Procédé de préparation du sel de sodium de n-butylmercapto-pénicilline. Le présent brevet est relatif à un procédé de préparation du sel de sodium de n-butyl- mercapto-pénicilline, composé nouveau répon dant à la formule suivante: CH3CH2CH2CH2S-C1oH12N204S Na. On connaît des pénicillines formant un groupe de composés chimiquement apparentés qui, sous des conditions de croissance conve nables, s'obtiennent comme produits du méta bolisme d'une moisissure appropriée. On n'a pu établir entièrement la structure molécu laire de ces composés.
On a, toutefois, pu acquérir des connaissances suffisantes sur leur structure pour pouvoir leur attribuer la formule empirique .suivante Ro-C1oHlaN204S dans laquelle Ro représente un radical orga nique qui caractérise chaque pénicilline indi viduelle.
Ces pénicillines connues forment nui groupe de six pénicillines, dans chacune des quelles le radical Ro représente un radical butène-1-yle, butène-2-yle, n-butyle, n-hexyle, phényle ou p-hydroxyphényle. On sait, en outre, que dans le mode de production normal par fermentation, ces six pénicillines sont ob tenues en mélange.
La titulaire a découvert qu'il est possible (le faire produire à une moisissure productrice de pénicilline une pénicilline nouvelle en incorporant au milieu nutritif, .dans lequel la moisissure se développe, un composé organi- que, désigné dans la suite par composé précurseur . Ce composé précurseur, bien qu'étranger aux besoins normaux clu ' métabo lisme de la moisissure, peut être métabolisé et incorporé pour Lune part substantielle à la molécule de la nouvelle pénicilline. Ce résul tat est particulièrement remarquable en rai son du caractère spécifique reconnu des systè mes d'enzymes par lesquels les organismes in férieurs maintiennent leur croissance et leur développement.
Il est surprenant, en outre, que l'utilisation d'un composé ,précurseur puisse conduire à la production d'une péni cilline nouvelle, et cela. pratiquement à l'ex clusion des pénicillines connues se formant normalement.
Ainsi, la présente invention fournit un procédé de production-d'une pénicilline nou velle, sans qu'il y ait production concommit- tante de pénicillines connues, par incorpora tion de quantités importantes d'un composé précurseur choisi.
Le procédé qui fait l'objet du présent brevet est caractérisé en ce qu'on fait croître une moisissure productrice de pénicilline sur ou dans un milieu de culture contenant les éléments nécessaires à la. croissance de la moi sissure et un composé précurseur renfermant le radical n-butylmercapto et qu'on forme le sel de sodium. de la pénicilline ainsi produite. Le sel de sodium de la n-butylmercapto-péni- cilline est un solide blanc cristallisé.
On peut isoler la nouvelle pénicilline par des méthodes connues, par exemple par ad- sorption et extraction, pour obtenir un pro duit suffisamment pur pour les besoins prati ques. Pour obtenir un produit plus pur, on peut soumettre la nouvelle pénicilline à des traitements de purification supplémentaires comme le montre l'exemple ci-après.
Le milieu nutritif utilisé pour le développe ment de la moisissure peut comprendre des ingrédients tels que de l'eau, des sucres, des sels minéraux et, de préférence, un ou plu sieurs des produits mal déterminés obtenus par macération des grains de céréales et du son. On connaît un grand nombre de milieux nutritifs appropriés comprenant des matières de ce type.
Pendant la croissance de la moisissure, on maintient le milieu .de culture à une tempé rature appropriée, par exemple de l'ordre de 20 à 30 C. Les températures qui se sont révé lées particulièrement convenables sont com prises entre 24 et 26 C.
Le temps pendant lequel on laisse la moisissure se développer dépend du but poursuivi. Ainsi, on peut ne laisser croître la moisissure que pendant la période où son développement est le plus rapide, c'est-à-dire deux à trois jours; ou bien on peut laisser croître la moisissure plus long temps pour obtenir le rendement quantitatif maximum, soit en général pendant 5 jours.
La moisissure peut être cultivée sous di verses conditions. On peut, par exemple, la laisser croître sans aucune agitation du milieu de culture, auquel cas elle se développe en sur face, ou, au contraire, on peut agiter le milieu de culture, en secouant ou en remuant, auquel cas elle se .développe dans toute la masse dudit milieu.
Les moisissures utilisables pour réaliser l'invention sont les organismes du type capable de produire des pénicillines, par exemple les moisissures du groupe Penicillium notatum- chrysogenum, ainsi que certaines moisissures du groupe Aspergillus. Bien entendu, toutes les variétés de moisissures ne sont pas égale ment efficaces;
les plus favorables sont celles des variétés g-1612 et Q-176 du groupe Peni- cillium notatum-chrysogeniuu et la variété G-147 du groupe Aspergillus flavlls. La concentration en composé précurseur, qui peut être l'acide n-butylmercapto-acétique ; ou un composé capable de se transformer en cet acide soirs l'action de la moisissure, dans le milieu de culture, peut fortement varier. Cette concentration peut être de l'ordre de 1010, mais il est en général désirable d'utiliser des ; concentrations plus faibles.
La concentration optimum en composé précurseur se trouve comprise entre 0,01 et 0,05 %, calculée en poids-volume, lorsqu'on utilise la variété Y-1612, tandis que cette concentration est , supérieure lorsqu'on utilise la variété Q-176.
On peut ajouter le composé précurseur à tout moment convenable. Ainsi, on peut en semencer le milieu nutritif avec la moisissure, le composé précurseur étant ajouté soit avant, , soit après cet ensemencement. <I>Exemples:</I> On prépare un milieu de culture ayant la composition suivante
EMI0002.0047
Lactose <SEP> 125 <SEP> g
<tb> Matières <SEP> solides <SEP> d'une <SEP> macération <SEP> de
<tb> grains <SEP> de <SEP> céréales <SEP> 150 <SEP> g
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Acide <SEP> n-butylmercaptoacétique <SEP> 0,9 <SEP> g
<tb> Eau <SEP> 5000 <SEP> cm <SEP> 3 On répartit le milieu de culture par frac tions de 200 cm3 dans des flacons Erlenmeyer de 1 litre, on les stérilise,
on ensemence avec une suspension de spores de moisissure Peni- eillium, variété 1=I. R. R. L. 1976, et on -ôbture les flacons avec un tampon de coton. On main tient les flacons à une- température de 23 à 26 C environ en les agitant constamment pendant cinq jours.
On filtre ensuite le con tenu des flacons pour séparer le mycélium de la moisissure, on laisse refroidir le filtrat jusqu'à 0 C environ, on l'acidifie jusqu'à un pH de 2,2 environ au moyen d'acide ortho- phosphorique et on l'agite avec un volume égal d'acétate d'amyle.
On sépare la couche d'acétate d'amyle et on l'extrait avec trois fractions de 100 cm3 d'eau froide à laquelle on ajoute une solution décinormale froide de bicarbonate de sodium au cours de chaque extraction, jusqu'à ce que la phase aqueuse ait atteint un pg d'environ 7,1 à 7,3.
On réunit les extraits aqueux, on les refroidit à 0 C environ, on les acidifie jusqu'à un pfi d'environ 2,2 par de l'acide orthophosphorique et on les extrait au moyen de trois fractions d'éther de 100 ems chacune. On réunit les extraits à l'éther et on les fait passer dans une colonne d'adsorption chromatographique du type à la silice, d'environ 30 mm de dia mètre et 300 mm de long et contenant une solution tampon au phosphate, dont le p$ est égal à 6,2.
On développe la colonne à silice par lixii-iation au moyen de six fractions de 100 cmB d'éther contenant des quantités suc cessivement croissantes de méthanol dans l'ordre de 1/2, 1, 11/2, 2, 21/ et 3 0/0.
On divise la colonne .de silice développée en environ 12 sections égales et on effectue l'élution de chaque section avec trois fractions de 30 cms d'une solution de phosphate M/15, de<B>pH</B> = 7,0. Les produits de l'élution sont soumis à un titrage bactériologique pour en déterminer la teneur en pénicilline.
L'activité antibiotique provient en grande partie de plu sieurs bandes de la colonne de silice et résulte de la présence de la n-butylmercapto-pénicil- line. Les éluats correspondant à ces bandes sont rassemblés, refroidis à 0 C environ, aci difiés jusqu'à un pH de 2,2 environ et extraits au moyen de trois fractions de chloroforme de 50 cm3. On fait passer les extraits au chloro forme combinés à travers une colonne d'ab sorption de silice contenant une solution tam pon de phosphate ayant un pH -de 6,2.
On développe la colonne à silice par lixiviation avec trois fractions de 100 cm3 de chloroforme contenant des proportions successivement croissantes de méthanol dans l'ordre: 1, 2 et %. On divise alors la colonne à silice d6ve- loppée en 7.2 sections égales et on soumet chaque section à l'élution par trois fractions de 30 cm-9 d'une solution tampon
de phosphate 1#1/15 de p$ = 7,0. L'activité antibiotique provient en grande partie d'une bande" large occupant les 2/3 inférieurs de la colonne de silice. Les éluats obtenus par extraction des sections de la colonne de silice, qui constituent cette bande, sont rassemblés, refroidis à 0 C environ, acidifiés jusqu'à un p$ = 2,
2 environ et soumis à l'extraction au moyen de trois fractions d'éther de 100 cm3. On réunit les extraits à l'éther et on les extrait à leur tour par environ 75 cm3 d'une solution aqueuse froide et diluée de soude caustique à laquelle on ajoute de la soude caustique décinormale au cours de l'extraction, de manière à réaliser un p$ final d'environ 7,0 dans la phase aqueuse.
De la solution aqueuse, on peut séparer le sel de sodium de la n-butylmer- capto-pénicilline, par exemple par congélation et évaporation dans le vide à l'état congelé. On cristallise le sel de sodium de n-butylmer- capto-pénicilline sec en traitant le sel de sodium amorphe par de l'acétone absolu en quantité presque suffisante pour le dissoudre. Lorsqu'on laisse reposer le mélange pendant peu de temps, le sel de sodium cristallisé se sépare.
On recristallise deux fois le sel cristal lisé en le dissolvant dans de l'acétone aqueux < @ .90 % et en ajoutant de l'acétone absolu pour reprécipiter le sel.
Le sel de n-butylmer.. capto-pénicilline cristallisé obtenu présente une teneur .de 3400 unités par cms. L'essai différentiel donne une valeur de 0,53. L'ana- lyse révèle la présence de 7,52 % d'azote et de 17,
26 % de soufre. Les valeurs calculées cor- respondantes; sont de 7,60 % d'azote et de 17,40 % de soiûre.
Process for the preparation of the sodium salt of n-butylmercapto-penicillin. The present patent relates to a process for preparing the sodium salt of n-butyl-mercapto-penicillin, a new compound corresponding to the following formula: CH3CH2CH2CH2S-C1oH12N204S Na. Penicillins are known which form a group of chemically related compounds which, under suitable growing conditions, are obtained as metabolism products of a suitable mold. The molecular structure of these compounds could not be fully established.
We have, however, been able to acquire sufficient knowledge of their structure to be able to attribute to them the following empirical formula Ro-C1oHlaN204S in which Ro represents an organic radical which characterizes each individual penicillin.
These known penicillins form a group of six penicillins, in each of which the radical Ro represents a butene-1-yl, butene-2-yl, n-butyl, n-hexyl, phenyl or p-hydroxyphenyl radical. It is also known that in the normal mode of production by fermentation, these six penicillins are obtained as a mixture.
The proprietor has discovered that it is possible to cause a penicillin-producing mold to produce a new penicillin by incorporating into the nutrient medium, in which the mold grows, an organic compound, hereinafter referred to as the precursor compound. This precursor compound, although foreign to the normal needs of the metabolism of mold, can be metabolized and incorporated in a substantial part in the molecule of the new penicillin. This result is particularly remarkable because of the recognized specific character of the compounds. systems of enzymes by which lower organisms maintain their growth and development.
It is surprising, moreover, that the use of a precursor compound can lead to the production of a new penillin, and that. practically to the exclusion of known penicillins which form normally.
Thus, the present invention provides a process for the production of a novel penicillin, without the concomitant production of known penicillins, by incorporating large amounts of a selected precursor compound.
The process which is the subject of the present patent is characterized in that a penicillin-producing mold is grown on or in a culture medium containing the elements necessary for the. growth of the moiety and a precursor compound containing the n-butylmercapto radical and which forms the sodium salt. of the penicillin thus produced. The sodium salt of n-butylmercapto-penicillin is a white crystalline solid.
The new penicillin can be isolated by known methods, for example by adsorption and extraction, to obtain a product sufficiently pure for practical purposes. To obtain a purer product, the new penicillin can be subjected to additional purification treatments, as shown in the example below.
The nutrient medium used for the growth of mold may include ingredients such as water, sugars, mineral salts and, preferably, one or more of the ill-determined products obtained by maceration of the cereal grains and his. A large number of suitable nutrient media are known comprising materials of this type.
During the growth of the mold, the growing medium is maintained at a suitable temperature, for example in the range of 20 to 30 C. Temperatures which have been found to be particularly suitable are between 24 and 26 C.
The length of time that mold is allowed to grow depends on the goal. Thus, the mold can only be allowed to grow during the period when its development is most rapid, that is to say two to three days; or the mold can be left to grow for a longer time to obtain the maximum quantitative yield, that is generally for 5 days.
Mold can be grown under a variety of conditions. One can, for example, let it grow without any agitation of the culture medium, in which case it grows on the face, or, on the contrary, one can agitate the culture medium, by shaking or stirring, in which case it is. develops throughout the mass of said medium.
The molds which can be used for carrying out the invention are organisms of the type capable of producing penicillins, for example molds of the Penicillium notatum-chrysogenum group, as well as certain molds of the Aspergillus group. Of course, not all varieties of mold are equally effective;
the most favorable are those of the g-1612 and Q-176 varieties of the Penicillium notatum-chrysogeniuu group and the G-147 variety of the Aspergillus flavlls group. The concentration of precursor compound, which may be n-butylmercapto-acetic acid; or a compound capable of transforming into this acid in the evening the action of the mold, in the culture medium, can vary greatly. This concentration can be on the order of 1010, but it is generally desirable to use; lower concentrations.
The optimum concentration of precursor compound is between 0.01 and 0.05%, calculated in weight-volume, when using the Y-1612 variety, while this concentration is higher when using the Q- variety. 176.
The precursor compound can be added at any convenient time. Thus, the nutrient medium can be seeded with the mold, the precursor compound being added either before or after this seeding. <I> Examples: </I> A culture medium is prepared having the following composition
EMI0002.0047
Lactose <SEP> 125 <SEP> g
<tb> Solid <SEP> materials <SEP> of a <SEP> maceration <SEP> of
<tb> grains <SEP> of <SEP> cereals <SEP> 150 <SEP> g
<tb> Carbonate <SEP> of <SEP> calcium <SEP> 25 <SEP> g
<tb> <SEP> n-butylmercaptoacetic acid <SEP> 0.9 <SEP> g
<tb> Water <SEP> 5000 <SEP> cm <SEP> 3 The culture medium is distributed in fractions of 200 cm3 in 1 liter Erlenmeyer flasks, they are sterilized,
it is inoculated with a suspension of Penileillium mold spores, variety 1 = I. R. R. L. 1976, and the vials were sealed with a cotton swab. The vials are kept at a temperature of about 23-26 C with constant shaking for five days.
The contents of the flasks are then filtered to separate the mycelium from the mold, the filtrate is allowed to cool to approximately 0 ° C., acidified to a pH of approximately 2.2 using orthophosphoric acid. and stirred with an equal volume of amyl acetate.
The amyl acetate layer is separated and extracted with three 100 cm3 fractions of cold water to which a decinormal solution of cold sodium bicarbonate is added during each extraction, until the phase aqueous reached a µg of about 7.1 to 7.3.
The aqueous extracts are combined, they are cooled to about 0 C, they are acidified to a pfi of about 2.2 with orthophosphoric acid and they are extracted with three ether fractions of 100 ems each. . The ether extracts were combined and passed through a chromatographic adsorption column of the silica type, about 30 mm in diameter and 300 mm in length and containing a phosphate buffer solution, of which p. $ is equal to 6.2.
The silica column is developed by lixii-iation using six 100 cmB fractions of ether containing successively increasing amounts of methanol in the order of 1/2, 1, 11/2, 2, 21 / and 3. 0/0.
The developed silica column is divided into about 12 equal sections and each section is eluted with three 30 cms fractions of an M / 15 phosphate solution, of <B> pH </B> = 7, 0. The elution products are subjected to bacteriological titration to determine the penicillin content.
The antibiotic activity arises largely from several bands in the silica column and arises from the presence of n-butylmercapto-penicillin. The eluates corresponding to these bands are combined, cooled to approximately 0 ° C., acidified to a pH of approximately 2.2 and extracted by means of three 50 cm 3 chloroform fractions. The combined chloroform extracts are passed through a silica absorption column containing a phosphate buffer solution having a pH of 6.2.
The silica column is developed by leaching with three 100 cm3 fractions of chloroform containing successively increasing proportions of methanol in the order: 1, 2 and%. The expanded silica column is then divided into 7.2 equal sections and each section is eluted with three 30 cm-9 fractions of a buffer solution.
of phosphate 1 # 1/15 of p $ = 7.0. The antibiotic activity comes largely from a wide band occupying the lower 2/3 of the silica column. The eluates obtained by extraction from the sections of the silica column, which constitute this band, are combined, cooled to 0 C approximately, acidified to a p $ = 2,
2 approximately and subjected to the extraction by means of three fractions of ether of 100 cm3. The extracts are combined with ether and they are extracted in turn with about 75 cm3 of a cold and dilute aqueous solution of caustic soda to which decinormal caustic soda is added during the extraction, so as to achieve a final p $ of about 7.0 in the aqueous phase.
The sodium salt of n-butylmercapto-penicillin can be separated from aqueous solution, for example by freezing and evaporation in a frozen state. The dry sodium salt of n-butylmercapto-penicillin is crystallized by treating the amorphous sodium salt with absolute acetone in an amount almost sufficient to dissolve it. When the mixture is left to stand for a short time, the crystallized sodium salt will separate.
The crystallized salt is recrystallized twice by dissolving it in <@ 90% aqueous acetone and adding absolute acetone to reprecipitate the salt.
The crystallized n-butylmer .. capto-penicillin salt obtained has a content of 3400 units per cms. The differential test gives a value of 0.53. Analysis reveals the presence of 7.52% nitrogen and 17,
26% sulfur. The corresponding calculated values; are 7.60% nitrogen and 17.40% sulfur.