Verfahren zur Herstellung von N-Carboxyasparaginsäureanhydrid
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von N-Carboxyasparaginsäureanhydrid, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man Asparaginsäure unter im wesentlichen wasserfreien Bedingungen bei einer Temperatur von 150C bis 300C in einem den Reaktionsteilnehmern gegenüber inerten, organischen Lösungsmittel mit Phosgen umsetzt, ein zweites wasserfreies Lösungsmittel, das mit dem ersteren mischbar ist und einen höheren Siedepunkt als dieses aufweist, zufügt, das erzielte Gemisch bei vermindertem Druck destilliert, bis im wesentlichen das erste Lösungsmittel entfernt ist, wobei eine Lösung von N-Carboxyasparaginsäureanhydrid im erwähnten zweiten Lösungsmittel erzeugt wird, und das N-Carboxyasparaginsäureanhydrid durch Zusatz einer Flüssigkeit,
die mit dem zweiten Lösungsmittel mischbar ist und in der das N-Carboxyasparaginsäureanhydrid unlöslich ist, fällt.
Das zweite Lösungsmittel ist normalerweise ein schlechteres Lösungsmittel für N-Carboxyasparaginsäureanhydrid und im allgemeinen weniger polar als das Reaktionslösungsmittel. Das Produkt wird durch Zusatz einer mischbaren Flüssigkeit, in welcher das Produkt unlöslich ist, aus dem zweiten Lösungsmittel gefällt. Beim bevorzugten Verfahren wird genügend mischbares flüssiges Fällungsmittel beigefügt, um das Gemisch leicht trübe zu machen. Das Gemisch wird dann in der Regel gerührt, bis sich gewisse Kristalle des Produktes bilden, worauf weiteres Fällungsmittel beigefügt wird. Die ursprünglichen Kristalle dienen als Wachstum- oder Impfkristalle und das erzielte Produkt weist einen besonders hohen Reinheitsgrad auf.
Es ist ferner wünschenswert, das Endprodukt aus einer verhältnismässig verdünnten Lösung zu fällen, da aus einer solchen verdünnten Lösung ein reineres Produkt erzielt werden kann.
Als Reaktionslösungsmittel und zweites Lösungsmittel kann irgendein Paar aus einer Anzahl Paaren von organischen Lösungsmitteln verwendet werden. Das Reaktionslösungsmittel ist der Umsetzung gegenüber inert und hat unter gewöhnlichen Bedingungen einen niedrigeren Siedepunkt und ein besseres Lösungsvermögen für die Reaktionsteilnehmer und die Produkte als das zweite Lösungsmittel. Zu den geeigneten Reaktionslösungsmitteln gehören bis zu 8 Kohlenstoffatomen aufweisende Äther, doch werden Äther mit einem niedrigen Molekulargewicht, wie z.B. Äthyläther und Propyläther, infolge ihres niedrigen Siedepunktes bevorzugt. Besonders zweckmässig sind cyclische Äther, wie z.B. Dioxan und Tetrahydrofuran. Nichtcyclische Äther, insbesondere diejenigen mit einem niedrigen Molekulargewicht, weisen oft Spuren von Alkoholen u. Peroxyden auf.
Da diese Chemikalien unerwünschte Nebenreaktionen bewirken können, sollten sie entfernt werden, bevor die Lösungsmittel verwendet werden, um das Lösungsmittel der Reaktion gegenüber inert zu machen. Die bevorzugten zweiten Lösungsmittel sind bis zu 6 Kohlenstoffatomen aufweisende aliphatische Ester, da diese Produkte im allgemeinen einen höheren Siedepunkt als Äther haben und für die Reaktionsteilnehmer und Produkte im allgemeinen schlechtere Lösungsmittel als Äther sind, wobei sie die Eigenschaft aufweisen, dass sie mit Äthern mischbar sind. Zu den geeigneten Paaren von Reaktionslösungsmittel u. zweitem Lösungsmittel gehören zum Beispiel Tetrahydrofuran- Äthylacetat, Dioxan-n-Butylacetat, Äthyl äther-Äthylacetat und Propyläther-Propylacetat.
Die Fällungsflüssigkeit ist mit dem zweiten Lösungsmittel mischbar und N-Carboxyasparaginsäureanhydrid sollte darin im wesentlichen unlöslich sein. Die bevorzugten Fällungsmittel sind flüssige Alkane, Cycloalkane und Gemische davon, die bis zu 10 Kohlenstoffatome aufweisen. Hexan, Cyclohexan, Octan, Isooctan, Nonan und Gemische dieser Stoffe, die eventuell andere Alkane oder Cycloalkane enthalten, sind typische Fällungsflüssigkeiten.
Beim erfindungsgemässen Verfahren wird somitAsparaginsäure im Reaktionslösungsmittel bei etwa 150C bis etwa 300C, vorzugsweise bei Raumtemperatur, d.h. 250C bis 300C im ausgewählten Reaktionslösungsmittel mit Phosgen umgesetzt. Um die beste Ausbeute zu erzielen, wird mit Vorteil mindestens eine äquimolare Menge Phosgen verwendet, doch wird es vorgezogen, überschüssiges Phosgen zu verwenden. Ein molarer Überschuss von bis zu 200% oder sogar mehr kann ohne negative Wir kung verwendet werden.
Am Schluss der Reaktionsperiode, deren Dauer je nach der Menge Reaktionsteilnehmer variiert, jedoch im allgemeinen etwa 10 bis etwa 120 Min. beträgt, wird das zweite Lösungsmittel beigefügt, und die kombinierten Lösungsmittel werden bei vermindertem Druck destilliert, bis das im wesentlichen ganze Reaktionslösungsmittel entfernt ist. Das Reaktionsprodukt kann dann als zum zweiten Lösungsmittel gesetzt betrachtet werden. Das Produkt wird dann durch Zuzatz der Fällungsflüssigkeit gefällt, doch wird die Lösung vorzugsweise durch Zusatz von weiterem zweitem Lösungsmittel vor der Fällung verdünnt.
Die verwendeten Mengen Lösungsmittel und Fäl lungsflüssigkeiten variieren je nach deren Identität. Im allgemeinen ist die Menge an zweitem Lösungsmittel mindestens so gross wie das Volumen des Reaktionslösungsmittels und kann bis zu fünfmal grösser sein, obwohl die relativen Mengen Lösungsmittel sich von diesem Bereich merklich entfernen können. Liegt der Siedepunkt des zweiten Lösungsmittels beträchtlich über demjenigen des Realitionslösungsmittels, so können geringere Mengen des zweiten Lösungsmittels verwendet werden, da beträchtlich mehr Lösungsmittel mit dem niedrigerrn Siedepunkt beim Destillieren hinüber gelangt.
Liegen die Siedepunkte der beiden Lösungsmittel verhältnismässig nahe beisammen, z.B. innerhalb von 5-10 , so wird eine grössere Menge an zweitem Lösungsmittel gebraucht. Das zweite Lösungsmittel kann auf einmal beigefügt werden, in welchem Fall das im wesentlichen gesamte Reaktionslösungsmittel in einem Destillationsvorgang entfernt wird. In einer Alternative kann es in zwei oder mehr Teilen beigefügt und das Reaktionslösungsmittel in zwei od. mehr Destillationsstufen entfernt werden. In keinem Fall sollte die Destillation fortgesetzt werden, bis die gesamte Menge oder der Grossteil an Lösungsmittel entfernt ist, da unter diesen Bedingungen des gewünschte Produkt sich gewöhnlich zur Bildung gummiartiger Produkte, die wahrscheinlich polymerer Natur sind, weiter umsetzt.
Die verwendete Menge Fällungsflüssigkeit variiert je nach der Identität des zweiten Lösungsmittels, der jeweiligen Fällungsflüssigkeit und der Konzentration an Produkt im zweiten Lösungsmittel. Im allgemeinen wird es vorgezogen, das Produkt aus verdünnten Lösungen, die bis zu etwa 2 Gew.-% an gelöstem Produkt enthalten, zu fällen, da man aus verdünnten Lösungen reinere Pro dukte erhält. Wenn erwünscht, können jedoch konzen triertere Lösungen verwendet werden.
Die optimalen wirksamen Mengen Lösungsmittel und Fällungsflüssigkeiten für spezifische Lösungsmittelpaare und zur Fällung lassen sich durch Versuchsreaktionen leicht bestimmen. Zum Beispiel können variierende Men gen zweites Lösungsmittel bestimmten Mengen Reak tionslösungsmittel beigefügt und das Gemisch bei vermin dertem Druck destilliert werden, bis das Gemisch auf
Proben betreffend das Reaktionslösungsmittel nicht mehr reagiert. Dem zweiten Lösungsmittel, das N-Carboxy asparaginsäureanhydrid enthält, können variierende Men gen Fällungsflüssigkeit beigefügt und die Menge und
Qualität des gefällten Produktes geprüft werden, um die wirksamste Menge Fällungsmittel zu bestimmen.
Die Lösungsmittel und Fällungsmittel sollten mög lichst wasserfrei sein, um die Möglichkeit eines Verlustes an Produkt druch Hydrolyse auf ein Minimum zu be schränken, und es kann eine der Reaktion gegenüber inerte Atmosphäre, z.B. Stickstoff, verwendet werden, um allfällige Nebenreaktionen auf ein Minimum zu beschränken.
Infolge der Leichtigkeit, mit der sich Asparaginsäure in cyclische Anhydride, wie z.B. aminosubstituiertes Bernsteinsäureanhydrid, umwandelt, ist es höchst überraschend, dass das erfindungsgemässe Verfahren zu einem im wesentlichen reinen Produkt führt, wie dies aus Elementar- und Strukturanalysen hervorgeht. Es wurde festgestellt, dass die Behandlung des Produktes der vorliegenden Erfindung mit Ammoniak zu im wesentlichen reinem Isoasparagin führt. Wäre das Produkt mit aminosubstituiertem Bernsteinsäureanhydrid verunreinigt, so würde man sowohl Asparagin als auch Isoasparagin als Reaktionsprodukte erwarten. Es ist ferner beobachtet worden, dass die Umsetzungen keinen Einfluss auf die Symmetrie des Moleküls aufweisen.
Das so erhaltene Produkt wird zur Herstellung von Peptiden und Proteinen verwendet.
Beispiel N-CarboxyasparaginsäurezznAIydrid
5 g trockene Asparaginsäure werden in 200 ml Tetrahydrofuran aufgenommen, und Phosgen wird 20 Min.
durch das Reaktionsgemisch bei etwa 250C geleitet. Das Gemisch wird dann 10 Min. stehengelassen, und 300 ml trockenes Äthylacetat werden beigefügt. Das Gemisch wird bis zu einem Gesamtvolumen von etwa 40 ml konzentriert, und weitere 60 ml Äthylacetat werden beigefügt. Eine geringe Menge Niederschlag wird durch Filtrieren unter Stickstoff entfernt, und 85 ml Hexan werden beigefügt. Die leicht trübe Lösung wird etwa 10 Min. gerührt, worauf weitere 120 ml Hexan unter ununterbrochenem Rühren beigefügt werden. Es wird weitere 5 Min.
gerührt, und das gefällte N-Carboxyasparaginsäureanhydrid wird durch Filtrieren zurückgewonnen. Das Produkt wird mit einem 3 : 2 Gemisch von Hexan und Äthylacetat gewaschen und mit Stickstoffgas getrocknet.
Die nachstehende Tabelle fasst die Ergebnisse anderer Beispiele der Herstellung von N-Carboxyasparaginsäureanhydrid zusammen. In allen Fällen werden 5 g Asparaginsäure in 200 ml Reaktionslösungsmittel verwendet. In Beispiel 3 wird eine äquimolare Menge Phosgen verwendet. Der in dem anderen Beispiel verwendete molare Überschuss an Phosgen wird in der Tabelle angegeben. Die Reaktionstemperatur beträgt in Beispiel 2
300C und in Beispiel 3 150C. Bei allen anderen Beispielen ist sie Raumtemperatur.
Zweites Lösungsmittel Zweites Lösungsmittel Endvolumen Fällungsflüssigkeit Beispiel Lösungsmittel Phosgen Volumen Identität in ml in ml
2 Dioxan - 200 Butyl- 40 Cyclohexan acetat
3 Tetrahydrofuran 50 300 Äthyl- 100* Cyclohexan acetat
4 Dioxan 100 200 Butyl- 100* Hexan acetat
5 Äthyläther 200 200 Äthyl- 40 Pentan acetat
6 Propyläther 100 1000 Propyl- 100 Isooctan acetat Das ursprüngliche Gemisch wird bei vermindertem Druck auf etwa 40 ml Gesamtvolumen konzentriert und durch Bei gabe von etwa 60 ml des zweiten Lösungsmittels verdünnt.
Die Identität des N-Carboxyasparaginsäureanhydrids wird bestimmt, indem dieses in Isoasparagin umgewandelt wird. Diese Umsetzung wird durchgeführt, indem
1,0 Millimol des Produktes in 2 ml frisch aus Natrium destilliertem Dioxan gelöst und die erzielte Lösung tropfenweise in eine kalte gesättigte Lösung von wasserfreiem Ammoniak in Dioxan gegeben wird. Es bildet sich sofort ein amorpher Niederschlag. Das Reaktionsgemisch wird bei vermindertem Druck zur Trockene verdampft und das Produkt einer Dünnschichtchromatographie auf Silicagel unterzogen.
Das Produkt wird in jedem der aus einem 7 : 2:1 Gemisch von Isopropanol, Wasser und Essigsäure, einem 5 : 5 :1: 3 Gemisch von Pyridin, Äthylacetat, Essigsäure und Wasser und einem 10:1: 3 Gemisch von n-Butanol, Essigsäure und Wasser bestehenden Lösungsmittelsystemen geprüft, wobei authentische Proben von Asparagin und Isoasparagin als Kon trollsubstanzen verwendet werden. Es stellt sich heraus, dass es sich um im wesentlichen reines Isoasparagin handelt, wodurch bewiesen wird, dass die Ausgangsverbindung im wesentlichen reines N-Carboxyasparaginsäu- reanhydrid ist.
Process for the preparation of N-carboxyaspartic anhydride
The present invention relates to a process for the preparation of N-carboxyaspartic anhydride, which is characterized in that aspartic acid is reacted with phosgene under essentially anhydrous conditions at a temperature of 150C to 300C in an organic solvent that is inert towards the reactants, a second anhydrous Solvent which is miscible with the former and has a higher boiling point than this is added, the resulting mixture is distilled at reduced pressure until substantially the first solvent is removed, producing a solution of N-carboxyaspartic anhydride in the mentioned second solvent, and the N-carboxyaspartic anhydride by adding a liquid,
which is miscible with the second solvent and in which the N-carboxyaspartic anhydride is insoluble, falls.
The second solvent is usually a poorer solvent for N-carboxyaspartic anhydride and is generally less polar than the reaction solvent. The product is precipitated from the second solvent by adding a miscible liquid in which the product is insoluble. In the preferred method, enough miscible liquid precipitant is added to make the mixture slightly cloudy. The mixture is then usually stirred until certain crystals of the product form, whereupon further precipitant is added. The original crystals serve as growth or seed crystals and the product obtained has a particularly high degree of purity.
It is also desirable to precipitate the end product from a relatively dilute solution, since a purer product can be obtained from such a dilute solution.
Any of a number of pairs of organic solvents can be used as the reaction solvent and the second solvent. The reaction solvent is inert to the reaction and, under ordinary conditions, has a lower boiling point and better solvency for the reactants and the products than the second solvent. Suitable reaction solvents include ethers having up to 8 carbon atoms, but ethers having a low molecular weight, such as e.g. Ethyl ether and propyl ether, preferred due to their low boiling point. Cyclic ethers are particularly useful, e.g. Dioxane and tetrahydrofuran. Noncyclic ethers, especially those with a low molecular weight, often contain traces of alcohols and the like. Peroxides.
Since these chemicals can cause undesirable side reactions, they should be removed before the solvents are used in order to render the solvent inert to the reaction. The preferred second solvents are aliphatic esters containing up to 6 carbon atoms, since these products generally have a higher boiling point than ethers and are generally poorer solvents than ethers for the reactants and products, having the property that they are miscible with ethers . The appropriate pairs of reaction solvent u. The second solvent includes, for example, tetrahydrofuran-ethyl acetate, dioxane-n-butyl acetate, ethyl ether-ethyl acetate and propyl ether-propyl acetate.
The precipitation liquid is miscible with the second solvent and N-carboxyaspartic anhydride should be essentially insoluble therein. The preferred precipitants are liquid alkanes, cycloalkanes and mixtures thereof containing up to 10 carbon atoms. Hexane, cyclohexane, octane, isooctane, nonane and mixtures of these substances, which may contain other alkanes or cycloalkanes, are typical precipitation liquids.
In the process according to the invention, aspartic acid is thus added to the reaction solvent at about 150C to about 300C, preferably at room temperature, i. 250C to 300C in the selected reaction solvent reacted with phosgene. In order to achieve the best yield, at least an equimolar amount of phosgene is advantageously used, but it is preferred to use excess phosgene. A molar excess of up to 200% or even more can be used with no negative effect.
At the end of the reaction period, the duration of which varies depending on the amount of reactants, but is generally about 10 to about 120 minutes, the second solvent is added and the combined solvents are distilled under reduced pressure until essentially all of the reaction solvent is removed . The reaction product can then be considered to have been added to the second solvent. The product is then precipitated by adding the precipitation liquid, but the solution is preferably diluted by adding a further second solvent before the precipitation.
The amounts of solvent and precipitation liquids used vary depending on their identity. Generally, the amount of second solvent is at least as great as the volume of the reaction solvent and can be up to five times greater, although the relative amounts of solvent can move appreciably from this range. If the boiling point of the second solvent is considerably higher than that of the reaction solvent, smaller amounts of the second solvent can be used, since considerably more solvent with the lower boiling point passes over during the distillation.
If the boiling points of the two solvents are relatively close together, e.g. within 5-10, a larger amount of the second solvent is needed. The second solvent can be added all at once, in which case substantially all of the reaction solvent is removed in one distillation operation. As an alternative, it can be added in two or more parts and the reaction solvent removed in two or more distillation stages. In no event should the distillation be continued until all or most of the solvent has been removed, since under these conditions the desired product will usually further react to form gummy products which are likely to be polymeric in nature.
The amount of precipitation liquid used varies depending on the identity of the second solvent, the particular precipitation liquid and the concentration of product in the second solvent. In general, it is preferred to precipitate the product from dilute solutions containing up to about 2% by weight of dissolved product, since purer products are obtained from dilute solutions. However, more concentrated solutions can be used if desired.
The optimal effective amounts of solvent and precipitation liquids for specific solvent pairs and for precipitation can easily be determined by test reactions. For example, varying amounts of second solvent can be added to certain amounts of reaction solvent and the mixture can be distilled at reduced pressure until the mixture is up
Samples related to the reaction solvent stopped responding. The second solvent, which contains N-carboxy aspartic anhydride, can vary in the amount and amount of precipitation liquid added
The quality of the precipitated product should be checked to determine the most effective amount of precipitant.
The solvents and precipitants should be as anhydrous as possible in order to minimize the possibility of loss of product through hydrolysis, and an atmosphere inert to the reaction, e.g. Nitrogen, can be used in order to limit any side reactions to a minimum.
Due to the ease with which aspartic acid converts to cyclic anhydrides such as e.g. amino-substituted succinic anhydride, it is extremely surprising that the process according to the invention leads to an essentially pure product, as can be seen from elemental and structural analyzes. It has been found that treatment of the product of the present invention with ammonia results in essentially pure isoasparagine. If the product were contaminated with amino-substituted succinic anhydride, both asparagine and isoasparagine would be expected as reaction products. It has also been observed that the conversions have no influence on the symmetry of the molecule.
The product obtained in this way is used for the production of peptides and proteins.
Example N-carboxyaspartic acid fluoride
5 g of dry aspartic acid are taken up in 200 ml of tetrahydrofuran, and phosgene is added for 20 min.
passed through the reaction mixture at about 250C. The mixture is then left to stand for 10 minutes and 300 ml of dry ethyl acetate are added. The mixture is concentrated to a total volume of about 40 ml and an additional 60 ml of ethyl acetate is added. A small amount of precipitate is removed by filtration under nitrogen and 85 ml of hexane are added. The slightly cloudy solution is stirred for about 10 minutes, after which a further 120 ml of hexane are added with uninterrupted stirring. It will take another 5 min.
stirred, and the precipitated N-carboxyaspartic anhydride is recovered by filtration. The product is washed with a 3: 2 mixture of hexane and ethyl acetate and dried with nitrogen gas.
The table below summarizes the results of other examples of the preparation of N-carboxyaspartic anhydride. In all cases, 5 g of aspartic acid in 200 ml of reaction solvent is used. In example 3 an equimolar amount of phosgene is used. The molar excess of phosgene used in the other example is given in the table. The reaction temperature in Example 2 is
300C and in Example 3 150C. In all other examples it is room temperature.
Second solvent Second solvent Final volume of precipitation liquid Example Solvent Phosgene Volume Identity in ml in ml
2 dioxane - 200 butyl- 40 cyclohexane acetate
3 tetrahydrofuran 50 300 ethyl 100 * cyclohexane acetate
4 dioxane 100 200 butyl- 100 * hexane acetate
5 ethyl ether 200 200 ethyl 40 pentane acetate
6 Propyl ether 100 1000 Propyl 100 isooctane acetate The original mixture is concentrated under reduced pressure to a total volume of about 40 ml and diluted by adding about 60 ml of the second solvent.
The identity of the N-carboxyaspartic anhydride is determined by converting it to isoasparagine. This implementation is carried out by
1.0 millimole of the product is dissolved in 2 ml of dioxane freshly distilled from sodium and the resulting solution is added dropwise to a cold saturated solution of anhydrous ammonia in dioxane. An amorphous precipitate forms immediately. The reaction mixture is evaporated to dryness under reduced pressure and the product is subjected to thin layer chromatography on silica gel.
The product is in each of a 7: 2: 1 mixture of isopropanol, water and acetic acid, a 5: 5: 1: 3 mixture of pyridine, ethyl acetate, acetic acid and water and a 10: 1: 3 mixture of n-butanol , Acetic acid, and water existing solvent systems, using authentic samples of asparagine and isoasparagine as control substances. It turns out to be essentially pure isoasparagine, which proves that the starting compound is essentially pure N-carboxyaspartic anhydride.