CA2467441A1 - Biomasses bacteriennes, leur protocole d'obtention, et leur utilisation pour la bacterisation de sols et de residus de cultures - Google Patents

Abstract

L'invention vise un procédé d'obtention in vitro de biomasses bactériennes d'origine édaphique comprenant les étapes de : - mise en contact d'une suspension aqueuse de sol avec un substrat matriciel, de manière à former une zone hydratée, ou biofilm, à la surface du substrat, analogue à celle adjointe au CAH du sol, abritant pour l'essentiel la composante bactérienne autochtone du sol, afin de retenir à la surface du substrat matriciel, l'essentiel de la microflore bactérienne endogène aux milieux édaphiques d'origine. - maturation du biofilm avec établissement de conditions oligotrophiques permettant aux cellules les plus constitutives du biofilm édaphique qui ont colonisé le substrat matriciel, de migrer vers la phase liquide surnageant le substrat matriciel, et progressivement à la dominer, - récupération et culture des souches bactériennes les plus prolifiques en milieux de cultures liquides riches, à caractère autochtone, rustiques et persistantes in situ, cultivables en milieux liquides, et donc aptes à être produites industriellement. Application des biomasses bactériennes et souches obtenues à la bactérisation microbiologique de sols et de résidus de cultures, en particulier de résidus de cultures céréalières, y compris ceux du maïs-grain.

Description

Nouvelles biomasses bactériennes, leur protocole d'obtention, et leur utilisation pour la bactérisatïon de sols et de résidus de cultures L'invention concerne de nouvelles biomasses bactériennes., leur protocole d'obtention, et leur utilisation pour la bactérisation de sols et de résidus de cultures.
La bactérisation des sols arables consiste à apporter, par voies (mi cro)biologiques aux sols et aux cultures agronomiques, une partie des éléments nutritifs, notamment l'azote diatomique provenant de l'atmosphère, nécessaires pour l'obtention de rendements économiques et durables.
Traditionnellement, la bactérisation a surtout été synonyme d'utilisation d'inocula de souches Rh:~~obizrm pour le pelliculage des semences d'espèces Legranirzosecc comme le soja, la luzerne et le trèfle rouge.
Il a également été proposé d'utiliser des endomycorrhizes, des acétobacters diazotrophes endophytes, des rhizobactéries PGPB (Plant Growth Promoting Bacteria) des micro - algues et rles cyanobactéries, oa encore des bactéries diazotrophes non-symbiotiques en association avec des résidus de cultures.
L'utilisation de bactéries en agronomie, et plus particulièrement en production céréalière, s'est heurtée toutefois au problème de leur non persistance, une fois réintroduites dans les sols. De ce fait, elles ne peuvent pas assurer la réalisation de l'effet agronomique recherché, à savoir l'augmentation et la stabilité des rendements en grains, leurs teneurs en protéines, et/ou la réduction des niveaux d'intrants, notamment l'azote minéral.
Il s'ensuit que les biomasses bactériennes proposées à ce jour ne permettent pas une exploitation satisfaisante des composés issus de la dégradation iti sitar (i.e. au champ) des résidus de cultures agronomiques, notamment tes résidus de la culture céréalière intensive, y compris celle du maïs-grain.
Les composés solubles et assimilables issus de la dégradation ih situ des résidus de cultures céréalières sont mal valorisés par l'ensemble de la microflore du sol, et plus particulièrement sa composante diazotrophe et non-symbiotique dite a~otobactérienne. Ce manque de valorisation explique er~ bonne partie la réalisation de trais phénomènes, parfois nuisibles, WO 03/046156 ~ PCT/FR02/04119 bien connus ; (1) la présence continuelle de quantités agronomiques de résidus pailleux à la surface des sols au moment des travaux aratoires, (2) unc; immobilisation de l'azote par les microorganismes non - diazotrophes du .sol entraînant une « faim d' azote »
chez la culture en place, et, paradoxalement, (3) une baisse appréciable des teneurs en carbone (soluble, labile et total) et des biomasses microbiotiques.
Un autre problème rencontré avec les bactéries est lié à lEéur isolement et leur production en masse traditionnellement effectués par dilutïon en série d'une suspension de sol et la mise en culttue d'un aliquote d'une raième dilution de cet aliquote sur un milieu gélosé riche. Les scuchN: ainsi isolées, une fois suffisamment caractérisées., servent par la suite à ensemencer des fermenteurs bioindustriels conventionnels. La capacité des inocula ainsi produits à
augmenter durablement l'activité irz sitLa des organismes concérnés, la diazotrophie dans un sol arable amendé avec des résidus de culture par exemple, est de ce fait aujourd'hui très faible et/ou aléatoire. Le recours à divers supports poreux, solides ou organiques, afin de protéger ces bactéries une fois réintroduites) dans les sols, ne semble pas avoir pu permettre une plus grande ei~icacité de ce type d'inoculation.
L'étude de ces problèmes par les inventeurs les a conduita à mettre au point des conditions d'isolement de bactéries du sol à l'aide de protocoles et de: milieux d'isolement, ou rétention, 1fl hltl'O, capables d'assurer l'entretien et la survie des sou~~hes bactériennes les plus capables de per sistance active en milieux édaphiques, et une bactérisation satisfaisante des sols une fois (ré)introduites, grâce à leurs propriétés de persistance in situ.
Historiquement, on peut relever trois approches à l'obtention de souches bactériennes d'origine édaphique (c'est-à-dire de sols arables) en principe les mieux adaptées à la persistance active in sittc une fois réintroduites a. l'isolement sur matrices abiotiques : avec utilisation de milieux à
caractères édaphiques (i.e. gels siliciques avec ou sans extraits de terre), sans pour autant faire l'intégration des principales composantes (siliciques, humiques, carbonés, et hydrologique) de ces milieux ;
b. la tiré-incubation sur supports abiotiques : il s'agit d'une pré-incubation en milieu édaphique, ou au sein d'une fraction plus au moins fme de celui-ci, de cellules bactér'rennes déjà isolées et cultivées conventionnellement ;

J

c. la culture en milieux appâuvris : on procède à un appauvrissement volontaire, notamment en carbone, des milieux de culture de cellules bactériennes isolées conventionnellement. ..
La solution apportée par l'invention intègre ces 3 approches, et plus particulièrement l'approche a), au sein da protocole d'obtention défini ci-après, qui conduit à
l'obtention des souches et biomasses bactériennes constitutives, en termes d'adaptation, de persistance et d'activité irz sitr.~, et cela au-delà d'un simple conditionnement c~
posteriot~i des bactéries déjà
isolées et/ou cultivées selon les approches a), b) et/ou c) dü:es plus conventionnelles.
De plus, l'invention prend en compte le processus de formation des biofilms en milieu aqueux. A cet égard, les inventeurs ont considéré que la. zone édaphique la plus conséquente l7pL!r les bactéries du sol correspond à la zone hydratée (biofllm) adjacente aux complexes argilo-humique (CAH) du sol, et que la formation et le fonctionnement de celle-ci est probablement sujette aux mêmes mécanismes que ceux impliqués dans la formation et le fonctionnement de biofilms au sens large.
Selon Characlclis (1990) et Characklis et Marshall (1990) l'accumulation d'un biofilm à la smrface cl'~.zrle matrice, biotique ou abiotique, est le résultat de huit processus physico-chimiques et biologiques dlStïIlCtS
1. Conditionnement de la matrice

2. Transport des cellules bactériennes (planctoniques) vers la matrice

3. Adsorption d'une portion de ces cellules

4. Désorption d'une portion de ces cellules

5. Adsorption irréversible de cellules complémentaires G. Croissance tles celh,lles bactériennes constituant Ie biofilm aux dépens de la phase aqueuse surnageante 7. Attachement de cellules et de particules en suspension dans la phase aqueuse 8. Libération de cellules constituant le biofilm par voie de déplacement volumétrique, érosion, usure, etc. ...

6 4 PCT/FR02/04119 La réalisation de ces processus permet en principe la formation d'un biofilm à
deux phases (solide et liquide), et plus précisément à cinq compartiments 1. Un substrat matriciel (gels siliciques ou agas par exemple) ?. Le biofilm de base contenant l'essentiel des cellules bactériennes 3. Le biofilm de surface contenant pour l'essentiel les cellules complémentaires ~4. La phase liquide surnageante 5. La phase aqueuse ultime Gr, i1 s' avère que le biofilm en tant que tel est surtout constitué par les compartiments 2, 3 et 4.
Selon ïe modële édaphique le plus reconnu (Davier et al. 1998 ; Gordienko 1990 ; Pochon et Tchan 1948 ; Pochon et De Barjac 1958), la microflore bactérienne est elle aussi constituée d'essentiellement trots composantes, la composante autochtone la plus rustique et oligotrophe, la composante zymogëne plutôt copiotrophe associée à cette composante autochtone, et enfin ia composante, trés marginale mais facilement isolable, essentiellement zymogéne et t~~s copiotrophe.
L'invention repose sur un rapprochement conceptuel original entre les descriptions des bionlms au sens large et ia zone hydratée adjointe aux CAI3s des sols.
i~lle a alors pour but de fournir un procédé d'obtention de biomasses bactériennes essentiellement formées de souches persistantes et actives, une fois réintroduites dans un sol cible d'origine, caractérisées par l'intégration de caractéristiques APC (agro-pédo-climatique), notamment en interagissant avec les CAHs et ISL (interface sol-lignocellulosique) d'une zone édaphique identifiable.
Llle vise aussi les biomasses bactériennes et les nouvelles souches de ces biomasses possédant les caractéristiques rnétabolo-physiologiques couramment recherchées, comme la diazotrophie, l'activité fongi-statique etlou phytosanitaire, la production et la sécrétion de régulateurs de croissance, le catabolisme de xénobiotiques, etc).
L'invention vise en outre L'utilisation de ces biomasses bactériennes et souches pour la bactérisation de sols et de résidus de cultures, en particulier de cultures céréalières.

i,e procédé d'obtention ifr vitres de biomasses bactériennes d'origine édaphique est caractérisé
en ce qu'i1_ comprend les étapes de - mise en contact d'une su pension aqueuse de sol avec un substrat matriciel, de manière à~
fermer une zone hydratée, ou biofilm, à 1a surface du substrat, analogue à
celle adjointe au ~~'.,.I~ d.u sol; abritant pour l'essentiel la compo5at~te bactérienne autochtone du sol, aFin de retenir, à la surface du substr at matriciel, l'essentieï de la, microflore bactérienne endogène aux milieux édaphiques d'origin e.
- maturation du biofilm avec établissement de conditions oligotrophiques permettant aux cellules les plus constitutives du biofilm édaphique qui OIIt colonisé le substrat matriciel, de migrer vers la phase lic~iuide surnageant ledit substrat, et progressivement à
la dominer, récL:pér~~tion et culture des souches bactériennes les plus. prolifiques en milïeux de cultures liquides riches, à caractère autochtone, rustiques et persistantes irz sit2r, cultivables en milieux liyaicles et donc aptes à être prod~~:ites industriellement.
~sn utilise dans ce procédé un substrat matriciel inorganicue et abioüque, en milieu aqueux, faVCrïSaIlt 121 prOdl.~CtrC312 d'exopolysaccharides (EP~) et de:. autres composantes du glycocalyx bactérien, ainsi que l'organisation en réseau d'un nombre suffisant de cellules capables d'initier l~ws premières étapes de formation d'un biofilm à 1<~ surface du substrat.
i'~es matériaux appropr lés en tant que substrats comprennent le gel de silice, le polystyrëne, l'a.rgile, le verre poreux ou encore la vermiculüe.
L'eau de la suspension aqueuse renferme des composés pre;sents dans les proportions relatives caractéristiques du sol cible d'origine, à savoir des substances humiques et fulviques, des composés carbonés et notamment des mono-, oligo- et polysaccharides, d'origine végétale, animale, et bactério-fongique, des éléments nutritifs.
La maturation du biefilm est réalisée en alternant une phase où le biofilm formé sur Ia surface abiotique n'est pas en,..présence d'une phase liquide surnageante, avec une phase liquide CU111prellaTlt l'ensemble des cellules bactériennes surnàgear~t la phase solide.

Cette maturation résulte en principe de la mîgration des bactéries autochtones vers la phase liquide du biofilm formé sur le substrat matriciel. Le déplacement volumétrique n'a lieu qu'au cours et après vieillissement (maturation) du biofilm (c'est-à-dire du biofilm à la surface du substrat matriciel). Cette maturation permet la libération, dans la phase aqueuse surnageant le substrat matriciel, des cellules bactériennes les plus constitutives de ce biofilm.
La maturation du biofiln: peut être facilitée/augmentée si la phase liquide surnageante est périodiquement asséchée, ou dt~ moins retirée, de fa~~on à favorïser la croissance des biomasses bactériennes constituant le biofilm, qui sont pour la plupart aérobiques. Elle est ensuite restaurée en ajoutant de l'eau aseptique. Cette addition peut être réalisée par exemple par microfiltratior~.
L'invention permet ainsi de réconcilier la diversité microbialogique (surtout bactérienne) des sols avec la pureté microbiologique des biomasses dev,~.nt être produites en bioprocédés conventionnels, ce qui n'a jamais véritablement été tenté jusqu'à présent.
L'isolement de souches bactériennes est en effet surtout réalisé à l'aide de milieux de cultures relativement riches eWselon des caractères métaboliques (eg. ré:>istance à certains antibiotiquès, diazotrophie in vit~~o, activités spécifiques de certaines enz:~mes, etc.) et/ou génomiques (eg. à
l'aide do sondes oligo-uucléoüdiques spécifiques de certa.ius opérons d'intérêt agronomique ou industriel) facilement identitïables, mais qui n'ont fondamentalement peu, ou rien à voir avec l''cLda'j'~tatlUli et ïa persistance active de ces cellules bactériennes autochtones plut~t que zymogènes une fois (rë)introduites dans divers milieux édaphiques.
Le protocole d'obtention de biomasses bactériennes de l'invention favorise ainsi la dominance microbiologique de souches bactériennes à caractères édaphiques, et assure néanmoins que celles-ci demeurent aussi suffisamment copiotrophes (i.~~. capables de croître en milieux riches) pour être produites en quantités industrielles par voies de bioprocédés conventionnels.
Tout au contraire, dos bactéries obtenues selon des procédés n'intégrant pas les dispositions qui précèdent au sein d'un même protocole sont inefficaces. Il en est ainsi o des biomasses bactériennes 1) obtenues de surfac~ds biotiques mais sans la présence d'un biofilm ou d'un complément humique, et/ou des bibmasses bactériennes 2) obtenues de surfacE;s abiotiques selon le protocole en WO 03/046156 ~ PCT/FR02/04119 question, mais a) avec un complément humique non-calqué sur celui du sol cible et/ou b) avec un substrat carboné apporté en quantité supérieure aux concentrations normalement présentes dans le sol, .et/ou ~ des biomasses bactériennes 3) obtenues de surfaces abiotiques non conditionnées (i.e.
sans le développement d'une pellicule hydratée ou b iofilm).
saur illustrer cette dérr~onstraticn, une série J'inocula témoins n'intégrant pas au moins l'une des notions envisagées ci-dessus a été produite, à savoir notion l: adhérence à des surfaces inorganiques et abiotiques; notion 2: croissance oligotrophique à partir de compléments glucidielues et humiques; notion 3: expression de caractè:aes benthiques et planctoniques, la comparaison directe des effets obtenus avec Ies biomasses de l'invention et avec ces témoins permet d'interférer que l'intégration des 3 notions (1,2,3) évôquées ci-dessus est possible pour obtenir les résultats recherchés et constituent un moyen d'identification des biomasses de l'invention comme exposé dans les exemples.
~elon un mode de réalisation préféré du procédé de l'invention d'isolement progressif de biomasses bactériennes rustiques et persistantes zro situ, on a avantageusement recours a~
étapes suivantes a) - rétention immédiate et temporaire de l'essentiel de la microflore bactérienne endogéne aux milieux édaphiclues d'origine Afin de rendre cette étape de rétention moins draconienne ~;n termes d'élimination et de pertes des soucr~es moins copiotrophes, on procède à une pré-incubation du substrat matriciel avec la suspension de sol renfermant les bactéries.
Le substrat matriciel est inorganique et abiotique, tel que gel de silice, argile, polystyréne, verre poreux, vermiculite. La surface du substrat est conditionnée par mise en contact avec un milieu de rétention essentiellement calqué sur les caractéristiques du sol cible d'origine. Ces caractéristiques comprennent, non-exclusivement : (1) les teneurs en substances humiques et fivlviques et leurs constitutions en termes des divers composés phénoliques et benzoïques, (2) les teneurs en composés carbonés, et notamment les mono-, oligo- et polysaccharides de provenance végétale, animale et/ou bactério-fongique, ~;3) la granulométrie de la partie minérale du sol, et s~u~:out la plus nne, ou du moins à l'exclusion des agrégats supérieurs à 5 ô

mm de diamètre, (4) les teneurs immédiates en éléments nutritifs (azote, phosphore, soufre, etc.) capables d'influencer le développement bactérien à court terme.
Cette pré-incubation en présence d'eau des milieux de rétention permet la formation de manière satisfaisante d'une pellicule hydratée ou biofilm à la surface des substrats matriciels solides.
Les souches bactérienne, qui progressivement viennent à dominer à la surface de ces substrats et au sein de ces biofilins, sont ainsi plus spéc.inquement adaptées aux APC sur lesquels la constitution de ces biofilms a été calquée et sont donc aussi plus aptes à persister activement une fois réintroduites dans ces APC.
b) - dominance progressive des souches bactériennes recherchées, diazotrophes et/ou fongi-statiques par exemple, sur ces milieux de rétention spéc'ifiqûes et caractéristiques des milieux édaphiques d'origine Les milieux de culture, ou de rétention, deviennent chu facto la source des éventuelles biomasses bactériennes candïdates. Les cellules bactériennes étant de bonnes productrices d'exo- polysaccharides {EPS) servant à la formation de biofilms à la surface du substrat, elles peuvent aussi être amenées à dominer la phase liquide r estaurée à sa surface.
En effet, les biofilms ainsi formés peuvent en ce sens maturer. C'est vendant ce processus de maturation qz:e Ia multiplication de cellules du biofilm permet :le déplacer graduellement les cellules bactériennes vers la surzàce di: biofilm, par voie d'un processus appelé
déplacement volumétrique (Characl>iis 90 et Characklis et Marshall 90 ci-dessus). Ces cellules se retrouvent donc éventuellement libres dans la phase liquide surnageant à la surface du biofilm~. Dans la mesure où cette phase liquide et le substrat du biof~lm sont quasi dépourvus d'azote minéral assirr~ilable, les cellules concernées seront pour la plupart azotobactériennes.
c) - isolement, par dominance micr o-biologique, des souches bactériennes recherchées les plus prolifiques en milieux de cultures liquides riches et phis conventionnels Les biomasses et souches de l'invention, bien que relativement plus oligotrophes que des souches plus conventionnelles, doivent néanmoins rester cultivables en milieux riches conventionnels, tels qu'on les utilise au cours de bio-procédés industriels.
Cependant, et puisque les aliquotes provenant des phases liquides suunageant les milieux d'obtention de ces souches ne sont pas nécessairement d'une pureté microbiologique absolue, il existe un risque que les souches candidates recherchées qu'ils contiennent soient déplacées (i.e. dominées en WO 03/046156 ~ PCT/FR02/04119 nombre) par des contaminations plus copiotrophes et contraires au but recherché. Pour éviter autant que possible de telles contaminations, on restaure le milieu de culture avec un aliquote contenant à 90% environ des cellules . provenant de la phase surnageant les milieux d'obtention et seulement 10% environ de cellules effectivement pré-incubëes afin de favoriser, éventuellement, la dominance de cellules plutôt oligotrophes. Suite au troisième, voire quatriëme, cycle de pré-incubation, un aliquote de 1 ~?our 1000 environ de cette dernière pré-ciaiture sera transféré vers à un milieu liquide riche conventionnel, avec azote, les cellules qui contiennent cet aliquote pourront alors être produites en masse et de façon conventionnelle.
Il est recommandé de procéder à un suivi et contrôle: de la pureté de ces biomasses et souches en plus d'une série de profils génomiques non-i:èmctionnels de type RAPD, et plus fonctionnels selon l'ex_pression particuliëre de certains mécanismes les plus importants en terme d'adéquation édaphique (eg. czlg, nzurc, eps, pc~b, ~lzl, etc.).
Les inocula prototypes candidats sont formulés et conditionnés pour leur utilisation au champ.
Des formulations liquides et solides permettent non-seulement d'assurer un délai .~de conservation satisfaisant d'un minimum de 6 mois, soit à. 4°C, soit à
température ambiante (i.e. de 18 à 27°C), mais aussi d'assurer encore plu; une pré-adaptation des cellules baciériennes déjà sélectionnées selon la présente invention.
L'invention vise également les biomasses bactériennes ,i:;olées, caractérisées en ce qu'elles comportent, comme souches dorr~inantes, des souches bactériennes GRAM négatif, à
caractère édaphique, autochtones, eligotrophes, en majeure partie aérobiques, présentant des caractéristiques métabolo-physiologiques de diazotrophie, activité fongi-statique etlou phytosanitaire.
Avantageusement ces biomasses bactériennes sont capat~les de croître aisément en milieux liquides, ce qui permet de les produire en quantités industrielles par voie de bioprocédés conventionnels.
Comme illustré par ïes exemples donnés ci-après, ces biomasses sont caractérisées par les phénotypes suivants exprimés in vit~~o et/ou in situ : par rapport à des témoins isolés selon tout WO 03/046156 1~ PCT/FR02/04119 ou partie des protocoles conventionnels 1), 21 et 3) rappelés ci-dessus, elles sont plus mucoïdes que ces témoins, plus enkystées et de manière plus durable, moins copiotrophes que lesdits témoins, et produisent des facteurs. d'auto-induction (FAT) selon des taux plus élevés que les témoins, par exemple de !' octanoyl homosérine lactone.
Par rapport auxdits témoins, elles sont capables de maintenir la teneur en azote minéral des sols reconstitués en microcosmes selon une fraction granulométrique > 3mm, sur une période de plus de 28 jours d'incubation.
Des biomasses bactériennes préférées de l'invention sont des Azobacteriaceae, des Pseudomonaceae, ou des Rhizobiaceae.
La caractérisation génomique et moléculaire des souches isolées montre qu'elles renferment et expriment un fragment génomique analogue à des fral;ments caractéristiques de algD et crlgU responsables de la production d'EPS, ainsi que des :fragments caractéristiques de pobA
et pob~Z responsables de la production de PHBH, trouvés chez bon nombre d'Azoto bacteriaceae, Pseudomonaceae et Rhizobiaceae.
L es biomasses bactériennes obtenues sont particulièrement appropriées pour la bactérisation microbiologique de sols et de résidus de cultures, en particulier de résidus de cultures céréaliers, y compris ce~.ix du maïs-grain.
Grâce à la persistance de leur activité in sztu une fois (ré)introduites dans le sol, durant la période de mise en culture des cultures agronomiques concernées, elles peuvent utiliser les résidus en voie de décoïnposition comme substrats énergétiques et structurels.
L'invention vise donc leur utilisation pour une telle bactérisation en les introduisant in sittc, à
proximité desdits résidus, de manière à exploiter !e carbone soluble libéré
par suite de leur dégradation.
A cet effet, des inoculas préparés à. partir des biomasses bactériennes et souches isolées sont avantageusement pulvérisés sur les résidus de culture, notamment au moment de leur enfouissement dans les sols. Gn utilise par exemple des taux d'inoculation de 100.000 à 1 million de cel-hiles viables/g de résidus, ou encore lg/tonne de résidus.

WO 03/046156 1 j PCT/FR02/04119 Au niveau édapho-agronomique, on observe ira sit2r ou en microcosmes, une plus grande persistance in sitar et dans le temps de .l'activité de la nitrogénase, dans le cas de biomasses azotabactériennes capables de diazotrophie, une augmentation de l'accumulation de l'azote minéral, notamment socs forme ammoniacal, une augmentation des biomasses végétales, du rapport entre les parties végëtaüves et racinaires, un rfaard initial de la dégradation des l'ésldLls de cuiture attribuable à.1'.4ct~Vite fongi-staüque de s bactéries (ré)introduites.
D'autres caractéristiques et avantages de l'irwention sont donnés dans les exemples qui suivent, avec référence aux figures I à ~, qui représentent, :respectivement - les figures lA et 1B, les bandes PCR produites pair des amorces AlgU'h selon le type de matrices utilisées ;
- Ia figure 2, les bandes produites par RAPD, sel~an une série de six amorces (n10) car actéristirjues des souches de type Azote~bactet°cccecce candidates, comparées à une souche d'A. chr°~ococcum 76. i 12 témoin, - la figure 3, les teneurs en azote minéral mesurées, sur des microcosmes et des microparcelles inoculés avec divers témoins et des souches candidates, - la figure 4, le rapport, en fonction du temps d'incubation entre l'activité
de la réduction de (acétylène en présence de résidus de culture inoculés selon l'invention ou avec des tén2cins, et non inocul és, - la figure 5, les teneurs en azote minéral de 2 ;âéries de microcosmes traités selon l'invention ou par des témoins, avec addition de composés ?ara-humidues ;
- la figure 6, l'effet d'un antibiotique sur le traitement de résidus de culture et par des témoins, - les figures 7A et 7B, Ia décomposition de résidus de culture en fonction du temps d'incubation (laboratoire et au champ) ;
- les figures ~A ei ~B, l'effet de la granulométrie d~ sols reconstitués en microcosmes sur les propriétés des bactéries, et - les figures 9A à 9E, les effets de biomasses de l'invention par rapport à
des témoins.

WO 03/046156 1~ PCT/FR02/04119 ~~em ~e 1 : Isolement de souches candidates de type A.zotobacteraceae.
sols utilises pour les prélè~~ements On r appoue ïes r ésultats obtenus sur 2 sites (Terrefort et Groies) dont les caractères ~1PC sont 1G'S SLilVû.iit:i Tableau la : Analyses physico-chimiques des sols F4 et :I9 (« Terrefort ») sur le domaine expérimental de l'Inra-Toulouse Parcelle i~ranulor_rlétrie ~r~ilP ?30 X60 Limon fin Limon grossier 139 165 able fin 167 X07 ~'. ,L,le gr ossier ~?~ 141 C'..arbone organique 8.5 9.2 Matires organique 14.6 15.8 E~zote organique 1.07 1.13 pH eau 5.9 6.6 CaCO 0 0 PaOs 0.11 0.06 Ca changeable 1.91 2.75 I'aa. changeable O.Olq~ 0.015 Mg changeable 0.173 0.187 I~ cha.ngea:ble 0.183 0.134 ~Iusnidit 105 C 24 28 Tableau l.b : Caractéristïques édaphique des sols Groies à proximité de Poitiers (86) TERRES . . .
.. Séchantes .. T~rincipalement au nord du département C ~~~ ~ C'l'öI~ ~' S
Couleur brrme o argile limoneuse Substrat : calcaire PROP:KIÉTöS
.- Sol calcaire, peu profond, caillouteux (calcaires) .
~ Sol sain o Réserve en eau faible (opportunité de l'irrigation) Fertilité bonne à moyenne V~FcI~TE : Grosse groie ou argilo-calcaire o Sol profond, plus argileux banne réserve en eau r~r,~tooolû o~'isclemcnt fin n~ot ei~ contact L!ne sl!sl~ensio2~ sol/eau a-voc un s>abstrat matriciel d'agar ou de gel silicique. Le bioftlm rlui se forme au contact du substrat rn.atriciel répond aux caractéristiques du sol cible d'origine, en ce qui concerne notamment (1) Les teneurs en substances humiques et fulviques et leur constitution en termes des diver s composés phénoliques et benzoïques, (2) les teneurs en composés carbonés, et notamment les morio-, oligo- et polysaccharides de provenance végétale, animale et/ou bactério-fongique, (3) la granulométrie de la partie minérale du sol, et surtout la plus fine, ou du moins à l'exclusion des agrégats supérieurs à 5 mm de diamëtre, (4) les teneurs immédiates en éléments nutritifs (azote, phosphore, soufre, etc.) capables d'influ.encer le développement bactérien à court terme.
four obtenir la maturation du 'oiofilm, on restaure périodiquement la phase liquide, à savoir par exemple une fois--par semaine, afin d'éviter l'assP~~hement du biofilm et d'attendre ,uffisamment longéemps entre deux restaurations (e.g. c;nviron sept jours), de manière à
l~~isser le temr5s au x c ell~!les azotobactériennes les plus constitutives du biofilm aïnsi formé de WO 03/046156 l~ PCT/FR02/04119 migrer par déplacement volumétrique vers la surface du biofilm. Afin d' éviter la dominance de cellules azotobactériennes copiotrophes aux dépens des cellules azotobactériennes recherchées, qui sont plutôt oligo- ou méso-trophes, plus autochtones et persistantes une fois (ré)introduites, mais aussi donc facilement dominées en milieux iti vites riches, il faut éviter de charger les gels et les phases liquides qui les surnagent avec des substrats carbonés, notamment des sucres simples tel que le glucose, et/ou dis éléments nutritifs minéraux. On ~~tiïise ~1~: p réfëreuce d, l'eau dl5üllée aseptique {en particulier par micro-tiltraüon).
Il faut aussi éviter de rompre ou de pertvirber excessivement le biofilm au moment de la I'eStaLlratIOn e2111t1hv2~nt jan jet d'eau Trop brusque ou dirigé au moment de la restauration de la phase liquide. En général, il est safflsant d'utiliser 1 ml d'eau sur gels contenus dans des boîtes de Pétri de 10 mm de diamètre et 5 ml pour les boîtes de 33 mm de diamëtre. Après environ sept ~Otlrs d'incubation à 22-27°C, la dernière réstauration, soit généralement la troisiëlne, des aliquotes de ces phases liquides serviront à ensemencer une série de milieux de cultures liquides conventionnels.
Four l'isolement des souches candidates recherchées, on procède avantageusement comme suit : orl place un aliquote de 1 ml dans 1000 mL de milieu l,'_quide glucosé
(avec sels <~e ~:~Tinogradslcy comprenant ceux provenant d'un extrait de terre à hauteur de 10% p/v) sans azote minéral et/ou assimilable, et on laisse pré-incuber 1 à 2 jours à 22-27°C. Ce transfert esi eff;:ctué ê. partir de la culture ainsi obtenue encore deu:~ à trois fois, mais en n'utilisant que 100 micro-litres (1/ 10 de tnL) de cette culture de « Rang I » et 9/10 de mL
d'un nouvel aliquote provenant directement de la phase ïiquide surnageant 1e milieu d'obtention d'origine.
~n réduit ïa probabilité, sans pour autant l'éliminer, de voir une biomasse candidate plutôt rnoir~s ohgotrophe prendre le dessus, en terme de nombn~ de cellules par mL de milieu de CLiltürf:, sur les biomasses candidates encore plus oligotrophes, persistantes et actives :n sitar.
- identité des or.~anismes Les baciéries ont été isolées sur des milieux sélectifs dépourvus d'azote minéral et/ou organique assurant ainsi la dominance de ces organismes diazotrophes aux dépens des autres organisn2es hétérotrophes du sol. Les organismes ainsi retenus sont Gram négatifs, aérobiques, diazotrophes et en forme de bâtonnets d'environ 1 à. 3 microns.
On sait que A. chf~oococcLnn est reconnue comme étant la plus adaptée aux conditions de vie édal:hique. Cette souche a donc été retenue comme référer;e pour les souches de l'invention.
En effet, les observations macro- et microscopique des souches de l'invention sont en accord c.
avec les descriptions d'_Azotobczeter chrt?ocoec~tcm Bei~énir~crkü 1901 de l'ATCC, de la DMS et do l' Institut Pasteur. Une caractérisation génomidue et moléculaire de ces souches a donc été
établie à partir de mécanismes connus chez Awtobcccter.
-- propriétés biologiques deS Or~alllsmPS
L.es bactéries 'de type Azetoberciercrcecc obtenues avec la technologie de l'invention sont capables de fixer de l'azote diatomique et d'utiliser les ;substrats carbonés provenant de la décomposition des résidus de culture au champ, et notamment ceux provenant de la ct~col~~l ~csü;iol des pailles de céréales et de :haïs. En principe, certains écotypes azotobactériens sont aussi capables d'établir des associations rhizosphériques et de promouvoir ainsi la croissance de la plante, mais ne sont pas pour autant virulentes. Elles ne sont pas non plus, et cela contrairement à certaines Acetobcrctef~, endophytes.
~os bactéries dP type !lzotobcrV~tetrcrcecce sont généralement trouvées dans les sols, elles sqnt Ora?~~ ?~.égatives, et ont ~_in mc:~e de croissance et dn développement conventionnel et hétéro~!.rohhe. Da~ls des conditions de stress hydrique o~u autre, elles peuvent s'enkyster à
l'aide do capsules d'exopolysacchar~~ides (EPf) et plus ~~articuliérement d'alginate. En ce sens, cette production cl'EPS est primordiale pour la surviE; et la rusticité
en milieu édaphique de Ce5 bactéries; la caractérisation plus ou moins fine de ce mécanisme servira donc à
l'identification de ces organismes comme décrït ci-après.
Ces bç!ctéries Boni. responsables de la fixation d'azote diatomique dans les sols par voie non Symbrotiqu~. Elles sont aérobiques, contrairement aux C'k~sty~idircm, et sont généralement reconnues comme ne pouvant; selon les circonstances, fixer par diazotrophie que quelques lcg, .voir e quelques dizaines de lcg d' azote par hectare et par an. Or, ces taux de fixation bioïogique sont surtout lirnités par 1a (non)disponi'oilité des substrats carbonés suite à la (non)persistance des scuches diazotrophes (ré)introduites dans des sols particuliers.
Or~ nouera que, conformément à l' invention, ces taux globaux par hectare peuvent être au moins triplés; voire quintuplés. Il a en effet été démonta à l'aide de données expérimentales E

WO 03/046156 ~~ PCT/FR02/04119 obtenues en laboratoire, en serre, en chambre de culture et en parcelles expérimentales au champ que l'invention permet effectivement une plus grande efficacité relative des souches azotobactériennes isolées, une fois celles-ci (ré)introduites dans leur agro-pédo-climat (APC) cl' or igine, - méti~odes d'analyse éta~lisset.~cr~t de i'iG.~l'ï7lTlG cleS OTg'C1177s77?i,'..
L'identité des organismes a été établie en fonction de leur adaptation aux APC. Les résultats rapportés ci-apr~s concernent les 2 APC à partir ë.esrluels les souches ont été isolées, et dans lesquels elles seront ré-introduites sous la forrzns J'inocula bactérien : un dans la région Toulousaine (31) ('Terrefort ou « TF31 », voir Tabl~saü l.a) et l'autre dans la région de Poitiers (86) (Groies oti « GR~6 », voir T ableau 1.b).
Aux fins de caractérisation, on a utilisé des oligonucléotides capables d'amorcer la iSClyri2éïlSatioil de S~grTiPrltS COriSerVBS Cl'iln géne reCOn?1u Comme eSSentlel à la synthèse d'exo -- polysaccrarides (EPS), notamment l'alginate, nécessaire à la survie des bactéries dans 1<=s sols.
Olig~ntrclér.~tides t~tiiisé,s ~orn~ lcr rcrr~c~ctérisatirry~.f~fzction:~elle ,~e segnver?tS AIgU et.
AigD clea~ .sez!ehes,~zatobc~cterireecre ecrrulic~'~~ries.
C)n a choisi les deux régions considérées comme les plus conservées des segments génonniques algU et algD eléjà rapportés comme appartenant aux genres Pseurclomoncrs et A~vW bcccte;° (information sur Genebar~l~ concernant le segment AVtJ11240. AIgD Azobacter vü:elandü ATCC 904 Campos et al. Tournai J. Bacteriol. 1713 (7), 1793-1799 (1996)). Sept séries d' amorces oligonucléotidiques ont été élabor ées à partir de ces régions pour servir à
amplifier par voie de PCR des portions de quelques centaines de bases de ces gènes facilement repérables par électrophorèse Poar3~ A lgD --Amorce AIgD 1 : TGG GCT ATG TIVTG GTG CAG T
9 Amorce AlgD2 : ACS ACC ACG GTG TGG CGA A
Amorce AlgD3 : GGT GTA CTT GAT CAT CTC GCiC

WO 03/046156 1~ PCT/FR02/04119 Po~arn AI.~U
~ Amorce AlgU~lTGG TYG QRC GRG TRC AGC
: G

d Amorce AlgU2ACG RTA KGC TYY GAT GAA
:

Amorce AigU3 TTY TAT AC1VI TGG CTG
: TAT C

Amorce AlgU4 GAC CCY ACE GTY CCM AC
:

Les résultats obtenus sont. donnés sur les figures 1 A et 1B dui représentent A. Les bandes PCR produites par les amorces fllgU 1/2 selon le type de matrices utilisées.
L'expression des bandes PCR-AIgU dénote selon toute vraisemblance des segments de axasses différentes et donc caractéristiques des souches candidates TF31 et R86, respectivement;
B. L~. mise en évidence de la différence entre les bandes PCR AIgU 1/2 pour les souches CandiCl~ tws TF31 et GR86.
Les amorces AIgTJl ;,t U2 se révëlent les plus discriminantes, permettant d'obtenir de façon reproductible des produits PCR caractéristiques des deux souches candidates retenues, et cela vis-à-vis de la. souche utilisée comme térnoin, Azotobc~cteY c:lzroococczrzn 76.116 de la C1VCM
Lie l'Institut Pasteur (voir figure 1).
eorat:vle de lcc parr~eté rzzierobzoiogiqare de lcz sozrehe ecendidcrte et de lcz p~épcroatzorz La technique dite « R.APD » (Rcrrzdonz AJZZpI~ed Polymozphisnz DNA) est la plus gënéralement utilisée pour obtenir rapidement un profil g~°nétique d'un organisme bactérien.
Un choix d'amorces oligonucléotidiques servant à amplifier par PCR des segments d'ADN, a pl'dOTd disposés aléatoirement au sein du génome de l'organisme, peut donc servir d'outil d' A QCQ {Assurance Qz:alité, Contrôle Qualité) au cours de la production et du déploiement expérimental d'organismes bactériens. Ce choix est dicté: par (i) l'apparition d'une « bande PC R », dans un premier temps, {ü) la ré-apparition systématique de cette bande au cours de hCR successives, et (iii) le rapport qu' établira cette communauté de bandes entre les diverses souches que l'on cherche à distinguer les unes des autres.
Les souches Eandidates ayant été caraciérisées comme e;tant de type A~otobcrcter~aceae et probablement des écotypes d'A. chroococczizzz Bezjerzrtclcü, Gram négatifs, aérobiques, WO 03/046156 1g PCT/FR02/04119 diazotrophes, en forme de bâtonnets, parfois ovoïdes, et de dimension de 1 à 3 microns selon le stade de développement de la culture et la composition du milieu, il s' agissait surtout de distinguer les diverses souches candidates TF31 et GR86, d'une souche de culture type, notamment A. chroococc~~n Be~jei°ir3kciz 76.116 de la CNCM de l'Institut Pasteur.
~_ pa rtir de deux séries «~. neuf amorces aléatoires composl:es chacune de dix bases nucléiques (voir Tc~bleczzr 2), six amorces ont été choisies selon les trois critëres de choix mentionnés plus haut (Voir Bunicoa et al. 1 S99).
Tableau 2 : Synopsis de l'ensemble des amorces (décamères) essayés dans le cadre de l' analyse par RAPD des trois souches et biomasses azotob;~ctériennes, y compris la souche de référence Azotobactef~ chi°oc:co~crrrr~ 76.116 de la CNCM d~e l'Institut Pasteur.
Produc;tior~ de Bandes PCR-RAPD

Squence Azotobcrcte~~ souches Souches l~calnreC3ligonuclotidiqueschf~oococez~r3~~~ candidatescandidates ~Tt l-~ TCG T AG CCA A ? ____ ? ____ Vt2-4a TCA CGA TGG A ? ---- **

Vt3-arc TCT CGA TGC A ? ---- ? ----Vt~-Sa CTG TTG CTA C ? ---- ? ----Vt5-8 TGG TCA CTG A ? ---- ? ----Vt 6-10 GGA AGT AGT G ? ---- ? ----b ~; t7-1:1ACC TC'r a~C A ? ____ ? ____ ~t.

~~'t8-1?bCGG C.CC C TG T ~ *%jG*:~ Jh '~'.~::

Vt9-13 ATT GCG TCC A ? ____ ? ____ A.zr l GGC CCG ATC G '7 -_ ? _-Azr2 TAC CCC GAG G ? -- ? --Azr3 TGC GGC TCA G ? ~ ***

Azr4 TCC CAG CGC G ? -- ? --AzrS GCA TGC ACG G * ** **

Azr6 GCC AGT CCC G
** ? _ ?

Azr7 GCT GCC CGA G '? ? - ? -AzrB GTG CGA CCA C ? ** **

A~r9 TTC GGC GCG A * * *

____- ~TOtes -? : amorce utilisée mais auciuie bande PCR
- : amorce abandonnée en raison de l'absence de bande PC:R..
bande PCR réalisée brode PCPh non-réalisée Les résultats obtenus sont rapportés sur la figure 2, qui représente les bandes produites par RAPIN.

Les six amorces, qui sont des décamères, ont permis de s'assurer que les souches candidates étaient effectivement apparentées à A. chr~oococcaun 1901 / 76.116 de l'Institut Pasteur (voir les bandes a2 et a5 sur la Figure 2), tout en se distinguant de celles-ci (voir les bandes al, a3, a4 et a6 sur la Figure 2). Ce profil PCR-RAPD permet aussi de distinguer entre les souches c~.~i,!dic:?aaca TF~ 1. et ~P.~6, ce qui vient corroborer l'analyse plus fonctionnelle de ces deux souches en fonction des segments de gènes alg {voir Figure: 1).
Les résultats obtenus sont rapportés sur la figure 2, qui représente les bandes produites par I~4PD, selon une série de six amorces (n10) caractéristiques des souches de type :~ZOt!?JC!nt2YC~G2Cl~ Cand!dateS, comparées à une souche d'A. ehnoococcrr~z 76.112 témoin.
Identification de biomasses de l'invention par rapport à dés témoins On rappelle que, de manière générale, le protocole de: rétention ira vit~~o de biomasses bactériennes à caractères édaphiques les mieux adaptées à la survie, la persistance et l'activité
au cours de la périodes de mise en culture des cultures agronomiques concernés intègre les trois (3) notions suivantes au sein du protocole, à savoir ~ Notion 1 : Adhérence à des surfaces inorganiques et abiotiques .. -~°~Ioüon '~ : CïoisSa.r~Ge oligotrophique à partir de carnpléments glucidiques et humiques .. I~~ûtion 3 : Expression de caractères benthiques et p:.a.nctoniques Ces biomasses peuvent être en effet repérëes et distinguées par rapport à une gamme de b!oillaSSes témoins produites plus ou moins conventionnellement (traditionnellement) et/ou ~.~~let, ,7ne variante dtz dit p!-otacole n'intégrant que deux:, voire une seule, desdites notions.
Plus prëcisërnent, une série d' essais en microcosmes, voire; en micro-parcelles incorporant un ou plusieurs des témoins inoculés {azb etlou Azb) listés ci-dessous, et la biomasse candidate {~7~) p~ui mettre en évidence, a posteriori, la mise en ~u~~re du dit protocole ;
rntga~ation Biomasses candidates Numro du tmoin des Notions Bactriennes Retenus chus les exem les 1,2 AZB Na ,3 _ Tmoin Azb T e I TMI
2,3 1,3 Tmoin Azb T e II TM2 1,2 Tmoin Azb T e III TM3 1 Tmoin azb 1 _ TM4 '- --2 Tmoin azb 2 _ ~ TMS

3 Tmoin azb 3 TM6 WO 03/046156 2~ PCT/FR02/04119 TMl - Témoin Azb Type I : Ces biomasses sont isolées de gels agar ou autres surfaces matrici elles organiques et biotiques conventionnels sur lesquels un extrait de terre calqué sur la situation édaphique du sol d'origine/cible. De par la présence d'un substrat matriciel relativement riche, elles sont donc en principe surtout à
caractère oligotrophe et contraires au principe de la persistance active tel que visé
par l'invention ;
v TM2 - Témoin Azb Type II : Ces biomasses sont isolées en présence de gels siliciques en alternant les phases liquides et solides par assèchement graduel de l'apport d'eau distillée à la surface des gels n'ayant pas reçu d'etrait de terre, ou encore ayant reçu Lin e, irait de terre (i.e. complément glucido - humique calqué sur le sol cible) d'un sol d'origine différent de celui du soi cible.
TM3 - Témoin Azb Type IiI : Comme avec les térr~oins Azb de Type I, ces biomasses sont ïsolées de gels, mais siliciques et/ou inorganiques et abiotiques, sur lesquels un extrait de terre est calqué sur la situation édaphique du sol d'origine /
cible. Un extrait c:~ terre est at~parté =v la surface du gel silicique (i.e. installation d'une première, et dernière phase liquide), mais celle-ci n'est pas restaurée une fois asséchée.
TM4 - Témoin azb 1. : Ces biomasses baatérienne;~ candidates sont obtenues selon le protocole de Pochon (1950, Pochon et Tchan (19~E8), Pochon et al. {1958) et Basson (1967). <~epe~idant, et selon la présente détinitïon, ces biomasses sont obtenues sans l'imprégnation des gels siliciques, et/ou autres surfaces matricielles inorganiques et ;b~OtlC~L!8â, a~%~G l.Iil CILL~l~«i2C~tle eXtralt de terre.
Tï~;~'i5 - Témoin azô ~ : Ces biomasses sont Obt2ilLl~:~ par voie de protocoles d'obtention à caractères édaphiques maïs strictement en ce qui ~~oncerne le complément glucidique et humique du sol d'origine/cible ; ce complément (« extrait de terre ») est soit apportë
à la surface d'une surface matricielle organique/biotique (eg. gel agar) ou dans un milieu de culture liquide riche et plus ou moins conventionnel.
i1'~6 - Témoin azb 3 : Ces biomasses sont dci~à répertoriées dans les diverses collections bactériennes (ATCC, UTE~, Institut Pasteur, D1~~1ZM, ete.) et ont été
isolées conventionnellement, ou du moïns sans considération parïiculière cherchant à
reproduire irz viL wo, au cours de leur isolement, le caractère édaphique, au sens de la présente invention. Il est aussi possible de distingv.u~r deux type de Témoins azb 3 ; (a) d'une part les Témoins azb 3 « endogènes » (azb3a), c'est-à-dire ces biomasses WO 03/046156 ~ 1 PCT/FR02/04119 bactériennes obtenues de façon conventionnelle. mais directement à partir d'un échantillon du sol d'origine / cible, et (b) d'autre part les Témoins azb 3 «
exogènes »
(azb3b), c'est-à-dire ces biomasses bactériennes déjà répertoriées dans les collections.
Représentation Graphidue de l'Effet AZB uar rapport aux Inocula Témoins ~3r1 a représenté gra.phicluerr~ent lot réa.lisatiali de cet effet <cAZB » en ordonnant les rapports dis ïésultats agr~or~amicluos obtel~lus sait e11 l'illCrOGOsmeS, soit eI1 Sarre, soit en micro-parcelles aux. champs suivants (voir Figure 9A et B) Rapports AZB/Témoins Azb (I, II et III) -~e~s~xs Rapport AZB/Témoins Azb (l, 2 et 3) n Rapports AZB/Témoins Azb (I, II et III; j~e~sLlS Rapport AZB en condition favorables/défavorables à l'expression du l'effet «A2B » provenant de la mise en ouvre de l'invention.
~~wtte l:résentatian permet de mettre en évidence l'efficacité des biomasses bactériennes obtenues selon l'invention par rapport à. leurs divers inocula témoins. Cette représentation permet aussi de facilement identifier Ies préparatïons inoculantes relativement efflcacgs pouvant servir de souches candidates à la fabri'~<~tian d'inocula destinës à
la cam_merr.;iaiisaüon.
A titre d'exemple, 3 jeux de données expérimentales ont été rapportés et sont illustrés respectivement par les figures 9C, 9D et 9E
Figure 9C : (a) Efficacité relative de diverses préparations inoculantes provenant de biomasses azotobactériennes isolées de deux types de sols (F4 et I9) ;
o Figure 9D : (b) Efficacité relative de diverses préparations inoculantes provenant de lilal.W ~55C-~ aZ:3~r0rJaCtérlenlle5 lSCléeS de deux types de sols (F4 et I9) selon les résultats obtenus au cours d'incubation en microcosmes avec et sans des agrégats de sols Intacts;
a Figure 9E : (c) Efficacité relative de diverses prnparations inoculantes obtenues et essayées au coLiï=s d'une série d'essais expérimentaux (Exp 17, 18, 19, 20 et 21).

Les efficacités relatives AZB/témoins supérieures à 1.00 dénotent des préparations inoculantes plus efficaces que les préparations conventionnelles. Cette amélioration de l' efficacité est nécessairement attribuable à la mise en ~uv:ce de l'invention.
T'o:~r~ûJs e2l,ériïneritales comprenant des témoins !-1zb conventionnels et des témoins Azb de ~r~e T
'~ ei~e~!_rs en ~,~ote/ic~ de sol On indique dans le tableau 3 ci-dessous, les teneurs en azote minéral (Nm) des sols en microcosmes incubés en présence de 1% p/p de résidus de; culture de maïs inoculës avec des préparaéio~~s 'oactériennes selon l'invention (AZB) et leurswtémoins Tl'~I6 et TLVIl (i.e. des térr~oins internas).
Tableau 3 ___________ mg Nm l l~g sol -_________ Témoïn TIt~i6 Témoin TI~/il AZB A.ZB / Tli'Il AZB / T1VI6 Vat 2 54 ~7 71 1.2~ 1.31 Val3 SR 62 64 1.03 1.10 vaI ~t ~ ~1 7I 1.29 1.2~

Val ~ 62 62 62 1.00 1.U0 ~/ 1 c; GO 02 53 i.0?. 1.05 i~~o~T~~n~~~ 'v2 &ls 1.10 ~.3~5 ' Phase II : cle jru-wier 98 à décembre 1999 Témoir. Azb Tape I
. accumulation de l'azote minéral (Nm) par Icg de sol selon les conditions de rétention szir .mi1_ieux tels elu'utilisés dans l'invention.
L~~ façv~~ génc~rale, le protocole d'isolement de l'inventïon favorise la rétention irr vitro à la surface de rnatiéres abiotiques conditionnées de façon ~, abriter des biofilms propices à
l' évolution de souches (azoto) bactériennes à caractères édaphiques. L'une des principales caractéristiques de ces biomasses bactériennes édaphiques ainsi retenues est en principe leur oligotrophie dui est associée à leur plus grande rusticité et efficacité in site. Pour mettre en évidence cette oligotrophie rustique, quelquefois appelée zymogénie, I'expërimentation ~~;.2:~~vr~ ~? aizs lo ta'~l~au._~ ci-dessous a é~é effectuée WO 03/046156 2' PCT/FR02/04119 Tableau 4 Accumulation de l'azote minéral (Nm) .par. lsg de sol selon les conditions de rétention sur des milieux de l'invention. 'Les conditions d'obtention des biomasses (azoto)bactériennes en itc~li~tre annulent l'efficacité du protocole de l'invention, en instaurant des conditions de rétention trop riches en substrats carbonés.
Pré-incubation Présence de glucose Par rapporE
t~ov sols sur les milieux de r~.zb, témoin Avec cellulose rétention ~~onventionnel mg Nm / kg soli oZCi o~ci L 0~ 26(3) non ozri 0.99 26(1) ~.~i non 1.1~ 29(2) non non 1.3 8 3 6(2) 3 Microcosmes de 2~ g de soI Terrefort reconstitué sur 28 j~~urs d'incubation â 22°C
Données expérimentales témoins Azb de T~ tee II ~TM21:
. efficacité du protocole de l'invention pour i:avoriser l'obtention de biomasses ~.-~z~~to~Llctériennes selon ia nature édaphirlue du sol d'origine et « cible ».
Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau 5 ci-dessous ~n donne sur la figure ;i, les teneurs en azote minéral (rdm) /kg de sol en inoculant divers té~üoins et des souches candidates, en rnicrocomes et sur df;s mite oparcelles.

Tableau 5 .~iotzc!sseNature daphiqueNature daphitltteRapportA~BlAxb pe II iTM2) Ty ctat~rlidatesdtt sol d'origine.tlu sol ~c cibla,Premire srie Deuxime srie T ,aoitr~Ar~lo-limoneuxArgile 1.52 1.U7 TNd2 ~'s~~nit?Limon Argile U.75 U.89 a'l'vT2 ~~'G'7390?.l?~ableLl\ Argile O.G3 1.31 t"l?~r~

~a~ Ardu Arb le 2.02 2.81 On a procédé à la pré-incubation de deux séries d'un même sol à partir duquel on souhaite isoler selon le protocole de l'invention les bactéries AZB càndidates avec et sans 2°Jo P/V de cellulose.
En principe cette pré-incubation aurait dû favoriser la prolifération des bactéries plutôt zymogéniques et les moins oligotrophes et Ies rendre ainsi plus facilement, ou du moins plus ;:~iJ~J!~i~~i~elrL, lsolaLIPs ~nz leur plus grand nombre.
l.jaris de telles conditions, les souches obtenues par voie du protocole de l'inventi<on (<< !'~'B ;>) devraient être peu ou pas pi_us eff~caces que les biomasses azobactériennes conventionnelles (A.zb). _'.~~ plus, cn a ajouté une solution à
1°'° de glucose suffisante pour alléantlT les conditions oligotroplüques en principe présentf;s sur les milieux de rétention selon i'111venti0il. Trois témoins négati:Fs annulant l'action des souches candidates ont pu être instaurés au moment d~ la rétention des biomasses (azoto'i bactériennes les plus oligotrophes et rustiques (voir tableau).
A noter que seule l'absence complète de substrats carbonés apportés permet d'obtenir selon le protocole décrit ci-dessus des biomasses (azote) bactt;riennes AZB
véritablement plus e~caces que les biomasses azotobactériennes azb isolées d.e fàçon plus conventionelle.
~~tte expérimentation met parfaüement en évidence les rôles de l'oligotrophie au cours de la rétention de biomasses (azoto)bactériennes les plus rustiques et efficaces une fois réïntroduites dans les zones édaphiques en tant qu'inocula. Il faut rappeler que cette condition d'obtention qtl'e5t l'oligotrophie est nécessaire mais non suffisante pour assurer l'isolement des souches b~.ctériennes Ies plus édaphiques. En effet, la rusticité et la résistance au stress r_utrüi.onnel ne correspond pas exclusivement aux seules bactéries du sol, mais restent WO 03/046156 ~5 PCT/FR02/04119 néanmoins ici primordiales compte tenu de la recrudescence des conditions oligotrophes en zones édaphiques.
Autres données expérimentales . Etude de l'augmentation de la teneur des microcosmes en mg d'azote minéral (Nm) par kg Cln sol re~onstitl~é., et de la. persistance de i activité de la nitrogénase dans le temps mesurée selon le rappol-t de l'activité de la rédl1ct1011 de l'acétylène (AIaA) au temps t2 et au temps tl.
Les r ésultats obtenus sont résumés dans le tableau 6 ci-des;;ous Tableau 6 Essai Essai 2 Essai MiCr"oCOSme Nm ARA3 Nm ARAS Nm ARA5 Rsidus de culture 28 3.87 1U.8 22 60 1.6 Rsidus de culture avec tmoin 29 4.~~214.8 45 68 2.1 TwlS

Rsidus de culture avec AZB 40 6.67 15.3 112 72 2.7 . Teneurs en azote minéral (Nm) des sels en microcosmes incubés en présence de 1% p/p d~-résidus de culture de haïs inoculés avec des préparations bactériennes A.ZB et leurs témoins azb et Ab (i.e. témoins « internes ») ' t2 = 26 h après début d'illCllb~Lt1011 des microcosmes ; tl = 22 h ' t2 = 72 i~ après elébui d'inc~ioa ion des microcosmes ; tl = 24 h 't2 = C6 ïi après début d'incubation des microcosir~es ; tl = 16h WO 03/046156 ~~ PCT/FR02/04119 i,es résultats sont résumés dans le tableau 7 ci-dessous . Tableau 7 _____.._____ mg Nm / Icg sol -_________ Essais Phase I6 témoin TM6 témoin TI~Il AZB AZB / TMl AZB / TM6 II9 51 Na 56 Na 1.10 III .~5 Na 6i Na 1.33 IV 73 na 54 Na 1.02 Eai 53 na 54 Na 1.02 Ea2 51 na 56 Na 1.10 Ea3F4 51 na 56 Na 1.10 Ea3I9 52 na 55 Na 1.06 Ea4 ~9 na 58 Na 1.18 ea~i~bis 52 na 55 Na 1.06 Ea4tris 53 na 54 .. Na 1.02 ~

lblonentze51 na 56 Na 1.10 Essais Tmoil~ tmoin TMl AZB AZB / TMl AZB /TM6 Pase Ih TIvI6 ZIal2 54 57 71 1.25 1.31 Val3 58 62 64 1.03 1.10 VaI4 57 55 71 1.29 1.25 Val s 62 62 62 1.00 1.00 -Vai 6 50 62 63 1.02 1.05 Vloyenne :9 b2 68 1.10 1.16 f Phase l : de scutembre 96 à décembre 97 Phase II : de janvier 98 at décembre 99 La .figure 5 donne les teneur s en azote minéral (mg Nm / kg sol) de deux séries de microcosmes en parallèles, avec et sans l'apport de l'équivalent d'une cinquantaine d'unités d'azote minéral par hectare, selon le type d'inocula (azot~~)bactériens utilisés (azb - inocula témoin conventionnel constitué de souches azotobactériennes isolées conventionnellement ;
gels süiciclues (~W) co~:ditionnés selon l'invention plus ~Iiverses substances para-humiques (;~p~T I, 2 et 3), un polycondensat de catéchol (PG) et une ~~pH).
':inétielue ale clégr~~dation des résidus de culture au <;hamp sur ur_ période de 5 mois (d'octobre 2000 à mars 2001) sur sol de type «'ferres rouge de châtaignier», Domaine expérimental Inca, Lusignan (~6).

WO 03/046156 2~ PCT/FR02/04119 Or~ rapporte dans le tableau 8 ci-dessous les résultats obtenus Tableau 8 -..__-- ~-_ Inocula selonCoefficient g rsidus restant par de rapport I l'invewtior_dgradations Coefficient aux tmoins non-inoculs et R' (t -' = 5 mois I tmoins -lcl x 10 " ) Trnoit~ TA!rb37 0.93 1..~7 i'tr; ozo ~! 0.97 L 11 2~2 AZB ~7 0.91 . 0.91 a Selon la cinétitlue de dégradation dRC =A x e ~, oàt dRC représente ler qttatztité de résidus de eultatre dégradés ast temps t, et A la qttat~tité de résidus att temps 0, soit .~. 00 g de trtatière sèehe.
~acté~-isation selon l'invention des résidus de culture (RC) - effet d'une mouture plus fine sur l'utilisation des substrats provenant de leur dégradation et en principe utilisables par les bielmasses ;azoto)bactériennes ainsi apportées à la surface de ces résidus.
.eg ré5ultatS obtellll.S SOilt résumés dans le tableau 9 ci-de:;sous Tableau 9 __________________________ mg Nni / kg Sol -______________.._____.
inoo~~ia Mouture Fine des RC lVlouture Grossière des RC
Térr~oin TMG 58 52 Témoin TMl 52 48 On observera que le mouture plus grossièr e (3 mm) de ces même résidus ne permet vraisemblablement pas aux biomasses AZB de contribuer à l'augmentation relative des teneurs en azote minérale (Nm) des microcosmes par rapport aux témoins inoculés TM6 (i.e.
biomasse azotobactérienne isolée conventionnellement) et TMl (i.e. biomasse azotobactérienne isolée~selon une variante inefficace de l'invention.

WO 03/046156 ~g PCT/FR02/04119 augmentation de la biomasse : les résultats obtenus sont rapportés dans les tableaux 10,11 et 12 ci-après A) Augmentation de la production de biomasse végétale {aérienne) par les espèces Lolia~m fnttltif7.o~r.ti~~ et T~~itiG~ann ctestiv2rtn selon le mode de culture en pot (serre) au cours de l'incubation de résidus de cultures céréalières (pailles de blé) sur une période de 28 à 56 jours (Essai 5) avec et sans les cüvers inocula de l'invention et leurs témoins TM6 et TMI..
Tableau 10 __ ma de biomasse MoCle de ~ultut'e et1 pot Essail'; Lssai2a Essai3~' Essai4b Essai5b Rsidus de culture 9.1 7.1 33 37 35 Rsidus de culture avec tmoin 8.7 5.9 39 32 37 Rsidus de culture avec tmoin na 8.1 39 32 37 ;Zsidus ci~ culture avec trnoinna na 39 32 37 RSidLIS de culture avec AZB 10.0 8.7 40 41 39 Note : a ; g de biomasseLolir.tm nrttltiflor7tm par pot b ; ny de biomasse Triticrnn aestivrtm par phntule B? Pourcentage (%) d'augmentation dos rendements en grains (Rdt à
15°l° humidité) et des PI~Ifs {s'oids de mille grains) au cours d'essais agronomiques au champ (campagne 1999-2000 à Touïouse 31 sur sol 'ierreféu, et campagne 2000-2001 à Lusignan sur sol Terre rouge de châtaignier) par rapport aux témoins non-inoculés jumelés à TM6, TMl et AZB.
Tableau lI
Rdt 15% hure PiVIG
hlEûCle ds. CUitut'e au champ ToulouseLusianan ToulouseLusianan Résidus de culture avec témoin TM6 4 % 0.73 % 5 % 0.08 i~~sidus de cuhure avec témoin TM112a 13 % 0.86 °rô ~. % 0.02 f?ésidus cie culture avec AZB 20 % '1.47 °~ô 6 % 0.94 ~:~Tote.:~a ; Témoins TMl pote Toulouse, TM2 pour Lttsignan C) Coïncidence des augmentations de rendements et de PMCr au cours des essais agronomiques au champ de la campagne 2001-2001 à Lusignan sur sol Terre rouge de châtaigner et les divers indices de valorisation des résidus de culture obtenus de façon parallèle sur ces même parcelles.

?9 Tableau 12 ~l¿iede de culture au champ Rdt° PIvIGb -nt° dRCd ctRCe Résidus de culture avec témoin TM6 G3 0.08 % 41 2.10 0.70 résidus de culture avec témoin TM2 ~ 71 0.02 °rô 37 2.02 0.81 Résidus de culture avec AZi3 12G 0.94 °r~ 47 2.42 1.19 2~fote : a ; augmentation des rendements en kg grain / ha à 15% lnunidité
h ; poids mille grlins de blé par rapport auY témoins non-inoculés jwnelés au~t témoins TM2/6 et AzB
c ; coefficient de degradation ;~ l0a selon dRC = ATe-~~
d ; dégradation des résidus de culture (4,00 g à t0) stu~ 164 jours e ; degradation des résidus de culture par rapport auY témoins non-inoculés jumelés auY témoins 71V12/6 et AZB
. Augmentation du rapport biomasses végétales/biomasses macitaires attribuables à l'action rhizosphërique des bactéries (ré)introduites.
Le tableau 13 ci-après donne les résultats obtenus concernant l'augmentation du rapport entre les parties végétatives (aériennes) et racinaires {Index Végétatif, IV)des plantules cultivés sur sols incubés en présence de résidus de culture céréaliëres t,pailles de blé) traités et non-traités avec les inocula selon l'invention et leurs témoins TM6 et 7,M2.
Traitement des résidus de culture ---------rapport végétationracines (Index Végétatif ------------Essai 1 Essai 2 Essai 3 Moyenne Témoins TM6 0.85 na na 0.85 Témoin T1VI2 na na na TF31 (AZB TF31) 0.90 na na 0.90 '-Témoin TNI6 1.02 0.90 1.03 0.98(0.03)9 î én~oin fi ivi2 na 1.03 1.09 1.06 (0.04) GRBû (~GB GF'8ô) i.05 0.92 1.36 i.ll (0.09) (écartype) Retard de l'effet de l'immobilisation de l'azote comparé à celui obtenu sur des résidus de culture témoins traités avec un antibiotique.
Gn étudie l'effet du traitement des résidus de culture céréalière {pailles de blé) avec un antI1710tiCllte (ampicilline) à un taux agronomique (de 1060 kg i 10 NIg de résidus / hectare (soit environ 1000 lVlg de sol)).

WO 03/046156 3o PCT/FR02/04119 Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau 14 ci-dessous.
Tableau 14 Mode de culture en pot Essai 1 Essai 2 Essai 3 Moyenne Résidus de culture 33 37 35 35 (2)'°
Résidus de culture avec antibiotiquell 37 39 38 38 (1 ) Résidus de culture avec AZB 40 41 39 40 (1 ) ° (écart type) ~ ~ Ampicilline L'effet observé est attribuable au retard inculqué aux bactéries impliquées dans la dégradation des résidus de culture, et donc accessoirement à l'immobilisation de l'azote minéral assimilable du sol. Cette atténuation de l'immobilisation de l'azote assimilable permet une plus grande croissance végétale des plantules testés en place ; cette augmentation de la croissance végétative est analogue à celle observée en présence de résidus de culture traités selon l'invention. Ce traitement peut donc aussi être conçu comme une bonne alternative (micro)biologique à un éventuel traitement aux antibiotiques des résidus de cultures.
La figure 6 donne une représentation graphique de trois expérimentations VBS
avec l'utilisation de l'ampicilline comme témoin antibiotique. On observera que l'ampicilline est plus favorable à la croissance végétative que les témoins inoculés azb et Azb, tandis que AZB
est plus favorable que l'ampicilline.
Dégradation des résidus de culture On étudie la décomposition en microcosmes au laboratoire et au champ, en sachets de nylon, des résidus de culture céréaliéres traités selon l'invention par rapport à
leurs témoins jumelés non inoculés.
Les résultats obtenus sont donnés sur les figures 7A ET 7B.
. effet de la granulométrie des sols On rapporte sur lés figures ~A et ~B les résultats concernant l'étude de l'efficacité relative des biomasses (azoto)bactériennes de (invention pour maintenir la teneur en azote minéral de sols reconstitués en microcosmes selon la fraction granulométrique (> 3 mm en (A), et moins de 1 mm en (B)) de ces fractions. On notera que seules les biomasses A~B sont efficaces et que cette efficacité par rapport aux témoins.inoculés (azb et A:~b) et non inoculés (témoin), n'est plus observée lorsque les biomasses évoluent au sein de la fraction 1 mm.

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Claims (12)

REVENDICATION

1. Procédé d'obtention in vitro de biomasses bactériennes d'origine édaphique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de:
- mise en contact d'une suspension aqueuse de sol avec un substrat matriciel, de manière à
former une zone hydratée, ou biofilm, à la surface du substrat, analogue à
celle adjointe au CAH du sol, abritant pour l'essentiel la composante bactérienne autochtone du sol, afin de retenir à la surface du substrat matriciel, l'essentiel de la microflore bactérienne endogène aux milieux édaphiques d'origine.
- maturation du biofilm avec établissement de conditions oligotrophiques permettant aux cellules les plus constitutives du biofilm édaphique qui ont colonisé le substrat matriciel, de migrer vers la phase liquide surnageant le substrat matriciel, et progressivement à la dominer, - récupération et culture des souches bactériennes les plus prolifiques en milieux de cultures liquides riches, à caractère autochtone, rustiques et persistantes in situ, cultivables en milieux liquides, et donc aptes à être produites industriellement.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le substrat matriciel est un substrat matriciel inorganique et abiotique, en milieu aqueux, favorisant la production d'exopolysaccharides (EPS) et des autres composantes du glycocalyx bactérien, ainsi que l'organisation en réseau d'un nombre suffisant de cellules capables d'initier les premières étapes de formation d'un biofilm à la surface du substrat.

3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'eau de la suspension aqueuse renferme des composés présents dans les proportions relatives caractéristiques du sol cible d'origine, à savoir des substances humiques et fulviques, des composés carbonés et notamment des mono-, oligo- et polysaccharides, d'origine végétale, animale, et bactério-fongique, des éléments nutritifs.

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la maturation du biofilm est réalisée en alternant une phase où le biofilm formé
sur la surface abiotique n'est pas en présence d'une phase liquide surnageante, avec une phase liquide comprenant l'ensemble des cellules bactériennes surnageant la phase solide.

5. Biomasses bactériennes isolées, caractérisées en ce qu'elles comportent, comme souches dominantes à caractère édaphique, autochtones, oligotrophes, en majeure partie aérobiques, présentant des caractéristiques métabolo-physiologiques de diazotrophie, activité
fonti-statique et/ou phytosanitaire.

6. Biomasses selon la revendication 5, caractérisé par les phénotypes suivants exprimés in vitro et in situ par rapport à des biomasses bactériennes témoins obtenues de surfaces biotiques, mais sans la présence d'un biofilm ou d'un complément humique et/ou obtenues de surfaces abiotiques, mais a) avec un complément humique non-calqué
sur celui du sol cible et/ou b) avec un substrat carboné apporté en quantité supérieure aux concentrations normalement présentes dans le sol, et/ou obtenues de surfaces abiotiques non conditionnées, lesdites biomasses bactériennes sont plus mucoïdes que ces témoins, plus enkystées et de manière plus durable, moins copiotrophes que lesdits témoins, et produisent des facteurs d'auto-induction selon des taux plus élevés que les témoins, par exemple de l'octanoyl homosérine lactone.

7. Biomasses bactériennes selon la revendication 6, caractérisées en ce que, par rapport auxdits témoins, elles sort capables de maintenir la teneur en azote minéral des sols reconstitués en microcosmes sur une période plus de 28 jours d'incubation d'Azobacteriaceae, des Pseudomonaceae, ou des Rhizobiaceae.

8. Biomasses bactériennes selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisées en ce qu'il s'agit d'Azobacteriaceae, de Pseudomonaceae, ou de Rhizobiaceae.

9. Souches bactériennes isolées à partir des biomasses bactériennes selon l'une quelconque des revendications 5 à 8.

10. Souches bactériennes selon la revendication 9, en ce qu'il s'agit de d'écotypes de A.
chroococcum Berjerinkcii.

11. Application des biomasses bactériennes selon l'une quelconque des revendications à 9 et des souches bactériennes selon la revendication 10, à la bactérisation microbiologique de sols et de résidus de cultures, en particulier de résidus de cultures céréalières, y compris ceux du maïs-grain.

12. Application selon la revendication 11, caractérisée par inoculation desdites biomasses bactériennes et souches par pulvérisation de formulations les contenant sur les résidus de culture.