BRPI0914919B1 - Método para selecionar um primeiro grupo de células de uma população de células e sistema para detectar e alterar seletivamente uma subpopulação de células desejada em uma população de células de espécime - Google Patents
Método para selecionar um primeiro grupo de células de uma população de células e sistema para detectar e alterar seletivamente uma subpopulação de células desejada em uma população de células de espécime Download PDFInfo
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Description
“MÉTODO PARA SELECIONAR UM PRIMEIRO GRUPO DE CÉLULAS DE UMA
POPULAÇÃO DE CÉLULAS E SISTEMA PARA DETECTAR E ALTERAR
SELETIVAMENTE UMA SUBPOPULAÇÃO DE CÉLULAS DESEJADA EM UMA
POPULAÇÃO DE CÉLULAS DE ESPÉCIME”
PEDIDOS RELACIONADOS [0001] Este pedido reivindica prioridade à Patente Provisória dos EUA N.° 61/077.083 protocolada no dia 30 de junho de 2008, cuja divulgação é integralmente incorporada ao presente por referência. Este pedido está relacionado ao Pedido de Patente US N.° ___, concomitantemente depositado (Arquivo do Agente n.°
30752/44821), cuja divulgação é também integralmente incorporada ao presente por referência.
CAMPO DA INVENÇÃO [0002] A presente invenção se relaciona, em geral, a métodos e dispositivos para classificar células e, em particular, a métodos e dispositivos para usar uma fonte de energia controlada para modificar uma população de células de interesse pela remoção, enriquecimento ou alteração de células, vírus ou partículas da população, feitos de modo seletivo.
FUNDAMENTOS [0003] A classificação citométrica do fluxo permite a seleção, enriquecimento, partilha ou divisão de populações de células, vírus, corpos ou partículas de interesse (doravante referidas como células). Os critérios de seleção incluem propriedades mensuráveis de células individuais que podem ser detectadas da parte externa da célula, com ou sem o auxílio de reagentes químicos ou de complexos ou corpos que estão, ou que podem ser levados a estar, associados à célula. Por exemplo, propriedades de células podem ser medidas ou aproximadas pela detecção e/ou quantificação da associação das células com um ou mais identificadores, tais como moléculas, complexos, ou corpos que apresentam fluorescência ou que foram modificados para parecerem fluorescentes. Tais moléculas, complexos e/ou corpos fluorescentes podem diferencialmente se associar a células baseados nas propriedades qualitativas ou quantitativas das células, incluindo sua composição
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2/59 com relação a proteínas, lipídios, fosfoproteínas, glicoproteínas, fosfolipídios, glicolipídios, ácidos nucleicos (incluindo a quantidade, sequência ou organização de ácidos nucleicos), carboidratos, sais/íons e quaisquer outras moléculas, dentro, sobre ou associadas às células. Além disso, tais moléculas fluorescentes, complexos, e/ou corpos podem diferencialmente se associar às células baseados em características físicas ou fisiológicas das células, exemplos das quais incluem, entre outros, à permeabilidade da membrana, composição da membrana, fluidez da membrana, potencial da membrana ou químico, viabilidade, gradientes químicos, mobilidade, potencial ou estado de oxidação ou redução e outros parâmetros ou propriedades.
[0004] Outras propriedades mensuráveis de células sejam elas identificadas ou não identificadas, modificadas ou não modificadas, que podem fornecer uma base para a seleção de células podem incluir, entre outras:
propriedades de interação de luz com as células, tais como fluorescência, absorbância, refletância, disseminação, polarização ou outras propriedades;
propriedades elétricas das células ou do efeito das células em seu meio ambiente incluindo condutância, indutância, resistência, potencial ou tensão da membrana ou outras propriedades;
propriedades magnéticas ou eletromagnéticas de células, incluindo magnetismo, paramagnetismo, ressonância magnética e/ou interação das células com energia eletromagnética;
a aparência, imagem, ou propriedades morfológicas das células e a composição das células com relação a qualquer substância ou parâmetro, medido direta ou indiretamente de qualquer modo.
[0005] Além disso, a medição de tais parâmetros, direta ou indiretamente, singularmente ou em combinação, pode refletir propriedades simples ou complexas de interesse das células.
[0006] Um exemplo de tal propriedade é o cromossomo sexual incluído no diploide, haploide, ou genoma dos gametas, que pode ser um cromossomo X ou um cromossomo Y ou combinações de ambos dependendo do tipo de célula e do
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3/59 organismo. A determinação de teor do cromossomo sexual pode ser inferida usando medições ou determinações diretas ou indiretas através de um ou mais métodos. Tais métodos incluem a medição do teor do DNA das células determinado relativamente ou absolutamente; a presença ou ausência de certas sequências de DNA; ou marcadores da presença ou ausência de certas sequências de DNA; o tamanho das células ou de porções ou organelas das células; a presença, localização, ou ausência de proteínas ou outros marcadores característicos do teor do cromossomo sexual das células, ou combinações ou padrões de expressão de tais marcadores ou qualquer outra medição que reflita a composição do cromossomo sexual da célula. Muitas outras tais medições podem ser feitas, ou propriedades determinadas, para identificar células que são de interesse em uma instância, situação, sistema, doença, condição, processo ou circunstância específica.
[0007] Tais medições citométricas permitem determinações quantitativas e/ou qualitativas sobre células, populações de células, órgãos, tecidos, ou organismos. Tais determinações podem ser usadas de muitos modos incluindo, entre outros, diagnósticos, pesquisa biomédica, engenharia, epidemiologia, medicina, agricultura, criação de animais, gerenciamento de rebanhos, zoologia, indústria biofarmacêutica e outros campos. Além da habilidade de realizar tais medições, métodos e instrumentação atuais permitem a separação de células baseada em características ou parâmetros medidos pela citometria conforme descrito acima. Células podem ser selecionadas positivamente ou negativamente pela concentração, coleta ou divisão de células de interesse ou pela remoção de células que não são desejadas ou de interesse na preparação. Tal seleção pode ser controlada com base em qualquer parâmetro, característica, ou combinação de parâmetros ou características que podem ser determinados conforme descrito acima.
[0008] As células identificadas através dos métodos incluindo ou relacionadas àqueles descritos acima podem ser separadas, divididas, concentradas, esgotadas ou coletadas dentro de qualquer número arbitrário de grupos. Um método de separação comum (retratado na Figura 1 A) usa forças eletrostáticas para desviar uma corrente, gotícula ou gotículas carregadas eletricamente ou eletrostaticamente
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4/59 contendo uma célula ou células que têm propriedades desejadas ou indesejadas. As células desviadas são coletadas ou descartadas conforme apropriado a aplicações determinadas, conforme ilustrado na Figura 1A. Outros métodos de separação incluem o uso de dispositivos fluídicos incluindo válvulas para desviar células em uma corrente fluida para alternar vias, canais, tubos ou elementos para coleta ou eliminação posteriores, conforme ilustrado na Figura 1B.
[0009] Existe um número de métodos e sistemas para a realização da classificação citométrica de fluxo de células. Entre estes existem métodos e sistemas projetados especificamente para realizar a classificação citométrica de fluxo de células de espermas de mamíferos e, em particular, para classificar as células de espermas em populações de células de esperma que carregam cromossomos X e/ou populações de células de esperma que carregam cromossomos Y, com a finalidade de aumentar a probabilidade de que a fertilização de um ovo com o esperma classificado resulte em prole com um gênero desejado. Por exemplo, um produtor de leite pode desejar classificar o esperma de um touro de modo que embriões bovinos possam ser produzidos, por inseminação artificial, em fertilização in vitro, ou outros meios, com esperma que tenha cromossomo X para produzir prole fêmea bovina.
[0010] Métodos de classificação citométrica de fluxo apresentam um numero de desafios, particularmente em relação à classificação de células de esperma de mamíferos para uso posterior na produção de prole. De modo importante, os métodos usados para rotular e/ou diferenciar entre as células e/ou métodos usados para classificar células não devem afetar adversamente a viabilidade das células. Frequentemente um ou mais objetivos dos métodos e/ou sistemas envolvidos (por exemplo, classificação mais rápida, precisão aprimorada, etc.) entram em conflito com outros objetivos dos métodos e/ou sistemas. Vários fatores devem ser pesados e considerados, incluindo as temperaturas, mudanças de temperatura, pressões e/ou mudanças de pressão as quais as células estão sujeitas, os ambientes fluídicos aos quais as células estão expostas, as forças aplicadas às células e o tempo de vida da célula. Por exemplo, a taxa na qual uma molécula fluorescente (por exemplo,
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5/59 um fluorocromo) entra em uma célula para se ligar ao DNA dentro do núcleo da célula (isto é, a taxa na qual as células podem ser marcadas), pode aumentar conforme a temperatura aumenta. Assim, o desempenho de um sistema (pelo menos o desempenho do processo de marcação) pode aumentar com um aumento na temperatura do ambiente das células. Entretanto, a temperatura aumentada pode ser prejudicial para a viabilidade das células e/ou o período de tempo que as células permanecem viáveis. Em contraste, manter as células na temperatura ideal para viabilidade pode aumentar o tempo necessário para marcação (e medição e classificação) das células, de modo que o processo leva mais tempo do que seja prático ou de modo que as células não sejam viáveis após o tempo necessário para completar o processo.
[0011] Outro desafio associado à classificação de células se relaciona as propriedades físicas e ópticas das células. Em particular, células achatadas ou de outra forma assimétricas, tais como glóbulos vermelhos de mamíferos ou células de esperma, mostram emissão anisotrópica de energia (por exemplo, luz). As geometrias complexas do interior de uma célula e/ou as geometrias complexas dos limites da célula atuam para refratar e/ou refletir luz em modos que são altamente dependentes da orientação da célula com relação a quaisquer fontes de iluminação e/ou detectores usados para fazer a diferenciação entre células. Por exemplo, a classificação citométrica de fluxo de células de esperma de mamíferos em populações que têm cromossomos X ou Y geralmente envolve a marcação das células com uma molécula fluorescente que se liga ao DNA dentro das células. A variação no teor de DNA entre os cromossomos X e Y da maioria das espécies de mamíferos (cromossomos Y geralmente contêm menos DNA do que os cromossomos X) resulta em fluorescência relativamente maior de células contendo cromossomos X. Entretanto, a diferença no teor de DNA de cromossomos X e Y está tipicamente na ordem de somente um pequeno percentual e, frequentemente, a geometria e/ou orientação das células pode afetar a fluorescência detectada por uma porcentagem que é muito superior à diferença de porcentagem no teor de DNA entre os cromossomos X e Y. Adicionalmente, tal análise requer que as células
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6/59 passem através da região de detecção isoladamente, de modo que um detector não interprete a fluorescência de duas células como fluorescência de uma única célula. [0012] Sistemas de classificação citométrica de fluxo frequentemente empregam um mecanismo fluídico de núcleo-revestimento para carregar as células através da região de detecção. Conforme retratado na Figura 1C, uma corrente 50 de movimentação relativamente vagarosa de uma suspensão aquosa de células 52 é injetada em um fluxo 54 de movimentação relativamente mais rápida de fluido de revestimento. Esta preparação focaliza as células 52 dentro de uma corrente 56, mencionada como a corrente principal. Com seleção apropriada das pressões e das consequentes velocidades da suspensão principal e do fluido de revestimento, a corrente principal é estreitada por forças hidrodinâmicas exercidas pelo fluxo de revestimento e as células na corrente principal são distribuídas longitudinalmente de modo que elas sejam transportadas uma por uma no fluxo. As forças que alongam e estreitam a corrente principal têm o benefício adicional de orientar as células 52 de modo que um eixo longitudinal 58 da célula 52 esteja paralelo à direção do fluxo da corrente de fileira única 56. Entretanto, a orientação das células sobre o eixo longitudinal 58 permanece mais ou menos aleatória. Assim, conforme cada célula 52 passa através da área de detecção, a luz incidente sobre a célula, a luz emitida da célula (por exemplo, luz fluorescente) e a luz refletida fora da célula, permanece dependente da orientação da célula 52. Isto é especialmente verdadeiro em relação a tipos de células de esperma de mamíferos.
[0013] Existem várias soluções para o problema de orientação da célula de esperma com relação à iluminação e detecção de células dentro de sistemas de citometria de fluxo. Por exemplo, a Figura 1D ilustra uma solução, sendo que esta solução emprega uma ponta chanfrada cortada 60 em um tubo 62 que injeta uma corrente de amostra 64 em um fluxo de revestimento 66. A ponta chanfrada, achatada 60 ajuda a orientar as células em relação a seus eixos longitudinais 58 dentro do fluxo de revestimento 66 de modo que as faces achatadas das células tendem a se alinharem em uma direção consistente. Outra solução (que pode ser combinada com a solução de ponta chanfrada) emprega dois detectores 68 e 70
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7/59 ortogonais um ao outro (um detector 68 com 0 grau e um detector 70 com 90 graus) que são usados em combinação para estimar a orientação de cada célula 52 conforme ela passa através de uma área de detecção 72 e para medir a fluorescência daquelas células que são consideradas apropriadamente orientadas de modo que a quantização precisa do sinal fluorescente seja possível. As soluções que empregam orientação hidrodinâmica das células em torno do eixo longitudinal geralmente produzem populações nas quais o alinhamento desejado para a medição de fluorescência é alcançado para cerca de 70% ou menos das células no fluxo de amostra, que diminui o desempenho do instrumento e resulta no descarte das células orientadas inadequadamente.
[0014] Ainda outra solução para os problemas associados à geometria e orientação da célula utiliza detecção óptica ao longo do mesmo eixo que o fluxo núcleo-revestimento que transporta as células. Em tal solução, ópticas de epiiluminação são usadas para iluminar a célula e detectar a luz emitida pela célula. Conforme retratado na Figura 1E, uma corrente de amostra 74 transportada por um fluxo de revestimento 76 viaja diretamente em direção a uma lente objetiva de microscópio 78, eliminando a dependência da orientação da célula (por exemplo, uma célula de esperma 80) em relação a um eixo longitudinal 82 da célula 80. Entretanto, a trajetória da célula 80 em direção a lente objetiva 78 requer que a célula 80 mude a trajetória imediatamente após passar através de uma área de detecção 82 (isto é, o ponto focal 84 da lente objetiva 78). O sistema realiza esta mudança de trajetória usando um fluxo transversal 86 de fluido. Pode ser apresentada incerteza na posição de células individuais após a análise pela convergência 88 do fluxo de fluido transversal 86 e do fluxo de revestimento 76 e corrente de fluido 74. Tal incerteza de posição pode deixar o sistema inoperável para realizar a classificação de células porque a localização da célula 80 dentro do fluxo convergente pode se tornar imprevisível imediatamente após a célula passar através da área de detecção 82.
[0015] Ainda outra solução, ilustrada na Figura 1F, utiliza um ou mais refletores parabólicos 102 para iluminar células uniformemente e/ou coletar luz radialmente
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8/59 das células. O sistema utiliza um bocal 104 para emitir uma corrente/jato 106 de liquido contendo células individuais 92. A corrente 106 se move através de uma região de detecção 94 a através de um orifício 96 no refletor parabólico 102. Em certo ponto após passar através da região de detecção a corrente 106 é separada em gotículas 90 que podem ser carregadas eletricamente. A partir daí, cada uma das gotículas 90 pode ser classificada, por exemplo, pela deflexão da gotícula 90 carregada e as placas defletoras 98 carregadas eletricamente para realizar a deflexão das gotículas para dentro de um ou mais receptáculos 100. Problematicamente, esta configuração de “jato no ar” sujeita a corrente 106 (e as células 92 contidas na corrente 106) a uma queda na pressão quando a corrente 106 sai do bocal 104. Mudanças bruscas na pressão (e as pressões aumentadas dentro do próprio bocal), bem como o impacto subsequente da célula 92 dentro do receptáculo 100, podem afetar adversamente a viabilidade da célula 92. Assim, a pressão e velocidade da corrente 106 saindo do bocal 104 devem permanecer abaixo de qualquer limite que poderia danificar as células 92, o que reduz o desempenho do sistema. Além disso, o movimento das gotículas 90 através da atmosfera pode exigir restrições ambientais incluindo limpeza do ar ambiente (por exemplo, um “ambiente limpo”) e controle de temperatura.
[0016] Assim, mesmo com o estado relativamente avançado de citometria de fluxo, existe uma necessidade contínua na técnica de fornecer métodos e dispositivos mais eficientes, mais sensíveis e mais precisos para a separação e/ou identificação de células.
SUMÁRIO [0017] Um método e dispositivo é descrito para detectar, alterar seletivamente por modificação funcional e/ou física e coletar células desejadas ou indesejadas em uma população usando citometria de fluxo. O método não se baseia em refletores parabólicos ou detecção ortogonal para detectar e categorizar células, como é o caso dos métodos e dispositivos de classificação citométricos comuns existentes. Ao contrário, o método emprega uma lente objetiva que tem um eixo óptico coaxial com o fluxo da amostra através de uma área de detecção. O método pode ou não se
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9/59 basear no desvio ou separação da corrente de fluxo de células ou na colocação de células dentro de receptáculos ou vias de recebimento diferentes, como também é o caso para métodos e dispositivos de classificação citométrica comuns existentes. [0018] O método contempla o uso de uma fonte de energia controlável, tal como, entre outras, uma fonte de radiação eletromagnética tal como o laser, para irradiar células desejadas ou indesejadas em uma população que foi identificada através de técnicas de detecção citométricas. A fonte de energia controlável é dirigida seletivamente a células de interesse baseadas em suas propriedades ou características medidas, após sua análise no citômetro, em determinado aspecto dentro de um segundo desde sua análise enquanto as células permanecem no fluxo fluídico do dispositivo. Tais células podem ser alteradas funcionalmente ou fisicamente pela energia fornecida. Dependendo do uso específico e da modalidade específica dos métodos e dispositivos, a população de células resultante pode ser funcionalmente ou fisicamente esvaziada de células indesejadas, ou pode ser modificada de tal modo que permita o enriquecimento subsequente de células desejadas ou a remoção de células indesejadas. Os métodos e dispositivos descritos são de grande utilidade em aplicações onde o enriquecimento ou esvaziamento de células é necessário. Em algumas modalidades, o método e/ou dispositivo altera líquido contendo células desejadas ou indesejadas em uma população que foi identificada através de técnicas de detecção citométricas e podem não alterar as células diretamente. Em tais modalidades, o método e/ou dispositivo pode se basear no desvio ou separação da corrente de fluxo de células ou na colocação de células dentro de receptáculos ou vias de recebimento diferentes.
[0019] Um aspecto dos métodos e dispositivos descritos inclui o uso deles para enriquecimento, seleção, alteração funcional ou esvaziamento de espermatozóides em uma população com base no cromossoma sexual, X ou Y, contidos nas células. Os métodos e dispositivos incluem o uso de projetos alternativos para os sistemas fluídicos e ópticos de um citômetro, incluindo em um aspecto, um dispositivo onde os componentes de medição óptica e/ou uma fonte de energia de alteração de célula estão/está orientada(s) ortogonalmente à corrente fluídica e em outro aspecto, um
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10/59 dispositivo onde alguns dos citados componentes podem também ou alternativamente estar orientados no mesmo eixo que a corrente fluídica e/ou em ângulos oblíquos a ela.
[0020] Os métodos e dispositivos citométricos de fluxo fornecem um método e dispositivo novos permitindo a seleção positiva ou negativa de células através da observação das células e classificando precisamente cada célula independentemente da orientação da célula em relação ao seu eixo mais longo e subsequentemente usando a classificação para determinar se é necessário modificar, derivar, danificar, exterminar ou fragmentar a célula no curso do procedimento de citometria. Os métodos e dispositivos descritos no presente incorporam a aplicação de forças, energia ou irradiação para células desejadas ou indesejadas coincidentes com ou seguindo dentro de um segundo da medição citométrica para efetuar mudanças naquelas células que as alteram fisicamente ou funcionalmente. Tais células alteradas, ou seus resíduos ou derivados, estão em um aspecto retidos na preparação resultante ou em outros aspectos são enriquecidas ou removidas, dependendo dos requisitos do uso ou aplicação determinados.
[0021] Uma modalidade é descrita que permite a separação funcional e/ou física dos espermatozóides que carregam cromossomos X dos espermatozóides que carregam cromossomos Y e/ou de espermatozóides que carregam cromossomos Y de espermatozóides que carregam cromossomos X. Nesta modalidade, o teor do DNA relativo dos espermatozóides individuais em uma população de espermatozóides é medido indiretamente, utilizando uma propriedade bastante conhecida de produtos químicos de associação do DNA tais como, entre outros, bisbenzimida, corantes SYBR, tais como SYBR14, Hoechst 33342, Hoechst 33258, brometo de etídio, laranja de acridina, DAPI, cromomicina, mitramicina, olivomicina e outros e outros produtos químicos conhecidos na técnica que exibem fluorescência avançada quando associados ao DNA. A medição é realizada pela observação de uma célula enquanto a célula se move dentro de uma corrente que flui em direção ao ponto de observação, preferivelmente por uma lente objetiva que tem um eixo óptico coaxial com o fluxo da corrente. Células contendo relativamente mais DNA
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11/59 (isto é, um teor de DNA mais alto) presume-se que contêm o cromossomo X maior e células contendo relativamente menos DNA (isto é, um teor de DNA mais baixo) presume-se que contêm o cromossomo Y menor. Em algumas modalidades do método onde células que têm somente um dos cromossomos sexuais são desejadas na preparação final, o método utiliza uma fonte de energia a laser dirigida as células, em um aspecto, coincidente com ou em outro aspecto, dentro de um segundo ou menos de sua análise, onde a fonte de energia a laser pode ser rapidamente modulada para irradiar células que contêm o cromossomo sexual indesejado e/ou células cujo teor do cromossomo sexual é incerto. Em um aspecto desta modalidade, o método utiliza uma fonte de energia a laser que deposita energia de qualidade e/ou quantidade suficiente para modificar, derivar, romper, desabilitar e/ou exterminar as células indesejáveis. Tais mudanças nas células selecionadas envolvem, em um aspecto, a fragmentação das células ou, em um aspecto alternativo, são menos destrutivas, dependendo da aplicação. Por exemplo, em modalidades do método onde espermas identificados e/ou isolados serão usados para fertilização e/ou reprodução, a renderização de células indesejáveis incapazes de produzir prole viável, por exemplo, pelo rompimento da sequência ou estrutura das moléculas de DNA nas células, ou pela diminuição de sua mobilidade de tal forma que elas sejam em grande parte inférteis quando usadas na inseminação artificial, é em um aspecto suficiente para produzir a preparação desejada. Em outros aspectos, as células indesejáveis são tornadas não-móveis, exterminadas, modificadas ou desativadas de outro modo para afetar a capacidade reprodutiva das células indesejadas. Em um aspecto alternativo, células indesejadas são modificadas ou derivadas em um modo que permita sua remoção subsequente ou remoção parcial da preparação de células desejadas.
[0022] Em outra modalidade, a configuração do citômetro emprega um ou mais elementos ópticos usados, em um aspecto, para a medição de propriedades celulares e/ou em outro aspecto, usados no fornecimento de energia para células, onde pelo menos um elemento óptico, preferivelmente um eixo óptico de uma lente objetiva, esteja orientado no mesmo eixo que o fluxo das células sob análise. Assim,
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12/59 em algumas modalidades, um método e dispositivo é fornecido utilizando um elemento óptico e, em particular, uma lente objetiva posicionada coaxialmente com o fluxo de fluido, para a iluminação, medição, ou fornecimento de energia para as células. Em outra modalidade, um método e dispositivo é fornecido utilizando um ou mais elementos ópticos adicionais, sozinhos ou em combinação, posicionados em 90 graus em relação à corrente de fluido para medições ou para o fornecimento de energia para células. Ainda em outra modalidade, um método e dispositivo é fornecido utilizando um ou mais elementos ópticos adicionais, sozinhos ou em combinação, posicionados não coaxialmente em relação à corrente de fluido para medições ou para o fornecimento de energia para células. Em ainda outra modalidade, um método e dispositivo é fornecido utilizando um ou mais elementos ópticos adicionais, sozinhos ou em combinação, posicionados em um ângulo oblíquo em relação à corrente de fluido para medições ou para o fornecimento de energia para células. Conforme usado aqui, um “ângulo oblíquo” é um ângulo, tal como um ângulo agudo ou obtuso, que não é um ângulo reto ou um múltiplo de um ângulo reto.
[0023] Algumas modalidades fornecem um método para modificar uma célula de interesse em uma população de células compreendendo a etapa de contatar a célula de interesse com uma fonte de energia controlável que modifica a célula de interesse através da identificação de uma célula como uma célula de interesse em uma população de células, sem separar a célula de interesse da população de células quando da modificação através da fonte de energia.
[0024] Algumas modalidades fornecem um método para identificar uma subpopulação de células de interesse em uma população de células, compreendendo a etapa de contatar a população de células com uma fonte de energia controlável que modifica células da subpopulação de células de interesse, em que o contato acontece após uma primeira análise das células em um fluxo de amostra fluídica de um citômetro de fluxo e não mais do que cerca de um segundo após a primeira análise, as células que permanecem dentro do fluxo de amostra fluídica do citômetro de fluxo, onde a primeira análise identifica células da subpopulação de células como células de interesse, conforme aquelas células de
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13/59 interesse fluem em direção a uma área de interrogação e em que a fonte de energia controlável modifica as células de interesse no fluxo da amostra através do citômetro de fluxo.
[0025] Em algumas modalidades, a primeira análise compreende detectar as células de interesse como tendo uma propriedade desejada selecionada do grupo consistindo em: composição de proteína, composição de DNA, marcador de superfície da célula, tamanho da molécula, absorção de luz, reflexão de luz, fluorescência, dispersão de luz, polarização, propriedade elétrica, propriedade magnética, propriedade morfológica, permeabilidade da membrana, fluidez da membrana e estado redox desejados.
[0026] Em algumas modalidades, contatar a população de células com a fonte de energia ocorre enquanto a população de células passa através de uma corrente de fluxo em um citômetro de fluxo. Em uma modalidade relacionada, a célula de interesse está contatada com a fonte de energia após e dentro de um segundo da identificação da célula como sendo uma célula de interesse na corrente de fluxo.
[0027] É considerado, em algumas modalidades, que a fonte de energia esteja posicionada coaxialmente em relação à corrente de fluxo. É considerado ainda que a fonte de energia esteja posicionada em um ângulo de 90° em relação à corrente de fluxo, ou posicionada em um ângulo oblíquo em relação à corrente de fluxo. Em outra modalidade, a fonte de energia é aplicada às células de interesse via Kohler e/ou ótica de epi-iluminação. Em outra modalidade, a fonte de energia é dirigida a um ponto no fluxo de células que está a jusante da posição na qual as propriedades celulares são medidas. Em outra modalidade, a fonte de energia é dirigida a um ponto no fluxo de células que está a jusante da posição na qual as propriedades celulares são medidas e está após um desvio ou curva da corrente de fluxo em relação à sua direção original de fluxo.
[0028] Em algumas modalidades, uma ou mais análises são realizadas pela observação de uma célula enquanto a célula se move dentro de uma corrente fluindo em direção a um ponto de observação, preferivelmente por uma lente objetiva que tem um eixo óptico coaxial em relação ao fluxo da corrente. Após
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14/59 passar através do ponto de observação, a corrente muda de direção em algumas modalidades, enquanto a ordem e/ou localização das células dentro da corrente permanece determinável. Em algumas modalidades, uma fonte de energia controlável pode seletivamente alterar uma ou mais células de acordo com uma ou mais análises. Em algumas modalidades, a fonte de energia controlável é posicionada coaxialmente em relação à corrente recentemente direcionada, enquanto em outras modalidades, a fonte de energia controlável é posicionada perpendicularmente ou em um ângulo obliquo em relação à corrente recentemente direcionada. Em algumas modalidades, que podem ou não incluir uma fonte de energia controlável, um bocal pode ejetar corrente, formando gotículas que podem ser classificadas usando meios conhecidos (por exemplo, usar uma fonte de energia controlável para aplicar uma carga eletrostática, controlar pressão em várias vias de fluxo de fluido, etc.).
[0029] Em algumas modalidades relacionadas, a fonte de energia controlável é dirigida para a localização da célula em uma corrente de fluxo de uma maneira selecionada dentre o grupo compreendendo corrente contínua, corrente pulsada, ciclos liga/desliga intermitentes, concentração e desconcentração periódicas do foco da fonte de energia e desvio rápido intermitente da fonte de energia para a corrente. [0030] Em algumas modalidades, a fonte de energia controlada é uma fonte eletromagnética. Em algumas modalidades, a fonte de energia é um laser.
[0031] Em algumas modalidades, a modificação das células é selecionada dentre o grupo compreendendo derivatização, extermínio, danificação, rompimento e fragmentação das células de interesse.
[0032] Em outro aspecto, a célula de interesse é identificada como uma célula de interesse usando um marcador detectável por meios elétricos, magnéticos, espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos, fluorescentes ou outros meios químicos. Em algumas modalidades, o marcador é a adição de um composto ou identificador químico fotoativável.
[0033] Em uma modalidade relacionada, a célula de interesse é identificada como tendo uma propriedade desejada selecionada dentre o grupo compreendendo
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15/59 composição de proteína, teor de proteína, composição de DNA, teor de DNA, marcador de superfície da célula, tamanho da molécula, absorção de luz, reflexão de luz, fluorescência, dispersão de luz, polarização, propriedade elétrica, propriedade magnética, propriedade morfológica, permeabilidade da membrana, fluidez da membrana e estado redox desejados.
[0034] Os métodos e dispositivos descritos contemplam que qualquer fonte de energia, detector, ou elemento de foco usado na detecção de propriedades de células no fluxo podem ser posicionados coaxialmente em relação à corrente de fluxo. Por exemplo, em um citômetro de fluxo compreendendo detectores e uma fonte de energia controlável, os detectores ou a fonte de energia controlável, ou ambos, são posicionados coaxialmente em relação à corrente de fluxo. Em uma modalidade relacionada, qualquer dispositivo de detecção e/ou elementos ópticos usados na detecção de propriedades de células no fluxo é posicionado coaxialmente em relação à corrente de fluxo.
[0035] Em uma modalidade adicional, Kohler e/ou ópticas de epi-iluminação são usados para o fornecimento de luz ou energia usado para a detecção de propriedades desejadas. Em uma modalidade relacionada, quando o método usa um citômetro de fluxo, o citômetro de fluxo é um citômetro de epi-iluminação. É adicionalmente considerado que um citômetro de epi-iluminação útil no método descrito incorpora dispositivo para a modificação de células de interesse conforme ainda é descrito aqui.
[0036] Quando um citômetro de fluxo é usado no método descrito, o citômetro de fluxo é um citômetro de fluxo que tem uma ou mais correntes de amostra e incorpora óptica que tem uma lente objetiva coaxial em relação ao fluxo de uma ou mais correntes de amostra para o fornecimento de luz ou energia usado para a detecção de propriedades desejadas, para a detecção de propriedades de células desejadas e/ou para o fornecimento de luz ou energia usado para a modificação de células desejadas ou indesejadas.
[0037] Em outra modalidade, a fonte de energia modifica a célula de interesse que tem uma propriedade desejada. Em uma modalidade relacionada, a fonte de
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16/59 energia modifica a célula de interesse que não tem uma propriedade desejada. [0038] Em ainda outra modalidade, a célula de interesse é uma célula de esperma selecionada de um grupo de esperma que carrega o cromossomo X e esperma que carrega cromossomo Y. É considerado, em algumas modalidades, que a célula de esperma é identificada como uma célula de interesse baseada em uma propriedade desejada de diferença no teor de DNA entre o esperma que carrega cromossomo X e o esperma que carrega o cromossomo Y.
[0039] Os métodos e dispositivos descritos ainda estipulam que a população de células seja coletada em uma câmara de coleta para uso posterior. Em algumas modalidades, a câmara de coleta contém células de interesse que foram modificadas pela fonte de energia controlável. Em uma modalidade relacionada, após a coleta, as células de interesse podem ser usadas em processos ou procedimentos subsequentes. Em ainda uma modalidade adicional, é considerado que após a coleta, as células de interesse são descartadas e o restante da população de células é usado em processos e procedimentos subsequentes.
[0040] Os métodos e dispositivos descritos também fornecem um dispositivo para modificar uma célula de interesse em uma população de células compreendendo uma fonte de energia controlável que modifica a célula de interesse na identificação de uma célula como uma célula de interesse em uma população de células, sem separar a célula de interesse da população de células quando da modificação pela fonte de energia.
[0041] Em uma modalidade relacionada, os métodos e dispositivos descritos contemplam a identificação de uma subpopulação de células de interesse de uma população de células através de um citômetro de fluxo compreendendo uma fonte de energia controlável que modifica a subpopulação de células de interesse, onde o contato acontece após uma primeira análise das células durante fluxo de amostra através de um tubo de amostra do citômetro de fluxo e geralmente dentro de um segundo da análise da célula, enquanto as células permanecem dentro do fluxo de amostra fluídico do dispositivo, onde a primeira análise identifica a célula como uma célula de interesse e onde a fonte de energia controlável modifica a célula de
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17/59 interesse durante o fluxo de amostra através do citômetro de fluxo.
[0042] Em algumas modalidades, uma ou mais etapas de um método descrito são armazenadas com instruções legíveis por máquina em um meio de armazenamento tangível dentro de um controlador. Um processador do controlador executa as instruções para monitorar e/ou controlar vários aspectos de um citômetro de fluxo de classificação. As instruções podem abranger uma ou mais rotinas adaptadas a várias tarefas dentro do citômetro.
[0043] Em algumas modalidades adicionais, uma célula óptica, cubeta, janela, tubo de fluxo, parede, divisória ou outra parte de um citômetro de fluxo de classificação é formado de um material que tem um índice de refração entre 1,30 e 1,40, inclusive. Nestas e em outras modalidades, uma solução contendo analisado pode ser ajustada de modo que o índice de refração da célula óptica, cubeta, janela, tubo de fluxo ou outra parte do citômetro de fluxo de classificação e, em particular, os índices de refração diferem em 0,02 ou menos.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0044] A Figura 1A ilustra um método de classificação de gotículas empregado em citômetros de fluxo de classificação.
[0045] A Figura 1B ilustra um método de pressão de fluxo diferencial empregado em citômetros de fluxo de classificação.
[0046] A Figura 1C retrata um mecanismo de revestimento e corrente empregado em sistemas de citometria de fluxo.
[0047] A Figura 1D retrata um mecanismo de bainha e corrente que emprega uma ponta chanfrada para orientar dentro da corrente.
[0048] A Figura 1E retrata um citômetro de fluxo detectando uma célula usando uma lente objetiva orientada coaxialmente em relação à corrente de fluxo.
[0049] A Figura 1F ilustra um sistema usando um refletor parabólico para iluminar células uniformemente e para coletar luz radialmente das células.
[0050] A Figura 2 retrata uma modalidade considerada da via de fluxo de um citômetro de fluxo de classificação.
[0051] A Figura 3 retrata uma modalidade considerada de um citômetro de fluxo
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18/59 de classificação.
[0052] A Figura 4 retrata uma modalidade alternativa considerada de um citômetro de fluxo de classificação.
[0053] A Figura 5 retrata outra modalidade alternativa considerada de um citômetro de fluxo de classificação.
[0054] A Figura 6A retrata uma modalidade alternativa considerada de uma porção de um citômetro de fluxo de classificação.
[0055] A Figura 6B retrata outra modalidade alternativa considerada de uma porção de um citômetro de fluxo de classificação.
[0056] A Figura 7 ilustra um método que pode ser usado com uma ou mais modalidades de um citômetro de fluxo de classificação considerada para criar dois pontos focais diferentes para energia dentro do sistema.
[0057] A Figura 8A retrata uma lente objetiva e ponto focal associado dentro de uma via de fluxo de uma modalidade considerada dos métodos e dispositivos agora descritos.
[0058] A Figura 8B ilustra uma modalidade de um volume geralmente cônico formado entre um ponto focal nominal e uma lente objetiva.
[0059] A Figura 9 retrata uma lente objetiva de imersão em água e ponto focal associado dentro de uma via de fluxo de uma modalidade dos métodos e dispositivos descritos agora.
[0060] A Figura 10 retrata um corpo no qual uma porção da via de fluxo de um citômetro de fluxo de classificação pode ser formada, de acordo com uma modalidade dos métodos e dispositivos descritos agora.
[0061] A Figura 11 retrata uma modalidade alternativa do corpo retratado na Figura 9.
[0062] A Figura 12 retrata outra modalidade alternativa do corpo retratado na Figura 9.
[0063] A Figura 13 retrata ainda outra modalidade alternada do corpo retratado na Figura 9.
[0064] A Figura 14 retrata ainda outra modalidade alternada do corpo retratado
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19/59 na Figura 9 e [0065] A Figura 15 retrata um fluxograma ilustrando as etapas de um método de acordo com os métodos e dispositivos descritos no presente.
DESCRIÇÃO DETALHADA [0066] A presente especificação descreve métodos, sistemas e dispositivos para separação de células baseada em citometria de fluxo. A menos que de outra forma definidos, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado conforme comumente entendido por pessoa com conhecimentos comuns na técnica à qual as invenções reivindicadas pertencem.
[0067] Nota-se aqui que, conforme usado nesta especificação e nas reivindicações anexadas, as formas singulares “um”, “uma”, “o” e “a” incluem referência de plural a menos que o contexto claramente dite de outra forma.
[0068] Como pessoas com conhecimentos comuns da técnica reconhecerão imediatamente, a menos que de outra forma indicado como sendo importantes para a compreensão dos métodos e dispositivos descritos, as figuras incluídas não estão desenhada em escala.
[0069] Conforme usado aqui, os seguintes termos têm os significados atribuídos a eles a menos que especificado de outro modo.
[0070] O termo “células” se refere ao analisado nos métodos e dispositivos descritos, este assunto incluindo, entre outros, células, vírus, corpos ou partículas. O termo “células de interesse” ou “célula de interesse” se refere a uma célula que tem uma propriedade desejada que pode ser detectada durante o fluxo da célula através do dispositivo citométrico de fluxo. Uma “propriedade desejada” se refere a certa característica que distingue a célula que tem a propriedade desejada de uma célula que não tem as ditas características. As células que têm uma propriedade desejada estão dentro de uma “subpopulação desejada” de células. Características de células detectáveis ou mensuráveis exemplares em uma célula de interesse incluem, entre outras, composição de proteína, teor de proteína, composição de DNA, teor de DNA, marcadores da superfície da célula, tamanho da molécula, absorção de luz, reflexão da luz, fluorescência, dispersão de luz, polarização, propriedades elétricas das
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20/59 células, propriedades magnéticas, propriedades morfológicas, permeabilidade da membrana, fluidez da membrana e estado redox. Aquela pessoa com conhecimento comum na técnica reconhecerá imediatamente que um citômetro pode medir ou detectar qualquer número de características alternativas em uma célula de interesse e que estas características alternativas são facilmente passíveis de exploração nos métodos e dispositivos descritos. Em um aspecto, os métodos ou dispositivos exploram uma “propriedade desejada” de uma célula de interesse para identificar células que têm esta propriedade.
[0071] O termo “primeira análise” se refere a uma análise inicial de células quando as células prosseguem através de um dispositivo citométrico de fluxo, que pode ser um tubo, uma cubeta, uma região, uma célula, uma câmara, etc., para determinar se as células são células de interesse. Em um aspecto de algumas modalidades, detectores em um citômetro de fluxo executam a primeira análise.
[0072] O termo “segunda análise” como é usado aqui se refere à caracterização da célula de interesse após a primeira análise através do tubo de fluxo para determinar se altera a célula de interesse usando uma fonte de energia. Em um aspecto de algumas modalidades, a segunda análise acontece após a primeira análise, geralmente menos de um segundo após a mesma.
[0073] Os termos “modificar”, “modificação”, “alterar” e “alteração”, conforme usados aqui, se referem ao uso da fonte de energia para induzir mudanças em uma célula. As modificações incluem, entre outras, efeitos diretos nas células, incluindo entre outros, a modificação de componentes celulares ou produtos químicos incluindo proteínas, DNA e substâncias envolvidas no metabolismo celular; rompimento, aquecimento, cavitação ou explosões que ocorrem dentro ou perto das células; permeabilização ou perfuração de células; e destruição, fragmentação ou alteração morfológica de células. Em outros aspectos, modificações também ou alternativamente incluem efeitos indiretos da fonte de energia, mediados pela fonte de energia ou por outros fatores, incluindo ativação e/ou desativação química, ligação cruzada química, ou derivatização química das células de um ou mais componentes celulares, a ativação e/ou desativação de um ou mais agentes
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21/59 químicos dentro ou perto das células que causam a ligação ou associação de tais agentes ou seus derivativos para a célula ou seus componentes, ou a indução de funcionamento alterado das células. Em certos aspectos, agentes químicos, normalmente presentes dentro ou de outra forma aplicados às células, interagem com as células quando da irradiação das células.
[0074] Os métodos e dispositivos descritos permitem a identificação de células de interesse pela detecção da presença ou ausência de qualquer número de características (por exemplo, uma propriedade desejada) ou parâmetros que possam ser determinados, estimados ou refletidos em medições compatíveis com técnicas citométricas de fluxo. As medições citométricas usadas para definir células ou populações celulares de interesse incluem em vários aspectos aqueles discutidos aqui e aqueles de outra forma conhecidos na técnica, assim como novos métodos de medição, mecanismos e/ou dispositivos que podem ser introduzidos ou tornados aplicáveis à análise citométrica de fluxo. Células sujeitas à análise citométrica através da prática dos métodos e dispositivos descritos agora podem ser rotuladas ou não rotuladas ou de outra forma modificadas ou não modificadas usando técnicas e reagentes conhecidos na técnica.
[0075] Conforme usado aqui, o termo “identificador” se refere a uma composição detectável por meios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquimicos ou químicos. Por exemplo, identificadores úteis incluem corantes fluorescentes, reagentes elétron-densos, enzimas, estreptavidina-biotina, dioxigenina, haptenos, proteínas para as quais anticorpos de soro ou monoclonais estão disponíveis ou corantes específicos de ácido nucleico, assim, nos métodos e dispositivos descritos agora, a composição, propriedades, e/ou características de células com relação a qualquer substância ou parâmetro, medidos direta ou indiretamente de qualquer forma é a base para a identificação de células e populações de células para seleção ou exclusão.
[0076] Exemplos de composição, propriedades e/ou características detectáveis de células incluem, entre outras: medições de propriedades de luz interagindo com as células ou emitida pelas células, tais como absorção, dispersão de luz,
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22/59 luminescência, fluorescência, fosforescência, polarização ou despolarização de luz ou outras propriedades; propriedades de eletricidade incluindo, entre outras, a indutância, capacitância, potencial, corrente ou resistência de células ou do meio envolvente; propriedades de eletromagnetismo incluindo magnetismo, paramagnetismo, ressonância magnética e/ou interação da célula ou emissão de forças e/ou ondas eletromagnéticas; imagem, propriedade de imagem, propriedades morfológicas ou propriedades relacionadas derivadas da coleta e/ou análise de imagem ou propriedades similares à imagem de células. Em certos aspectos, a medição é uma quantidade ou qualidade intrínseca da célula, ou em aspectos alternativos, a medição é um valor que indiretamente reflete, representa ou aproxima uma quantidade ou qualidade da célula. Ainda em outros aspectos, a medição é tanto uma quantidade ou como uma qualidade intrínseca da célula e um reflexo, representação ou aproximação indiretos de uma quantidade ou qualidade da célula. Como exemplo não limitante, uma medida de fluorescência de uma célula pode refletir a fluorescência intrínseca da célula ou a medida de fluorescência de uma célula pode refletir a presença e/ou quantidade de um fluorocromo ou partícula fluorescente que se liga ou se associa à célula e reflete direta ou indiretamente alguma propriedade da célula, ou ambas.
[0077] Em alguns aspectos dos métodos e dispositivos descritos, um citômetro de classificação emprega uma técnica que resulta na separação física ou espacial de células e de populações de células. Em outros aspectos dos métodos e dispositivos descritos, um citômetro de classificação utiliza uma técnica que modifica fisicamente e/ou funcionalmente células selecionadas em populações para permitir sua separação funcional e/ou física e/ou diferenciação, opcionalmente para uso subsequente. Em alguns aspectos do método e dispositivo descrito, um citômetro de classificação não conta com separação imediata de células pela posição, localização, receptáculo ou tempo, mas ao contrário fornece células que estão desativadas, incapacitadas, rompidas, desarticuladas, fragmentadas ou de outra forma alteradas (isto é, “modificadas”) em relação a alguma propriedade desejada, que opcionalmente permite a separação ou diferenciação de subpopulações na
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23/59 preparação. A natureza da modificação depende, em todo ou em parte, de uma aplicação pretendida ou uso para células identificadas e assim, nas características das células identificadas que são relevantes na aplicação. Como exemplo e apenas para fins de explicação ou esclarecimento, uma célula maligna ou de outra forma imortal ou que cresça rapidamente poderia ser considerada funcionalmente desativada no contexto da preparação de células somáticas normais se a capacidade da célula para reproduzir for afetada negativamente ou se a célula for exterminada. Em outro exemplo, novamente apenas para fins de explicação ou esclarecimento, onde uma aplicação exige a remoção de uma população de uma subpopulação de células que produzem uma proteína indesejada ou outra substância, um citômetro de classificação pode alcançar este resultado ao abolir a produção da substância nestas células, pelo extermínio das células e/ou pela modificação das células para permitir sua remoção física da população.
[0078] Os métodos e dispositivos descritos no presente utilizam, em algumas modalidades, uma fonte de energia para modificação de células ou para a indução ou iniciação de processos tais como ativação química que pode modificar células. As modificações induzidas pela fonte de energia incluem em vários aspectos, efeitos diretos nas células, incluindo, entre outros, a modificação de componentes celulares ou químicos incluindo proteínas, DNA e substâncias envolvidas no metabolismo celular; rompimento, aquecimento, cavitação ou explosões que ocorram dentro ou perto das células; permeabilização ou perfuração de células e destruição, fragmentação, ou alteração morfológica de células, incluindo células, vírus, corpos ou partículas. Em outras modalidades, modificações também ou alternativamente incluem efeitos indiretos da fonte de energia, mediados pela fonte de energia ou por outros fatores, incluindo ativação e/ou desativação química, ligação cruzada química, ou derivatização química das células ou de um ou mais componentes celulares, a ativação e/ou desativação de um ou mais agentes químicos dentro ou perto das células que causam a ligação ou associação de tais agentes ou seus derivados à célula ou seus componentes, ou a indução de funcionamento alterado das células. Em certas modalidades, agentes químicos que reagem à radiação com
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24/59 as células estão normalmente presentes nas células ou na aplicação, ou eles são adicionados como parte do método.
[0079] Em algumas modalidades, os métodos e dispositivos descritos incorporam o uso de compostos foto ativáveis que são induzidos para se ligarem ou se associarem às células ou componentes celulares pela radiação com luz de uma intensidade e energia apropriada. Tais compostos em certos aspectos induzem uma ligação cruzada ou desnaturação suficientes de um ou mais componentes celulares que afetam processos celulares ou metabolismo de células de interesse. Alternativamente, tais compostos em certos aspectos induzem uma ligação cruzada ou desnaturação suficientes de um ou mais componentes celulares que exterminam células de interesse. Em outra alternativa, compostos fotoativáveis usados nos métodos e dispositivos descritos se ligam para selecionar células e alterar uma ou mais propriedades de células de interesse de tal modo que apresentem as células de interesse passíveis de identificação e/ou enriquecimento e/ou esgotamento em processos subsequentes. Células de interesse que foram alteradas por derivatização química, tal como a adição de uma substância química, são em certos aspectos removidas, concentradas ou purificadas em uma etapa subsequente por métodos que utilizam as propriedades ou interações de tal substância. Como exemplo e apenas para fins de explicação e esclarecimento, células de interesse são, em um aspecto, derivatizadas pela adição de uma substância que está subsequentemente ligada por um anticorpo que permite a captura ou retenção da célula de interesse derivatizada por vários meios. Muitas tais substâncias são consideradas e, em um aspecto, tais substâncias incluem uma classe de compostos contendo ou relacionada ao grupo 2,4-dinitrofenil (DNP), que em um aspecto é reconhecido e especificamente ligado por anticorpos que reconhecem o DNP. Consequentemente, derivados fotoativáveis de DNP ou compostos relacionados são usados em um aspecto para derivatizar células de interesse em uma aplicação deste tipo. Alternativamente, células de interesse derivatizadas são capturadas ou removidas usando estratégias que fazem com que as células de interesse derivatizadas se liguem preferencialmente a certos substratos. Como exemplo e apenas para fins de
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25/59 explicação e esclarecimento, as células de interesse derivatizadas usando compostos contendo ou relacionados à biotina são em um aspecto capturadas ou retidas em substratos, superfícies, substâncias, meio, compostos ou partículas que se ligam ou foram modificados para se ligarem à biotina, por exemplo, através da presença de avidina, estreptavidina, anticorpos que se ligam à biotina, ou outras moléculas que se ligam à biotina. Em outra alternativa relacionada a este aspecto, derivados fotoativáveis de biotina ou compostos relacionados são usados para derivatizar células de interesse em tal aplicação. Alternativamente em outros aspectos, células interesse são alteradas pela adição ou associação de substâncias químicas ou compostos antes de serem submetidas à seleção e modificação. Nesse caso, portanto, uma modalidade dos métodos e dispositivos descritos aqui utiliza alteração da substância adicionada às células selecionadas para permitir a diferenciação de tais células de outras na população. Como exemplo e apenas para fins de explicação e esclarecimento, em um aspecto todas as células em uma população são derivatizadas pela adição de um composto químico fotoinstável antes da análise e, em um aspecto, células específicas são o alvo para modificação usando a fonte de energia do dispositivo para modificar o composto químico fotoinstável naquelas células.
[0080] Em algumas modalidades de um citômetro (vide a Figura 1), células passam dentro de uma câmara, cubeta, corrente de interrogação ou análise, ou outro lugar ou região de análise no modo usual, conhecido na técnica, para análise e/ou classificação citométrica de fluxo. O citômetro identifica células por suas propriedades medidas conforme descrito acima, incluindo, entre outras, tais propriedades como fluorescência e/ou dispersão de luz, conforme tenham uma propriedade desejada ou não tenham uma propriedade desejada na preparação final. Um fluxo de fluido transporta as células através da região do citômetro e, em um aspecto, passam por um ou mais feixes de laser, detectores, e/ou outros dispositivos que detectam quantidades e qualidades das células. Em tal aspecto, o fluxo de fluido move as células em direção a um elemento óptico que tem um eixo geralmente alinhado coaxialmente em relação ao fluxo de fluido. Por meio de
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26/59 exemplo não limitante, o elemento óptico pode incluir uma lente, tal como uma lente objetiva, e/ou pode incluir um ou mais detectores, feixes de laser e/ou outras fontes de energia. A luz e/ou energia que passa entre as células e os detectores, feixes de laser e ou outras fontes de energia pode passar através de um elemento óptico (por exemplo, a lente objetiva) que está alinhado coaxialmente em relação ao fluxo das células através da porção relevante do citômetro. A posição de cada célula no citômetro a qualquer momento é, em um aspecto, determinada direta ou indiretamente e/ou estimada a partir da velocidade da célula ou fluido que passa através da porção relevante do instrumento. Uma célula que passou por algumas ou todas as posições de análise na região é, em um aspecto, identificada como tendo uma propriedade desejada ou não tendo uma propriedade desejada na preparação final. Tal determinação, em um aspecto, é feita por um dispositivo ou dispositivos de análises de dados de um computador e/ou eletrônico ou elétrico digital e/ou analógico e/ou software e/ou hardware de computador. Tal dispositivo compara propriedades individuais ou múltiplas, medições e/ou característica de cada célula com um ou um conjunto ou grupo de propriedades, medidas e/ou características definidas pelo operador do dispositivo. Alternativamente, as propriedades com as quais as propriedades medidas devem ser comparadas são, em um aspecto, determinadas automaticamente usando algoritmos ou programas incluídos dentro ou com o citômetro.
[0081] O conjunto de propriedades diante das quais células medidas no citômetro são comparadas em um aspecto define uma ou mais subpopulações de células de interesse que têm uma propriedade desejada ou não têm uma propriedade desejada na preparação da célula, a determinação se uma célula que está passando através da região de análise do instrumento é um membro de uma subpopulação determinada de células de interesse é, em um aspecto, feita rapidamente de modo que o estado da célula com tendo uma propriedade desejada ou não tendo uma propriedade desejada na preparação da célula é determinado em um momento em que a posição da célula no sistema de fluxo do instrumento é determinada, em certos aspectos, geralmente menos de um segundo após entrar na
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27/59 região de análise do instrumento. Uma vez que a determinação tenha sido feita, as células em um aspecto são acionadas por uma energia ou força que é seletivamente conferida às células que satisfazem ou não satisfazem os critérios de seleção. A força ou energia em vários aspectos desativa, incapacita, rompe, desarticula, fragmenta ou de outra forma altera as células de interesse com relação a uma propriedade desejada que seja relevante para uma aplicação subsequente opcional, ou a força ou energia em aspectos alternativos modifica e/ou derivatiza, ou faz com que as células de interesse sejam derivatizadas de um modo que permita a separação ou diferenciação subsequente de uma ou mais subpopulações de células de interesse na preparação.
[0082] Tal força ou energia, em vários aspectos, é conferida por um ou mais lasers ou outra luz e/ou fontes eletromagnéticas direcionas à localização das células na corrente de fluxo, de tal maneira que a fonte de energia possa ser rapidamente desviada, desconcentrada ou desligada para permitir a passagem de células que não estão selecionadas para modificação. Como exemplo e apenas para fins de esclarecimento e explicação, um laser de alta energia e/ou de alta intensidade, capaz de ser rapidamente pulsado ou ligado e desligado, expõe células selecionadas à radiação danosa tornado-as não funcionais no contexto de qualquer uso desejado. Em certos aspectos, a força ou energia passa através de um elemento óptico geralmente alinhado coaxialmente em relação ao fluxo de células quando as células passam através da área relevante do citômetro. Em qualquer caso, todas as células, tanto as selecionadas e acionadas pela força e pela energia modificadora como aquelas não selecionadas e não acionadas pela força ou energia, continuam a migrar com o fluxo celular e saem da região do dispositivo na qual a medição das propriedades celulares e a modificação das células selecionadas são realizadas. O efluente é coletado e contém células modificadas e não modificadas assim como, em certos aspectos, fragmentos ou resíduos de células, assim como fluido, soluções e/ou tampões usados no processo. Em vários aspectos, o efluente é também usado nesta forma, ou em outros aspectos ele é concentrado, fracionado ou de outra forma ainda processado para alcançar as propriedades e/ou
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28/59 a composição desejadas.
[0083] As Figuras 2 a 5 retratam várias modalidades de um citômetro de fluxo de classificação de acordo com os métodos e dispositivos descritos. A Figura 2 em particular retrata uma modalidade de uma via de fluxo básico 110 do citado citômetro. Um tubo de entrada de fluido de revestimento 112 permite que o fluido de revestimento pressurizado entre na via de fluxo 110 em uma entrada de fluido de revestimento 114, criando um fluxo 116 de fluido de revestimento através da via de fluxo 110. A jusante da entrada de fluido de revestimento 114 e preferivelmente em uma região de fluxo laminar suave do fluido de revestimento, um tubo de entrada 118 de fluido do analisado permite que uma corrente 120 do fluido do analisado (isto é, um fluido no qual um analisado é suspenso, transportado, etc.) entre na via de fluxo 110 através de uma entrada do analisado 122. Em algumas modalidades, a entrada do analisado 122 é disposta centralmente dentro do fluxo 116 do fluido de revestimento e/ou centralmente dentro da via de fluxo 110 e orientada de modo que a corrente 120 do fluido do analisado esteja paralela ao fluxo 116 do fluido de revestimento quando o fluido do analisado entrar na via de fluxo 110. É óbvio que a entrada do analisado 122 não precisa ser central em relação ao fluxo 116 do fluido de revestimento ou para em relação à via de fluxo 110 e aquela pessoa com conhecimento comum da técnica poderia imaginar modalidades nas quais a corrente 120 do fluido do analisado é diferente da paralela ao fluxo 116 do fluido de revestimento quando a corrente 120 do fluido do analisado entra a via de fluxo 110. A taxa de fluxo e pressão do fluxo 116 do fluido de revestimento relacionadas à corrente 120 do fluido do analisado comprime e faz a constrição da corrente 120 do fluido do analisado ser estreita em relação ao fluxo 116 do fluido de revestimento. O fluxo 116 do fluido de revestimento e a corrente 120 do fluido do analisado se combinam para formar um fluxo de amostra 123.
[0084] A via de fluxo 110 pode mudar de direção em uma região 124, mas preferivelmente depois disso inclui uma região 126 livre tanto de obstáculos como de mudanças abruptas na direção de fluxo que serve para estabilizar o fluxo de amostra 123 antes que o fluxo de amostra 123 alcance uma área de interrogação/detecção
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128 (isto é, uma área de observação, área de análise, ponto focal nominal, etc.). A via do fluxo de amostra 123 através da via de fluxo 110 define um eixo de fluxo 130.
Em algumas modalidades, a corrente 120 do fluido do analisado e, em particular os analisados (isto é, as células) dentro da corrente 120 do fluido do analisado geralmente viaja através da via de fluxo 110 ao logo do eixo de fluxo 130.
[0085] Após alcançar e/ou passar através da área de interrogação/detecção 128, o fluxo de amostra 123 é desviado. Em algumas modalidades, a via de fluxo 110 muda de direção em um canto 132 (indicado na Figura 2 por uma linha pontilhada). Em algumas modalidades, o fluxo de amostra 123 encontra um fluxo transversal 134 quando ele alcança uma extremidade 136 da região 126. O fluxo transversal 134 redireciona o fluxo de amostra 123. Em algumas modalidades, o canto 132 ou o fluxo transversal 134 causa uma mudança de 90° na direção do fluxo de amostra 123. Entretanto, o fluxo de amostra 123 pode, em modalidades alternativas, variar por mais ou menos 90 graus. Em qualquer caso, após mudar de direção, o fluxo de amostra 123 pode fluir para um receptáculo de coleta 138 e pode passar através de um ou mais elementos da via de fluxo 140 (por exemplo, reguladores de fluxo, filtros, etc.) antes de alcançar o receptáculo de coleta 138.
[0086] Uma lente objetiva 142 geralmente disposta no ou próxima ao canto 132 ou na ou próxima à interseção do fluxo de amostra 123 com o fluxo transversal 134 opera para criar um ponto focal (não mostrado) dentro da área de interrogação/detecção 128. Um eixo óptico 144 da lente objetiva 142 está geralmente alinhado coaxialmente em relação ao eixo de fluxo 130 da via de fluxo quando a via de fluxo 110 passa através da área de interrogação/detecção 128. É claro que o eixo óptico 144 e o eixo de fluxo 130 não precisam estar perfeitamente coaxiais e podem variar de modo que o eixo óptico 144 esteja paralelo e deslocado a partir do eixo de fluido 130, de modo que o eixo óptico 144 esteja em um ângulo oblíquo com relação ao eixo de fluxo 130, etc.
[0087] A Figura 3 ilustra um citômetro de fluxo de classificação exemplar 151 incluindo várias características dos métodos e dispositivos descritos. Similarmente à modalidade da via de fluxo 110 retratada na Figura 2, a Figura 3 retrata o tubo de
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30/59 entrada de fluxo de revestimento 112 e o tubo de entrada 118 do fluido de amostra, apresentando respectivamente o fluxo 116 do fluido de revestimento e a corrente 120 do fluido do analisado através da entrada do fluido de revestimento 114 e da entrada 122 do fluido do analisado. Em particular, o fluido do analisado retratado na Figura 3 inclui células 150 de esperma de mamíferos e uma solução tampão 152 transportando as células 150 de esperma de mamíferos. Conforme o fluxo 116 do fluido de revestimento e o fluxo 120 do fluido do analisado se mesclam para formar o fluxo de amostra 123, as taxas de fluxo respectivas fazem com que as células 150 formem geralmente uma corrente de fileira única e alinhem seus eixos longitudinalmente (isto é, ao longo do comprimento da cauda da célula) com a direção do fluxo de amostra 123.
[0088] Ainda em referência à Figura 3, uma modalidade de um citômetro de fluxo de classificação inclui uma primeira análise e uma segunda análise. Conforme as células 150 prosseguem através da via de fluxo 110 com o fluxo de amostra 123, a primeira análise pode determinar se as células são de interesse, pode determinar a taxa na qual as células estão se movendo através da via de fluxo 110, pode determinar se em um determinado ponto no fluxo de amostra 123 as células 150 estão muito próximas para uma ou mais análises posteriores, se as células 150 estão orientadas primeiro pela cauda ou primeiro pela cabeça, etc. Na modalidade representada pela Figura 3, a primeira análise ocorre quando as células 150 alcançam um ponto 154 na via de fluxo 110. Uma fonte 156 de iluminação de primeira análise dirige a energia 158 em direção ao ponto 154. A energia 158 pode interagir com cada célula 150 para disseminar a energia 158 ou de outra forma interagir com a célula 150, um anticorpo associado com a célula 150, um fluorocromo (por exemplo, fluoresceína) associado com a célula 150, etc. Um detector 160 pode detectar a energia resultante 162 (por exemplo, a energia espalhada, o sinal fluorescente resultante, etc.) e enviar um sinal correspondente via uma conexão 164 para um controlador 166. O detector 160 pode ser disposto em qualquer local apropriado para detectar a energia 162, incluindo em um ângulo oblíquo em relação ao ponto 154 (com relação à fonte 156 de energia de iluminação)
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31/59 ou em consonância com o ponto 154. A fonte 156 de iluminação da primeira análise é preferivelmente um laser de 488 nm, mas pode compreender qualquer fonte de energia adequada para medições consideradas na primeira análise. A fonte 156 de iluminação da primeira análise pode ser orientada de modo que a energia 158 viaje perpendicularmente ao fluxo de amostra 123 ou pode, alternativamente, ser orientada de modo que a energia 158 esteja incidente sobre as células 150 em um ângulo oblíquo em relação à direção do fluxo de amostra 123. Além disso, a energia 158 e/ou a energia 162 podem passar através de um ou mais elementos ópticos (não mostrados) tais como filtros, lentes, etc., que podem permitir que um ou ambos a fonte 156 de energia de iluminação e o detector 160 estejam posicionados diferentemente do que foi retratado pela criação de uma via óptica diferente conforme é geralmente conhecido na técnica.
[0089] Algumas modalidades podem omitir a primeira análise. Por exemplo, informações recolhidas da segunda análise (descrita em detalhes abaixo) podem se mostrar suficientes tanto para determinar quais células sejam de interesse como para distinguir entre células em subpopulações desejadas e indesejadas. Assim, os elementos 154 a 164 podem ser omitidos em algumas modalidades. Alternativamente, algumas modalidades podem incluir duas ou mais primeiras análises e, consequentemente, dois ou mais conjuntos de elementos 154 a 164. Por exemplo e sem limitação, o fluxo de amostra 123 pode incluir um ou mais marcadores (por exemplo, incluídos no fluxo de revestimento 116, anexados ou de outra forma associados a algumas células 150 na corrente de amostra 120, etc.). Uma primeira análise primária pode detectar um dos marcadores em um primeiro ponto e uma primeira análise secundária pode detectar o marcador em um segundo ponto para determinar a taxa de fluxo de células no fluxo de amostra 123.
[0090] Em qualquer caso, o fluxo de amostra 123 prossegue após a primeira análise para transportar as células 150 ao longo da via de fluxo 110. Quando as células 150 passam através de um ponto 170, a segunda análise caracteriza as células 150, conforme descrito abaixo, para determinar se cada célula 150 deve ser modificada ou não. Conforme cada célula 150 alcança o ponto 170, uma fonte 172
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32/59 de iluminação de segunda análise dirige energia 174 em direção ao ponto 170. A energia 174 pode interagir com a célula 150, um anticorpo associado à célula 150, um fluorocromo (por exemplo, mancha Hoechst) associado à célula 150 ou ao DNA dentro da célula 150, etc. Em algumas modalidades a fonte 172 de iluminação de segunda análise é um laser ultravioleta que emite a energia 174 na forma de radiação ultravioleta que interage com partículas de mancha Hoechst anexadas ao DNA dentro da célula 150 para causar fluorescência proporcional ao teor do DNA da célula 150, conforme é geralmente conhecido na técnica. A fonte 172 de iluminação de segunda análise pode ser orientada de modo que o feixe 174 esteja perpendicular ao fluxo de amostra 123, conforme retratado na Figura 3. Entretanto, a fonte 172 de iluminação de segunda análise também pode estar localizada em um ângulo oblíquo com relação ao fluxo de amostra 123. Além disso, a energia 174 pode passar através de um ou mais elementos ópticos (não mostrados) tais como filtros, lentes, etc., que podem permitir que a fonte 172 de iluminação de segunda análise esteja posicionada diferentemente do mostrado pela criação de uma via óptica que não seja reta.
[0091] A interação da energia 174 com a célula 150 ou com elementos dentro da célula 150 faz com que a energia resultante 176 se irradie a partir da célula 150. A lente objetiva 142, posicionada de modo que o eixo óptico 144 da lente objetiva 142 esteja geralmente coaxial ao fluxo de amostra 123, opera para concentrar a energia 176. Um ponto focal 178 da lente objetiva 142 está localizado geralmente no ponto 170, mas pode estar localizado de modo a detectar a energia resultante 176 da célula 150 pouco depois que a energia 174 ilumina a célula 150 (isto é, o ponto focal 178 pode estar um pouco mais perto da lente objetiva 142 do que o ponto 170). Um detector 180 situado de modo a receber energia 182 focalizado pela lente objetiva 142 detecta a energia focalizada 182 da célula 150 e envia um sinal correspondente via uma conexão 184 para o controlador 166. É claro que um ou mais elementos ópticos, tal como um filtro 186, podem atuar para alterar ou redirecionar a energia 182 entre a lente objetiva 142 e o detector 180. Em algumas modalidades, a lente objetiva 142 cria o ponto focal 178 antes do canto 132 ou da convergência do fluxo
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33/59 transversal 134 e do fluxo de amostra 123. Em outras modalidades, a lente objetiva
142 cria um ponto focal (não mostrado) em ou perto do canto 132 ou da convergência do fluxo transversal 134 e do fluxo de amostra 123.
[0092] O controlador 166, que pode incluir um ou mais microprocessadores 188, um ou mais osciladores de cristal 190, uma ou mais memórias 192 que armazenam uma ou mais rotinas 194, etc., interpreta os sinais recebidos do detector 160 e/ou do detector 180 para determinar para cada célula 150 se a célula 150 é parte de uma subpopulação desejada de células. Por exemplo, em algumas modalidades, as células 150 são células de esperma de mamíferos e o controlador 166 interpreta sinais recebidos do detector 180 para determinar se cada célula 150 carrega um cromossomo X ou um cromossomo Y. Conforme é geralmente conhecido por aqueles que têm conhecimento comum da técnica, em células de esperma de mamíferos cromossomos Y geralmente contém menos DNA do que cromossomos X. Consequentemente, pela análise da fluorescência (isto é, a energia resultante 176) emitida pela mancha na célula 150 na iluminação pela fonte 172 de iluminação da segunda análise, o controlador 166 pode geralmente determinar se a célula 150 carrega um cromossomo X ou Y. Em algumas modalidades, uma das rotinas 194 monitora continuamente a distribuição estatística de sinais fluorescentes detectados para aprimorar com o passar do tempo a precisão da determinação.
[0093] Ainda com referência à Figura 3, em algumas modalidades o controlador 166, de acordo com a determinação se uma célula 150, faz parte de uma subpopulação desejada, produz um sinal para uma fonte de energia controlável 196 via uma conexão 198. A fonte de energia controlável 196 pode emitir energia 197 direcionada a um ponto 199 no fluxo de amostra 123. Em algumas modalidades, o controlador 166 opera para coordenar o sinal para a fonte de energia controlável 196 e/ou o ponto 199 é selecionado (por exemplo, por mira, por uma ou mais lentes, espelhos, etc.) de acordo com a taxa na qual a célula 150 se move através da via de fluxo 110. Em algumas modalidades, o ponto 199 pode estar localizado antes do canto 132 ou da convergência do fluxo transversal 134 e do fluxo de amostra 123, para simplificar a determinação da posição da célula 150 viajando ao longo da via de
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34/59 fluxo 110. Em outras modalidades, o ponto 199 pode estar localizado na ou após a convergência do fluxo transversal 134 e do fluxo de amostra 123. No exemplo acima, o controlador 166 pode produzir um sinal para fazer com que a fonte de energia controlável 196 emita a energia 197 em resposta a uma determinação de que a célula 150 tem um cromossomo X ou em resposta a uma determinação de que a célula 150 tem um cromossomo Y. Alternativamente, o controlador 166 pode produzir um sinal para fazer com que a fonte de energia controlável 196 pare de emitir energia 197 em resposta a uma determinação de que a célula 150 tem um cromossomo X ou em resposta a uma determinação de que a célula 150 tem um cromossomo Y. A energia 197 emitida da fonte de energia controlável 196 pode atuar para desabilitar a célula 150 ou tornar a célula 150 não-viável (por exemplo, pela modificação de componentes celulares ou químicos incluindo proteínas, DNA e substâncias envolvidas no metabolismo celular, causando rompimento, aquecimento, cativação ou explosões dentro ou próximo à célula 150; causando a permeabilização ou perfuração da célula 150 e/ou causando a destruição, fragmentação, ou alteração morfológica da célula 150), pode agir para alterar a célula (por exemplo, pela interação com um componente celular químico dentro ou anexado a ela), de modo que ela possa mais tarde ser identificada e/ou removida da subpopulação desejada de células 150, ou pode agir de modo a afetar favoravelmente a célula. Em algumas modalidades, a fonte de energia controlável
196 é um laser e, em particular, pode ser um laser produzindo energia nas partes visíveis ou infravermelhas do espectro. Em algumas modalidades, o laser produz energia que tem um comprimento de onda de 690 nm. Em outras modalidades, a fonte de energia controlável 196 pode emitir outros tipos ou comprimentos de onda de radiação, tais como raios X, microondas, luz visível, luz infravermelha, luz ultravioleta, ou qualquer outro tipo de energia que tem um efeito desejado em uma célula 150. É claro que, em resposta à determinação de se saber se uma célula é parte da subpopulação desejada ou não, o controlador 166 pode: (1) emitir a energia
197 para afetar adversamente as células 150 determinadas como não fazendo parte da subpopulação desejada (deixando de lado as células 150 determinadas como
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35/59 fazendo parte da subpopulação desejada); (2) pode emitir energia 197 para afetar positivamente as células 150 determinadas como fazendo parte da subpopulação desejada (deixando de lado as células 150 determinadas como não fazendo parte da subpopulação desejada); (3) pode parar de emitir a energia 197 para evitar afetar positivamente as células 150 determinadas como não fazendo da subpopulação desejada (enquanto continua a emitir a energia 197 para afetar positivamente as células 150 determinadas como fazendo parte da subpopulação desejada) ou (4) pode parar de emitir a energia 197 para evitar afetar adversamente as células 150 determinadas como fazendo parte da subpopulação desejada (enquanto continua a emitir a energia 197 para afetar adversamente as células 150 determinadas como não fazendo parte da subpopulação desejada). Além disso, em algumas modalidades, o controlador 166 pode tratar as células 150 indeterminadas (por exemplo, as células 150 para as quais o controlador 166 não pôde fazer uma determinação, as células 150 que estão muito próximas, etc.) da mesma maneira pela qual o controlador 166 trata as células determinadas como não fazendo parte da subpopulação desejada.
[0094] A Figura 4 ilustra um citômetro 200 de fluxo de classificação exemplar incluindo várias características dos métodos e dispositivos descritos. Em particular, o citômetro 200 de fluxo de classificação retratado na Figura 4 omite a primeira análise e, consequentemente, os elementos 154 a 164 não aparecem. Entretanto, enquanto não ilustrado, aqueles com conhecimento comum da técnica reconhecerão que a primeira análise pode ser incluída, se desejado, na modalidade ilustrada na Figura 4. Assim como na modalidade retratada na Figura 3, o fluxo de amostra 123 transporta as células 150 ao longo da via de fluxo 110. Quando as células 150 passam através do ponto 170, a segunda análise (que na representação da Figura 4 não segue qualquer primeira análise) caracteriza as células 150, conforme descrito acima, para determinar se cada célula 150 deve ser modificada ou não. Isto é, quando cada célula 150 alcança o ponto 170, a fonte 172 de iluminação da segunda análise dirige a energia 174 em direção ao ponto 170 e a energia 174 interage com a célula 150, conforme descrito acima. É claro que a fonte 172 de iluminação da segunda análise
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36/59 pode ser um laser ultravioleta e a energia 174 pode interagir com moléculas da mancha de Hoechst 33342 anexadas ao DNA dentro da célula 150. A fonte 172 de iluminação da segunda análise pode ser orientada de modo que o feixe 174 esteja perpendicular ao fluxo de amostra 123, conforme retratado na Figura 4. Entretanto, a fonte 172 de iluminação da segunda análise pode estar também em um ângulo oblíquo com relação ao fluxo de amostra 123. Além disso, a energia 174 pode passar através de um ou mais elementos ópticos (não mostrados) tais como filtros, lentes, etc., que podem permitir que a fonte 172 de iluminação da segunda análise seja posicionada diferentemente do que foi retratado, criando uma via óptica que não seja reta.
[0095] A energia resultante 176 irradiando da célula 150 se propaga em direção à lente objetiva 142, que está posicionada de modo que o eixo óptico 144 (vide a Figura 3) da lente objetiva 142 está geralmente coaxial com o fluxo de amostra 123 e opera para concentrar a energia 176. O ponto focal 178 da lente objetiva 142 está localizado geralmente no ponto 170, mas pode alternativamente estar localizado de modo a detectar a energia resultante 176 da célula 150 logo após a energia 174 iluminar a célula 150. Um ou mais elementos ópticos podem dirigir a energia concentrada 182 da lente objetiva 142 para o detector 180. Por exemplo, na modalidade retratada pela Figura 4, a energia concentrada 182 passa através de um divisor de feixe 202 e pelo filtro 186 antes de alcançar o detector 180. Outros elementos ópticos (por exemplo, lentes, espelhos, filtros, etc.) também podem afetar a via da energia concentrada 182 entre a lente objetiva 142 e o detector 180. Assim como na modalidade retratada na Figura 3, em algumas modalidades a lente objetiva 142 cria o ponto focal 178 antes do canto 132 ou da convergência do fluxo transversal 134 e do fluxo de amostra 123. Em outras modalidades, a lente objetiva 142 cria um ponto focal (não mostrado) no ou próximo do canto 132 ou da convergência do fluxo transversal 134 e do fluxo de amostra 123.
[0096] O controlador 166, conforme descrito acima com relação à Figura 3, opera para interpretar sinais recebidos (por meio da conexão 184) do detector 180 (e o detector 160 se o citômetro 200 incluir a primeira análise) para determinar para cada
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37/59 célula 150 se a célula 150 faz parte ou não de uma subpopulação desejada de células (por exemplo, células de esperma com um cromossomo X). O controlador 166 envia um sinal sobre uma conexão 206 para uma fonte de energia 204 controlável. A fonte de energia 204 controlável opera da mesma maneira que a fonte de energia 196 controlável (Figura 3). Entretanto, na modalidade retratada na Figura 4, a energia 208 emitida pela fonte de energia 204 controlável passa através da lente objetiva 142 após passar, em algumas modalidades, através de um ou mais elementos ópticos, tais como um filtro 216. A lente objetiva 142 opera para concentrar a energia 208 em um ponto focal 210. Em algumas modalidades, a lente objetiva 142 pode concentrar a energia 208 da fonte de energia controlável 204 de modo que a energia concentrada 212 está geralmente coaxial em relação ao fluxo de amostra 123 e de modo que o ponto 210 esteja localizado mais próximo da lente objetiva 142 do que o ponto 170.
[0097] Aqueles com conhecimento comum da técnica reconhecerão que existem múltiplos métodos para criar tanto o ponto focal 210 como o ponto focal 178 usando a mesma lente. A Figura 7 retrata um método que o citômetro 200 poderia empregar para criar o ponto focal 178 para a energia 176 e o ponto focal 210 para a energia 212. A Figura 7 mostra que quando a energia 176 (indicada por linhas sólidas na Figura 7) passa através de uma lente 214 da lente objetiva 142 (não mostrada na Figura 7) do ponto focal 178 (isto é, a partir da célula 150 no ponto 170), a lente 214 age sobre a energia 176 de modo que os raios de energia 176 estejam paralelos ao deixarem a lente 214. Em contraste, os raios de energia 208 estão convergindo levemente quando eles incidem sobre a lente 214 e, consequentemente, convergem em um ponto focal 210 após passarem através da lente 214. É claro que existem outros métodos para criar tanto o ponto focal 178 como o ponto focal 210, incluindo tirar vantagem do fato de que comprimentos de onda de energia diferentes podem refratar diferentemente através do mesmo material, ou empregar lentes multifocais tais como, por exemplo e não limitante, aquelas descritas na Patente dos EUA N.° 6.010.647.
[0098] Para fins ilustrativos, a Figura 5 retrata outra modalidade exemplar de um
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38/59 citômetro 220 de fluxo de classificação. O citômetro 220 de fluxo de classificação inclui a via de fluxo 110 conforme é geralmente descrito com relação às Figuras 3 e
4. Similarmente ao citômetro 200 de fluxo de classificação retratado na Figura 4, o citômetro 220 de fluxo de classificação omite a primeira análise (assim como o equipamento associado à primeira análise). O fluxo de amostra 123 e, em particular, as células 150, fluem em direção à lente objetiva 142. Assim como nas modalidades descritas anteriormente, a lente objetiva 142 cria um ponto focal 178 em um ponto 170 na via de fluxo 110. A energia 176 da célula 150 quando a célula 150 alcança o ponto 170 passa através da lente objetiva 142, cuja lente objetiva 142 está posicionada de modo que o eixo óptico 144 da lente objetiva 142 esteja geralmente coaxial com o fluxo de amostra 123 e opera para concentrar a energia 176. O ponto focal 178 da lente objetiva 142 está localizado geralmente no ponto 170, mas pode alternativamente estar localizado de modo a detectar a energia 176 resultante da célula 150 logo após a energia 174 iluminar a célula 150. Um ou mais elementos ópticos (tais como o divisor de feixe 202, o filtro 186, etc.) podem direcionar a energia concentrada 182 da lente objetiva 142 para o detector 180.
[0099] Ainda em relação à Figura 5, o citômetro 220 de fluxo de classificação retratado inclui uma fonte de iluminação 222 de segunda análise. A fonte de iluminação 222 de segunda análise emite energia 224, que pode ser energia ultravioleta 174. A energia 224 emitida pela fonte de iluminação 222 de segunda análise viaja através de uma via óptica para a lente objetiva 142. A lente objetiva 142 pode concentrar a energia 224 no ponto focal 178 e, desta maneira, as vias ópticas da energia 176 e da energia 224 podem se sobrepor em algum grau. Várias combinações de outros elementos ópticos, tais como o divisor de feixe 202 e o filtro 226 podem operar para dirigir a energia 224 da fonte de iluminação 222 de segunda análise para a lente objetiva e para dirigir a energia 176 (da célula 150) da lente objetiva 142 para o detector 180.
[00100] O controlador 166, conforme descrito acima com relação às Figuras 3 e 4, opera para interpretar sinais recebidos (por meio da conexão 184) do detector 180 (e do detector 160 se o citômetro 200 incluir a primeira análise) para determinar para
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39/59 cada célula 150 se a célula 150 faz parte ou não de uma subpopulação desejada de células. O controlador 166 produz um sinal sobre uma conexão 230 para uma fonte de energia 228 controlável. A fonte de energia 228 controlável opera da mesma maneira que a fonte de energia 196 controlável (Figura 3), produzindo energia 232 direcionada a um ponto 234.
[00101] As Figuras 6A e 6B retratam as porções 235A e 235B, respectivamente, ainda de outras modalidades de um citômetro de fluxo de acordo com os métodos e dispositivos considerados. Em cada uma das Figuras 6A e 6B, as células 236 viajam em uma corrente 237 através de uma via de fluxo 238, cuja via de fluxo 238 muda a trajetória no ou em torno do ponto 239, conforme descrito com relação à Figura 2. A modelagem fluídica e/ou a formação precisa da via de fluxo 238 e/ou da corrente 237 de células 236 através da via de fluxo 238 e/ou a inclusão de elementos adicionais (não mostrados) para monitorar a posição de células 236 podem melhorar a incerteza causada de outra forma pela mudança na trajetória no ou em torno do ponto 239. Deste modo, a posição e identidade de células individuais podem permanecer determináveis após a mudança de trajetória. A Figura 6A retrata uma modalidade na qual uma fonte de energia 240 controlável, operando da mesma maneira conforme descrito acima com relação às Figuras 3, 4 e 5 (196, 204 e 228, respectivamente) está posicionada de modo que a energia emitida 241 incida sobre as células 236 e após as células 236, viajem além do ponto 239 na via de fluxo 238. A Figura 6A retrata a energia 241 viajando perpendicularmente na direção na qual as células 236 fluem através da via de fluxo 238. É claro que uma pessoa pode reconhecer que a fonte de energia 240 controlável pode alternativamente ser posicionada de modo que a energia emitida 241 viaja geralmente coaxialmente com a direção na qual as células 236 fluem através da via de fluxo 238 (por exemplo, novamente pela mudança da direção de fluxo e posicionando a fonte de energia 240 controlável de modo que as células 236 na via de fluxo 238 viajem em direção à fonte de energia 240 controlável).
[00102] Deve ser reconhecido que um citômetro de fluxo de classificação de acordo com os métodos e dispositivos considerados pode alternativamente
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40/59 empregar uma configuração de “jatos no ar”, conforme mostrado na Figura 6B. A Figura 6B retrata um bocal 242 emitindo uma corrente 243 de gotículas 244. Uma fonte de energia controlável (não mostrada) altera seletivamente as gotículas através da transmissão de uma carga a uma ou mais das gotículas 244. Depois disso e como exemplo e não limitante, um par de placas 245 carregadas eletricamente pode classificar a corrente 243 de gotículas 244 dentro de receptáculos 246 de acordo com uma determinação por um detector (não mostrado), conforme descrito acima. [00103] A Figura 8A retrata a lente objetiva 142 e uma porção da via de fluxo 110 que inclui a região de interrogação/detecção 128. Como é geralmente conhecido na técnica, um ou mais elementos de lentes 250 (por exemplo, uma lente frontal hemisférica, uma lente menisco, etc.) agem para criar um ponto focal nominal 252. Nas modalidades descritas acima com relação às Figuras 3 a 5, o ponto focal nominal 252 está dentro do fluxo de amostra 123 e, em particular, dentro da via das células 150 através da via de fluxo 110. O ponto focal nominal 252 define o ápice de um volume geralmente cônico 254 entre o ponto focal nominal 252 e um elemento externo 256 da lente objetiva 142 formando uma base 253 do volume cônico 254. O volume cônico 254 pode ser um volume circular cônico reto, mas também pode ser um volume cônico oblíquo. Um eixo 258 do cone é geralmente coaxial com um eixo 260 da lente objetiva 142 nas modalidades nas quais o volume cônico 254 é um volume cônico circular reto. Em tais modalidades, os eixos 258 e 260 são ainda coaxiais com um eixo de fluxo 262 dentro da via de fluxo 110, cujo eixo de fluxo 262 geralmente define a via que as células 150 viajam dentro da via de fluxo 110.
[00104] Em algumas modalidades, o ponto focal 252 da lente objetiva 142 é tal que o número de interfaces através das quais a superfície lateral 264 do volume cônico 254 passa é minimizado. Por exemplo e com referência à Figura 8A, a parede da via de fluxo 268A forma uma via de fluxo transversal geralmente cilíndrica 270A e a parede da via de fluxo 268B forma uma via de fluxo geralmente cilíndrica 270B que é geralmente coaxial com o eixo de volume cônico 254. O volume cônico 254 na Figura 8A passa somente através de duas interfaces quando ele entra e sai do material que compreende a parede 268A. O volume cônico 254 passa através de
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41/59 uma interface 272 entre o ar 276 e o material que compreende a parede 268A e através de uma interface 274 entre o material que compreende a parede 268A e o fluido 278 na via de fluxo 110. Além disso, em algumas modalidades, a parede 268A da via de fluxo 110 através da qual passa a superfície lateral 264 pode estar geralmente paralela à base 253 do volume cônico 254. Isto simplifica as interfaces através das quais a energia concentrada pela lente objetiva 142 deve passar (isto é, a energia não passa através de nenhuma superfície curvilínea), cada uma das interfaces pode, pela operação de refração, afetar o ponto focal 252 da lente objetiva 142. Adicionalmente, o volume cônico 254 pode ser formado das seções 255A, 255B e 255C de cones múltiplos 257, 259 e 261 unidos, conforme mostrado na Figura 8B, como é o caso onde uma ou mais interfaces (tais como as interfaces 272 e 274) são formadas de materiais que têm diferentes índices de refração.
[00105] Geralmente, o volume cônico 254 deve passar através de pelo menos as duas interfaces 272 e 274. Em algumas modalidades dos métodos e dispositivos descritos, a lente objetiva 142 pode considerar uma ou mais das interfaces, por exemplo, ao levar em consideração a espessura e o índice de refração do material que forma as interfaces (por exemplo, a parede 268A). Além disso, em algumas modalidades, a lente objetiva 142 pode ser uma lente de mergulho em água, de imersão em água ou de imersão em óleo, que usa um meio de imersão (por exemplo, água ou óleo) que tem um índice de refração parecido com o do material que forma a interface (por exemplo, a parede 268A). Assim, conforme retratado na Figura 9, algumas modalidades adicionalmente reduzem a distorção do ponto focal 252 ao minimizar as diferenças entre os índices de refração respectivos dos materiais através dos quais o volume cônico 254 passa. Na Figura 9, por exemplo, o volume cônico 254 pode passar através da água 280, da parede 268A e do fluido 278 na via de fluxo 110. A lente objetiva 142 pode ser uma lente objetiva de imersão em água onde, por exemplo, a parede 268A é feita de vidro. Alternativamente, a lente objetiva 142 pode ser uma lente de mergulho em água em situações nas quais não há necessidade de corrigir a refração causada pela parede 268A, como quando a parede 268A é formada de um material com um índice de refração similar ou o
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42/59 mesmo índice de refração do fluido 278.
[00106] Ainda em modalidades adicionais e conforme completamente descrito no pedido simultaneamente depositado, (número de protocolo 30752/44821), as paredes 268A e 268B da via de fluxo 110 podem ser formadas de material que tem um índice de refração próximo àquele do fluido 278 (isto é, um material que minimiza a diferença entre os índices de refração de materiais através dos quais passa o volume cônico 254). Por exemplo, materiais que têm um índice de refração próximo ao da água incluem materiais com um índice com um índice de refração na faixa de
1,30 a 1,40, inclusive. Vários materiais sólidos nas famílias de perfluoropolímeros amorfos, fluoropolímeros amorfos e perfluoroalcoxi polímeros têm índices de refração naquela faixa. Como exemplo e não limitante, CytopTM, fabricado pela Asahi Glass Co., Ltd. e Teflon® AF e Teflon® PFA, fabricados pela DuPontTM, são três destes materiais.
[00107] Em algumas modalidades, os métodos ou dispositivos podem também ajustar o índice de refração do fluido 278 de modo que o índice de refração do fluido 278 esteja mais próximo do índice de refração do material que forma as paredes 268A e/ou 268B da via de fluxo 110. Em particular, os métodos e dispositivos podem ajustar o índice de refração do fluido 278 para ficar dentro de 0,02 do índice de refração do material que forma as paredes 268A e/ou 268B da via de fluxo 110.
[00108] Em alguns citômetros, uma porção da via de fluxo110, incluindo a região de interrogação/detecção 128, é formada em um corpo 280, como no corpo 280 mostrado na Figura 10. A Figura 10 retrata o corpo 280 como um cubóide retangular, que tem uma porção 281 da via de fluxo 110 perfurada ou de outro modo formada nele. A porção 281 inclui uma primeira porção da via de fluxo 282 geralmente perpendicular a uma superfície 284 através da qual a lente objetiva 142 pode observar e uma segunda porção da via de fluxo 286 geralmente paralela à superfície 284 e em interseção com uma extremidade 288 da seção da primeira via de fluxo 282 mais próxima da superfície 284. O corpo 280, que pode, por exemplo, ser uma cubeta, pode ser formado de quartzo polido, vidro, plástico, ou outros materiais geralmente conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, o corpo 280 pode ser
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43/59 formado, no todo ou em parte, de um material que tem um índice de refração na faixa de 1,30 a 1,40, inclusive, tal como CytopTM ou Teflon® AF.
[00109] Em outra modalidade, ilustrada na Figura 11, o corpo 280 inclui a porção 281 da via de fluxo. A porção 281 inclui a primeira porção da via de fluxo 282 geralmente perpendicular à superfície 284 através da qual a lente objetiva 142 pode observar. Entretanto, na modalidade retratada na Figura 11, a segunda porção da via de fluxo 286 forma um canal que tem uma borda superior 290 geralmente coplanar com a superfície 284. Uma lamela 292 disposta em cima da superfície 284 pode, em algumas modalidades, permitir o uso de uma lente objetiva corrigida para uso com tal lamela 292 para eliminar ou minimizar os efeitos de refração de interfaces entre materiais com diferentes índices de refração.
[00110] Ainda em outras modalidades, tal como a retratada na Figura 12, o corpo 280 inclui um reservatório 294 formado na interseção da primeira porção da via de fluxo 282 e da segunda porção da via de fluxo 286. Por exemplo, a primeira porção da via de fluxo 282 pode cruzar o reservatório 294 em uma superfície inferior 296 geralmente plana que está geralmente paralela à superfície 284. Duas partes 286A e 286B da porção da via de fluxo 286 podem se conectar ao reservatório 294 em superfícies opostas do reservatório 294, que podem geralmente ter a forma de um cilindro achatado. Esta preparação pode fornecer flexibilidade adicional quando o ponto focal 252 for ajustado (Figuras 8 e 9), por exemplo, evitando que o volume cônico 254 passe através da parede 268A da via de fluxo 270A transversal geralmente cilíndrica (Figuras 8 e 9).
[00111] A Figura 13 retrata uma modalidade similar na qual uma borda superior 298 do reservatório 294 é coplanar com a superfície 284 do corpo 280. Uma lente objetiva de mergulho em água (não mostrada) pode se estender dentro do reservatório 294 e, ao fazer isto, pode estar em contato com o fluido que flui através da via de fluxo 110, que pode eliminar quaisquer interfaces entre materiais com diferentes índices de refração.
[00112] A Figura 14 retrata ainda outra modalidade, na qual uma lamela 299 é colocada acima do reservatório exposto retratado na modalidade da Figura 13.
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44/50 [00113] A Figura 15 ilustra um método 300 para selecionar uma subpopulação desejada de células a partir de uma amostra de células. Em algumas modalidades, o método 300, ou porções dele, é armazenado em uma memória como um conjunto de instruções legíveis por máquina realizando uma rotina de controle para um ou mais dispositivos associados. Um processador pode ler as instruções da memória e executar as instruções para realizar o método 300. Em outra modalidade, o método 300 inclui várias rotinas, que podem individualmente controlar um ou mais dispositivos, pode analisar dados coletados por um ou mais dispositivos, pode fazer uma ou mais determinações baseadas nos dados analisados, etc. Como é geralmente conhecido, um técnico ou dispositivo pode identificar (por exemplo, aplicando uma mancha Hoechst) um espécime para análise (por exemplo, um conjunto de células de esperma) (bloco 305). A identificação das células pode ser realizada dentro de um citômetro de fluxo de classificação, ou em um processo separado ou procedimento fora do citômetro de fluxo de classificação. Além disso, a identificação determinada aplicada às células pode depender da aplicação citométrica.
[00114] Em qualquer caso, após a identificação das células, um citômetro de fluxo de classificação pode criar um fluxo de fluido de revestimento em uma via de fluxo (bloco 310). Através de uma entrada separada, o citômetro de fluxo de classificação pode injetar um espécime (isto é, as células marcadas) dentro da via de fluxo (bloco 315), preferivelmente no ou próximo do centro do fluxo do fluido de revestimento. Também preferivelmente, o espécime entra no fluxo do fluido de revestimento lentamente em relação ao fluxo do fluido de revestimento, de modo que as células dentro do espécime (por exemplo, as células de esperma) se alinhem com um eixo longo paralelo ao fluxo do fluido de revestimento e de modo que as células fluam geralmente em um padrão de fileira única.
[00115] Quando as células se movem através da via de fluxo, uma fonte de energia de excitação, tal como um laser UV, ilumina o espécime (bloco 320). A fonte de energia de excitação pode iluminar continuamente a via de fluxo, ou uma execução de rotina no processador pode controlar a fonte de energia de excitação
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45/59 para iluminar a via de fluxo seletivamente (por exemplo, somente quando um espécime estiver presente na via de fluxo).
[00116] Uma lente objetiva ou outro meio de concentração opera para concentrar energia emitida, transmitida, ou refletida de cada célula (por exemplo, luz fluorescente emitida pela identificação) em uma direção coaxial ao fluxo (bloco 325). Isto é, o fluxo de revestimento e o espécime combinados dentro da via de fluxo se movem geralmente em direção a uma lente objetiva que tem um eixo óptico que é geralmente coaxial com o fluxo e, nominalmente, cada célula dentro do espécime passa através de um ponto focal da lente objetiva. Um detector recebe a energia concentrada da lente objetiva (bloco 330) e envia um sinal representante da energia detectada para um controlador. Em algumas modalidades, o detector pode detectar individualmente a energia concentrada de mais de 40.000 células por segundo, pode detectar individualmente a energia concentrada de mais de 75.000 células por segundo ou pode detectar individualmente a energia concentrada de mais de 100.000 células por segundo.
[00117] O controlador recebe o sinal representante da energia detectada e analisa os dados (bloco 335) para determinar (no bloco 340) se os dados representam uma célula dentro da subpopulação desejada, uma célula fora da subpopulação desejada, ou uma célula indeterminada que nem pode ser determinada como fazendo parte da subpopulação desejada nem pode ser determinada como não fazendo parte da subpopulação desejada. Neste último caso, o controlador pode tratar a célula como se o detector tivesse determinado que a célula não fizesse parte da subpopulação desejada. Se o controlador determinar que a célula não faz parte da subpopulação desejada ou for indeterminada, o controlador pode enviar um sinal para uma fonte de energia controlável, tal como um laser infravermelho, para irradiar a célula (por exemplo, para alterar a célula, destruir a célula, tornar a célula como não viável, etc.) (bloco 345). Alternativamente, se o controlador determinar que a célula faz parte da subpopulação desejada, o controlador pode enviar um sinal para a fonte de energia controlável (ou se abster de enviar um sinal) de modo que a fonte de energia controlável não irradie a célula (bloco 350).
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46/59 [00118] O dispositivo pode coletar as células para uso e/ou processamento posterior (por exemplo, separando as células) no final do processo. Em algumas modalidades, que podem incluir a modalidade retratada na figura 15, o controlador envia um sinal para a fonte de energia controlável para deixar inalteradas (isto é, não irradiar) as células determinadas como fazendo parte da subpopulação desejada e a coleta resultante de células processadas compreende uma proporção de células na subpopulação desejada de células para células inalteradas totais maior do que ou igual a 60%. Adicionalmente, em algumas modalidades, que podem incluir a modalidade retratada na Figura 15, o controlador envia um sinal para a fonte de energia controlável para deixar inalteradas (isto é, não irradiar) células determinadas como fazendo parte da subpopulação desejada e a coleta resultante de células processadas compreende uma proporção de células alteradas na subpopulação desejada de células para células totais na subpopulação desejada menor do que ou igual a 50%.
[00119] É claro que, o método descrito acima reflete uma ou mais modalidades dos métodos descritos agora, mas também podem englobar uma ou mais etapas ou rotinas adicionais, conforme descrito em toda esta especificação com relação a várias modalidades. Além disso, algumas modalidades podem omitir uma ou mais das etapas ou rotinas descritas com relação ao método 300. Como exemplo e não limitante, em algumas modalidades, a identificação pode ter autofluorescência, deste modo eliminando a necessidade de iluminar o espécime com uma fonte de energia de iluminação. Adicionalmente, em algumas modalidades (conforme descrito acima), o método pode inverter os blocos 345 e 350, permitindo que as células determinadas como não fazendo parte da subpopulação desejada passem sem irradiação pela fonte de energia controlável, enquanto faz com que a fonte de energia controlável irradie as células determinadas para estarem na subpopulação desejada.
[00120] Os métodos e dispositivos fornecem um número de vantagens importantes sobre os citômetros de fluxo de classificação implementados atualmente. Como uma vantagem, os métodos e dispositivos agora descritos não submetem as células do analisado, que em algumas modalidades são células de
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47/59 esperma de mamíferos, à configuração jato no ar comumente usada em citômetros de fluxo de classificação. O resultado é que um citômetro de acordo com as modalidades descritas agora não expõe as células do analisado ao ambiente fora do citômetro ou à colisão resultante da gotícula classificada com um receptáculo e não experimenta as pressões e mudanças de pressão associadas a um bocal da configuração de jato no ar. Isto permite o uso do citômetro fora de um ambiente que implementa condições estritas de qualidade do ar e controle de temperatura (por exemplo, fora de um ambiente de “sala limpa”). Na verdade, o citômetro em si pode implementar o controle de temperatura para estender a viabilidade das células do analisado. Além disso, os métodos e dispositivos descritos agora podem detectar e alterar as células do analisado mais rapidamente e/ou mais precisamente, em parte porque o alinhamento geralmente coaxial da lente objetiva com o fluxo do analisado através da área de interrogação mitiga e/ou elimina os problemas associados à emissão anisotrópica de energia do analisado, particularmente em modalidades usadas para classificar muitos tipos de células de esperma de mamíferos. Tendo lido a presente descrição dos métodos e dispositivos divulgados aqui, outras vantagens dos métodos e dispositivos descritos agora serão aparentes para aqueles de conhecimento comum na técnica.
[00121] Embora o texto anterior apresente uma descrição detalhada de numerosas modalidades diferentes, deve ser entendido que o escopo de proteção é definido pelas palavras das reivindicações que se seguem. A descrição detalhada será interpretada como exemplar somente e não descreve todas as modalidades possíveis porque descrever todas as modalidades possíveis seria impraticável, se não impossível. Numerosas modalidades alternativas poderiam ser implementadas, usando a tecnologia atual ou tecnologia desenvolvida após a data de depósito desta patente, que ainda estariam dentro do escopo das reivindicações.
[00122] Assim, muitas modificações e variações podem ser feitas nas técnicas e estruturas descritas e ilustradas aqui sem sair do espírito e escopo das presentes reivindicações. Consequentemente, deve ser entendido que os métodos e dispositivos descritos aqui são ilustrativos somente e não estão limitando o escopo
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48/59 das reivindicações. O relatório descritivo acima descreve pelo menos os seguintes aspectos:
[00123] 1. Método para selecionar um primeiro grupo de células de uma população de células incluindo o primeiro grupo de células e um segundo grupo de células, caracterizado pelo fato de que o método compreende:
marcar a população de células de modo que o primeiro grupo de células possa ser distinguido do segundo grupo de células;
fornecer uma primeira via de fluxo tendo uma extremidade distal, uma extremidade proximal, uma área de interrogação disposta entre a extremidade proximal e a extremidade distal e um eixo de fluxo;
criar um fluxo de revestimento de um fluido de revestimento através da primeira via de fluxo, o fluxo de revestimento se movendo em direção à extremidade proximal em uma primeira taxa de fluxo;
injetar no fluxo de revestimento, em um ponto a montante da extremidade proximal, um fluxo de espécime incluindo a população de células, o fluxo de espécime tendo inicialmente uma segunda taxa de fluxo menor do que a primeira a primeira taxa de fluxo;
fornecer uma fonte de energia de excitação, a energia emitida da fonte de energia de excitação agindo em células individuais quando elas passam através da área de interrogação e causando emissão ou transmissão de radiação secundária das células;
usar uma lente objetiva que tem um eixo óptico geralmente alinhado coaxialmente com o eixo de fluxo para concentrar a radiação secundária das células individuais conforme as células passam através da área de interrogação;
detectar a radiação secundária concentrada das células individuais;
determinar, a partir da radiação secundária detectada, se as células individuais estão no primeiro grupo ou no segundo grupo; e selecionar células determinadas para estarem no primeiro grupo.
[00124] 2. Método de acordo com o aspecto 1, caracterizado pelo fato de que selecionar células determinadas para estarem no primeiro grupo compreende um
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49/59 método de derivatização, extermínio, danificação, rompimento ou fragmentação de células não determinadas para estarem no primeiro grupo.
[00125] 3. Método de acordo com o aspecto 1, caracterizado pelo fato de que selecionar as células determinadas para estarem no primeiro grupo compreende: ejetar as células em uma corrente de um bocal; criar uma pluralidade de gotículas da corrente; aplicar seletivamente uma carga as gotículas e classificar as gotículas de acordo com a carga de cada gotícula.
[00126] 4. Método de acordo com quaisquer dos aspectos de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que identificar a população de células compreende manchar as células.
[00127] 5. Método de acordo com quaisquer dos aspectos de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que causar a emissão de uma radiação secundária compreende causar a emissão de luz fluorescente.
[00128] 6. Método de acordo com quaisquer dos aspectos de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a energia emitida da fonte de energia de excitação passa através da lente objetiva.
[00129] 7. Método de acordo com quaisquer dos aspectos de 1 a 6, caracterizado pelo fato de que as células são células de esperma e adicionalmente caracterizado pelo fato de que o primeiro grupo de células compreende células com um cromossomo X ou células com um cromossomo Y.
[00130] 8. Método de acordo com quaisquer dos aspectos de 1 a 7, caracterizado pelo fato de que selecionar células determinadas para estarem no primeiro grupo compreende usar uma fonte de energia de diferenciação para irradiar células não determinadas para estarem no primeiro grupo.
[00131] 9. Método de acordo com o aspecto 8, caracterizado pelo fato de que a fonte de energia de diferenciação é um laser infravermelho próximo.
[00132] 10. Método de acordo com o aspecto 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que a energia emitida da fonte de energia de diferenciação passa através da lente objetiva.
[00133] 11. Método de acordo com quaisquer dos aspectos de 1 a 10, caracterizado pelo fato de que fornecer uma fonte de energia de excitação
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50/59 compreende fornecer um laser ultravioleta.
[00134] 12. Método de acordo com o aspecto 10, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente:
selecionar uma combinação de um comprimento de onda da fonte de energia de diferenciação, a primeira taxa de fluxo, a segunda taxa de fluxo e a lente objetiva de modo que um ponto focal nominal da lente objetiva e um ponto focal nominal da fonte de energia de diferenciação estejam separados pela distância que as células individuais viajarão através da via de fluxo entre a detecção da radiação secundária concentrada e o uso da fonte de energia de diferenciação para irradiar células não determinadas para estarem no primeiro grupo.
[00135] 13. Método de acordo com o aspecto 8 ou 10, caracterizado pelo fato de que fornecer uma fonte de energia de excitação compreende fornecer uma saída atenuada da fonte de energia de diferenciação.
[00136] 14. Método de acordo com quaisquer dos aspectos de 1 a 13, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente fornecer uma segunda via de fluxo transversal ao eixo de fluxo e disposta na extremidade proximal da primeira via de fluxo, de modo que após passar através da área de interrogação e alcançar a extremidade proximal da primeira via de fluxo, as células se movam para dentro da segunda via de fluxo e para longe da área de interrogação.
[00137] 15. Método de acordo com quaisquer dos aspectos de 1 a 14, caracterizado pelo fato de que fornecer uma via de fluxo compreende fornecer adicionalmente uma via de fluxo formada por um material que tem um índice de refração na faixa de 1,30 a 1,40 inclusive.
[00138] 16. Método de acordo com quaisquer dos aspectos de 1 a 15, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente ajustar o índice de refração de uma solução contendo a população de células de modo que o índice de refração da solução esteja dentro de 0,02 do índice de refração de um material que forma a via de fluxo.
[00139] 17. Dispositivo para detectar e alterar seletivamente uma subpopulação desejada de células em uma população de células de espécime, caracterizado pelo
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51/59 fato de que o dispositivo compreende:
uma via de fluxo fluido tendo:
uma primeira de seção de fluxo tendo um eixo de fluxo e uma segunda seção de fluxo, a primeira e a segunda seção de fluxo em interseção na extremidade de medição da primeira seção de fluxo;
uma área de interrogação disposta na ou próxima a extremidade de medição da primeira seção de fluxo;
uma entrada de fluido de revestimento na comunicação de fluxo de fluido com a via de fluxo de fluido;
uma entrada de espécime na comunicação de fluxo de fluido com a via de fluxo de fluido;
uma lente objetiva tendo um ponto focal nominal e um eixo óptico e disposta na extremidade de medição da primeira seção de fluxo, a lente objetiva alinhada com a primeira seção de fluxo de modo que o ponto focal nominal esteja junto com o eixo de fluxo e na área de interrogação e de modo que o eixo óptico esteja geralmente alinhado coaxialmente com o eixo de fluxo;
um detector disposto para detectar luz focalizada pela lente objetiva;
uma rotina lógica acoplada comunicativamente ao detector, operável para determinar se uma célula na população de células de espécime é uma da subpopulação desejada de células e ainda operável para produzir um sinal baseado na determinação se a célula é uma célula da subpopulação desejada de células; e uma fonte de energia controlável acoplada comunicativamente a rotina lógica e operável para alterar seletivamente células na subpopulação desejada de células ou células que não estão na subpopulação desejada de células de acordo com pelo menos o sinal produzido da rotina lógica.
[00140] 18. Dispositivo de acordo com o aspecto 17, caracterizado pelo fato de que a fonte de energia controlável altera seletivamente células pela derivatização, extermínio, danificação, modificação, rompimento ou fragmentação de uma ou mais células não determinadas para estarem na subpopulação desejada.
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52/59 [00141] 19. Dispositivo de acordo com o aspecto 17 ou do aspecto 18, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma fonte de energia de excitação.
[00142] 20. Dispositivo de acordo com o aspecto 19, caracterizado pelo fato de que a energia emitida da fonte de energia de excitação passa através da lente objetiva.
[00143] 21. Dispositivo de acordo com o aspecto 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que a fonte de energia de excitação compreende um atenuador tendo uma fonte de energia controlável como uma entrada.
[00144] 22. Dispositivo de acordo com quaisquer dos aspectos 17 a 21, caracterizado pelo fato de que a energia emitida da fonte de energia controlável passa através da lente objetiva.
[00145] 23. Dispositivo de acordo com quaisquer dos aspectos 17 a 22, caracterizado pelo fato de que a fonte de energia controlável compreende um laser.
[00146] 24. Dispositivo de acordo com quaisquer dos aspectos 17 a 23, caracterizado pelo fato de que a fonte de energia controlável compreende um laser de infravermelho próximo.
[00147] 25. Dispositivo de acordo com quaisquer dos aspectos 17 a 24, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um corpo no qual a via de fluxo é formada.
[00148] 26. Dispositivo de acordo com aspecto 25, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um sulco formando a segunda seção de fluxo em uma primeira superfície do corpo, no qual a extremidade de medição da primeira seção de fluxo intercepta o sulco na primeira superfície.
[00149] 27. Dispositivo de acordo com aspecto 25, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente:
um primeiro canal interior através do corpo, estendendo de uma primeira superfície do corpo até um ponto no corpo e formando a primeira seção de fluxo; e um segundo canal interior através do corpo, se estendendo do ponto no corpo até uma segunda superfície do corpo.
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53/59 [00150] 28. Dispositivo de acordo com quaisquer dos aspectos 25 a 27, caracterizado pelo fato de que o corpo é formado de um material tendo um índice de refração entre 1,30 e 1,40 inclusive.
[00151] 29. Dispositivo de acordo com aspecto 28, caracterizado pelo fato de que o material compreende um perfluoropolímero amorfo, um fluoropolímero amorfo ou um polímero perfluoroalcoxi.
[00152] 30. Dispositivo de acordo com quaisquer dos aspectos 17 a 29, caracterizado pelo fato de que a lente objetiva é uma lente de imersão em água ou uma lente de mergulho em água.
[00153] 31. Dispositivo de acordo com quaisquer dos aspectos 17 a 30, caracterizado pelo fato de que a população de células de espécime compreende células de esperma.
[00154] 32. Dispositivo de acordo com aspecto 31, caracterizado pelo fato de que a população desejada de células compreende células com um cromossomo X ou células com um cromossomo Y.
[00155] 33. Sistema para detectar e alterar seletivamente uma subpopulação desejada de células em uma população de células de espécime, caracterizado pelo fato de que o sistema compreende:
via de fluxo fluida tendo um eixo de fluxo;
uma área de interrogação disposta dentro da via de fluxo fluida;
uma entrada de fluido de revestimento em comunicação de fluxo de fluido com a via de fluxo de fluido;
uma primeira bomba em comunicação de fluxo de fluido com a entrada de fluido de revestimento;
uma entrada de fluido de espécime em comunicação de fluxo de fluido com a via de fluxo de fluido;
uma segunda bomba em comunicação do fluxo de fluido com a entrada de fluido de espécime;
uma lente objetiva tendo um ponto focal nominal e um eixo óptico e disposta de modo que o ponto focal nominal esteja junto com o eixo de fluxo e na
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54/59 área de interrogação e de modo que o eixo óptico esteja geralmente alinhado coaxialmente com o eixo de fluxo na área de interrogação;
um detector disposto para detectar luz focalizada pela lente objetiva;
uma fonte de energia controlável;
um processador acoplado comunicativamente a um meio de armazenamento legível em computador, ao detector e à fonte de energia controlável; e no qual o processador e a fonte de energia controlável cooperam para alterar seletivamente, de acordo com uma saída do processador, células na subpopulação desejada ou células que não estejam na subpopulação desejada de células.
[00156] 34. Sistema de acordo com o aspecto 33, ainda caracterizado ainda pelo fato de que o processador e a fonte de energia controlável cooperam para alterar seletivamente células na subpopulação desejada de células pela derivatização, extermínio, danificação, modificação, rompimento ou fragmentação de uma ou mais células não determinadas para estarem na subpopulação desejada de células.
[00157] 35. Sistema de acordo com o aspecto 33 ou 34, caracterizado pelo fato de que a energia emitida da fonte de energia controlável passa através da lente objetiva.
[00158] 36. Sistema de acordo com quaisquer dos aspectos 33 a 35, caracterizado pelo fato de que a fonte de energia controlável compreende um laser infravermelho próximo.
[00159] 37. Sistema de acordo com quaisquer dos aspectos 33 a 35, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um corpo formado de um material tendo um índice de refração entre 1,30 e 1,40 inclusive.
[00160] 38. Sistema de acordo com quaisquer dos aspectos 33 a 37, caracterizado pelo fato de que a população de células de espécime compreende células de esperma.
[00161] 39. Sistema de acordo com aspecto 38, caracterizado pelo fato de que a subpopulação desejada são células com um cromossomo X ou células com um
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55/59 cromossomo Y.
[00162] 40. Método de detectar e alterar seletivamente uma subpopulação desejada de células em uma população de células de espécime, o método incorporado em um grupo de instruções legíveis por máquina executadas em um processador e armazenadas em um meio tangível, caracterizado pelo fato de que o método compreende:
controlar o fluxo de uma população de células de espécime através de uma via de fluxo tendo um eixo de fluxo;
controlar uma fonte de iluminação para iluminar uma área de interrogação através da qual as células na população de células de espécime passam;
receber dados de um detector em uma via óptica que tem uma lente objetiva, a lente objetiva tendo um eixo óptico e um ponto focal nominal, o eixo óptico geralmente alinhado coaxialmente com o eixo de fluxo, o ponto focal nominal estando dentro da área de interrogação;
determinar a partir dos dados recebidos a presença na área de interrogação de uma das células na população de células de espécime;
determinar a partir dos dados recebidos se a célula das células de espécime é uma das células da subpopulação desejada de células e controlar uma fonte de energia de seleção de células, de acordo com pelo menos a determinação de se a célula das células de espécime faz parte ou não da subpopulação desejada de células.
[00163] 41. Método de acordo com aspecto 40, caracterizado pelo fato de que controlar a fonte de energia de seleção de célula compreende:
determinar a taxa de fluxo através da área de interrogação da célula das células de espécime; e irradiar seletivamente a célula das células pelo controle da fonte de energia de seleção de célula de acordo com a taxa de fluxo determinada da célula das células de espécime através da via de fluxo.
[00164] 42. Método de acordo com aspecto 40, caracterizado pelo fato de que
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56/59 controlar a fonte de energia de seleção de célula compreende aplicar seletivamente uma carga a uma gotícula contendo uma das células.
[00165] 43. Sistema para detectar e alterar seletivamente uma subpopulação desejada de células em uma população de células de espécime, caracterizado pelo fato de que o sistema compreende:
uma via de fluxo tendo uma área de interrogação e um eixo de fluxo na área de interrogação;
meios de controle para controlar um fluxo da população de células de espécime através da via de fluxo;
meios de iluminação para iluminar as células de espécime conforme elas passam através da área de interrogação;
uma lente objetiva tendo um eixo óptico e um ponto focal nominal, o eixo óptico geralmente alinhado coaxialmente com o eixo de fluxo, o ponto focal nominal estando dentro da área de interrogação;
meios de detecção para detectar energia focalizada pela lente objetiva e fornecer dados relacionados à energia detectada;
meios de processamento para receber os dados relacionados à energia detectada e para determinar se células de espécime individuais passando através da área de interrogação são células da subpopulação desejada;
meios de seleção de células para irradiar seletivamente as células de espécime; e meios de controle de seleção de células para controlar os meios de seleção de células de acordo com pelo menos a determinação de se as células de espécime individuais são células da subpopulação desejada ou não.
[00166] 44. Sistema de acordo com o aspecto 43, caracterizado pelo fato de que a população de células de espécime compreende uma população de células de esperma e no qual a subpopulação desejada de células compreende células de esperma com um cromossomo X.
[00167] 45. Sistema de acordo com o aspecto 43, caracterizado pelo fato de que a população de células de espécime compreende uma população de células de
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57/59 esperma e no qual a subpopulação desejada de células compreende células de esperma com um cromossomo Y.
[00168] 46. Sistema de acordo com quaisquer dos aspectos 43 a 45, caracterizado pelo fato de que a energia emitida a partir dos meios de seleção de célula passa através da lente objetiva antes de alcançar as células de espécime.
[00169] 47. Sistema de acordo com quaisquer dos aspectos 43 a 46, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma parte da via de fluxo é formada de um material que tem um índice de refração entre 1,30 e 1,40 inclusive.
[00170] 48. Processo para detectar e alterar seletivamente uma subpopulação desejada de células em uma população de células de espécime, caracterizado pelo fato de que o processo compreende:
criar um fluxo que carregue geralmente uma progressão de fileira única de células de espécime através de uma via de fluxo;
iluminar as células de espécime quando as células de espécime passam através de uma área de interrogação na via de fluxo;
posicionar uma lente objetiva de modo que:
um eixo óptico da lente objetiva esteja geralmente coaxial com a via de fluxo, o fluxo se mova através da via de fluxo em direção a lente objetiva e a lente objetiva tenha um ponto focal nominal na área de interrogação;
detectar um parâmetro de células de espécime individuais quando as células de espécime passam através da área de interrogação;
interpretar o parâmetro detectado das células de espécime individuais para determinar se as células de espécime individuais são células da subpopulação desejada ou não;
seletivamente derivatizar, exterminar, danificar, modificar, romper ou fragmentar uma ou mais células da população de células de espécime de acordo com a determinação se as células de espécime individuais são células da subpopulação desejada de células ou não e recolher a população resultante das células processadas.
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58/59 [00171] 49. Processo de acordo com o aspecto 48:
caracterizado pelo fato de que a população de células de espécime compreende células de esperma;
caracterizado pelo fato de que a subpopulação desejada de células compreende células que têm um cromossomo X ou células que têm um cromossomo Y e caracterizado pelo fato de que detectar um parâmetro das células de espécime individuais quando as células de espécime passam através da área de interrogação compreende detectar o parâmetro de mais de 40.000 células de espécime por segundo quando as células passam através da área de interrogação. [00172] 50. Processo de acordo com o aspecto 48, caracterizado pelo fato de que detectar um parâmetro das células de espécime individuais quando as células de espécime passam através da área de interrogação compreende detectar o parâmetro de mais de 75.000 células de espécime por segundo quando as células passam através da área de interrogação.
[00173] 51. Processo de acordo com o aspecto 48, caracterizado pelo fato de que detectar um parâmetro das células de espécime individuais quando as células de espécime passam através da área de interrogação compreende detectar o parâmetro de mais de 100.000 células de espécime por segundo quando as células passam através da área de interrogação.
[00174] 52. Processo de acordo com quaisquer aspectos 48 a 51, caracterizado pelo fato de que células determinadas para estarem na subpopulação desejada não são alteradas seletivamente por derivatização, extermínio, danificação, modificação, rompimento ou fragmentação das células e no qual a população resultante das células processadas compreende uma proporção de células na subpopulação desejada de células para células inalteradas totais maior do que ou igual a 60%.
[00175] 53. Processo de acordo com quaisquer aspectos 48 a 51, caracterizado pelo fato de que células determinadas para estarem na subpopulação desejada são alteradas seletivamente por derivatização, extermínio, danificação, modificação, rompimento ou fragmentação das células e no qual a população resultante das
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59/59 células processadas compreende uma proporção de células na subpopulação desejada de células para células alteradas totais maior do que ou igual a 60%.
[00176] 54. Processo de acordo com quaisquer aspectos 48 a 53, caracterizado pelo fato de que as células determinadas para estarem na subpopulação desejada não são alteradas seletivamente por derivatização, extermínio, danificação, modificação, rompimento ou fragmentação das células e no qual a população resultante das células processadas compreende uma proporção de células alteradas na subpopulação desejada para células totais na subpopulação desejada menor do que ou igual a 50%.
[00177] 55. Processo de acordo com quaisquer aspectos 48 a 53, caracterizado pelo fato de que as células determinadas para estarem na subpopulação desejada são alteradas seletivamente por derivatização, extermínio, danificação, modificação, rompimento ou fragmentação das células e no qual a população resultante das células processadas compreende uma proporção de células inalteradas na subpopulação desejada para células totais na subpopulação desejada menor do que ou igual a 50%.
Claims (22)
- REIVINDICAÇÕES1. Método para selecionar um primeiro grupo de células de uma população de células (150) incluindo o primeiro grupo de células e um segundo grupo de células, o método caracterizado pelo fato de que compreende:rotular a população de células de modo que o primeiro grupo de células possa ser distinguido do segundo grupo de células;fornecer uma primeira via de fluxo (110) tendo uma extremidade distal, uma extremidade proximal, uma área de interrogação/detecção (128) entre a extremidade proximal e a extremidade distal, e um eixo de fluxo (130);criar um fluxo de revestimento (116) de um fluido de revestimento através da primeira via de fluxo (110), o fluxo de revestimento se movendo em direção a extremidade proximal em uma primeira taxa de fluxo;injetar no fluxo de revestimento, em um ponto acima da extremidade proximal, um fluxo de espécime (122) incluindo a população de células (150), o fluxo de espécime (122) tendo inicialmente uma segunda taxa de fluxo menor do que a primeira a primeira taxa de fluxo;fornecer uma fonte (156, 172) de energia de excitação, a energia emitida da fonte (156) de energia de excitação agindo em células individuais conforme elas passam através da área de interrogação/detecção (128) e causam emissão ou transmissão de radiação secundária das células (150);usar uma lente objetiva (142) que tenha um eixo óptico (144) alinhado coaxialmente com o eixo de fluxo (130) para concentrar a radiação secundária (182) das células individuais conforme as células passam através da área de interrogação/detecção (128);detectar a radiação secundária (182) concentrada das células individuais;determinar, a partir da radiação secundária (182) detectada, se as células individuais estão no primeiro grupo ou no segundo grupo; e selecionar células determinadas a estarem no primeiro grupo.
- 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a seleção de células determinadas para estarem no primeiro grupo compreendePetição 870180124147, de 31/08/2018, pág. 67/742/5 um método dentre derivatização, extermínio, danificação, modificação, rompimento, ou fragmentação de células não determinadas a estarem no primeiro grupo.
- 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que as células são células de esperma e adicionalmente que o primeiro grupo de células compreende células com um cromossomo X ou células com um cromossomo Y.
- 4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a seleção de células determinadas a estarem no primeiro grupo compreende usar uma fonte de energia (196) de diferenciação para irradiar células não determinadas a estarem no primeiro grupo.
- 5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a fonte de energia (196) de diferenciação é um laser infravermelho próximo.
- 6. Método de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que a energia emitida da fonte de energia (196) de diferenciação passa através da lente objetiva (142).
- 7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que fornecer uma fonte de energia de excitação compreende fornecer um laser ultravioleta (172).
- 8. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente:selecionar uma combinação de um comprimento de onda da fonte de energia (196) de diferenciação, a primeira taxa de fluxo, a segunda taxa de fluxo, e a lente objetiva (142) de modo que um ponto focal nominal da lente objetiva (142) e um ponto focal nominal da fonte de energia (196) de diferenciação estão separados pela distância que as células individuais viajarão através da via de fluxo (110) entre a detecção da radiação secundária (182) concentrada e o uso da fonte de energia (196) de diferenciação para irradiar células não determinadas a estarem no primeiro grupo.
- 9. Método de acordo com a reivindicação 4 ou 6, caracterizado pelo fato de que fornecer uma fonte de energia de excitação compreende fornecer uma saídaPetição 870180124147, de 31/08/2018, pág. 68/743/5 atenuada a partir da fonte de energia (196) de diferenciação.
- 10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente fornecer uma segunda via de fluxo (286) transversa ao eixo de fluxo (130) e disposta na extremidade proximal da primeira via de fluxo (110), de modo que após passar através da área de interrogação/detecção (128) e alcançar a extremidade proximal da primeira via de fluxo (110), as células se movem para dentro da segunda via de fluxo (286) e para longe da área de interrogação/detecção (128).
- 11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que fornecer uma via de fluxo (110) compreende ainda fornecer uma via de fluxo formada de um material que tem um índice de refração na faixa de 1.30 a 1.40 inclusive.
- 12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente ajustar o índice de refração de uma solução contendo a população de células de modo que o índice de refração da solução esteja dentro de 0.02 do índice de refração de um material que forma a via de fluxo (110).
- 13. Sistema para detectar e alterar seletivamente uma subpopulação desejada de células em uma população de células (150) de espécime, caracterizado pelo fato de que o sistema compreende:uma via de fluxo (110) de fluido tendo um eixo de fluxo (130);uma área de interrogação/detecção (128) disposta dentro da via de fluxo (110) de fluido;uma entrada de fluido de revestimento (114) em comunicação de fluxo de fluido com a via de fluxo (110) de fluido;um primeiro dispositivo de pressurização em comunicação de fluxo de fluido com a entrada de fluido de revestimento (114);uma entrada (118) de fluido de espécime em comunicação de fluxo de fluido com a via de fluxo de fluido (114);um segundo dispositivo de pressurização em comunicação de fluxo dePetição 870180124147, de 31/08/2018, pág. 69/744/5 fluido com a entrada (118) de fluido de espécime;uma lente objetiva (142) tendo um ponto focal (178) nominal e um eixo óptico (144), e disposta de modo que o ponto focal (178) nominal esteja junto com o eixo de fluxo (130) e na área de interrogação/detecção (128), e de modo que o eixo óptico (144) esteja alinhado coaxialmente com o eixo de fluxo (130) na área de interrogação/detecção (128);um detector (180) disposto para detectar luz (182) focalizada pela lente objetiva (142);uma fonte de energia (196) controlável;um processador (188) acoplado comunicativamente a um meio de armazenamento legível (192) em computador, ao detector (180), e a fonte de energia (196) controlável; e em que o processador (188) e a fonte de energia (196) controlável cooperam para alterar seletivamente, de acordo com uma saída do processador (188), células na subpopulação desejada de células ou células que não estejam na subpopulação desejada de células.
- 14. Sistema de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o processador (188) e a fonte de energia (196) controlável cooperam para alterar seletivamente células na subpopulação desejada de células pela derivatização, extermínio, danificação, modificação, rompimento ou fragmentação de uma ou mais células não determinadas para estarem na subpopulação desejada de células.
- 15. Sistema de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que a fonte de energia (196) controlável compreende um laser infravermelho próximo.
- 16. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um corpo (280) formado de um material tendo um índice de refração entre 1.30 e 1.40 inclusive.
- 17. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, caracterizado pelo fato de que a população de células de espécime compreendePetição 870180124147, de 31/08/2018, pág. 70/745/5 células de esperma e em que a subpopulação desejada são células com um cromossomo X ou células com um cromossomo Y.
- 18. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 17, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma fonte (156, 172) de energia de excitação.
- 19. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 18, caracterizado pelo fato de que a fonte de energia de excitação compreende um atenuador tendo uma fonte de energia (196) controlável como uma entrada.
- 20. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 19, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um corpo (280) no qual a via de fluxo é formada.
- 21. Sistema de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente:um primeiro canal interior através do corpo (280), estendendo de uma primeira superfície do corpo (280) até um ponto (288) no corpo (280) e formando a primeira seção (110) de fluxo; e um segundo canal interior (286) através do corpo (280), se estendendo do ponto (288) no corpo (280) até uma segunda superfície do corpo.
- 22. Sistema de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o material compreende um perfluoropolímero amorfo, um fluoropolímero amorfo, ou um polímero perfluoroalcoxi.
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