CN101215583A - 一种发酵与膜分离单元耦合制备丁二酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种发酵与膜分离单元耦合制备丁二酸的方法，该方法先将产丁二酸菌株的发酵种子接入发酵罐进行培养，再将微滤或超滤膜分离单元与发酵罐耦合实现半连续或连续发酵制备丁二酸，分离出部分发酵液，解除代谢产物抑制，被膜分离单元截留的菌体细胞与组分返回罐内继续发酵，并通过纳滤回收分离的发酵液中未消耗的底物继续用于发酵，同时流加发酵培养基保持罐内发酵液体积恒定。本发明不但可以解除代谢产物抑制显著提高丁二酸的生产强度，而且利用纳滤回收分离液中未消耗还原糖，并同时进行浓缩，工艺条件温和，环境污染小，易于自动化控制，具有广泛的社会和经济效益。

Description

一种发酵与膜分离单元耦合制备丁二酸的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及利用发酵与膜分离单元相耦合制备丁二酸的方法。

背景技术

丁二酸(Succinic Acid，Butanedioic Acid)又称琥珀酸，是一种重要的二元有机羧酸，可作为合成复杂有机化合物的中间体，广泛用于制药、食品加工、合成材料、表面活性剂、防护涂料、染料和其它工业中。然而，传统上的化学合成丁二酸因成本和环境污染等原因使得丁二酸作为基本化工原料的广泛应用受到限制。发酵法制备丁二酸以成本较低的可再生的生物质和温室气体二氧化碳为原料，污染少，能耗低，因此以微生物发酵法生产丁二酸的研究与开发正在美国、日本等国家深入地进行着。利用微生物发酵制备提取丁二酸的专利有：US5034105(1991)、US5168055(1992)、US5143834(1992)、US5958744(1999)等，其专利保护内容主要涉及发酵用菌种、发酵工艺和提取工艺等。

目前国内外利用微生物发酵制备丁二酸多采用传统的批式发酵工艺，在发酵过程中，随着产品丁二酸及甲酸、乙酸等副产物的大量积累，严重地抑制了丁二酸生产菌的生长并进而影响丁二酸的合成速度，造成其发酵生产水平低下，因此在丁二酸发酵过程中往往需要添加大量的钙镁盐来中和大量产生的有机酸以保证发酵的正常进行。在上述公开的专利中，经实践和研究发现，采用这些工艺存在以下问题：

钙镁盐中和，给丁二酸发酵体系带来了大量杂质，增加了后期分离提取的难度，如硫酸钙过滤过程中产品损失高达30％以上；高离子强度导致离子交换树脂污染严重，工作容量迅速下降，树脂再生困难；高浓度的钙镁离子还会导致溶剂萃取效率低下或污染电渗析膜导致能耗迅速增加。

总之采用钙镁盐中和的批式发酵制备丁二酸，分离工艺步骤多，收率低，酸碱/溶剂消耗量大，生产装置易被污染，产生的废液废渣严重污染环境，运行成本高，最终限制了发酵法制备丁二酸的市场竞争能力。因此如何解除丁二酸发酵过程中的代谢产物抑制、提高丁二酸的生产强度与收率是生物法制备丁二酸实现产业化的关键。

目前将膜分离单元与生物反应器进行耦合，可较好地实现菌体细胞与代谢产物的分离而倍受关注，在发酵制备乙醇、丙酮-丁醇、乳酸、丙酸及细胞高密度培养的研究中均有成功报道。但目前未见将膜分离单元与发酵耦合进行连续或半连续制备丁二酸的专利报道。

但目前基于膜分离技术的反应-分离耦合发酵制备有机酸的研究中，多采用基于筛分原理的微滤、超滤膜作为单一的分离组件，此类设计只能实现细胞与发酵液的分离，难以实现产物与底物的分离，不可避免地造成发酵液中未消耗底物及其他营养元素的损失，为了解决这一问题，前人在微滤、超滤膜循环生物反应器中结合离子交换、化学萃取、电渗析等手段回收未消耗的底物，但这些手段或需消耗大量酸碱再生树脂，或易造成溶剂残留对发酵不利，或需消耗大量电能。而纳滤膜介于反渗透与超滤之间(截留分子量为100-1000道尔顿)，其分离机理与分子量筛分及膜分离层表面的静电排斥有关，对分子量≤1000的生物小分子及高价离子有较好的分离效果，在抗生素分离浓缩、氨基酸分离纯化等方面已有应用，目前未见使用纳滤等高效膜分离手段从丁二酸发酵液中回收底物的专利报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用发酵与膜分离单元的耦合制备丁二酸的方法，以解除丁二酸发酵过程中的代谢产物抑制，提高丁二酸发酵生产水平，同时实现反应-分离耦合过程中未消耗底物的回收与利用，提高底物的利用率。

本发明为解决上述技术问题，所采用的技术方案如下：

一种发酵与膜分离单元耦合制备丁二酸的方法，包括如下步骤：

1、制备产丁二酸菌株的发酵种子；

2、制备发酵培养基；

3、将发酵培养基装入发酵罐，再将发酵种子接入发酵罐；

4、前期厌氧发酵生产丁二酸；

5、使部分发酵液流出发酵罐，同时流加发酵培养基以保持发酵罐内发酵液体积恒定；

6、发酵罐内的发酵液继续发酵生产丁二酸；同时流出发酵罐的发酵液先经过微滤或超滤单元，再经过纳滤单元，被微滤或超滤单元截留的菌体细胞与组分返回发酵罐内，被纳滤单元截留的发酵液中未消耗的底物也返回发酵罐，收集纳滤膜渗透液。

其中，步骤1中所述的产丁二酸菌株为产琥珀酸放线杆菌Actinobacillussuccinogenes。

其中，步骤1中所述的制备发酵种子的方法由如下步骤组成：

a、种子培养基的制备：种子培养基为pH 6.0～7.0的含有糖类的能提供碳源、氮源及无机盐的常规液体培养基；斜面培养时，种子培养基内再添加琼脂。其中糖类为葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖等碳源中的一种或多种；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵、氯化铵中的一种或多种，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母膏、玉米浆、牛肉膏中的一种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、锰盐、铁盐中的一种或多种。

b.斜面培养：将产丁二酸菌株在斜面培养基中进行平板划线后，在厌氧培养箱中培养，培养箱通入含有N₂、CO₂和H₂的混合气体，N₂、CO₂和H₂的体积比为8∶1∶1，温度为30～40℃，培养24～48h，用于种子培养基接种和菌株保存。

c.发酵种子培养：每100mL血清瓶中种子培养基的用量为20～80mL，通入含有N₂、CO₂的混合气体，N₂、CO₂的体积比为4∶1，115～121℃灭菌15～30min，冷却后接入产丁二酸菌种，培养温度为30～40℃，转速100～200r/min，发酵时间为10～14h，作为发酵种子。

其中，步骤2所述的发酵培养基为pH 6.0～7.0的含有糖类的能提供碳源、氮源及无机盐的常规液体培养基，并添加维生素。其中糖类为葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、生物质(如玉米皮、玉米芯、植物秸秆)水解糖液等碳源中的一种或多种；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵、氯化铵中的一种或多种，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母膏、玉米浆、牛肉膏中的一种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、锰盐、铁盐中的一种或多种；维生素为叶酸、生物素、维生素B₁₂、硫辛酸、烟酸、泛酸、硫胺素或维生素B₆中的一种或多种。

其中，步骤3中，每5L发酵罐中发酵培养基体积为2～4L，丁二酸发酵种子的接种体积占培养基体积的3～7％。

其中，步骤4所述的厌氧发酵生产丁二酸的方法为：温度35～40℃，发酵罐通入CO₂气体，通气量为0.75～1.5L/min，搅拌转速100～300rpm，发酵过程采用碳酸钠、氨水、氢氧化钠、硫酸或盐酸，控制体系的pH在6.0～7.5，进行前期厌氧发酵10～15h。

其中，步骤5可采用半连续方式(又称半连续发酵)，即每隔4～6h，将40～67％发酵液分离出发酵罐，同时向发酵罐内补充发酵培养基，并保持发酵罐内发酵液体积恒定。也可采用连续方式(又称连续发酵)，即以0.1～0.8h^-1的稀释速度(本发明中稀释速度是指单位时间内流加至发酵罐内的溶液体积与初始发酵液体积之比)流加发酵培养基，同时排出发酵液，以保持发酵罐内发酵液体积恒定。

其中，步骤6微滤或超滤单元中，所使用的微滤膜孔径为0.1～0.2μm，超滤膜的截留分子量为8000～100000道尔顿，其膜组件形式为中空纤维式或管式膜，其膜材质为有机膜或无机陶瓷膜；对于有机膜，使用前可采用1～4％的氢氧化钠溶液进行化学消毒；对无机陶瓷膜，使用前可采用110～120℃的蒸汽湿热消毒或以1～4％的氢氧化钠溶液进行化学消毒。纳滤单元中，纳滤膜的截留分子量为100～200道尔顿，采用卷式纳滤膜组件，使用前需经1～4％的氢氧化钠溶液消毒处理。

其中，步骤6中，发酵液在流出微滤或超滤单元之后，先用硫酸或盐酸调节pH值至3.0～4.5；然后进入纳滤单元，操作压力为7～20bar，温度为10～30℃；此时，纳滤膜可截留葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、二价金属盐和有机氮源，并截留料液中的部分色素(降低色度可减少下游工艺的活性炭用量)，而丁二酸、甲酸和乙酸等抑制性代谢产物可透过纳滤膜；当发酵液中的糖被纳滤浓缩至糖浓度为30～60g/L，且甲酸、乙酸浓度均低于2g/L，丁二酸浓度低于5g/L时，停止纳滤；将截留的纳滤浓缩液用氢氧化钠调节pH值至6.0～6.5，再经截留分子量为10000道尔顿的超滤膜过滤后直接返回至发酵罐内。

收集的纳滤渗透液可继续进行丁二酸的下游分离操作。

本发明发酵与膜分离单元耦合制备丁二酸的方法流程图见图1。

有益效果：本发明采用膜分离单元与发酵过程耦合实现半连续或连续发酵制备丁二酸，不但可以解除发酵过程中代谢产物对菌体生长的抑制，显著提高丁二酸的生产强度，而且不需要在生产过程中添加任何钙、镁盐中和；利用纳滤回收分离液中未消耗还原糖的同时，实现了底物的浓缩及底物与产品的分离，不需要使用任何有机溶剂及离子交换树脂。本发明提供的方法在实现丁二酸高生产强度的同时，将细胞与产物分离、底物回收与浓缩等工艺与发酵过程紧密耦合，克服了现有技术存在的步骤繁琐、酸碱用量大、污染重、能耗高及生产劳动强度大的缺陷，生产过程条件温和、易于自动化控制及产业化，具有显著的社会和经济效益。

附图说明

图1为发酵与膜分离单元耦合制备丁二酸的方法流程图。

具体实施方式

下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。

实施例1：

(1)种子培养基：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 1g/L，NaHCO₃10g/L，Na₂HPO₄ 9～15g/L，KH₂PO₄ 4～12g/L，(斜面培养时加琼脂20g/L)，通入N₂∶CO₂＝4∶1的混合气2min，121℃灭菌20min，冷却；

(2)发酵培养基：葡萄糖40g/L，酵母膏10～50g/L，蛋白胨10～50g/L，MnCl₂0.05g/L，FeCl₂ 0.05g/L，CaCl₂ 0.05g/L，K₂HPO₄  2.0g/L，维生素添加叶酸5mg/L，生物素5mg/L，维生素B₁₂ 5mg/L，硫辛酸5mg/L，烟酸5mg/L，泛酸5mg/L，硫胺素5mg/L，维生素B₆ 5mg/L，pH 7.0；

(3)将保藏编号为CGMCC No.1716的产琥珀酸放线杆菌菌株在种子斜面培养基中进行平板划线后，在厌氧培养箱中培养，控制培养箱中混合气比例为：N₂∶CO₂∶H₂＝8∶1∶1，培养36h后的菌株用接种环接一环到含有50ml种子液体培养基的100ml血清瓶中，转速150r/min，37℃培养12小时后用于上述发酵培养基接种。采用5L发酵罐培养时培养基装液量为3L，接种量为5％(v/v)，搅拌转速在200rpm，37℃，以250g/L碳酸钠调控pH为7.0，发酵罐二氧化碳的通气量为0.75L/min。发酵12h后，丁二酸生产强度已达2.0g/L·h，菌体生长进入对数生长期末期，体系中积累的丁二酸及甲酸、乙酸的总浓度已达30g/L，发酵液中葡萄糖浓度为10g/L，此时准备耦合微滤膜进行半连续发酵；

(4)采用0.1μm的中空纤维式有机微滤膜，使用前用1％的氢氧化钠溶液浸泡6h进行消毒，后用无菌水洗涤至出水pH8.5封闭备用。将微滤膜与发酵罐连接，在0.5ba的压力下进行微滤，滤出发酵液，细胞及截留部分返回罐中继续发酵，滤出液至2.0L(相当于罐内原体积的67％)时，停止分离，流加1.5L葡萄糖浓度为60g/L的发酵培养基；将收集的滤出液用浓盐酸调节至pH4.0，选用截留分子量为100道尔顿的卷式纳滤膜进行纳滤分离，操作压力为15bar，料液温度控制在30℃，纳滤分离过程中葡萄糖截留率达到90％，丁二酸、甲酸、乙酸的截留率均＜8％，收集浓缩液0.5L，葡萄糖浓度达40g/L，用氢氧化钠调至pH6.0，经超滤膜过滤后流加至发酵罐内，保持罐内体积恒定，继续发酵。

此后每隔5h进行分离及补料操作，共分离补料6次，持续30h，丁二酸生产强度达到3.0g/L·h。丁二酸生产强度比相同葡萄糖浓度并加入40g/L碳酸镁进行中和的批式发酵增加了50％，比不用钙镁盐中和的批式发酵提高84％。

实施例2：

(1)种子培养基、发酵培养基均与实施例1相同。

(2)将保藏编号为CGMCC No.1716的产琥珀酸放线杆菌菌株制备发酵种子，方法同实施例1。采用5L发酵罐培养时培养基装液量为3L，接种量为4％(v/v)，搅拌转速在300rpm，37℃，以280g/L碳酸钠调控至pH 6.8，发酵罐二氧化碳的通气量为1.0L/min。发酵11h后，丁二酸生产强度已达2.2g/L·h，菌体生长对数生长期末期，体系中积累的丁二酸及甲酸、乙酸的总浓度已达29g/L，此时发酵液中葡萄糖浓度为11g/L，此时准备耦合超滤膜进行半连续发酵；

(3)采用截留分子量为100000道尔顿的管式陶瓷超滤膜，使用前在121℃灭菌20min，备用。将超滤膜与发酵罐连接，在2ba的压力下进行超滤，滤出发酵液，细胞及截留部分返回罐中继续发酵，滤出液至1.5L时(相当于罐内原体积的50％)，停止分离，流加1L葡萄糖浓度为70g/L的发酵培养基。

将超滤分离得到的1.5L滤液用浓盐酸调节至pH4.0，选用截留分子量为150道尔顿的卷式纳滤膜进行纳滤分离，操作压力为10bar，料液温度控制在15℃，将滤液浓缩至0.5L，纳滤分离过程中葡萄糖截留率达到88％，丁二酸、甲酸、乙酸的截留率均＜5％，浓缩液中葡萄糖达到31g/L，甲酸1g/L、乙酸0.5g/L、丁二酸2g/L。同时纳滤对透过液的脱色率达80％。

每隔6h进行相同的分离操作，在流加培养基同时，将纳滤回收的葡萄糖浓缩液用氢氧化钠调至pH6.0，经超滤处理后直接返回发酵罐内，保持罐内体积恒定。整个半连续发酵过程持续50h，分离补料5次，发酵中共消耗葡萄糖470g，产丁二酸325g，丁二酸生产强度为2.17g/L·h。在初始葡萄糖40g/L的条件下，丁二酸质量收率0.69g/g葡萄糖，丁二酸生产强度比相同葡萄糖浓度并加入40g/L碳酸镁进行中和的批式发酵增加了8.5％，比不用钙美盐中和的批式发酵提高33％。

实施例3：

将保藏编号为CGMCC No.1716的菌株采用同实施例1相同的方法制备发酵罐种子，5L发酵罐培养时培养基装液量为3L，发酵培养基中葡萄糖浓度为25g/L，其余组分同实施例1，采用10N氢氧化钠调节pH 6.80，通入CO₂，通气量为0.75L/min，保持发酵体系的厌氧环境，接种量为5％(v/v)，转速250r/min，培养37℃发酵培养10.5h后，丁二酸生产强度已达1.7g/L·h，体系中积累的丁二酸及甲酸、乙酸的总浓度已达23g/L，葡萄糖浓度仅2g/L，准备耦合微滤膜进行连续发酵。

采用经4％氢氧化钠消毒处理的0.14μm的管式陶瓷微滤膜，将微滤膜与发酵罐连接，分离发酵液，细胞及截留部分返回罐中，同时流加培养基(葡萄糖浓度为30g/L)保证罐内体积恒定，稀释速度分别为0.1～0.8h^-1，分别流加葡萄糖600g，结果见表1。

表1  不同稀释速度对丁二酸生产强度的影响

稀释速度h-1	0.1	0.2	0.5	0.6	0.8
						丁二酸生产强度(g/L·h)	3.4	4.2	8.5	10.7	13.0
丁二酸质量收率(g/g葡萄糖)	0.82	0.78	0.67	0.62	0.55

与半连续发酵相比，连续发酵过程中丁二酸生产强度最高可达13.0g/L·h。在0.1h^-1的稀释速度下，丁二酸质量收率可达0.82g/g葡萄糖。

实施例4：

将半连续发酵过程中超滤分离得到的发酵液(葡萄糖9g/L，丁二酸20～24g/L，甲酸4～5g/L，乙酸6～7g/L)作为纳滤分离原料，用盐酸调节至pH4.0，选用截留分子量为150道尔顿的纳滤膜分别在7～20bar的操作压力下进行分离，分离体积为1.5L，操作温度控制18℃，纳滤过程中收集纳滤膜渗透液，截留液返回进料液中，结果见表2。

表2不同压力对纳滤分离回收葡萄糖的影响

压力(ba)	葡萄糖截留率(％)	丁二酸截留率(％)	甲酸截留率(％)	乙酸截留率(％)	膜渗透通量(L/m2h)	脱色率(％)
							7	83.3	3.5	4.3	0.9	20.8	76
10	87.2	4.2	4.4	1.6	36.5	81
							12	89.5	4.8	4.8	1.8	38.2	83
15	91.6	4.6	5.0	2.1	42.3	86
							18	92.2	4.1	4.7	2.4	39.6	88
20	90.3	3.7	4.7	2.6	37.0	89

可见操作压力为15～20ba时，纳滤膜对葡萄糖的截留率可达90％。截留液中甲酸、乙酸浓度均≤2g/L、丁二酸浓度≤5g/L，脱色率均≥85％。

实施例5：

将保藏编号为CGMCC No.1716的菌株采用同实施例1相同的方法制备发酵罐种子，5L发酵罐培养时培养基装液量为3L，发酵培养基中总还原糖浓度为50g/L(以以玉米皮水解液为碳源，其中葡萄糖20g/L、木糖18g/L、阿拉伯糖12g/L)，其余组分同实施例1，采用2M碳酸钠调节pH 6.70，通入CO₂，通气量为0.75L/min，保持发酵体系的厌氧环境，接种量为5％(v/v)，转速250r/min，培养37℃发酵培养15h后，菌株产丁二酸速率已稳定在2.5g/L·h，体系中积累的丁二酸及甲酸、乙酸的总浓度已达30g/L，此时残留的还原糖总浓度为12g/L(葡萄糖2.5g/L，木糖3g/L，阿拉伯糖6.5g/L)，准备耦合微滤膜进行连续发酵。

采用经4％氢氧化钠消毒处理的0.1μm的中空纤维微滤膜，将微滤膜与发酵罐连接，开始分离发酵液，细胞及截留部分返回罐中，将连续发酵过程中分离得到的发酵液分别用盐酸调节至pH3.0～4.5，选用截留分子量为100道尔顿的纳滤膜分别在15bar的操作压力下进行分离纳滤分离，操作温度控制20℃，浓缩3倍，纳滤分离效果见表3。

可见pH≤4.0时，纳滤膜对还原糖的截留率可达90％左右。甲酸、乙酸、丁二酸等抑制性代谢产物浓度均≤5％，脱色率均≥85％。浓缩液中总还原糖浓度约为50g/L，调至pH6.0。

向发酵罐内流加培养基(以玉米皮水解液为碳源，总还原糖浓度为60g/L，其中葡萄糖25g/L、木糖22g/L、阿拉伯糖13g/L)的稀释速度为0.1h^-1，同时将纳滤回收的还原糖浓缩液经超滤处理后直接返回发酵罐内，控制稀释速度为0.1h^-1，保持发酵罐内体积恒定。整个连续发酵过程持续40h，丁二酸生产强度为2.55g/L·h，与加入钙镁盐中和的批式发酵相比提高59％，丁二酸质量收率达0.71g/g还原糖，提高了9.2％。

表3不同pH对纳滤分离回收葡萄糖的影响

pH	总糖截留率(％)	丁二酸截留率(％)	甲酸截留率(％)	乙酸截留率(％)	膜渗透通量(L/m2h)	脱色率(％)
							3.0	93.5	2.5	2.3	0.5	30.3	88
3.5	93.2	3.7	4.4	1.0	26.7	85
							4.0	91.6	4.4	4.8	3.8	15.8	86
4.5	83.9	9.1	6.3	4.4	10.2	83

Claims (10)

1.一种发酵与膜分离单元耦合制备丁二酸的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

(1)制备产丁二酸菌株的发酵种子；

(2)制备发酵培养基；

(3)将发酵培养基装入发酵罐，再将发酵种子接入发酵罐；

(4)前期厌氧发酵生产丁二酸；

(5)使部分发酵液流出发酵罐，同时流加发酵培养基以保持发酵罐内发酵液体积恒定；

(6)发酵罐内的发酵液继续发酵生产丁二酸；同时流出发酵罐的发酵液先经过微滤或超滤单元，再经过纳滤单元，被微滤或超滤单元截留的菌体细胞与组分返回发酵罐内，被纳滤单元截留的发酵液中未消耗的底物也返回发酵罐，收集纳滤膜渗透液。

2.根据权利要求1所述的发酵与膜分离单元耦合制备丁二酸的方法，其特征在于步骤(1)中所述的产丁二酸菌株为产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes。

3.根据权利要求1所述的发酵与膜分离单元耦合制备丁二酸的方法，其特征在于步骤(1)中所述的制备发酵种子的方法由如下步骤组成：

a、种子培养基的制备：种子培养基为pH 6.0～7.0的含有糖类的能提供碳源、氮源及无机盐的常规液体培养基；斜面培养时，种子培养基内再添加琼脂；其中糖类为葡萄糖、阿拉伯糖、木糖或甘露糖中的一种或多种；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵或氯化铵中的一种或多种，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母膏、玉米浆或牛肉膏中的一种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、锰盐或铁盐中的一种或多种；

b.斜面培养：将产丁二酸菌株在斜面培养基中进行平板划线后，在厌氧培养箱中培养，培养箱通入含有N₂、CO₂和H₂的混合气体，N₂、CO₂和H₂的体积比为8∶1∶1，温度为30～40℃，培养24～48h，用于种子培养基接种和菌株保存；

c.发酵种子培养：每100mL血清瓶中种子培养基的用量为20～80mL，通入含有N₂、CO₂的混合气体，N₂、CO₂的体积比为4∶1，115～121℃灭菌15～30min，冷却后接入产丁二酸菌种，培养温度为30～40℃，转速100～200r/min，发酵时间为10～14h，作为发酵种子。

4.根据权利要求1所述的发酵与膜分离单元耦合制备丁二酸的方法，其特征在于步骤(2)所述的发酵培养基为pH 6.0～7.0的含有糖类的能提供碳源、氮源及无机盐的常规液体培养基，并添加维生素；其中糖类为葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖或生物质水解糖液中的一种或多种；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵或氯化铵中的一种或多种，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母膏、玉米浆或牛肉膏中的一种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、锰盐或铁盐中的一种或多种；维生素为叶酸、生物素、维生素B₁₂、硫辛酸、烟酸、泛酸、硫胺素或维生素B₆中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的发酵与膜分离单元耦合制备丁二酸的方法，其特征在于步骤(3)中，每5L发酵罐中发酵培养基体积为2～4L，丁二酸发酵种子的接种体积占培养基体积的3～7％。

6.根据权利要求1所述的发酵与膜分离单元耦合制备丁二酸的方法，其特征在于步骤(4)所述的厌氧发酵生产丁二酸的方法为：温度35～40℃，发酵罐通入CO₂气体，通气量为0.75～1.5L/min，搅拌转速100～300rpm，发酵过程采用碳酸钠、氨水、氢氧化钠、硫酸或盐酸，控制体系的pH在6.0～7.5，进行前期厌氧发酵10～15h。

7.根据权利要求1所述的发酵与膜分离单元耦合制备丁二酸的方法，其特征在于步骤(5)采用半连续方式，每隔4～6h，将40～67％的发酵液分离出发酵罐，同时向发酵罐内补充发酵培养基，保持发酵罐内发酵液体积恒定。

8.根据权利要求1所述的发酵与膜分离单元耦合制备丁二酸的方法，其特征在于步骤(5)采用连续方式，以0.1～0.8h^-1的稀释速度流加发酵培养基，同时排出发酵液，保持发酵罐内发酵液体积恒定。

9.根据权利要求1所述的发酵与膜分离单元耦合制备丁二酸的方法，其特征在于步骤(6)微滤或超滤单元中，所使用的微滤膜孔径为0.1～0.2μm，超滤膜的截留分子量为8000～100000道尔顿，其膜组件形式为中空纤维式或管式膜，其膜材质为有机膜或无机陶瓷膜；纳滤单元中，纳滤膜的截留分子量为100～200道尔顿，采用卷式纳滤膜组件。

10.根据权利要求1所述的发酵与膜分离单元耦合制备丁二酸的方法，其特征在于步骤(6)中，发酵液在流出微滤或超滤单元之后，先用硫酸或盐酸调节pH值至3.0～4.5；然后进入纳滤单元，操作压力为7～20bar，温度为10～30℃；当发酵液中的糖被纳滤浓缩至糖浓度为30～60g/L，且甲酸、乙酸浓度均低于2g/L，丁二酸浓度低于5g/L时，停止纳滤；将截留的纳滤浓缩液用氢氧化钠调节pH值至6.0～6.5，再经截留分子量为10000道尔顿的超滤膜过滤后直接返回至发酵罐内。

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