, asma (por exemplo, asma alérgica e não alérgica (por exemplo, asma devido a infecção com, por exemplo, vírus respiratório sincicial (RSV), por exemplo, crianças mais novas)), doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), e outras condições envolvendo inflamação das vias respiratórias, eosinofilia, fibrose e excessiva produção de muco, por exemplo, fibrose cística e fibrose pulmonar; distúrbios atópicos, por exemplo, resultantes de uma aumentada sensibilidade a IL- 13 (por exemplo, dermatite atópica, urticária, eczema, rinite alérgica, e enterogastrite alérgica); condições inflamatórias e/ou autoimunes, da pele (por exemplo, dermatite atópica), órgãos gastrintestinais (por exemplo, doenças inflamatórias dos intestinos (IBD), tal como colite ulcerativa e/ou doença de Crohn), fígado (por exemplo, cirrose, carcinoma hepatocelular), e escleroderma; tumores ou cânceres (por exemplo, tumores sólidos ou do tecido mole), tal como leucemia, glioblastoma, e linfoma, por exemplo, linfoma de Hodgkin; infecções virais (por exemplo, from HTLV-1); fibrose de outros órgãos, por exemplo, fibrose do fígado, (por exemplo, fibrose caused por um vírus da hepatite B e/ou C); e supressão da expressão de respostas imunes protetoras Tipo 1, (por exemplo, durante a vacinação), como aqui descrito.

[00182]Em outras modalidades, esse pedido proporciona um método de tratar (por exemplo, reduzir, melhorar) ou prevenir um ou mais sintomas associados com um distúrbio respiratório, por exemplo, asma (por exemplo, asma alérgica e não alérgica); alergias; doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC); uma condição envolvendo inflamação das vias respiratórias, eosinofilia, fibrose e excessiva produção de muco, por exemplo, fibrose cística e fibrose pulmonar. Por exemplo, sintomas da asma incluem, mas não estão limitados a, respiração ofegante e falta de ar, broncoconstrição, hiper-reatividade das vias respiratórias, reduzida capacidade pulmonar, fibrose, inflamação das vias respiratórias, e produção de muco. O método compreende administrar ao indivíduo an antagonista de IL-13, por exemplo, um anticorpo da IL-13 ou um seu fragmento, numa quantidade suficiente para tratar (por exemplo, reduzir, melhorar) ou prevenir um ou mais sintomas. O anticorpo de IL-13 pode ser administrado de modo terapêutico ou profilático, ou ambos. O antagonista de IL-13, por exemplo, o anticorpo anti-IL-13, ou seu fragmento, pode ser administrado ao indivíduo, sozinho ou em combinação com outras modalidades terapêuticas como aqui descrito. Preferivelmente, o indivíduo é um mamífero, por exemplo, um humano que sofre de um distúrbio associado com a IL-13 como aqui descrito.

[00183]Num outro aspecto, esse pedido proporciona um método para detectar a presença da IL-13 em uma amostra in vitro (por exemplo, uma amostra biológica, tal como soro, plasma, tecido, biópsia). O método em questão pode ser usado para diagnosticar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio associado com imuno-células. O método inclui: (i) contacting a amostra ou a control sample com o anticorpo anti-IL-13 ou seu fragmento como aqui descrito; e (ii) detectar a formação de um complexo entre o anticorpo anti-IL-13 ou seu fragmento, e a amostra ou a amostra controle, em que uma alteração estatisticamente significativa na formação do complexo na amostra relativamente a amostra controle é indicativo da presença da IL-13 na amostra.

[00184]Em ainda um outro aspecto, esse pedido proporciona um método para detectar a presença da IL-13 in vivo (por exemplo, imageamento in vivo em um indivíduo). O método em questão pode ser usado para diagnosticar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio associado com a IL-13. O método inclui: (i) administrar o anticorpo anti-IL-13 ou seu fragmento como aqui descrito a um indivíduo ou um indivíduo controle sob condições que que permitem a ligação do anticorpo ou fragmento a IL-13; e (ii) detectar a formação de um complexo entre o anticorpo ou fragmento e IL-13, em que uma alteração estatisticamente significativa na formação do complexo no indivíduo relativamente ao indivíduo controle é indicativo da presença da IL-13.

[00185]Anticorpos da invenção, ou suas partes antígeno-ligantes podem ser usados sozinhos ou em combinação para tratar tais doenças. Deve ser entendido que os anticorpos da invenção ou sua parte antígeno-ligante pode ser usado sozinho ou em combinação com um agente adicional, por exemplo, um agente terapêutico, o referido agente adicional sendo selecionado por aqueles usualmente versados na técnica para seus propósitos pretendidos. Por exemplo, o agente adicional pode ser um agente terapêutico reconhecido na arte como sendo útil para tratar a doença ou condição que está sendo tratada pelo anticorpo da presente invenção. O agente adicional também pode ser um agente que confere um atributo benéfico à composição terapêutica, por exemplo, um agente que tenha efeitos na viscosidade da composição.

[00186]Deverá ser adicionalmente entendido que as combinações que são para seren incluídas nessa invenção são aquelas combinações úteis para os seus propósitos pretendidos. Os agentes apresentados adiante são para propósitos ilustrativos e não são pretendidos a limitar a invenção. As combinações que são partes dessa invenção, podem ser dos anticorpos da presente invenção e pelo menos um agente adicional selecionado a partir das listas adiante. A combinação pode também incluir mais que um agente adicional, por exemplo, dois ou três agentes adicionais se a combinação for tal que a composição formada possa realizar sua função pretendida.

[00187]A terapia por combinação pode incluir um ou mais antagonistas de IL-13, por exemplo, anticorpos anti-IL-13 ou seus fragmentos, co-formulada com, e/ou co-administrada com, um ou mais agentes terapêuticos adicionais, por ex., um ou mais inibidores da citocina e fator de crescimento, imunossupressores, agentes antiinflamatórios (por exemplo, agentes antiinflamatórios sistêmicos), agentes anti- fibróticos, inibidores metabólicos, inibidores enzima, e/ou agentes citotóxicos ou citostáticos, como descrito em mais detalhes aqui.

[00188]Exemplos de preferidos agentes terapêuticos adicionais que pode ser co-administrados e/ou co-formulados com um ou mais antagonistas de IL-13, por ex., anticorpos anti-IL-13 ou seus fragmentos, incluem, mas não estão limitados a, um ou mais de: esteróides inalados; beta-agonistas, por exemplo, beta-agonistas de ação curta ou de ação prolongada; antagonistas de receptores leucotrienos ou leucotrieno; fármacos de combinação tal como ADVAIR; Inibidores de IgE, por exemplo, anticorpos anti-IgE (por ex., XOLAIR); inibidores fosfodiesterase (por ex., inibidores PDE4); xantinas; fármacos anticolinérgicos; agentes estabilizantes de mastócitos tal como cromolina; Inibidores de IL-4; inibidores de IL-5; inibidores de eotaxina/CCR3; antagonistas de histamina ou seus receptores incluindo H1, H2, H3, e H4, e antagonistas de prostaglandina D ou seus receptores (DP1 e CRTH2). Tais combinações podem ser usadas para tratar asma e outros distúrbios respiratórios. Exemplos adicionais de agentes terapêuticos que podem ser co-administrados e/ou co-formulados com um ou mais anticorpos anti-IL-13 ou seus fragmentos incluem um ou mais de: antgonistas de TNF (por exemplo, um fragmento solúvel de um receptor do TNF, por exemplo, p55 ou p75 humano receptor do TNF ou derivados desses mencionados, por exemplo, 75 kD TNFR-IgG (75 kD receptor do TNF-Proteína de fusão IgG, ENBREL)); antagonistas de enzima de TNF, por exemplo, inibidores da enzima conversora de TNF (TACE); antagonistas de receptor muscarínico; antagonistas de TGF-beta; interferon gamma; perfenidona; agentes quimioterápicos, por exemplo, metotrexato, leflunomida, ou um sirolimus (raparnycin) ou um seu análogo, por exemplo, CCI-779; inibidores COX2 e cPLA2; NSAIDs; imunomoduladores; inibidores de p38, TPL-2, MK-2 e inibidores de NFkB, entre outros.

[00189]Outras combinações prreferidas são fármacos antiinflamatórioos supressores de citocina (CSAIDs); anticorpos para ou antígenos de outras citocinas ou fatores de crescimento humano, por exemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, IL-21, IL-31, interferons, EMAP-II, GM-CSF, FGF, EGF, PDGF, e edothelin-1, bem como os receptores dessas citocinas e fatores de crescimento. Anticorpos da invenção, ou sua parte antígeno-ligantes, podem ser combinadas com anticorpos a moléculas da superfície da célula tal como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90, CTLA ou their ligands incluindo CD154 (gp39 ou CD40L).

[00190]Combinações preferidas de agentes terapêuticos podem interferir em diferentes pontos na cascada inflamatória; exemplos preferidos incluem antgonistas de TNF do tipo anticorpos do TNF quimérico, humanizado ou humano, D2E7, (Publicação PCT No. WO 97/29131), CA2 (RemicadeTM), CDP 571, e receptores solúveis p55 ou p75 do TNFs, seus derivados, (p75TNFRlgG (EnbrelTM) ou p55TNFRlgG (Lenercept), e também inibidores da enzima conversora do TNF (TACE); de modo similar, inibidores da IL-1 (inibidores da enzima conversora da Interleucina-1, IL-IRA, etc) podem ser efetivos pela mesma razão. Outras combinações preferidas incluem Interleucina 4. Ainda uma outra combinação preferida são outros participantes importantes da resposta asmática que pode atuar paralelamente a, dependente de ou em conjunto com a função da IL-13; especialmente preferidos são os antagonistas da IL-9 incluindo anticorpos da IL-9. Foi demonstrado que a IL-13 e IL-9 têm funções sobrepostas porém distintas e a combinação dos antagonistas a ambos pode ser muito efetiva. Ainda uma outra combinação preferida são anticorpos anti-IL-5. Ainda outras combinações preferidas incluem antagonistas de quimiocinas incluindo MCP-I, MCP-4, eotaxinas, RANTES, MDC, CCL-12 e CCL-17 (TARC) e receptores quimiocinas incluindo CCR2, CCR3, CCR4, e CXCR4. Ainda combinações podem incluir antagonistas a mediadores da asma incluindo quitinase ácido mamífero, CRHT2, chymase, S1P1, S1P2, Tyk2, ROCKII, Statβ, p38, NFkB, fosfodiesterase 4 (PDE-4), tritase de mastócitos, NO, adenosina, IKK2, GATA3, ICAM-I, VCAM-I, e ICOS.

[00191]As composições farmacêuticas da invenção podem incluir uma “quantidade terapeuticamente eficaz” ou uma “quantidade profilaticamente eficaz” de um anticorpo ou porção anticorpo da invenção. Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessário, para conseguir o desejado efeito terapêutico. Uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou porção anticorpo pode ser determinada por aqueles usualmente versados na técnica e pode variar de acordo com fatores tal como o estado da doença, idade, sexo, e peso do indivíduo, e da capacidade do anticorpo ou porção anticorpo em eliciar uma desejada resposta no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também uma em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do anticorpo, ou porção anticorpo, são sobrepujados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” se refere a uma quantidade efetiva, em dosagens, e por períodos de tempo necessários, para conseguir o desejado resultado profilático, tipicamente, uma vez que uma dose profilática é usada em indivíduos antes de ou em um estágio mais inicial da doença, a quantidade profilaticamente eficaz será menor que a quantidade terapeuticamente eficaz.

[00192]Regimes de dosagens podem ser ajustados para proporcionar a resposta ótima desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica ou profilática). Por exemplo, um único bolus pode ser administrado, diversas doses divididas podem ser administradas durante o tempo ou a dose pode ser proporcionamente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parenterais em forma de dosagem unitária para facilidade de administração e uniformidade da dosagem. Forma unitária de dosagem como usado aqui se refere a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos mamíferos a serem tratados; cada unidade contendo uma quantidade predeterminada do composto ativo calculada para produzir o desejado efeito terapêutico em associação com o requerido veículo farmacêutico. A especificação para as formas de dosagem unitárias da invenção são ditadas por, e diretamente dependentes de (a) as características únicas do composto ativo e do particular efeito terapêutico ou profilático a ser alcançado, e (b) das limitações inerentes na arte da composição de um tal composto ativo para o tratamento da sensibilidade nos indivíduos.

[00193]Uma faixa representativa, não limitante para uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um anticorpo ou porção anticorpo da invenção é 0,1-20 mg/kg, mais preferivelmente 1-10 mg/kg. É para ser notado que os valores de dosagem podem variar com o tipo e gravidade da condição a ser aliviada. É para ser adicionalmente entendido que para qualquer indivíduo particular, regimes de dosagens específicas deverão ser ajustados ao longo do tempo de acordo com as necessidades individuais e do critério do profissional que está administrando ou supervisionando a administração das composições, e que as faixas de dosagens apresentadas aqui são apenas representativas e não são pretendidas a limitar o escopo ou a prática da composição reivindicada.

[00194]Será facilmente evidente para aqueles usualmente versados na técnica que outras modificações e adaptações adequadas dos métodos da invenção descrita aqui são evidentes e podem ser feitas usando equivalentes adequados sem se afastar do escopo da invenção ou das modalidades reveladas aqui. Tendo agora descrito a presente invenção em detalhes, a mesma será mais claramente entendida por referência aos exemplos apresentados a seguir, os quais são incluídos para os propósitos somente de ilustração e não são pretendidos a serem limitadores da invenção.

Exemplos Exemplo 1: Geração e isolamento de anticorpos monoclonaisanti-IL-13 humana Exemplo 1.1: Ensaios para identificar anticorpos anti-IL-13 humana

[00195]No transcurso do Exemplo 1 os ensaios apresentados a seguir foram usados para identificar e caracterizar anticorpos anti-IL-13 humana a menos que de outro modo estabelecido.

Exemplo 1.1.A: ELISA

[00196]Ensaios Imunoabsorventes Vinculados a Enzima para classificar anticorpos que se ligam a IL-13 humana foram realizados como a seguir.

[00197]Placas ELISA Corning Costar, Acton, MA) foram revestidas com 50μL/cavidade de 5μg/mL IgG cabra anti-camundongo Fc specífico (Pierce # 31170, Rockford, IL.) em Fosfato Tamponado em Salino (PBS) de um dia para o outro a 4 °C. As placas foram lavadas uma vez com PBS contendo 0,05% Tween-20. As placas foram bloqueadas pela adição de 200 μL/cavidade solução de bloqueio diluída a 2% em PBS (BioRad #170-6404, Hercules, CA.) por 1 hora na temperatura ambiente. As placas foram lavadas uma vez após bloqueio com PBS contendo 0,05% Tween-20.

[00198]Cinquenta microlitros por cavidade de soro de rato ou de sobrenadantes hibridoma diluídos em PBS contendo 0,1% Albumina de Soro Bovino (BSA) (Sigma, St. Louis, MO.) foi acrescentado à placa de ELISA preparada como descrito anteriormente e incubado por 1 hora na temperatura ambiente. As cavidades foram lavadas três vezes com PBS contendo 0,05% Tween-20. Cinquenta microlitros de variante IL-13 humana recombinante purificada biotinilada (R110Q) diluída a 100ng/mL em PBS contendo 0,1% BSA foi acrescentado a cada cavidade e incubado por 1 hora na temperatura ambiente. As placas foram lavadas 3 vezes com PBS contendo 0,05% Tween-20. Estreptavidina HRP (Pierce # 21126, Rockland, IL.) was diluted 1: 20000 em PBS contendo 0.1% BSA; 50 μL/cavidade foi acrescentado e as placas incubadas por 1 hora na temperatura ambiente. As placas foram lavadas 3 vezes com PBS contendo 0,05% Tween-20. Cinquenta microlitros de TMB solução (Sigma # T0440, St. Louis, MO.) foi acrescentado a cada cavidade e incubada por 10 minutos na temperatura ambiente. A reação foi interrompida pela adição de ácido sulfúrico 1N. As placas foram lidas por espectrofotometria num comprimento de onda de 450 nm.

Exemplo 1.1.B: Determinações da Afinidade usando Tecnologia BIACORE

[00199]O ensaio BIACORE (Biacore, Inc, Piscataway, NJ) determina a afinidade de anticorpos com as constantes de associação e dissociação. Os anticorpos ligantes a IL-13 humana recombinante purificada ou variante da IL-13 humana recombinante purificada (R110Q) foram determinados por medições baseadas em ressonância plásmon de superfície com um equipamento Biacore® 3000 (Biacore® AB, Uppsala, Sweden) usando HBS-EP de corrida (10 mM HEPES [pH 7,4], 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, e 0,005% tensoativo P20) a 25° C. Todos os produtos quimicos foram obtidos da Biacore® AB (Uppsala, Sweden) ou de outro modo a partir de uma diferente fonte como descrito no texto. Aproximadamente 5000 RU de IgG cabra anti-camundongo, (FCY), anticorpo policlonal fragmento específico (Pierce Biotechnology Inc, Rockford, EL) diluído em 10 mM acetato de sódio (pH 4.5) foi diretamente imobilizado através de um chip biosensor de grau pesquisa CM5 usando um kit de acoplamento amina padrão de acordo com as instruções e procedimentos do fabricante a 25 μg/mL. As frações não reagidas na superfície do biosensor foram bloqueadas com etanolamina. Superfície carboximetil dextrano modificada na célula de fluxo 2 e 4 foi usado como uma reação de superfície. Carboximetil dextrano não modificado sem IgG cabra anti-camundongo na célula de fluxo 1 e 3 foi usado como a superfície de referência. Para as análises cinéticas, equações de taxas derivadas do modelo ligante de Langmuir 1:1 foram ajustadas simultaneamente simultaneamente em relação as fases de associação e dissociação de todas as oito injeções (usando análise de ajuste global) com o uso do software Biaevaluation 4.0.1. Os anticorpos purificados foram diluidos em salino tamponado em HEPES para captura através das superfícies reacionais específicas IgG cabra anti-camundongo. Os anticorpos de rato a serem capturados como um ligando (25 μg/mL) foram injetados sobre matrizes reazionais numa vazão de 5 μL/min. As constantes da taxa de associação e de dissociação, Icon (unidade M-1S-1) e koff (unidade s-1) foram determinadas sob uma vazão contínua de 25 μL/min. As constantes de taxas foram derivadas mediante realizar as medições das ligações cinéticas em dez diferentes concentrações do antígeno variando na faixa de 10 a 200 nM. A constante de equilíbrio de dissociação (unidade M) da reação entre (unidade M) da reação entre camundongo anticorpos e IL-13 humana recombinante purificada ou IL-13 humana recombinante purificada foi em seguida calculada a partir das constantes das taxas cinéticas pela fórmula seguinte: KD = kon/koff. A ligação é registrada como uma função do tempo e as constantes das taxas cinéticas são calculadas. Nesse ensaio, taxas de associação tão rápidas quanto 106M-1S'1 e taxas de dissociação tão lentas quanto 10-6s- podem ser medidas.

Exemplo 1.1.C: Atividade Funcional dos anticorpos anti-IL-13 humana

[00200]Para avaliar a atividade funcional dos anticorpos anti-IL-13 humana da invenção, os anticorpos foram usados nos ensaios seguintes que medem a capacidade de um anticorpo para inibir a atividade da IL-13.

Exemplo 1.1.C 1Bioensaio de A-549

[00201]A capacidade dos anticorpos anti-IL-13 humano para inibir a produção de TARC induzida por IL-13 humana (CCL-17) por células A-549 foi analisada como a seguir. As células A-549 foram semeadas no dia um em uma placa com 96 cavidades de meio de crescimento RPMI (2E5 células/cavidade) (com 10% FBS). No dia dois, o meio foi substituído com meio de crescimento RPMI novo contendo 400 ng rhTNF/mL (100 μL/cavidade). Ao mesmo tempo, diversas concentrações de soro de rato imunizado, sobrenadante de hibridoma murino ou anticorpos anti-IL-13 humano purificado foram pré-incubados por uma hora a 37 °C com 10 ng/mL de IL-13 humana recombinante purificada ou variante IL-13 em 100 μL meio completo RPMI numa placa de microtitulação (fundo-U, 96 cavidades, Coastar). O anticorpo mais mistura de IL-13 humana recombinante purificada foi em seguida acrescentada (100 μL/cavidade) a células A-549 tratadas por TNF, com o volume final de 200 μL/cavidade (as concentrações finais de IL-13 e TNF foram de 5 ng/mL e 200 ng/mL, respectivamente), e incubado por 18 horas a 37°C. Após incubação, 150 μL de sobrenadante livre de células foi retirado de cada cavidade e o nível de TARC humano produzido foi medido usando um ELISA de TARC humano (R&D Systems Cat#DDN00).

[00202]As células A-549 também respondem a IL-13 de outras espécies, incluindo macaco cynomolgus, camundongo, rato, e carneiro, com valores ED50 similares àqueles da IL-13 humana. Portanto ela foi empregada para análise de reação cruzada de anti-hIL-13 mAbs a IL-13 de outras espécies usando o mesmo protocolo experimental.

Exemplo 1.2: Geração de anticorpos monoclonais anti-IL-13 humana Anticorpos monoclonais de camundongo anti-IL-13 humana foram obtidos como a seguir: Exemplo 1.2.A: Imunização de camundongos com antígeno da IL-13 humana

[00203]Vinte microgramas da variante da IL-13 humana recombinante purificada (Peprotech) misturada com adjuvante de Freund completo ou adjuvante de Imunoensaio (Qiagen, Valencia, CA) foi injetado de forma subcutânea em cinco camundongos Balb/C, cinco camundongos C57B/6, e cinco camundongos AJ, de 6 a 8 semanas de idade, no dia 1. Nos dias 24, 38, e 49, vinte microgramas da variante da IL-13 humana recombinante purificada misturada com adjuvante de Freund completo ou adjuvante de Imunoensaio foi injetado de forma subcutânea nos mesmos camundongos. No dia 84 ou dia 112 ou dia 144, os camundongos foram injetados de modo intravenoso com 1 ug variante da IL-13 humana recombinante purificada.

Exemplo 1.2.B: Geração de Hibridoma

[00204]Os esplenócitos obtidos a partir dos camundongos imunizados descritos no Exemplo 1.2.A foram fundidos com células SP2/O-Ag-14 numa relação de 5:1 de acordo com o método estabelecido descrito em Kohler, G. e Milstein 1975, Nature, 256: 495 para gerar hibridomas. Os produtos de fusão foram plaqueados em um meio de seleção contendo azaserina e hipxantina numa placa de 96 cavidades numa densidade de 2,5x106 células de baço por cavidade. Sete a dez dias pós- fusão, as colônias foram observadas por microscópio. O sobrenadante de cada cavidade contendo colônias hibridoma foi testado por Elisa quanto a presença de anticorpo da variante de IL-13 (como descrito no Exemplo 1.1.A). os sobrenadantes apresentando atividade específica a variante de IL-13 foram em seguida testados quanto a capacidade para neutralizar a variante da IL-13 e IL-13 tipo natural no bioensaio de A-549 quanto a TARC (como descrito no Exemplo 1.1.C).

Exemplo 1.2.C: Identificação e caracterização n of anticorpos monoclonais anti-IL-13 humana

[00205]Anticorpos produtores de hibridoma que se ligaram a variante IL-13, gerados de acordo com Exemplos 1.2.B e 1.2.C, e capazes de se ligar a variante IL- 13 especificamente e particularmente aqueles com valores de IC50 no bioensaio de A-549 de 5nM ou menos que 5nM foram escalonados e clonados por diluição limitante.

[00206]As células hibridoma foram expandidas num meio contendo 10% soro fetal bovino de baixo teor de IgG (Hyclone #SH30151, Logan, UT.). ma média, 250 mL de cada sobrenadante hibridoma (derivado de uma população clonal) foi colhido, concentrado e purificado através de cromatografia de afinidade de proteína A, como descrito em Harlow, E. e Lane, D. 1988 “Antibodies: A Laboratory Manual”. A capacidade de mAbs purificada para inibir a atividade IL-13 foi determinada usando o bioensaio de A-549 como descrito no Exemplos 1.1.C. A Tabela 7 mostra valores de IC50 provenientes dos bioensaios de A-549 para 17 anticorpos monoclonais. Tabela 7: Neutralização da IL-13 por mABS anti-IL-13 mAbs em bioensaio A- 549

[00207]As afinidades ligantes dos anticorpos monoclonais para a variante da IL-13 humana recombinante purificada e tipo natural foram determinadas usando medição de ressonância plásmon de superfície (Biacore®) como descrito no Exemplo 1.1. B. A Tabela 8 mostra a afinidade dos 18 anticorpos monoclonais descritos acima para IL-13 humana. Tabela 8: Afinidade de mABS anti-IL-13 para o tipo natural humano e variante de IL-13

Exemplo 1.2.C.1: Especificidades das Espécies anticorpos anti-IL-13 humana monoclonal murina

[00208]Para determinar se os 17 anticorpos monoclonais descritos acima reconhecem a IL-13 murina, um ELISA indireto foi ajustado mediante revestir placas ELISA placas com 5 ug/mL de IgG cabra anti-camundongo, Anticorpo específico fragmento Fc (Pierce # 31170, Rockland, IL). mABS murina anti-IL-13 humana foram preparadas em diversas concentrações variando na faixa de 0,1 a 100 ng/mL em PBS contendo 0,1% BSA; 50 ul de cada diluição anticorpo foi acrescentado à placa ELISA revestida e incubado por 1 hora na temperatura ambiente. As cavidades foram lavadas 3 vezes com PBS contendo 0,05% Tween-20. IL-13 de camundongo recombinante biotinilada (R&D Systems) foi diluída a 0,1 ug/mL em PBS contendo 0,1% BSA; 50 ul/cavidade foi acrescentado e as placas incubadas por 1 hora na temperatura ambiente. As cavidades foram lavadas 3 vezes com PBS contendo 0,05% Tween-20. Estreptavidina HRP (Pierce # 21126, Rockland, IL.) foi diluída 1:20000 em PBS contendo 0,1% BSA; 50 mL/cavidade foi acrescentado e as placas incubadas por 1 hora na temperatura ambiente. As placas foram lavadas 3 vezes com PBS contendo 0,05% Tween-20. Cinquenta microlitros de TMB solução (Sigma # T0440, St. Louis, MO.) foi acrescentado a cada cavidade e incubado por 10 minutos na temperatura ambiente. A reação foi interrompida pela adição de ácido sulfúrico 1N. As placas foram lidas por espectrometria num comprimento de onda de 450 nm. Resultados provenientes do ELISA indireto indicaram que mAb 3H7 foi capaz de se ligar a mIL-13. Em um bioensao subsequente, foi mostrado que 3H7 pode inibir a produção de TARC estimulada por mIL-13 em um modo dose- dependente, com uma IC50 de 2,4nM. A análise Biacore também demonstrou ligação positiva de 3H7 a mIL-13, com uma KD de 12nM. Todos os outros mABS na tabela 8 não apresentaram qualquer ligação positiva a IL-13 de camundongo.

[00209]A potência de neutralização de mAbs anti-hIL-13 contra IL-13 de primata não humano (cynomolgus ) e IL-13 de carneiro foram também medidos no bioensaio A-548. Para gerar IL-13 cyno e IL-13 carneiro, cDNA para cada proteína foi obtida por PCR em gabarito DNA usando iniciadores degenerados baseados na sequência IL-13 humana. As proteínas de IL-13 cyno e de carneiro foram em seguida expressas em células COS transfectadas de modo transiente. IL-13 humana tipo natural foi também gerada em paralelo como um controle em todos os estudos funcionais. Células A-549 responderam a ambas as IL-13 cyno e carneiro com uma ED50 similar àquela da IL-13 humana. Muito das mAbs neutralizaram a atividade de IL-13 cyno, demonstrando reatividade cruzada a IL-13 cyno (Tabela 7). Todavia nenhum dos anticorpos apresentou significativa neutralização de IL-13 carneiro.

Exemplo 1.2.C.2: anticorpo monoclonal murino anti-IL-13 humana bloqueia a ligação da IL-13 aos receptores de IL-13 (IL-13Rα1 e IL-13Rα2)

[00210]A atividade IL-13 é mediada através de um complexo receptor que consiste das cadeias de IL-13Rα1 e IL-4Rα. A citocina primeiramente experimenta uma interação de relativamente baixa atividade com a IL-13Rα1 sobre a superfície das células. O complexo IL-13/IL-13Rα1 em seguida convoca DL-4Rα para formar o receptor completo de IL-13, que está ligado ao seu ligando (IL-13) com alta afinidade (Zurawski et al. (1993) EMBO J. 12: 2663; Zurawski et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 23869). A ligação da IL-13 com o receptor de alta afinidade em seguida envia sinais adiante através da cadeia IL-4Rα envolvendo a rota do transdutor de sinal de quinase de Janus e ativador de transcrição (JAK-STAT), por exemplo, através da fosforilação de STAT6, que pode ser monitorada como uma das respostas celulares mais precoce para IL-13 (Murata et al., supra).

[00211]Existe um outro receptor ligante a IL-13, a cadeia IL-13Rα2 (IL- 13Rα2), que se liga a IL-13 com alta afinidade (0,25-1,2 nM) (Caput, et al 1996 J. Biol. Chem. 271, 16921-16926; Donaldson et al 1998 J. Immunol. 161, 2317-2324). Nenhuma outra molécula receptora é conhecida estar envolvida no complexo IL- 13/IL-13Rα2. A IL-13Rα2 era inicialmente considerada atuar como um receptor “chamariz” não sinaloizante. Todavia, foi mais tarde descoberto que ele pode se ligar a IL-13, e signalizar através da rota AP-I, levando a produção de TGF-beta em certos tipos de células incluindo macrófagos, que por sua vez leva a fibrose pulmonar (Fichtner-Feigl. 2006 Nat Med 12: 99-106). Portanto, ambos o complexo IL-13Rα1/IL-4R e rotas IL-13Rα2 contribuem para a completa patofisiologia da asma e de outras doenças mediadas pela IL-13. Diversas abordagens, tal como o mapeamento do epitopo, ensaio de ligação aos receptores, cromatografia de exclusão dimensional (SEC), e adicional análise BIACORE, foram usados para elucidar a interação entre os anticorpos anti-IL-13 da invenção e IL-13 humana.

[00212]Para determinar se o anticorpos monoclonais descritos acima são capazes de bloquear a ligação IL13 aos receptores de IL-13 (IL-13Rα1 e IL-13Rα2), um ELISA ligante a receptor foi desenvolvido como a seguir. Placas ELISA de 96 cavidades de alta ligação foram revestidas com 4 ug/mL de IL-13Rα1 recombinante/Fc ou IL-13Rα2/Fc (R&D Systems) em 100 ul de tampão de revestimento/cavidade (tampão carbonato-bicarbonato, Pierce) a 40C. Após 16hr, a solução de revestimento foi removida mediante despejar os conteúdos da placa numa pia, e as placas foram lavadas e bloqueadas 4 vezes com Tampão de Bloqueio Superblock (240 ul/cavidade) (Pierce). mAbs Anti-IL13 (1:4 diluida serialmente de 40 ug/mL, 50ul/cavidade) e Biotin-IL-13 (50ul/cavidade, concentrações finais de 5nM para hIL-13Rαl/Fc, e 0,5nM para hIL-13Rα2/Fc) foram acrescentados e incubado por 2 horas na temperatura ambiente (RT). As placas foram lavadas 5 vezes com 300ul 0,1%PBST, e em seguida 100ul de MAb antibiotina de camundongo diluído 1:5000 (Jackson Immunosciences) foi acrescentado e incubado na temperatura ambiente por 45 min. As placas foram lavadas novamente 5 vezes com 300ul 0,1%PBST, seguido pela adição de reagente de substrato TMB (100ul/cavidade, Pharmingen); desenvolvido por 5 min, e interrompido pela adição de 50ul de H2SO4 2M (VWR). ODs a 450nm foram determinados por espectrofotometria.

[00213]Adicionalmente, as propriedades bloqueadoras do receptor de mAbs foram também avaliadas pelo ensaio de ligação ao receptor usando células COS transfectadas por IL-13Rα2. IL-13 humana recombinante foi marcada com 125I (Amersham, Arlington Heights, IL), usando reagente IODO-GEN (Pierce, Rockford, IL) como anteriormente descrito (Obiri NI et al., (1995) J Biol Chem. 270: 87978804). A atividade específica da IL-13 radiomarcada foi avaliada ser de 158 μCi/μg proteína. A IL-13 marcada apresentou bioatividade similar como a IL-13 não marcada, como avaliado pelo bioensaio A-549. Para experimentos ligantes, as células COS foram transfectadas de modo transiente com IL-13-Ra2 por Lipofectamine 2000 (Invitrogen), e incubadas por 48 h. As células COS transfectadas (5 x 105 células em 100 μL de tampão de ligação:RPMI 1640 contendo 0,2% de albumina de soro humano e 10 mmol HEPES) foram incubadas com 1,0 nM 125I-IL-B com ou sem 1 uM de IL-13 não marcada a 40C por 2 horas. Célula ligada a 125I-IL-13 foi separada da não ligada a 125I-IL-13 mediante centrifugação através de um gradiente de óleo ftalato, e a radioatividade foi determinada com um contador gama (Wallac, Gaithersburg, MD). Para o ensaio de deslocamento do anticorpo, células COS transfectadas foram incubadas com 125I-IL-13 (1,0 nM) com ou sem o aumento das concentrações (até 50 ug/mL) de anticorpos anti-IL-13, como descrito anteriormente. Ambas as formas do ensaio de ligação ao receptor demonstrou o seguinte: Primeiro, 13C5 e 9C11 bloquearam a ligação IL13 a IL-13Rα1; segundo, 13C5 bloqueou fortemente a ligação IL13 a IL-13Rα2 (IC50 - 1-3 nM em ambas as superfície de célula RBA e RB ELISA), enquanto que 9C11 bloqueou a ligação da IL13 da IL-13Rα2 com uma potência mais baixa (IC50 > 10 nM); e terceiro, 5G1 e 3E5 falharam em bloquear a ligação IL13 a um ou outro de IL-13Rα1 ou IL-13Rα2. Três outros anticorpos anti-IL-13, BAK502G9 (CAT PCT WO 2005/007699), mAb13.2 (Wyeth PCT WO 2005/123126A2) e MJ2-7 (Wyeth PCT WO 2006/0073148A1) foram também analisadas quanto a capacidade deles para bloquear a ligação IL-13 humana a IL-13 humana Rα2 em ambos a ligação receptor a ELISA e RBA da superfície da célula. O anticorpo mAb13.2 não bloqueou a ligação IL13 a um ou outro de IL-13Rα1 ou IL-13Rα2. BAK502G9 e MJ2-7 foi capaz de bloquear a ligação IL13 a IL-13Rα1; todavia eles apresentaram baixa potência em bloquear a ligação IL13 a IL-13Rα2 com concentrações de anticorpo de até 50μg/mL (330 nM).

[00214]A interação entre IL-13 e IL-13Rα1/α2 em presença de mAbs anti-IL- 13 foi também analisada por BIACORE. Essa análise foi feita em diversos formatos. Primeiro, IL-13Rα1/Fc foi unida ao chip Biacore e IL-13 foi fluída sobre o chip, na presença e ausência de mAbs anti-IL-13 mAbs. MAbs 13C5 e 9C11, entre outros, foram capazes de bloquear a ligação de IL13 a IL-13Rα1, enquanto que 5G1 e 3E5 falharam para inibir a ligação IL13 a IL-13Rα1, consistente com o ensaio de ligação aos receptores. Segundo, IL-4R foi ligado ao chip BIACORE, e um complexo da IL- 13 pré-ligada a IL-13Rα1 foi fluída sobre o chip. Na ausência de mAbs anti-IL-13, a formação de um complexo trimolecular foi demonstrada. Todavia, adição do anticorpo anti-IL-13 5G1 à mistura de IL-13 pré-ligada a IL-13Rα1 impediu a ligação a IL-4R no chip. Isso indicou que, apesar de 5G1 não poder bloquear a ligação IL13 a FL-13Rα1, ele pode bloquear a ligação da IL13 ligante a IL-4R, proporcionando uma base mecanicista para a sua atividade IL-13-neutralizante. Essas observações foram também confirmadas pela cromatografia de exclusão dimensional (SEC), onde complexos hetero-triméricos (mAb-IL-13-IL-13Rα1/Fc) foram observados para 5G1, mas não para 13C5. Estudos subsequentes do mapeamento do epitopo usando o processamento proteinase do complexo mAb-IL-13 seguido pela análise por espectrômetro de massa indicou o seguinte: Primeiro, 5G1 se liga a resíduos de IL- 13 incluindo o peptídeo 11-aa N-terminal 11 (GPVPPSTALRE), cobrindo parte da região A-helicóide que se mostrou reagir com a IL-4R (Moy et al 2001J Mol Biol. 310: 219 e Horita et al., (2001) J Mol Biol. 310: 231); segundo, o anticorpo 9C11 interage com a região entre a região C-helicóide e D-helicóide (VSAGQFSSLHVR); e terceiro, o anticorpo 13C5 interage com resíduos de IL-13 incluindo uma região conversora D-helicóide (VRDTK IEVAQ FVKDL LLHLK KLFRE GR correspondente um aminoácido 104-130 da SEQ ID NO. 1). D-helicóide se mostrou interagir com os receptores da IL-13 (Moy et al 2001 J Mol Biol. 310: 219; Horita et al 2001 J Mol Biol. 310: 231; e Madhankumar et al 2002 JBC 277: 43194). Uma vez que 13C5 se liga a variante IL-13 humana (KD=50 pM) muito mais fortemente que a IL-13 cynomolgus (KD=1800 pM), e a única diferença de sequência entre a variante IL-13 humana e a IL-13 cynomolgus dentro dessa de região epitopo 13C5 potencial é L em humano mas V na IL-13 cyno na posição 120, foi gerado um mutante V 120L mutant cyno IL- 13 e testado se essa mutação teria aumentada afinidade a 13C5 sobre a IL-13 cyno do tipo natural. Com base nos resultados Biacore e bioensaio, a afinidade ligante bem como o potencial de neutralização de 13C5 quanto ao mutante V 120L IL-13 foram equivalentes àquela para a IL-13 cyno do tipo natural, indicando que essa diferença V/L na posição 120 dentro da região C-terminal não contribui para a diferença de afinidade de 13C5 quanto a variante IL-13 humana versus IL-13 cyno, e que podem existir outros resíduos fora da região C-terminal que contribua para a diferencial afinidade ligante de 13C5 para a IL-13 humana e cyno. Isso é consistente com a observação de que 13C5 não reconhece a IL-13 humana desnaturada mediante a análise Western blot, indicando que o epitopo ligante de 13C5 na IL-13 humana é fortemente conformacional.

[00215]Os estudos de ligação e de mapeamento do epitopo indicaram que 5G1 não inibiu a interação da IL-13 com IL-13Rα1 mas rompeu a interação da IL- 13/IL-13Rα1 com IL-4Rα. Essa ruptura é considerada interferir com a formação de um complexo de sinalização IL-13 funcional. Essas observações proporcionam um modelo teórico quanto a atividade neutralizante desse anticorpo num sistema mediado por IL-13Rα1/IL-4R tal como as células A-549. Em contraste, 13C5 bloqueou a ligação da IL-13 a ambos IL-13Rα1 e IL-13Rα2. De modo interessante, apesar de 9C11 ter sido capaz de bloquear uma ligação de IL-13 a IL-13Rα1, ele apenas mostrou inibição parcial (ou baixa potência) da ligação IL13 a IL-13Rα2. Embora IL-13Rα1 e Rα2 adotem multiplicação tridimensional e orientação da ligação IL-13 similares, elas pssuem uma baixa identidade de sequência e portanto resíduos específicos responsáveis quanto a ligação IL13 podem variar (Arima 2005 JBC 280: 24915; e Madhankumar et al 2002 J. Biol. Chem. 277: 43194). Consequentemente, resíduos específicos na IL-13 para ligação a IL-13Rα1 e IL-13Ra2 podem diferir, o que pode explicar as diferentes propriedades de 9C11 de bloqueio ao receptor.

[00216]O ensaio de ligação aos receptores, mapeamento do epitopo, Biacore, e bioensaios descritos acima indicam coletivamente que um anticorpo neutralizante anti-IL-13 pode inibir a atividade associada a IL-13 através dos seguintes mecanismos: 1) Inibe a ligação IL13 a ambos IL-13Rα1 e IL-13R«2 mediante interagir com IL-13 na região envolvida na ligação ao receptor a ambos IL-13Rα1 e IL-13Rα2. Um exemplo de um tal anticorpo é 13C5. Tais anticorpos irão apresentar sinalização IL- 13 através de ambos o complexo IL-13Rα1/IL-4R e IL-13Ra2. 2) não inibir a ligação IL13 a um ou outro de IL-13Rα1 ou IL-13Ra2. Todavia o anticorpo inibe a interação com receptor IL-4, portanto, inibe a sinalização IL-13 através co complexo IL-13Rα1/IL-4R. Tal anticorpo pode não inibir a sinalização IL- 13Rα2. Exemplos de tais anticorpos são 5G1 e mAbl3.2 (Wyeth PCT WO 2005/123126). 3) Inibe a ligação IL13 a IL-13Rα1 mas não inibe eficazmente a ligação IL13 a IL-13Ra2. Isto pode ocorrer pelos seguintes motivos: a) epitopo: uma região que está envolvida na ligação IL-13Ra1 mas não na ligação IL-13Ra2 ou não como fortemente envolvida na ligação IL-13Rα2. Um exemplo é 9C11. b) afinidade: uma vez que IL-13Rα2 tem muito maior afinidade que IL-13Rα1 para IL-13, um anticorpo de baixa afinidade pode ser capaz de bloquear a ligação IL13 a IL-13Ra1 mas não a IL-13Rα2 nas concentrações fisiológicas de um anticorpo terapêutico. Um exemplo é BAK502G9, que apresentou uma afinidade 2,11 nM à IL-13 humana recombinante tipo natural como avaliado pro Biacore (CAT PCT WO 2005/007699). Um outro exemplo é MJ2-7, que apresentou uma afinidade de 1,4 nM a IL-13 humana recombinante tipo natural e maior afinidade (43 pM) para IL-13 macaco como avaliado por Biacore (Wyeth PCT WO 2006/0073148A1). Devido à diferença de afinidade, essa mAb pde inibir a IL-13 de macaco se ligar a IL-13Ra2 efetivamente, todavia ela inibe a ligação IL-13 humana ao mesmo receptor com muito menos potencia.

[00217]Os mAbs BAK502G9 e MJ2-7 possuem epitopos similares (CAT PCT WO 2005/007699 e Wyeth PCT WO 2006/0073148A1) e eles competem para ligação a IL-13 como avaliado pela competição ELISA. Em resumo, BAK502G9 foi imobilizado sobre placa ELISA seguido por lavagem e bloqueio. Em seguida IL-13 humana biotinilada (10 ng/mL) foi acrescentado à placa em presença de diversas concentrações de MJ2-7 (0,2 ng/mL a 20 ug/mL), seguido por lavagem e detecção usando anticorpo anti-biotiina HRP-conjugado. Esse estudo demonstrou que MJ2-7 competiu de modo dose-dependente com BAK502G9 para a ligação a IL-13 humana. Um controle negativo de IgG não mostrou competição com BAK502G9.

Exemplo 1.2.D Determinação da sequência aminoácido da região variável para cada mAb murina anti-IL-13 humana

[00218]Para cada determinação da sequência aminoácido, aproximadamente 10xl06 células hibridoma foram isoladas por centrifugação e processadas para isolar o RNA total com Trizol (Gibco BRL/Invitrogen, Carlsbad, CA.) seguindo as instruções do fabricante. O RNA total foi submetido a uma síntese do DNA da primeira fita usando o Sistema Superscript First-Strand Synthesis (Invitrogen, Carlsbad, CA) segundo as instruções do fabricante. Oligo(dT) foi usado para iniciar a síntese da primeira fita para selecionar quanto a poli(A)+ RNA. O cDNA primeira fita produzido foi em seguida amplificado por PCR com iniciadores designados para amplificação das regiões variáveis da imunoglobulina murina (Ig- Primer Sets, Novagen, Madison, WI). Os produtos de PCR foram resolvidos em um gel de agarose, extirpados, purificados, e em seguida subclonados com o Kit de Clonagem TOPO em um vetor pCR2.1-TOPO vetor (Invitrogen, Carlsbad, CA) e transformados em TOP10 E.coli quimicamente competente (Invitrogen, Carlsbad, CA). O PCR colonico foi realizado nos transformantes para identificar clontes contendo inserto. O DNA plasmídeo, foi isolado a partir dos clones contendo inserto usando um kit QIAprep Miniprep (Qiagen, Valencia, CA). Os insertos nos plasmídeos foram sequenciados em ambas as fitas para determinar as sequências DNA das cadeias variáveis pesadas ou leves usando iniciadores M13 para frente e M13 reverso (Fermentas Life Sciences, Hanover MD). As sequências variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve dos 17 anticorpos monoclonais descritos no Exemplo 1.2.C são descritos na Tabela 5.

Exemplo 2: Anticorpos anti-IL-13 humana recombinantes Exemplo 2.1: Construção e expressão de anticorpos anti-IL-13 humana quiméricos recombinantes

[00219]O DNA que codifica a região constante de cadeia pesada de anticorpos monoclonais murinos anti-IL-13 humana 5G1, 13C5, 9C11, 21D9, e 3H7 foi substituído por um fragmento cDNA codificador da região constante da IgG1 humana contendo 2 mutações aminoácidos na região de articulação por meio de recombinação homóloga em bactéria. Essas mutações são uma mudança de leucina para alanina na posição 234 (numeração EU) e uma mudança de leucina para alanina na posição 235 (Lund et al., 1991, J. Immunol., 147: 2657). Uma região constante de cadeia leve de cada um desses anticorpos foi substituída por uma região constante kappa humana. Anticorpos quiméricos de comprimento completo foram expressos de forma transiente nas células COS por co-transfecção de cDNAS quiméricos de cadeia pesada e leve ligados no plasmídeo de expressão pBOS (Mizushima e Nagata, Nucleic Acids Research 1990, Vol 18, pg 5322). Os sobrenadantes das células contendo o anticorpo quimérico recombinante foram purificados através de cromatografia por Proteína A Sepharose e o anticorpo ligado foi eluído pela adição de tampão ácido. Os anticorpos foram neutralizados e dialisados em PBS.

[00220]Os anticorpos monoclonais quiméricos anti-IL-13 humano purificados foram em seguida testados quanto às suas capacidades para inibir a produção de TARC induzida por IL-13 por meio de células A-549 como descrito no Exemplos 1.1.C2 e 1.1.C3. A tabela 12 mostra os valores de IC50 provenientes dos bioensaios de A-549 bioassays para três anticorpos quiméricos. Tabela 9 Neutralização of rhIL-13 wt por anticorpos quiméricos anti-IL-13 em bioensaio A-549

Exemplo 2.2: Construção e expressão de anticorpos humanizados anti-IL-13 humana 2.2.1: Seleção das cadeias estruturais do anticorpo humano

[00221]Cada sequência genética da cadeia variável pesada e variável leve (como descrito na Tabela 3) foi separadamente alinhado contra 44 linhas genéticas de imunoglobulina humana de cadeia pesada variável ou 46 linhas genéticas de sequências de cadeia leve variável (derivada de NCBI Ig Blast website em http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/retrieveig.html.) usando software vetor NTI.

[00222]A humanização foi baseada na homologia da sequência aminoácido, análise de agrupamento CDR, frequência de uso em meio aos anticorpos humanos expressos, e informação disponível nas estruturas do cristal. Levando em conta os pssiveis efeitos sobre a ligação anticorpo, o emparceiramento VH-VL, e outros fatores, resíduos murinos foram mutados para resíduos humanos onde os resíduos murino e humano da cadeia estrutural eram diferentes, com poucas exceções. Estratégias adicionais de humanização foram projetadas com base na análise das sequências de anticorpos de linhas genéticas humanas, ou um seu subgrupo, que possuisem um alto grau de homologia, isto é, similaridade de sequência, em relação à sequência aminoácido vigente das regiões variáveis do anticorpo murino.

[00223]A modelagem da homologia foi usada para identificar resíduos únicos relativamente às sequências anticorpo murinas que são preditas serem cruciais para a estrutura do spitio de combinação do anticorpo (os CDRs). A modelagem da homologia é um método computacional por meio do qual coordenadas aproximadamente tridimensionais são geradas para uma proteína. A fonte das coordenadas iniciais e o direcionamento quanto ao seu refino adicional é uma segunda proteína, a proteína de referência, para a qual as três coordenadas tridimensionais são conhecidas e a sequência da qual está relacionada com a sequência da primeira proteína. A relação entre as sequências das duas proteínas é usada para gerar uma correspondência entre a proteína de referência e a proteína para a qual as coordenadas são desejadas, a proteína alvo. As sequências primárias das proteínas de referência e alvo estão alinhadas com coordenadas de partes idênticas das duas proteínas transferidas diretamente a partir da proteína de referência para a proteína alvo. As coordenadas para as partes não encaixantes das duas proteínas, por exemplo, provenientes de mutações de resíduos, inserções, ou apagamentos, são construídas a partir de modelos estruturais genéticos e refinados em energia para assegurar consistência com as coordenadas de modelo já transferido. Essa estrutura protéica computacional pode ser adicionalmente refinada ou empregada diretamente nos estudos de modelagem. Deverá ficar clafo a partir dessa descrição que a qualidade da estrutura modelo é determinada pela precisão da contenção que as proteínas referência e alvo estão relacionadas e a precisão com que o alinhamento da sequência é construído.

[00224]Para as sequências murinas 5G1, 13C5 e 9C11, a combinação da pesquisa BLAST e a inspeção visual foi usada para identificar adequadas estruturas de referência. Identificação de sequência de 25% entre as sequências aminoácido de referência e alvo é considerado o mínimo necessário para tentar um exercício de modelagem da homologia. Os alinhamentos da sequência foram construídos manualmente e as coordenadas do modelo foram geradas com o programa Jackal (ver Petrey, D., Xiang, Z., Tang, C.L., Xie, L., Gimpelev, M., Mitros, T., Soto, CS. , Goldsmith-Fischman, S., Kernytsky, A., Schlessinger, A., et al. 2003. Using multiple structure alignments, fast model building, and energetic analysis in fold recognition e homology modeling. Proteins 53 (Suppl. 6): 430-435).

[00225]As sequências primárias das regiões da cadeia estrutural murina e humana dos anticorpos selecionados compartilham significativa identidade. Posições no resíduo que diferem são candidatos para a inclusão do resíduo murino na sequência humanizada a fim de manter a observada potência ligante do anticorpo murino. Uma lista de resíduos da cadeia estrutural que diferen entre a sequência humana e murina foi construída manualmente.

[00226]A probabilidade de que um dado resíduo da cadeia estrutural possa impactar as propriedades ligantes do anticorpo depende em suas proximidades aos resíduos de CDR. Portanto, utilizando as estruturas modelo, os resíduos que diferem entre as sequências murina e humana foram graduados de acordo com as suas distâncias a partir de qualquer átomo nos CDRs. Aqueles resíduos que se situavam dentro de 4,5 A de qualquer átomo CDR eram identificados como muito importantes e eram recomendados serem candidatos para a retenção do resíduo murino no anticorpo humanizado (isto é mutação reversa).

[00227]Para a humanização das regiões variáveis 5G1, a abordagem geral providas na presente invenção foi seguida. Primeiro, um modelo molecular das variáveis da região 5G1 foi construído com a ajuda dos programas de computador ABMOD e ENCAD (Levitt, M., J. Mol. Biol. 168: 595-620 (1983)). Em seguida, baseado numa pesquisa de homologia contra sequências de segmento V e J humanos, o segmento VH 21/28 (Dersimonian, H., et al., J. Immunol. 139: 24962501 (1987)) e o segmento J de JH4 (Ravetch, J.V., et al., Cell 27: 583-591 (1981)) foram selecionados para proporcionar as cadeias estruturais para a região variável de cadeia pesada Hu5G1. Para a região variável de cadeia leve 5G1, o segmento L HF-21/28 (Chastagner, P., et al., Gene 101: 305-306 (1991)) e o segmento J JK4 (Hieter, P.A., et al., J. Biol. Chem. 257: 1516-1522 (1982)) foram usados. A identidade dos aminoácidos da cadeia estrutural entre 5G1 VH e o aceitador humano 21/28 e segmentos JH4 foi de 72%, enquanto a identidade entre 5G1 VL e o aceitador humano HF21/28 e segmentos JK4 foi de 83%. Nas posições da cadeia estrutural em que o modelo de computador sugeriu significativo contato com os CDRs, os aminoácidos provenientes de regiões V de camundongo foram substitutos para os aminoácidos da cadeia estrutural original humana. Isso foi feito nos resíduos 48, 67, 68, 70, 72, 74 e 97 da cadeia pesada. Para a cadeia leve, a substituição foi feita no resíduo 50. Os resíduos da cadeia estrutural que ocorreram apenas raramente em suas respectivas posições nos correspondentes subgrupos das regiões V humanas foram substituídos com aminoácidos humanos de consenso naquelas posições. Isso foi feito nos resíduos 44 e 76 da cadeia pesada, e nos resíduos 2, 15, 41, 42, 44 e 51 da cadeia leve.

[00228]Para humanização das regiões variáveis 13C5, a abordagem geral provida na presente invenção foi seguida. Primeiro, um modelo molecular das regiões variáveis 13C5 foi construído com a ajuda dos programas de computador ABMOD e ENCAD (Levitt, M., J. Mol. Biol. 168: 595-620 (1983)). Em seguida, com base na pesquisa de homologia contra sequências de segmento V e J humano, o segmento VH M60 (Schroeder, Jr., H.W. e Wang, J. Y., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6146-6150 (1990)) e e o segmento J JH4 (Ravetch, J.V., et al., Cell 27: 583-591 (1981)) foram selecionados para proporcionar as cadeias estruturais para a região de cadeia variável pesada e Hu13C5. para a região variável de cadeia Hu13C5, o segmento VL III-3R (Manheimer-Lory, A., et al., J. Exp. Med. 174: 1639-1652 (1991)) e o segmento J JK4 (Hieter, P.A., et al., J. Biol. Chem. 257: 1516-1522 (1982)) foram usados. A identidade da cadeia estrutural aminoácidos entre 13C5 VH e o aceitador humano M60 e segmentos JH4 foi de 74%, enquanto que a identidade entre 13C5 VL e o aceitador humano III-3R e segmentos JK4 foi de 75%.

[00229]Nas posições da cadeia estrutural em que o modelo de computador sugeriu contato significativo com os CDRs, os aminoácidos das regiões V de camundongo foram substitutos para os aminoácidos da cadeia estrutural humana original. Isso foi feito nos resíduos 22, 49 e 71 para a cadeia leve. Os resíduos da cadeia estrutural que ocorreram apenas raramente em suas respectivas posições nos correspondentes subgrupos das regiões V humanas foram substituídos com aminoácidos humanos de consenso naquelas posições. Isso foi feito nos resíduos 10, 46, 83, 84, 86 e 87 da cadeia pesada, e at resíduos 62 e 73 da cadeia leve. Sequências aminoácidos de VL e VH de mAbs humanizados são mostrados na Tabela 10. Tabela 10: Lista de sequências aminoácidos de mAbs humanizados

Exemplo 2.2.2: Construção do anticorpos humanizados

[00230]Anticorpos humanizados construídos em silício descritos acima foram construídos novamente usando oligonucleotídeos. Para cada cDNA de região variável, 6 oligonucleotídeos de 60-80 nucleotídeos foram projetados para se sobrepor entre si por 20 nucleotídeos na terminação 5' e/ou 3' de cada oligonucleotídeo. Na reação de anelamento, todos os 6 oligos foram combinados, fervidos, e anelados em presença de dNTPs. Em seguida DNA polimerase I, fragmento Large (Klenow) (New England Biolabs #M0210, Beverley, MA.) foi acrescentado para preencher os espaços de aproximadamente 40bp entre os oligonucleotídeos sobrepostos. PCR foi em seguida realizado para amplificar o inteiro gene da região variável usando dois iniciadores situados mais externos contendo sequências apensadas complementares ao sítio de clonagem múlgipla num vetor pBOS modificado (Mizushima, S. e Nagata, S., (1990) Nucleic Acids Research Vol 18, No. 17)). Os produtos de PCR derivados de cada monômero cDNA foram separados em gel de agarose e a banda correspondente ao tamanho predito do cDNA da região variável foi extirpada e purificada. A região variável de cadeia pesada foi inserida em quadro por sobre um fragmento cDNA codificador da região constante da IgG1 humana contendo 2 mutações aminoácido na região de articulação mediante recombinação homóloga em bactéria. Essas mutações são uma mudança de leucina para alanina na posição 234 (numeração EU) e uma mudança de leucina para alanina na posição 235 (Lund et al., 1991, J. Immunol., 147: 2657). A região variável de cadeia leve foi inserida em quadro com a região constante kappa humana mediante recombinação homóloga. As colônias bacterianas foram isoladas e o DNA do plasmídeo extraído; insertos do cDNA foram seqüenciados em suas totalidades. As cadeias pesadas e leves humanizadas corrigidas correspondentes a cada anticorpo foram co-transfectadas em células COS para produzir de modo transiente anticorpos humanizados completos anti-IL-13 humana. Para 13C5, vetores pBOS contendo o cDNA enxertado da cadeia pesada 13C5 e o cDNA enxertado da cadeia leve 13C5 foram co-transfectados nas células COS. Os cbns das células contendo o anticorpo quimérico recombinante foram purificados através de cromatografia por Proteína A Sepharose e o anticorpo ligado foi eluído pela adição de tampão ácido. Os anticorpos foram neutralizados e dialisados em PBS. Diversos anticorpos humanizados são descritos na Tabela 10.

[00231]A capacidade dos anticorpos humanizados purificados para inibir a atividade IL-13 foi determinada usando o bioensaio de A-549 como descrito nos Exemplos 1.1.C. As afinidades ligants dos anticorpos humanizados para a IL-13 humana recombinante foram determinadas usando medição da ressonância plásmon de superfície (Biacore®) como descrito no Exemplo 1.1.B. A Tabela 11 mostra valores IC50 provenientes dos bioensaios de A-549 e a afinidade dos primeiros seis anticorpos humanizados descritos na Tabela 10 para a IL-13 humana wt e variante. Tabela 11: Potencial de Neutralização e afinidade de mAbs anti-IL-13 humanizado

[00232]As sequências de CDR do anticorpo humanizado 13C5.5 foram adicionalmente mutadas usando técnicas conhecidas na arte, e três anticorpos humanizados adicionais foram gerados. A capacidade desses adicionais anticorpos humanizados para inibir a atividade IL-13 humano, cynomolgus e rhesus foi determinada usando o bioensaio de A-549 como descrito nos Exemplos 1.1.C. As afinidades ligantes dos adicionais anticorpos humanizados a IL-13 recombinante humano, cynomolgus e rhesus foram determinadas usando medição por ressonância plásmon de superfície (Biacore®) como descrito no Exemplo 1.1.B. Adicionalmente a se ligar e inibir a IL-13 humana, esses três adicionais anticorpos apresentram aprimorada afinidade para IL-13 de cynomolgus e rhesus. A Tabela 12 mostra valores de IC50 provenientes do bioensaio de A-549s, e a Tabela 13 mostra a afinidade dos adicionais anticorpos humanizados para a IL-13 humano, cynomolgus e rhesus. Tabela 12: Potencial de neutralização de mAbs anti-IL-13 humanizado

Tabela 13: Afinidade ligante de mAbs anti-IL-13 humanizado adicional

Exemplo 2.2.3: Caracterização de anticorpos antio-IL-13 humanizados

[00233]Foram isolados anticorpos monoclonais que bloqueiam a ligação IL13 a ambos IL-13Rα1 e IL-13Ra2. Ambos ensaio de ligação ao receptor baseado em ELISA e ensaio de ligação a IL-13 marcado por 125-I na superfície da célula demonstraram que 13C5, ambos versão murina e versão humanizada (isto é 13C5.5), foram capazes de efetivamente bloquear a ligação IL13 a ambos os receptores. Anticorpos na mesma linhagem como 13C5, incluindo 25C8 e 33C3, foram também capazes de bloquear a ligação IL13 a ambos os receptores.

Exemplo 2.2.3.a: Anticorpos IL-13 humanizados bloqueiam a ligação da IL- 13 ao receptor de IL-13

[00234]Para determinar a capacidade do anticorpo humanizado 13C5.5 bloquear a ligação IL13 aos receptores de IL-13 (IL-13Rα1 e IL-13Rα2), um ensaio de ligação ao receptor baseado em ELISA foi usado. Placas ELISA de alta ligação de 96 cavidades foram revestidas com 4 ug/mL de IL-13 humana recombinante Ra1/Fc ou IL-13Rα2/Fc (R&D Systems) em 100 ul tampão de revestimento/cavidade (tampão carbonato-bicarbonato, Pierce) a 40C. Após 16hr, a solução de revestimento foi removida mediante despejar os conteúdos da placa numa pia, e as placas foram lavadas e bloqueadas 4 vezes com Tampão d Bloqueio Superblock (240ul/cavidade) (Pierce). mAb anti-IL-13 humanizado 13c5.5 e mAbs controle (1:4 diluída serialmente de 40ug/mL, 50ul/cavidade) e Biotin-IL-13 (50ul/cavidade, concentrações finais de 5nM para hIL-13Ra1/Fc, e 0,5nM para hIL-13Rα2/Fc) foram acrescentados e incubados por 2hr na temperatura ambiente (RT). As placas foram lavadas 5 vezes com 300ul 0,1%PBST, e em seguida 100ul de MAb antibiotina de camundongo diluído 1:5000 (Jackson Immunosciences) foi acrescentado e incubado na temperatura ambiente por 45 min. As placas foram lavadas novamente 5 vezes com 300ul 0,1%PBST, seguido pela adição de reagente de substrato TMB (100ul/cavidade, Pharmingen); desenvolvido por 5 min, e interrompido pela adição de 50ul de H2SO4 2M (VWR). ODs a 450nm foram determinados por espectrofotometria. Os resultados são mostrados na Tabela 14.

[00235]Adicionalmente, as propriedades bloqueadoras do receptor de mAbs foram também avaliadas pelo ensaio de ligação ao receptor usando células COS transfectadas por IL-13Rα2. IL-13 humana recombinante foi marcada com 125I (Amersham, Arlington Heights, IL), usando reagente IODO-GEN (Pierce, Rockford, IL) como anteriormente descrito (Obiri NI et al., (1995) J Biol Chem. 270: 87978804). A atividade específica da IL-13 radiomarcada foi avaliada ser de 158 μCi/μg proteína. A IL-13 marcada apresentou bioatividade similar como a IL-13 não marcada, como avaliado pelo bioensaio A-549. Para experimentos ligantes, as células COS foram transfectadas de modo transiente com Rα2-IL-13 por Lipofectamine 2000 (Invitrogen), e incubadas por 48 h. As células COS transfectadas (5 x 105 células em 100 μL de tampão de ligação:RPMI 1640 contendo 0,2% de albumina de soro humano e 10 mmol HEPES) foram incubadas com 1,0 nM 125I-IL-B com ou sem 1 uM de IL-13 não marcada a 40C por 2 horas. Célula ligada a 125I-IL-13 foi separada da não ligada a 125I-IL-13 mediante centrifugação através de um gradiente de óleo ftalato, e a radioatividade foi determinada com um contador gama (Wallac, Gaithersburg, MD). Para o ensaio de deslocamento do anticorpo, células COS transfectadas foram incubadas com 125I-IL-13 (1,0 nM) com ou sem o aumento das concentrações (até 50 ug/mL) de anticorpos anti-IL-13, como descrito anteriormente. Os resultados são mostrados na Tabela 14. Tabela 14: Potencial de mAbs em bloquear a ligação IL-13 humana (wt) a IL- 13 humana Rα2 em ensaios de ligação ao receptor baseado na superfície da célula e baseado em ELISA

P.B. Bloqueio parcial que não atinge 50% de inibição A Tabela 15 mostra a afinidade ligante do anticorpo 13C5.5 humanizado e outros anticorpos IL-13 Tabela 15: Afinidade ligante de mAbs anti-IL-13 como avaliado por Biacore

[00236]Em ambos ambos os ensaios de ligação ao receptor baseado na superfície da célula e baseado em ELISA, 13C5.5 apresenta alto potencial em bloquear a ligação da IL-13 humana a IL-13 humana Rα2, com uma IC50 entre 1 e 3 nM. Embora ambos BAK502G9 e MJ2-7 fossem também capazes de reduzir o sinal ligante, seus potenciaos foram muito mais baixos que aquele do 13C5.5 (ver Tabela 14), pelo menos parcialmente devido à sua mais baixa afinidade a IL-13wt humana (ver Tabela 15). MAb13.2 não foi capaz de inibir a ligação IL13 a IL-13Ra2, consistente com seu epitopo. Adicionalmente, 13C5.5 pode conseguir 100% inibição em ambos ensaios numa concentração de 100 nM (ou 15ug/ml). Na mesma concentração, BAK502G9 e MJ2-7 apresentou apenas 40% e 70% de inibição, respectivamente, no ensaio ligante de receptor baseado na superfície da célula, e ambos apresentaram apenas 60% inibição no ensaio de ligação ao receptor baseado em ELISA.

[00237]Com um mAb terapêutico com uma meia-vida sérica entre 10 e 20 dias em um homem, a concentração sérica está normalmente entre 5-15 ug/mL, com regime de dosagem de 3mpk IV ou SC semanalmente ou bi-semanalmente. Com base nesse cálculo, 13C5.5 é atualmente o único mAb anti-IL-13 que é provável de bloquear completamente (100%) a ligação da IL-13 humana a IL-13Rα2 in vivo como um mAb terapêutico, numa concentração sérica de 100 nM (ou 15ug/ml), sob um regime de dosagem convencional de um anticorpo monoclonal.

Exemplo 2.2.3.b: Ligação de anticorpos anti-IL-13 ao epitopo específico em IL-13

[00238]Os epitopos na IL-13 humana os mAbs anti-IL-13 13C5, 13C5.5, 9Cl 1 e 5G1 se ligam foram mapeados usando uma técnica de extirpação do epitopo, seguido pela análise do peptídeo com espectrometria de massa (MS). Na excisão do epitopo, a proteína foi primeiramente ligada a um mAb imobilizado e em seguida diferida com enzimas proteolíticas. As regiões de epitopo numa proteína foram determinadas mediante utilização da MS e MS/MS para identificar peptídeos contendo o epitopo. Microesferas Sepharose ativadas por CNBr (Amersham Biosciences, 10 mg/reação) foram suspensas em 500 uL de HCl 0,1M e equilibrada por 15 minutos. As microesferas foram transferidas para dentro de colunas compactas de reação (USB Corporation) e lavadas com HCl 0,1M seguida por tampão de acoplamento NaHCO3 0,1M. O mAb (100 ug) foi acrescentado à suspensão e incubado por 2 h com lenta rotação na temperatura ambiente. Microesferas com o mAb covalententemente anexado foram lavadas com tampão Tris-HCl 0,1M ~pH 8,0. O bloqueio dos grupos não reagidos nas microesferas Sepharose CNBr foi conseguido mediante incubação por 2 h com um tampão Tris- HCl 0,1M ~pH 8,0. O mAb não acoplado foi removido pela lavagem sequencial com dois tampões de pH diferentes; 1) 0,1 M acetato de Na, tampão 0,5M NaCl ~pH 4,0 e, 2) tampão 0,1 M Tris-HCl, 0,5M NaCl -pH 8,0. As microesferas foram equilibradas em PBS ~0,14 M NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, pH 7,2 e incubado por 2 h na temperatura ambiente, com e sem IL-13. Após lavagem das microesferas com PBS ~pH 7,2, uma alíquota da suspensão foi removida para a anls MALDI-TOF.

[00239]A proteína ligada por afinidade foi digerida com diferentes proteases (relação enzima:substrato 1:100-1:20) por 12 h. Proteases usadas incluíram: Tripsina, GluC, Quimiotripsina, Carboxipeptidase Y e Aminopeptidase M. Em seguida da proteólise, as microesferas foram lavadas com 500 uL de tampão de digestão. Os últimos 100 uL da solução de lavagem foi guardado como controle. Cerca de 100 uL de 2% TFA foi acrescentado às microesferas e coletado. Ambas as soluções de lavagem controle e ácida foram primeiramente concentradas para cerca de 20 uL sob vácuo. Os peptídios foram em seguida dessalinizados com ziptips C18. As amostras foram analisadas por MALDI-ToF MS, usando um ou outro do sistema Voyager DE ou um Voyager DE-Pro. A análise por nano-ESI-LC-MS/MS foi realizada num sistema Agilent 1100 Capillary HPLC interfaceado a um sistema Sciex Q-Star Pulsar i MS.

[00240]No estudo dos epitopos de 13C5, duas proteases usadas nas etapas sequenciais produziram os melhores resultados. Com quimiotripsina, um peptídeo importante consistindo de resíduos aminoácidos 100-130 da SEQ ID NO. 1 foi detectado, indicando que ela pode conter o(s) epitopo(s). Quantidades pequenas de peptídeos de resíduos aminoácidos 103-130 e 104-130 da SEQ ID NO. 1 foram também detectados. Aminopeptidase M foi usada após a digestão da Quimiotripsina. O peptídeo importante detectado foi resíduos aminoácidos 104-130 da SEQ ID NO. 1, sugerindo que os 4 resíduos aminoácidos N-terminal (80-83) não eram parte do epitopo. A digestão posterior com carboxipeptidase Y resultou na perda de afinidade. Não foi observado peptídeo após digestion e lavagem. Todas as sequências peptídeo foram confirmadas usando nano-ESI-LC-MS/MS.

[00241]O mapeamento epitopo de 13C5 e 13C5.5 indicaram que seu(s) sítio(s) ligante(s) incluíam C-terminal da região D-helicóide da IL-13 humana (resíduos VRDTK EEVAQ FVKDL LL HLK KLFRE GR, correspondentes a aminoácidos 104-130 da SEQ ED NO. 1). O C-terminal da região D-helicóide tem sido sugerido estar envolvido nas interações com o receptor de IL-13 (Zuegg et al 2001 Immunol Cell Biol. 79: 332-9).

Exemplo 2.3: Cristalização de anti-IL-13 complexada a IL-13.

[00242]A parte Fab de 13C5.5 foi complexada com IL-13 humana e cristais do complexo foram gerados como a seguir.

Exemplo 2.3.1: Preparação e Purificação do fragmento Fab 13C5.5

[00243]Para preparar fragmento Fab 13C5.5, 13C5.5 IgG em tampão PBS 0,15M foi primeiramente concentrado a 2 mg/mL usando um dispositivo de filtro de centrifugação Ultrafree-15 Biomax corte em peso molecular 10 kDa (MWCO) (Millipore). Polpa fluida de gel de papaína (Pierce) foi pré-lavado e carregado em 23X com Tampão A (20 mM Na2HPO4, 10 mM EDTA, 20 mM cisteína) numa relação volumétrica 1:1. O anticorpo concentrado foi em seguida misturado com 50% polpa fluida de gel papaína e incubado a 37 °C por 24 horas com vigorosa agitação. A mistura anticorpo/polpa fluida foi centrifugada (Beckman 6KR) e o sobrenadante foi carregado numa Superdex 75 pré-equilibrada com PBS. Um pico maior eluiu e a proteína foi misturada. Uma coluna de afinidade Protein A Sepharose 4 Fast Flow de 25 mL (Amersham Pharmacia) foi preparada por lavagem com 100 mL de PBS. Os fragmentos de anticorpo misturados foram aplicados a uma coluna de afinidade (2 mL/min vazão). As frações contendo fragmentos 13C5.5 Fab (monitorados por absorbância UV a 280 nm) foram misturados e coletados no transcurso. Frações contendo uma concentração de fragmento Fab 13C5.5 maior que 0,3 mg/mL (determinada por absorbância UV a 280 nm) foram misturadas e congeladas a -80 0C. A pureza da amostra foi avaliada com SDS-PAGE.

Exemplo 2.3.2: Preparação do complexo IL-13/13C5.5Fab

[00244]IL-13 humana recombinante foi expressa no sistema de expressão mamífero e em seguida purificado usando técnicas bem conhecidas na arte. Proteína IL-13 humana recombinante e 13C5.5 Fab foram misturadas numa relação molar de 1:1 e incubadas por 1 hora a 4 0C. A amostra do complexo foi carregada numa coluna Superdex 200 pré-equilibrada (20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl) a 0,5 mL/min. O complexo foi misturado e concentrado a 24 mg/mL usando um dispositivo de filtro de centrifugação Ultrafree-15 Biomax corte em peso molecular 10 kDa (MWCO) (Millipore) e congelado a -80 °C. A pureza da amostra foi avaliada com SDS-PAGE.

Exemplo 2.3.3: Cristalização da IL-13/13C5.5 Fab Complex

[00245]Estoque congelado do complexo IL-13/13C5.5 (~24 mg/mL) foi descongelado em gelo. O complexo (1,0 μL) foi misturado com 1,0 μL da solução reservatório (1,75 M sulfato de amônio, 100 mM MES pH 6,5, 10 mM CaCl2). A gota resultante foi misturada numa cavidade de incubação da gota (CrysChem sitting- drop plate) sobre o reservatório a cerca de 18°C. Cristais do tipo diamante surgiram no intervalo de uma semana.

Exemplo 2.3.4: Crioproteção e Resfriamento Flash dos cristais do complexo de IL-13/13C5.5 Fab

[00246]Cristais do complexo de IL-13/13C5.5 Fab foram coletados usando uma alça em fibra no licor mãe + 20% glicerol. Os cristais foram em seguida resfriados flash mediante imersão em nitrogênio líquido.

Exemplo 2.3.5: Coleta de dados de difração de raios-X do complexo IL- 13/13C5.5 Fab

[00247]Dados de difração de raios-X dos cristais IL-13/13C5.5 Fab foram coletados na linha de feixe IMCA na the Advanced Photon Source in Argonne, EL. Os cristais foram mantidos numa temperatura de 100 K com um resfriador Oxford Cryosystems Cryostream durante a coleta dos dados. Um total de 180 quadros foram coletados numa faixa de oscilação de 1,0°. Os dados foram processados com o conjunto de programas HKL2000 (Otwinowski and Minor, 1997). Após determinação da orientação do cristal, os dados foram integrados com DENZO e escalonados e consolidados com SCALEPACK, e colocados numa escala absoluta e reduzidos para amplitudes do fator de estrutura com TRUNCATE (French and Wilson, 1978). Cinco por cento de reflexões únicas foram consignadas, em um modo aleatório, para ser o conjunto “livre”, para o cálculo do fator livre-R (Rfree) (Brünger, 1992); o restante 95% das reflexões constituíram o conjunto de “trabalho”, para o cálculo do fator-R (R). Os dados de difração de raios-X estão resumidos na Tabela 16. As listas apresentadas adiante são índices para a forma cristal: (1) IL-13/13C5.5 Fab: grupo espaço P2( 1)2(1)2(1), a = 163.578 A, b = 163,318 A, c = 228.627 A, α = 90,0°, β= 90,0°... y =90,0°. A Tabela 17 lista as estatísticas da difração de raios-X para o conjunto de dados. Tabela 16: Sumário de Informação da Célula Unitária Cristalográfica do Complexo IL13/13C5.5 Fab

Tabela 17: Sumário de Estatísticas de dados de difração de raios-X para o complexo IL-13/13C5.5 Fab

♦ Maior resulução entre parêntesis

Exemplo 2.3.6: Solução de substituição molecular e refinamento da estrutura cristalina do complexo IL-13/13C5.5 Fab

[00248]Uma máxima probabilidade de solução se substituição molecular foi determinada usando o programa PHASER (Read, 2001). Um total de seis monômeros 13C5.5 foram resolvidos numa resolução de 3,0 A no grupo espaço P2(1)2(1)2(1). O modelo de pesquisa foi a estrutura cristalina de Fab reportada anteriormente (Protein Data Bank entrada IBJ1; Muller et al. 1998). As coordenadas foram 10 geradas com base na solução de substituição molecular.

[00249]O refinamento da estrutura cristalina do complexo IL-13/13C5.5 Fab iniciou com as coordenadas da solução de substituição molecular, descrita acima, no grupo espaço P2(1)2(1)2(1). O refinamento iniciou usando refinamento em corpo rígido através do programa REFMAC disponível no conjunto de programas CCP4 (Murshudov et al., 1997, Collaborative Computational Project, 1994), que resultou nas estatísticas seguintes a 2,6 A: R de 40,00% (Rfree 39,00%). Novamente a densidade eletrônica da IL-13 foi observada. A construção manual de seis monômeros IL-13 foi orientada pela estrutura RMN pública da IL-13 1IJZ (Moy et al., 2001) usando o programa O de gráficos moleculares (Jones et al., 1991) e exame dos mapas de densidade eletrônica de 2Fo-Fc e Fo-Fc. O programa de refinamento REFMAC (Murshudov et al., 1997) foi usado para rodadas interativas de refinamento contido resultando nas estatísticas seguintes: R de 25,8% (Rfree 30,5%). Resultados são mostrados na Tabela 18. Tabela 18: Sumário das etatísticas de refinamento cristalográfico do complexo IL-13/13C5.5 Fab

Exemplo 2.3.6: estrutura do complexo IL-13/13C5.5 Fab

[00250]Contatos extensivos são observados entre IL-13 humana e múltiplos 13C5.5 CDRs. A área da superfície enterrada na interface anticorpo-antígeno interface é 1415,50 A. Os contatos são compreendidos de críticas ligações hidrogênio e interações hidrofóbidas que estabilizam a interface. Os dois segmentos mínimos da sequência que compreende a maior parte dos contatos de interface estão nas hélices A e D da IL-13 (para a estrutura da IL-13 ver publicação de Patente U.S. No. 2003-0013851 A1 aqui incorporado por referência). Esses contatos engajam L1 e L3, e H2 e H3 do CDR. H3. Com base no mencionado, a faixa ligante do epitopo 13C5.5 compreende a região topográfica definida por Ser26-Asn38, Lysl23-Argl30 da SEQ ID NO. 1. Mais preferivelmente, a faixa ligante do epitopo 13C5.5 compreende a região topográfica definida por Arg30-Asn38, Lysl23-Argl27 da SEQ ID NO. 1.

Exemplo 2.4: Eficácia in vivo dos anticorpos IL-13 humanizados A eficácia in vivo dos anticorpos anti-hIL-13 foi avaliada como a seguir. Exemplo 2.4.1: Eficácia in vivo de anticorpos IL-13 humanizados em modelos asma induzida por IL-13 humana

[00251]A eficácia dos anticorpos anti-hIL-13 5G1, 13C5, e 13C5.5 foram testados em um modelo asma induzido por IL-13 humana em camundongos. Camundongos foram provocados com IL-13 humana recombinante numa dose de 1 μg em 50 μL de PBS estéril, aplicado na traquéia com um microaspersor usando um laringoscópio para roedores para visualizar a abertura traqueal. Um total de 2 doses da IL-13 foi dada nos dias 1 e 2 do estudo e a responsividade das vias respiratórias (AHR; Hoymann, H.G.; J Pharmacol Toxicol Métodos. 2007 Jan-Feb; 55(1): 16-26) bem como muco, quitinase acídica mamífero (AMCase, Donnelly LE, Barnes PJ., 1: Trends Pharmacol Sci. 2004 Oct;25(10): 509- 11) e quimiocina tímica e regulada por ativação (TARC; Bisset LR, Schmid-Grendelmeier P., Curr Opin PuIm Med. 2005 Jan;l l(l): 35-42) foram medidas no fluido da lavagem broncoalveolar 24 horas após o final da provocação. Doses de anticorpos de 100, 300, e 1000 μg foram administradas através de injeção intraperitoneal 1 dias antes da primeira provocação com IL-13 e os resultados são resumidos na Tabela 19. O anticorpo 5G1, que não bloqueia a ligação da IL-13 a um ou outro de IL-13Rα1 ou IL-13Rα2, foi incapaz de neutralizar a bioatividade da IL-13 nesse modelo in vivo com níveis comparáveis de AHR, AMCase, e Muc5ac detectados nos animais tratados com 5G1 comparado aos animais controle tratados com PBS. Em contraste, o anticorpo 13C5 que bloqueia a ligação a ambos os receptores α1 e a2, foi eficaz em reduzir todos os parâmetros. O tratamento IL-13 aumentou a resistência das vias respiratórias de 3,6 cm H2O/mL/s para 5,7 cm H20/mL/s. O tratamento com 13C5 (1000 μg) reduziu a resistência das vias respiratórias para 4,3 cm H2O/mL/s. A hiper-secreção de muco como medido pelos níveis de muc5ac foram reduzidas de 356,5 unidades para um máximo de 211 U com tratamento anticorpo correspondendo a uma redução de 40%. De modo similar, os níveis de AMCase foram reduzidos de 202 U para 68 U correspondendo a uma redução de 66% como comparável a redução observada nos níveis de TARC (n=10, p < .05, todas as doses). O anticorpo humanizado recombinante 13C5.5 demonstrou resultados similares nesse modelo. A IL-13 induziu um aumento na resistência das vias respiratórias em seguida da provocação com 30 μg/mL metacolina de 3,9 para 5,5 cm H2O/mL/s. O anticorpo 13C5.5 inibiu a resistência das vias respiratórias para 4,1, 4,45, e 4,3 cm H20/mL/s em doses de 100, 300 e 1000 μg respectivamente. A hiper-secreção de muco como medido pelos níveis de muc5ac foi reduzido de 247 U induzido por tratamento com IL-13 para 154, 30,2, e 11,1 U em doses de 100, 300, e 1000 μg de tratamento anticorpo respectivamente. Isso representa uma inibição de 38, 88, e 96% da produção de muco com esse anticorpo. O tratamento com IL-13 tratamento induziu 130 U de atividade AMCase que foi reduzida para 113, 98, e 55 U pelo tratamento anticorpo (doses 100, 300, e 1000 μg) representando uma inibição de 14, 24, e 68%. Esses dados demonstram que 13C5 e o anticorpo humanizado recombinante 13C5.5 que bloqueia a ligação da IL-13 a ambos IL-13Rα1 e α2 pode neutralizar respostas da AHR induzidas por IL-13, produção de muco, e AMCase no pulmão enquanto que anticorpos que não bloqueiam a ligação da IL-13 aos receptores α1 e α2 não são eficazes em bloquear a totalidade dessas respostas biológicas. Tabela 19; Eficácia dos anticorpos anti-IL-13 humana em modelo asma induzida por IL-13

*p<0,05, Teste T-Student **p<0,05, ANOVA, Bonferroni ***p<0,01, ANOVA, Bonferroni

[00252]Em um outro estudo, a eficácia de anticorpos anti-hIL-13 BAK502G9, MJ2-7 e 13C5.5 foram comparados com o modelo asma induzido por IL-13 humana em camundongos. Os camundongos foram provocados com IL-13 humana recombinante numa dose de 1 μg em 50 μL de PBS estéril, aplicado de modo intranasal sob leve secação. Um total de 2 doses da IL-13 foi dada nos dias 1 e 2 do estudo e as responsividades das vias respiratórias, bem como muco, e AMCase, foram medidos no fluido da lavagem broncoalveolar 24 h após o término da provocação. Doses de 1000 μg de anticorpo foram administradas por injeção intraperitoneal 1 dia antes da primeira provocação com IL-13.

[00253]Os resultados do estudo estão resumidos na Tabela 20. O anticorpo 13C5.5, que bloqueia a ligação da IL-13 a ambos os receptores a2 da IL-13, foi eficaz em reduzir significativamente a totalidade dos parâmetros. O tratamento com IL-13 aumentou a resistência das vias respiratórias em seguida da provocação com 30 mg/mL metacolina de 4,2 cm H20/mL/s para 7,2 cm H20/mL/s. O tratamento com 13C5.5 (1000 μg) reduziu a resistência das vias respiratórias em 86,8% para 4,6 cm H20/mL/s. A hiper-secreção do muco como medido pelos níveis de muc5ac foi reduzida de 768,2 unidades para 412,9 U com tratamento anticorpo correspondendo a uma redução de 58,8%. De modo similar, os níveis de AMCase foram reduzidos de 316,5 U para 147 U correspondendo a uma redução de 52% reduction (n=10, p < ,001). Ambos os anticorpos BAK502G9 e MJ2-7, que inibem a ligação da IL13 a IL- 13Rα1 mas não inibe efetivamente a liberação da IL13 a IL-13Rα2 demonstraram capacidade comparavel para neutralizar a AHR induzida por IL-13 nesse modelo. Os anticorpos BAK502G9 e MJ2-7 apenas inibiram a resistência das vias respiratórias de 7,2 a 5,96 cm H20/mL/s e 5,93 cm H20/mL/s, respectivamente, representando uma redução de 42% e 41,5% na AHR. A hiper-secreção de muco como medido pelos níveis de muc5ac foram reduzidas de 768,2 U induzida pelo tratamento por IL- 13 para 627,8 e 380 U em doses de 10000 μg do anticorpo correspondendo a uma inibição de 23% e 64% pelos anticorpos BAK502G9 ou MJ2-7, respectivamente. O anticorpo BAK502G9 foi menos eficaz em inibir a AMCase comparado a um ou outro dos anticorpos 13C5.5 ou MJ2-7. O tratamento por IL-13 induziu atividade AMCase de 316,5 que foi reduzida para 279, e 169 U por um ou outro anticorpo BAK502G9 ou MJ2-7 de tratamento (1000 μg dose) representando uma inibição de 8% e 45%, respectivamente. Esses dados demonstram que o anticorpo recombinante humanizado 13C5.5 que bloqueia a ligação da IL-13 a ambos IL-13Rα1 e α2 é muito eficaz em neutralizar respostas induzidas por IL-13 da AHR, produção de muco e da AMCase nos pulmões, enquanto que os anticorpos que bloqueiam a ligação de IL-13 ao receptor IL-13 α2 com mais baixa afinidade não são tão eficazes em bloquear essas respostas biologicas que contribuem para a patogênese da asma. Tabela 20: Comparação de anticorpos 13C5.5, BAK502G9, e MJ2-7 no modelo asma induzido por IL-13

Exemplo 2.4.2: Eficácia in vivo de anticorpos IL-13 em um modelo camundongoasma induzido por OVA

[00254]Para determinar se receptor bloqueia as propriedades (particularmente com respeito a IL-13Rα2) que impactam a eficácia in vivo de mAbs em modelos modelos camundongo, um painel de anticorpo rato anti-camundongo IL- 13 que apresentou diferentes propriedades bloqueadoras de anticorpo, como determinado por ELISA ligante ao receptor usando proteínas mIL-13Rα1/Fc e mIL- 13Rα2/Fc (R&D Systems) (ver Tabela 21) foi gerado. Uma vez que anti-hIL-13 mAb 3H7 reage cruzado com IL-13 de camundongo, suas propriedades anti-mIL-13 são também inclusas na Tabela 21. As afinidades ligantes dos anticorpos para a IL-13 de camundongo foram medidas usando ensaio BIACORE contra IL-13 recombinante de camundongo (R&D Systems), e os potenciais (IC50) dos anticorpos contra IL-13 de camundongo foram determinados por bioensaio A-549 contra IL-13 recombinante de camundongo. As sequências de domínio variável de 51D9 e 48D3 são apresentados na Tabela 22. Tabe a 21. Caracterização de anticorpos monoclonais anti-mIL-13

Tabela 22. Lista de sequências aminoácidos das regiões VH e VL de mAbs anti-mIL-13 de rato

[00255]Para o estudo da eficácia in vivo em um modelo asma murino, os animais (female Balb/c camundongos fêmeas Balb/c) foram adquiridos da Taconic, alojados no Centro de Biopesquisas da Abbott, e utilizados na idade de 8-12 semanas. Todos os protocolos foram aprovados pela IACUC. Os camundongos foram sensibilizados a OVA (Sigma, a endotoxina foi removida da ovalbumina usando DetoxiGel (Pierce) de acordo com protocolo do fabricante e o material final continha menos de 0,1 EU/mg proteína) no dia 0 e 7 com uma injeção intraperitoneal de 8 ug OVA em 2 mg alum (Pierce). Nos dias 14 e 16, os animais receberam provocação intra-nasal de 0,3 mg OVA em 50 mL de PBS estéril. Os anticorpos 51D9 e 48D3 (purificados a partir do sobrenadante de clones hibridoma 51D9 e 48D3 de acordo com procedimentos padrões, que continham menos de 0,1 EU/mg de proteína e eram negativos aos patógenos em roedores através de testagem PCR) foram administrados no dia 13 como uma injeção única intraperitoneal em PBS estéril. Dexamethasone (Sigma) foi administrada de modo oral uma vez ao dia nos dias 13-17 numa dose de 3 mg/kg. Todos os pontos finais foram analisados no dia 17, 24 h após a 2a provocação com OVA. As responsividades das vias respiratórias (AHR) foi avaliada pletismografia de corpo inteiro. Em resumo, um plano cirúrgico de anestesia foi induzido com uma injeção intraperidural de cetamina e xilasina. Uma cânula traqueal foi inserida cirurgicamente entre o 3° e 4° anel traqueal. A respiração espontânea foi impedida através de injeção venosa jugular de brometo de pancuronio e os animais foram colocados em um pletismógrafo de corpo inteiro (Buxco) e ventilados mecanicamente com 0,2 mL de ar ambiente a 150 respirações por minuto com um ventilador de volume controlado (equipamento Harvard). A pressão nos pulmões e o fluxo dentro do pletismógrafo foram medidos usando transdutores e a resistência pulmonar foi calculada como uma pressão/fluxo usando o software Biosystem Xa. A resistência de referência bem como a resistência em seguida da provocação com metacolina (3, 10, & 30 mg/mL) que foi aplicada com um nebulizador ultrassônico em linha foram medidas. Quando do término dos testes da função respiratória, os pulmões foram lavados 4 vezes com 0,5 mL de PBS estéril. O fluido de lavagem foi analisado quanto a TARC, AMCase e infiltrado celular. O soro foi coletado para a quantificação dos níveis de anticorpo na conclusão do estudo.

[00256]Os níveis de TARC murinos foram determinados por ELISA (R&D) de acordo com protocolo do fabricante. A atividade AMCase foi determinada no fluido da lavagem broncoalveolar (BAL) (diluição 1 a 10 com 0,01% BSA, 30 mM citrato de sódio, 60 mM fosfato de sódio, pH 5,2) em presença de 80 uM 4-metilumbeliferil β-D- N,N'-diacetilquitobiosida. As reações foram incubadas por 15 minutos na temperatura ambiente e inativadas pela adição de 100 uL de 1 M glicina/NaOH pH 10,6. A formação de produto foi determinada por emissão de fluorescência a 460 nm usando excitação a 385 nm em um fluorômetro Fluoroskan Ascent. Para avaliar a hiperplasia das células taças, os pulmões foram inflados com 10% de formalina tamponada neutra a 22 cm de altura por 15 minutos para conseguir área consistente da superfície pulmonar. As seções foram encaixadas em parafinas, cortadas, e manchadas com deslocamento ácido periodicamente (PAS). A área das células positivas a PAS juntamente com os brônquios principais no pulmão esquerdo foi quantificada usando o software ImagePro Plus. Os níveis de Muc5ac foram determinados por ELISA. Uma placa de 96 cavidades é revestida com fluido BAL, secada de um dia para o outro, e em seguida um anticorpo anti-Muc5ac biotinilado é acrescentado e detectado com estreptavidina conjugada a HRP, seguido por clivagem do substrato colorimétrico TMB.

[00257]A contribuição relativa da IL-13Rα1 e α2 no sentido da patogênese da asma foi testada em um modelo padrão de asma induzida por ovalbumina em em camundongos. Os anticorpos que bloquearam a ligação da IL-13 a ambos os receptores α1 e α2 (51D9, 54D1, e 3H7 com potenciais de 340, 24, e 2430 pM, respectivamente) bem como um anticorpo que bloqueou a ligação da IL-13 a apenas o receptor α1 (48D3, potencial de 50 pM) foram testados me dtratar os animais com os anticorpos um dia antes das provocações locais com ovalbumin e os resultados são apresentados na Tabela 23. A provocação OVA induziu aumentos na resistência pulmonar em seguida da provocação com metacolina, a hiper-secreção de muco foi medida pelos aumentados níveis de Muc5ac no fluido BAL bem como aumentado manchamento PAS positivo das células epiteliais através da avaliação histológica, infiltração do pulmão com oesinófilos & células-T, e produção de proteínas AMCase e TARC relacionadas com a asma.

[00258]Anticorpos que que bloquearam a ligação da IL-13 a ambos IL-13 Rα1 e a2 demostraram todos eficácia e o potencial in vivo dos reagentes se deslocaram de acordo com seus potenciais medidos in vitro. 51D9 foi testado em doses de 100, 300, e 1000 ug/camundongo. O tratamento OVA provocou um aumento na resistência das vias respiratórias em seguida à provocação com 30 mg/mL metacolina para 6,2 cm H2O/mL/s comparado a 3,6 cm H2O/mL/s em animais não asmáticos. O tratamento de camundongos com 51D9 impediu completamente o aumento na resistência pulmonar com valores comparáveis àqueles observados em animais controle não asmáticos de 4,1, 4,0, e 3,5 cm H2O/mL/s para doses de 100, 300, e 1000 μg respectivamente (n=8-10/grupo; p < .05). A quantidade de inibição observada com 51D9 foi comparável àquela conseguida com tratamento esteróide (3,3 cm H2O/mL/s). O tratamento com 51D9 também também inibiu a secreção de muco dose-dependente de 404 unidades Muc5ac para abaixo de 55 U em animais tratados com 1000 μg de 51D9. A inibição da hiper-secreção de muco foi também observada pela avaliação histológica de células epiteliais PAS-reativas. A área do percentual de células positivas foi reduzida de 1,0% para 0.6 % e 0.5 % com dose de 300 e 1000 ug de anticorpo 51D9 representando respectivamente uma diminuição de 47-65% (n=8, p < .01). O tratamento com 51D9 tratamento também inibiu TARC e AMCase. A provocação OVA induziu 61 pg/mL de TARC que foi reduzida a 7,8 pg/mL com 1000 ug de tratamento 51D9 (n=10, p < .05). A provocação OVA induziu 96 unidades arbitrárias da ativ AMCase que foi reduzida de modo dose-depenente com 51D9 para 52, 45 e 21 U com 100, 300 e 1000 μg do anticorpo respectivamente (n=9-10, p < ,01). 54D1 que tinha um potencial 10 vezes maior in vitro (24 pM) demonstrou inibição da AHR na dose de 30 ug com redução da resistência das vias respiratórias de 6,58 cm H2O/mL/s para 4,4 cm H2O/mL/s e inibição máxima observada com tratamento com 300 ug do anticorpo para reduzir a resistência das vias respiratórias para um valor de 3,65 cm H2O/mL/s. Potencial similar foi observado na inibição da produção de muco, AMCase e TARC. Um terceiro anticorpo 3H7, que tinha um potencial de 2,5 nM, demonstrou ainda uma inibição da AHR, níveis de muco e de AMCase mas somente na dose de 1000 μg do anticorpo de tratamento consistente com um deslocamento de 10 vezes no potencial descrito nos bioensaios in vitro.

[00259]A eficácia de anticorpos que bloqueiam ligação da IL-13 a somente IL-13Rαl foi testada com o anticorpo 48D3. os animais foram tratados com 30, 100, 300, e 1000 μg/camundongo. A provocação OVA induziu uma elevação na resistência das vias respiratórias para 5,69 cm H20/mL/s comparado a 4,1 cm H20/mL/s em animais não asmáticos tratados por PBS. O tratamento com 30 μg 48D3 não teve efeito na resistência pulmonar OVA-induzida embora o tratamento com 100, 300 e 1000 ug 48D3 inhibiisse alteracoes OVA-induzidas na resistência pulmonar a um máximo de 4,4 cm H2O/mL/s ou a -80% dos níveis OVA controle (n=10, p < 0,05). Em contraste aos efeitos observados com 51D9, 48D3 não inibiu a hiper-secreção de muco OVA-induzida como medido por um ou outro de Muc5ac ELISA ou células epitelias PAS reativas. Uma ligeira porém estatisticamente no muco (30%) foi observada com tratamento por 48D3 na dose de 30 μg, enquanto que todas as outras doses foram equivalentes aos animais provocados por OVA. A quantificação histológica do manchamento PAS positivo demonstrou 0,6% nos animais provocados por OVA vs 0,8% em animais provocados por OVA e tratados com 1000 ug 48D3. Nesses estudos 48D3 inibiu a expressão AMCase OVA-induzida de 196 U detectado em animais tratados por OVA para 63, 90, 87, e 96 U em doses de 30, 100, 300 e 1000 ug, respectivamente. A análise dos níveis de anticorpo indicaram que níveis comparáveis de 48D3 e 51D9 foram detectáveis em ambos o soro e fluido BAL dos camundongos tratados com o anticorpo. A despeito do potencial 7 vezes maior do anticorpo 48D3 comparado ao do anticorpo 51D9, e exposição equivalente dos dois anticorpos, o anticorpo 48D3 não foi capaz de inibir AHR ou AMCase na mesma extensão como a do anticorpo que bloqueou a ligação da IL-13 para IL-13Rα1 e a2 e foi incapaz de atenuar a produção de muco. Juntos esses dados sugerem que a IL-13Rα2 desempenha um papel central em mediar a hiper-secreção de muco OVA-induzida e que a IL-13Rα2 contribui no sentido a regular o fenótipo asmático in vivo. Tabela 23: Eficácia dos anticorpos anti-IL-13 de camundongo em modelo murino de asma induzida por ovalbumina

*denota p < 05, ANOVA

Claims (25)

1. Proteína de ligação CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um domínio de ligação ao antígeno, a dita proteína de ligação capaz de se ligar a IL-13, o dito domínio de ligação ao antígeno compreendendo seis CDRs: CDR-H1, CDR- H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, e CDR-L3, em que as ditas seis CDRs são: CDR-H1 é: SEQ ID NO: 101, CDR-H2 é: SEQ ID NO: 102, CDR-H3 é: SEQ ID NO: 103, CDR-L1 é: SEQ ID NO: 104, CDR-L2 é: SEQ ID NO: 105, e CDR-L3 é: SEQ ID NO: 106.

2. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita proteína de ligação compreende dois domínios variáveis, e em que os ditos domínios variáveis possuem sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 80 e SEQ ID NO: 81.

3. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita proteína de ligação é capaz de se ligar a uma IL-13 humana (SEQ ID NO: 1).

4. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita proteína de ligação é capaz de se ligar a uma variante de IL-13 humana (SEQ ID NO: 202).

5. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita proteína de ligação possui uma constante de taxa de associação (Kon) ao dito alvo IL-13 selecionada a partir do grupo que consiste em: pelo menos 102 M-1s-1; pelo menos 103 M-1s-1; pelo menos 104 M-1s-1; pelo menos 105 M-1s-1; e pelo menos 106 M-1s-1; como medido por ressonância de plásmon de superfície; ou a dita proteína de ligação tem uma constante de taxa de dissociação (Koff) ao dito alvo selecionada a partir do grupo que consiste em: no máximo 10-3s-1; no máximo 10-4s-1; no máximo 10-5s-1; e no máximo 10-6s-1, como medido por ressonância de plásmon de superfície; ou a dita proteína de ligação tem uma constante de dissociação (KD) ao dito alvo selecionada a partir do grupo que consiste em: no máximo 10-7 M; no máximo 10-8 M; no máximo 10-9 M; no máximo 10-10 M; no máximo 10-11 M; no máximo 10-12 M; e no máximo 10-13 M.

6. Construto de anticorpo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma proteína de ligação, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, o dito construto de anticorpo ainda compreendendo um polipeptídeo ligante ou um domínio constante de imunoglobulina.

7. Construto de anticorpo, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita proteína de ligação é selecionada a partir do grupo que consiste em: uma molécula de imunoglobulina, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo CDR-enxertado, um anticorpo humanizado, um Fab, um Fab', um F(ab')2, um Fv, um Fv ligado por dissulfeto, um scFv, um anticorpo de domínio único, um diacorpo, um anticorpo multiespecífico, um anticorpo dual específico, e um anticorpo biespecífico.

8. Construto de anticorpo, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita proteína de ligação compreende um domínio constante de imunoglobulina de cadeia pesada selecionado a partir do grupo que consiste em: um domínio constante de IgM humana, um domínio constante de IgG1 humana, um domínio constante de IgG2 humana, um domínio constante de IgG3 humana, um domínio constante de IgG4 humana, um domínio constante de IgE humana, e um domínio constante de IgA humana.

9. Uso da proteína de ligação, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou de um construto de anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para reduzir a função biológica de IL-13 em um indivíduo humano que sofre de um distúrbio em que a atividade da IL-13 é prejudicial.

10. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita proteína de ligação é um anticorpo isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo: se liga a IL-13 humana e inibe a ligação da dita IL-13 ao receptor IL-13α2 em um ensaio de ligação ao receptor baseado na superfície da célula com uma IC50 selecionada a partir do grupo que consiste em 1,5 x 10-8 a 1 x 10-8 M, 1 x 10-8 a 1 x 10-9 M, 10-9 a 10-10 M e 10-10 a 10-11 M, ou em um ensaio de ligação ao receptor baseado em ELISA com uma IC50 selecionada a partir do grupo que consiste em 1,8 x 10-8 a 1 x 10-8 M, 1 x 10-8 a 1 x 10-9 M, 10-9 a 10-10M e 10-10 a 10-11 M; ou se liga a IL-13 com características de ligação selecionadas a partir do grupo que consiste em: a) uma constante de taxa de associação (Kon) entre 105 M-1s-1 a 106 M-1s-1 ou 106 M-1s-1 a 107 M-1s-1; b) uma constante de taxa de dissociação (Koff) de 10-4s-1 a 10-5s-1, ou de 10- 5s-1 a 10-6s-1, como medido por ressonância de plásmon de superfície; e c) uma constante de dissociação (KD) de 1,5 x 10-10 a 1 x 10-10 M ou de 10-10 a 10-11 M.

11. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo possui uma constante de taxa de associação (Kon) para IL-13 selecionada a partir do grupo que consiste em: 6,68 x 105 M-1s-1, 7,86 x 105 M-1s-1, 8,35 x 105 M-1s-1, 8,69 x 105 M-1s-1, 9,15 x 105 M-1s-1, 1,26 x 106 M-1s-1, 1,7 x 106 M-1s-1, e 2,51 x 106 M-1s-1; ou em que o dito anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem uma constante de taxa de dissociação (Koff) para IL-13 selecionada a partir do grupo que consiste em: 1,23 x 10-4s-1; 1,76 x 10-4s-1; 4,74 x 10-4s-1; 1,91 x 10-5s-1; 2,14 x 10- 5s-1, 3,82 x 10-5s-1; 8,81 x 10-5s-1 e 9,65 x 10-5s-1, como medido por ressonância de plásmon de superfície; ou em que o dito anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem uma constante de dissociação (KD) para IL-13 selecionada a partir do grupo que consiste em: 1,05 x 10-10 M; 7,10 x 10-10 M; 1 x 10-11 M; 2,20 x 10-11 M; 2,72 x 10-11 M; 4,17 x 10-11 M; 5,68 x 10-11M; 7,01 x 10-11 M; 7,10 x 10-11 M; e 9,79 x 10-11 M.

12. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreende dois domínios variáveis, em que os ditos dois domínios variáveis têm sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 80 e SEQ ID NO: 81.

13. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de que compreende a proteína de ligação, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou o construto de anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 8, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

14. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 12, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

15. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito veículo farmaceuticamente aceitável funciona como um adjuvante útil para aumentar a absorção ou dispersão da dita proteína de ligação.

16. Proteína de ligação CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um domínio de ligação ao antígeno, a dita proteína de ligação capaz de se ligar a IL-13, o dito domínio de ligação ao antígeno compreendendo seis CDRs: CDR-H1, CDR- H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo:

17. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda uma cadeia estrutural aceitadora humana.

18. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita cadeia estrutural aceitadora humana compreende uma sequência aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, e SEQ ID NO:31.

19. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita cadeia estrutural aceitadora humana compreende pelo menos uma substituição de aminoácido na Região da Cadeia Estrutural em um resíduo chave, o dito resíduo chave é selecionado a partir do grupo que consiste em 2L, 15L, 22L, 41L, 42L, 44L, 49L, 50L, 51L, 62L, 71L, 73L, 10H, 44H, 46H, 48H, 67H, 68H, 70H, 72H, 74H, 76H, 83H, 84H, 86H, 87H e 97H.

20. Uso da proteína de ligação, como definida em qualquer uma das reivindicações 16 a 19, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para reduzir a atividade da IL-13 humana em um indivíduo humano que sofre de um distúrbio em que a atividade da IL-13 é prejudicial, em que o dito distúrbio é selecionado a partir do grupo que consiste em distúrbios respiratórios; asma; asma alérgica e não alérgica; asma devido à infecção, asma devido à infecção com vírus sincicial respiratório (VSR); doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC); outras condições envolvendo inflamação das vias aéreas; eosinofilia; fibrose e produção excessiva de muco; fibrose cística; fibrose pulmonar; distúrbios atópicos; dermatite atópica; urticária; eczema; rinite alérgica; e enterogastrite alérgica; condições inflamatórias e/ou autoimunes da pele; condições inflamatórias e/ou autoimunes de órgãos gastrintestinais; doenças inflamatórias intestinais (DII); colite ulcerativa; doença de Crohn; condições inflamatórias e/ou autoimunes do fígado; cirrose hepática; fibrose hepática; fibrose hepática provocada por vírus da hepatite B e/ou C; escleroderma; tumores ou cânceres; carcinoma hepatocelular; glioblastoma; linfoma; linfoma de Hodgkin; infecções virais; infecção HTLV-1 (por exemplo, a partir de HTLV-1); supressão da expressão de respostas imunes protetoras Tipo 1; e supressão da expressão de respostas imunes protetoras Tipo 1 durante a vacinação.

21. Uso da proteína de ligação, como definida em qualquer uma das reivindicações 16 a 19, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para reduzir a atividade da IL-13 humana em um indivíduo humano que sofre de um distúrbio em que a atividade da IL-13 é prejudicial, em que o medicamento compreende ainda um segundo agente, em que o segundo agente é selecionado a partir do grupo que consiste em esteróides inalados; beta-agonistas, beta-agonistas de curta duração ou de longa duração; antagonistas de leucotrienos ou receptores de leucotrieno; ADVAIR; inibidores de IgE; anticorpos anti-IgE; XOLAIR; inibidores de fosfodiesterase; inibidores de PDE4; xantinas; fármacos anticolinérgicos; agentes estabilizantes de mastócitos; cromolina; inibidores de IL-4; inibidores de IL-5; inibidores de eotaxin/CCR3; antagonistas de histamina ou seus receptores incluindo H1, H2, H3, e H4; antagonistas de prostaglandina D ou seus receptores DP1 e CRTH2; antagonistas de TNF; um fragmento solúvel de um receptor do TNF; ENBREL; antagonistas de enzima de TNF; inibidores da enzima de conversão de TNF (TACE); antagonistas do receptor muscarínico; antagonistas de TGF-beta; interferon gamma; perfenidona; agentes quimioterápicos, metotrexato; leflunomida; sirolimus (rapamicina) ou um análogo do mesmo, CCI-779; inibidores de COX2 ou cPLA2; NSAIDs; immunomoduladores; inibidores de p38; inibidores de TPL-2, MK-2 e NFkB; budenosida; fator de crescimento epidérmico; corticosteróides; ciclosporina; sulfasalazina; aminosalicilatos; 6-mercaptopurina; azatioprina; metronidazol; inibidores de lipoxigenase; mesalamina; olsalazina; balsalazida; antioxidantes; inibidores de tromboxano; antagonistas do receptor de IL-1; anticorpos anti-IL-1β; anticorpos anti-IL-6; fatores de crescimento; inibidores de elastase; compostos piridinil-imidazol; anticorpos ou agonistas de TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL- 18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL- 31, IL-32, IL-33, EMAP-II, GM-CSF, FGF, e PDGF, anticorpos de CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 ou seus ligantes; FK506; rapamicina; micofenolato de mofetila; ibuprofeno; prednisolona; inibidores de fosfodiesterase; agonistas de adenosina; agentes antitrombóticos; inibidores do complemento; agentes adrenérgicos; inibidores de MAP quinase, IRAK, NIK, IKK, ou p38; inibidores de enzima de conversão de IL-1β; inibidores da enzima de conversão de TNFα, inibidores de sinalização de célula T; inibidores de metaloproteinase; 6- mercaptopurinas; inibidores de enzima de conversão angiotensina; receptores de citocinas solúveis; receptor de TNF p55 solúvel; receptor de TNF p75 solúvel; sIL- 1RI; sIL-1RII; sIL-6R; citocinas antiinflamatórias; IL-4; IL-10; IL-11; e TGFβ.

22. Anticorpo anti-IL-13 recombinante, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a proteína de ligação, como definida na reivindicação 16, em que o dito anticorpo anti-IL-13 recombinante: se liga a IL-13 humana; compreende dois domínios variáveis, em que um domínio variável compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80 e o outro domínio variável compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 81; compreende uma região constante de cadeia pesada de IgG1 humana compreendendo uma região de dobradiça compreendendo uma mudança de leucina para alanina na posição 234 e uma mudança de leucina para alanina na posição 235; compreende uma região constante de cadeia leve kappa humana; bloqueia a ligação de IL-13 a IL-13Rα1 e a IL-13Rα2; e se liga a uma variante de IL-13 humana (SEQ ID NO: 202).

23. Anticorpo anti-IL-13 recombinante, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo anti-IL-13 recombinante, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreende quatro domínios variáveis, em que cada um de dois dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 80 e cada um dos outros dois dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 81.

24. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um anticorpo anti-IL-13 recombinante, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido na reivindicação 22 ou 23, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

25. Uso da composição farmacêutica, como definida na reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para tratar distúrbios respiratórios; asma; asma alérgica e não alérgica; asma devido à infecção, asma devido à infecção com vírus sincicial respiratório (VSR); doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC); outras condições envolvendo inflamação das vias aéreas; eosinofilia; fibrose e produção excessiva de muco; fibrose cística; fibrose pulmonar; distúrbios atópicos; dermatite atópica; urticária; eczema; rinite alérgica; enterogastrite alérgica; condições inflamatórias e/ou autoimunes da pele; condições inflamatórias e/ou autoimunes de órgãos gastrintestinais; doenças inflamatórias intestinais (DII); colite ulcerativa; doença de Crohn; condições inflamatórias e/ou autoimunes do fígado; cirrose hepática; fibrose hepática; fibrose hepática provocada por vírus da hepatite B e/ou C; escleroderma; tumores ou cânceres; carcinoma hepatocelular; glioblastoma; linfoma; linfoma de Hodgkin; infecções virais; infecção HTLV-1 (por exemplo, de HTLV-1); supressão da expressão de respostas imunes protetoras Tipo 1; ou supressão da expressão de respostas imunes protetoras Tipo 1 durante a vacinação.