CN102836465A - 一种注射用丝素蛋白透明质酸复合凝胶及其制备与应用 - Google Patents
一种注射用丝素蛋白透明质酸复合凝胶及其制备与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102836465A CN102836465A CN2012103149470A CN201210314947A CN102836465A CN 102836465 A CN102836465 A CN 102836465A CN 2012103149470 A CN2012103149470 A CN 2012103149470A CN 201210314947 A CN201210314947 A CN 201210314947A CN 102836465 A CN102836465 A CN 102836465A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hyaluronic acid
- silk fibroin
- composite gel
- hyaluronate
- injection
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 title claims abstract description 115
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 title claims abstract description 106
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 title claims abstract description 105
- 239000002131 composite material Substances 0.000 title claims abstract description 37
- 238000002347 injection Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 239000007924 injection Substances 0.000 title claims abstract description 34
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 39
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 34
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims abstract description 22
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims abstract description 21
- WCDDVEOXEIYWFB-VXORFPGASA-N (2s,3s,4r,5r,6r)-3-[(2s,3r,5s,6r)-3-acetamido-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-4,5,6-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O WCDDVEOXEIYWFB-VXORFPGASA-N 0.000 claims abstract description 20
- 229940014041 hyaluronate Drugs 0.000 claims abstract description 17
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000011049 filling Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims abstract description 11
- 108010022355 Fibroins Proteins 0.000 claims description 129
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 31
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 19
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 17
- YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N sodium;(2s,3s,4s,5r,6r)-6-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2-[(2s,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2- Chemical compound [Na+].CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N 0.000 claims description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 claims description 11
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 11
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 10
- AMXOYNBUYSYVKV-UHFFFAOYSA-M lithium bromide Chemical compound [Li+].[Br-] AMXOYNBUYSYVKV-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 229920002385 Sodium hyaluronate Polymers 0.000 claims description 8
- 229940010747 sodium hyaluronate Drugs 0.000 claims description 8
- HPILSDOMLLYBQF-UHFFFAOYSA-N 2-[1-(oxiran-2-ylmethoxy)butoxymethyl]oxirane Chemical compound C1OC1COC(CCC)OCC1CO1 HPILSDOMLLYBQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 6
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 6
- AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N divinyl sulfone Chemical compound C=CS(=O)(=O)C=C AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000012065 filter cake Substances 0.000 claims description 5
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- UWFRVQVNYNPBEF-UHFFFAOYSA-N 1-(2,4-dimethylphenyl)propan-1-one Chemical compound CCC(=O)C1=CC=C(C)C=C1C UWFRVQVNYNPBEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- AOBIOSPNXBMOAT-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(oxiran-2-ylmethoxy)ethoxymethyl]oxirane Chemical compound C1OC1COCCOCC1CO1 AOBIOSPNXBMOAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 4
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 claims description 4
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 claims description 4
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000011591 potassium Substances 0.000 claims description 4
- 239000008213 purified water Substances 0.000 claims description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims 1
- 238000001879 gelation Methods 0.000 claims 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 claims 1
- 239000012465 retentate Substances 0.000 claims 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 claims 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 claims 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 abstract description 9
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 abstract description 7
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 abstract description 4
- 239000007863 gel particle Substances 0.000 abstract description 4
- 238000000053 physical method Methods 0.000 abstract description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 abstract description 2
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 abstract 1
- 238000005461 lubrication Methods 0.000 abstract 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 25
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 23
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N aldehydo-D-glucuronic acid Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 12
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 12
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 9
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 9
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 8
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 235000011121 sodium hydroxide Nutrition 0.000 description 5
- UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 9H-carbazole Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=CC=C3NC2=C1 UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 4
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 4
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 4
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 4
- 239000000385 dialysis solution Substances 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 4
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 4
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 4
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 4
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 3
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 3
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- YVECGMZCTULTIS-PBXRRBTRSA-N glucal Chemical compound OC[C@H]1OC=C[C@@H](O)[C@@H]1O YVECGMZCTULTIS-PBXRRBTRSA-N 0.000 description 3
- 239000004531 microgranule Substances 0.000 description 3
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- LMYVDPWHMJXPIY-UHFFFAOYSA-N 2-(9h-carbazol-1-yl)ethanol Chemical compound C12=CC=CC=C2NC2=C1C=CC=C2CCO LMYVDPWHMJXPIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 description 2
- UZIWRCBLXLKBID-UHFFFAOYSA-N dodecasodium sulfuric acid tetraborate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-].[O-]B([O-])[O-].[O-]B([O-])[O-].[O-]B([O-])[O-].OS(O)(=O)=O UZIWRCBLXLKBID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 2
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 2
- 239000012779 reinforcing material Substances 0.000 description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 108010001394 Disaccharidases Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010058046 Post procedural complication Diseases 0.000 description 1
- 208000035965 Postoperative Complications Diseases 0.000 description 1
- 108010013296 Sericins Proteins 0.000 description 1
- 208000031737 Tissue Adhesions Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 230000000680 avirulence Effects 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-QIUUJYRFSA-N beta-D-glucuronic acid Chemical compound O[C@@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-QIUUJYRFSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000000589 cicatrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000000205 computational method Methods 0.000 description 1
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 208000018999 crinkle Diseases 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000003467 diminishing effect Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- -1 form Chemical class 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- KIUKXJAPPMFGSW-MNSSHETKSA-N hyaluronan Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)C1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H](C(O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-MNSSHETKSA-N 0.000 description 1
- 229940099552 hyaluronan Drugs 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000007493 shaping process Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001550 time effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Cosmetics (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
本发明公开了一种注射用丝素蛋白透明质酸复合凝胶及其制备与应用，所述复合凝胶由如下质量配比的原料组成：丝素蛋白微球1份，透明质酸盐1~50份和交联剂0.08~4份；本发明与传统透明质酸单纯交联的凝胶相比，丝素蛋白颗粒的加入，有效的减缓了复合凝胶的降解速度，延长其在组织修补，填充的作用时间，提高了材料的有效性，HA的加入，增加了材料的吸水性，提高材料的润滑度和储水功能；本发明与单纯物理方法混合丝素蛋白颗粒和HA颗粒相比，由于丝素蛋白颗粒是包裹在HA凝胶颗粒中的，两者混合更加均匀，制备的凝胶颗粒炎症反应小，生物相容性好，提高了材料的安全性。
Description
（一）技术领域
本发明涉及医用美容填充材料，特别涉及一种注射用丝素蛋白透明质酸复合凝胶及制备方法和在软组织填充材料中的应用。
（二）背景技术
目前在组织修补、组织增强中，非手术治疗的增长迅速，所占比例已经超过了80%；由于局部注射属于微创治疗方法，只需将某些药物和化学制剂注入结构松弛的软组织局部，改善局部松弛程度，提高局部耐受压力的能力，从而使该组织恢复其正常功能或外观。
随着科学技术的不断发展，组织填充材料也越来越多，根据其成分和生物学特征可以将它们分为生物材料类和细胞注射产品类。
采用细胞注射是极具应用前景的治疗方法，细胞可以合成并分泌细胞外基质，能促进胶原蛋白分子的合成，恢复缺损组织。但由于细胞产品多为液态，注射到局部组织后难以控制其分布，不能塑型，影响组织修补、增强的效果。
已报道的用于组织修补、增强类的生物材料已有很多，其中透明质酸较为突出。透明质酸是β-D-N乙酰氨基葡萄糖和β-D-葡萄糖醛酸相互结合的直链状高分子多糖，由于不具有种属及脏器特异性。透明质酸有特殊的流体力学性能，这使它具有高度粘弹性、可塑性、渗透性和良好的生物相容性。它还具有防止组织粘连，大大减少手术后并发症，同时，有促进创伤愈合，减少疤痕的优点。当植入到人体内之后，不引起异体排斥反应和过敏反应。
天然的外源性的透明质酸分子量大约在10万~500万Dalton，在体内的存留时间大约在3~15天左右，很大程度上限制了其在某些领域的应用。
专利CN1590444A采用透明质酸（HA）与交联剂（BDDE）用适当比例反应2-24小时，形成透明质酸凝胶。单一的透明质酸凝胶作为软组织填充材料，过一段时间就会因代谢而分解吸收，达不到长期填充的目的。
专利CN101502676A采用的方法为，将聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）微球和交联透明质酸凝胶微粒混合。由于PMMA微球的存在，使产品在肌体组织中的存留具有持久性。然而由于PMMA是一种高分子聚合物，会对局部组织产生异物刺激，生物相容性相对较差。
研究表明，蚕丝由约75%的丝素和约25%的丝胶所组成，它是蚕在绢丝腺内分泌出来的天然蛋白质，由18种氨基酸组成，主要由重复的Gly-Ala-Gly-Ala-Ser多胎单元组成，与人体胶原蛋白有一定的相似。它无毒性、无刺激性，是一种降解缓慢，且相对稳定的生物材料，被广泛用于生物材料学科、组织工程及药物释放等领域。
有研究者采用超声诱导或聚合物静电作用等方法制备丝素蛋白—透明质酸复合凝胶。与单纯的透明质酸凝胶相比，大大延长了凝胶的降解时间。然采用上述方法制备的复合凝胶，仅靠单纯丝素蛋白，或丝素蛋白和透明质酸之间的物理作用，透明质酸含量较少，复合凝胶的吸水性较差。
因此，寻找一种制备丝素蛋白和透明质酸复合凝胶的方法，能够使材料具良好生物相容性，且兼具良好的吸水性、缓慢的降解速度。故探寻一种兼具良好生物相容性、吸水性、体内保留时间长的丝素蛋白和透明质酸复合材料，能够长期有效的组织修补、增强材料，成为本发明的出发点。
（三）发明内容
本发明目的是克服上述已有技术的不足，采用制备透明质酸、丝素蛋白复合材料的方法，提供一种兼具良好生物相容性、力学性能及良好的吸水性，能够长期有效的组织修补、增强材料。
本发明采用的技术方案是：
一种注射用丝素蛋白透明质酸复合凝胶，所述复合凝胶由如下质量配比的原料组成：丝素蛋白微球1份，透明质酸盐1~50份和交联剂0.08~4份；所述丝素蛋白微球是将质量浓度5%的丝素蛋白溶液在25℃下静置凝胶后，在24000rpm/min条件下均质5min，过筛，收集过200~325目筛的丝素蛋白微球；所述交联剂为二乙烯基砜或二缩水甘油醚类化合物，优选为二乙烯基砜、乙二醇二缩水甘油醚、丁二醇二缩水甘油醚或聚丙二醇二缩水甘油醚中的一种或两种以上任意比例的混合，最优选丁二醇二缩水甘油醚。
所述透明质酸盐优选为透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸镁中的一种或两种以上任意比例的混合，更优选为透明质酸钠。
进一步，所述复合凝胶由如下质量配比的原料组成：丝素蛋白微球1份，透明质酸盐10~30份和交联剂0.8~2.4份。
更进一步，所述复合凝胶由如下质量配比的原料组成：丝素蛋白微球1份，透明质酸盐30份和交联剂2.4份。
更进一步，所述复合凝胶由如下质量配比的原料组成：丝素蛋白微球1份，透明质酸盐20份和交联剂1.6份。
更进一步，所述复合凝胶由如下质量配比的原料组成：丝素蛋白微球1份，透明质酸盐10份和交联剂0.8份。
进一步，本发明所述注射用丝素蛋白透明质酸复合凝胶的制备方法为：（1）丝素蛋白微球的制备：将桑蚕蚕丝加入到质量浓度0.2%的碳酸钠水溶液中，96~100℃水浴60min，过滤，取滤饼重复水浴操作3次，取最后一次过滤的滤饼干燥后用9mol/L的溴化锂水溶液溶解，在60℃水浴6h，然后在8000rpm条件下离心5min，收集上清液，用截留分子量（MW）为8000~14000的透析袋在室温下进行透析，以纯化水为透析液，磁力搅拌透析3天，取截留液用水配制成质量浓度5%的丝素蛋白溶液（取一定量所述的截留液在80℃烘箱中干燥4h至恒重，计算出截留液的含水量，进而将截留液用水配制成质量浓度5%的丝素蛋白溶液）；将质量浓度5%的丝素蛋白溶液在25℃下静置凝胶后，在24000rpm/min条件下均质5min，过筛，收集过200~325目筛的丝素蛋白微粒；所述碳酸钠水溶液的体积用量以桑蚕蚕丝质量计为67.5~125ml/g（优选67.5ml/g），所述溴化锂水溶液的体积用量以桑蚕蚕丝质量计为5~6.25ml/g；（2）注射用丝素蛋白透明质酸复合凝胶的制备：将配方量的透明质酸盐用质量浓度1%的氢氧化钠水溶液配制成0.1g/ml的透明质酸盐溶液，然后将配方量的丝素蛋白微粒加入到上述透明质酸盐溶液中充分混匀，再加入配方量交联剂混匀，25~60℃条件下静置2~8h，形成丝素蛋白透明质酸复合凝胶材料，将丝素蛋白透明质酸复合凝胶材料置于截留分子量（MW）8000~14000的透析袋中，以pH为7.4的PBS缓冲液为透析液进行透析处理，取透析处理后的复合凝胶材料（即截留液）在24000rpm/min条件下均质5~15min，过60目筛，收集粒径为60目筛的颗粒即为所述注射用丝素蛋白透明质酸复合凝胶；所述透明质酸盐为透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸镁中的一种或两种以上任意比例的混合，优选透明质酸钠，所述交联剂为二乙烯基砜、乙二醇二缩水甘油醚、丁二醇二缩水甘油醚或聚丙二醇二缩水甘油醚中的一种或两种以上任意比例的混合，优选丁二醇二缩水甘油醚。
进一步，步骤（2）加入交联剂混匀后，优选在30~40℃条件下静置。
进一步，步骤（2）加入交联剂混匀后，优选在4~6h条件下静置。
本发明提供所述注射用丝素蛋白透明质酸复合凝胶在软组织填充材料中的应用，它具有粒径均一，易于注射、与单纯的HA注射凝胶相比，存留时间长等优点。
所述软组织填充材料是指面部除皱等微整形填充材料。
丝素蛋白微球的平均粒径范围为1~120μm，优选20~100μm，更优选50~75μm，由于丝素蛋白微球在溶液中为白色，不透明，因此，本发明复合凝胶外观呈现乳白色。
与现有技术相比，本发明所述的丝素蛋白透明质酸复合凝胶具有以下显著优点：
1)本发明与传统透明质酸单纯交联的凝胶相比，丝素蛋白透明质酸复合凝胶体外抗酶解能力显著提高，体外抗酶解试验证明，在相同酶液，相同时间作用下，丝素蛋白透明质酸复合凝胶内的透明质酸的体外抗酶解能力随着丝素蛋白颗粒的增加而增加，由此可以发现，丝素蛋白颗粒的加入，有效的减缓了复合凝胶的降解速度，延长其在组织修补，填充的作用时间，提高了材料的有效性；
2)本发明与单纯丝素蛋白颗粒材料相比，HA的加入，增加了材料的吸水性，提高材料的润滑度和储水功能，可显著增加材料的填充效果；
3)本发明与单纯物理方法混合丝素蛋白颗粒和HA颗粒相比，由于丝素蛋白颗粒是包裹在HA凝胶颗粒中的，两者混合更加均匀，SD大鼠体内试验证明，丝素蛋白透明质酸复合凝胶和单纯的透明质酸交联凝胶一样，炎症反应小，生物相容性好，这提高了材料的安全性。
（四）附图说明
图1葡萄糖醛酸标准曲线；
图2丝素蛋白透明质酸复合凝胶体外抗降解能力：样本1为实施例1制备的丝素蛋白透明质酸复合凝胶，样本2为实施例2制备的丝素蛋白透明质酸复合凝胶，样本3为实施例3制备的丝素蛋白透明质酸复合凝胶；
图3丝素蛋白透明质酸复合凝胶在体内植入两周后的组织切片显微图，A为实施例1制备的丝素蛋白透明质酸复合凝胶在体内植入两周后的组织切片显微图，B为实施例1制备的丝素蛋白透明质酸复合凝胶在体内植入八周后的组织切片显微图；
图4丝素蛋白透明质酸复合凝胶及透明质酸凝胶在体内植入两周后的组织切片显微图，A~D为实施例1~4制备丝素蛋白透明质酸复合凝胶和透明质酸凝胶体内植入两周的HE染色图片，E为对照样本（PBS）体内植入两周后的HE染色图片。
（五）具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：丝素蛋白透明质酸复合凝胶
（1）丝素蛋白微球的制备：40g桑蚕蚕丝加入到2700ml质量浓度0.2%的碳酸钠水溶液中，96~100℃水浴60min，过滤，取滤饼重复水浴3次，取最后一次过滤的滤饼在60℃烘干后用9mol/L的溴化锂水溶液200ml缓慢溶解，在60℃水浴6h，然后8000rpm离心5min，取上清，将离心处理后的上清液装入透析袋（MW8,000~14,000），以纯化水为透析液，磁力搅拌透析三天，取截留液，并用纯化水配制成质量浓度为5%的丝素蛋白溶液。
在25℃条件下，将上述5%丝素蛋白溶液静置形成白色凝胶材料5g，将凝胶材料用均质机（T25，IKA）在24000rpm/min条件下均质5min后，得到直径大小不同的丝素蛋白凝胶颗粒5g，过滤，收集过200目筛的丝素蛋白颗粒3.5g，称取少量收集的丝素蛋白颗粒干燥至恒重确定丝素蛋白颗粒的含水量，并确定丝素蛋白颗粒质量浓度为3.23%。
（2）丝素蛋白透明质酸复合凝胶：将0.7g透明质酸钠溶解在7ml质量浓度1%氢氧化钠溶液中制成0.1g/ml透明质酸钠溶液，并向透明质酸钠溶液中加入步骤（1）获得的丝素蛋白颗粒0.712g（0.023/0.0323=0.712g，丝素蛋白颗粒干重为0.023g），充分混合后加入56μl（0.056g）的BDDE（1,4-丁二醇二缩水甘油醚），混合均匀后，置于40℃条件下静置4小时进行交联，即可形成丝素蛋白-HA复合凝胶材料。
将上述丝素蛋白-HA复合凝胶材料加入到MW8,000-14,000的透析袋中，以pH值为7.4的PBS缓冲液为透析液，在磁力搅拌下进行透析处理，将透析处理后的复合凝胶材料用均质机在24000rpm/min条件下均质10min后，置于注射器内挤压使凝胶通过60目筛，收集复合凝胶颗粒，120℃高温高压蒸汽灭菌15min后，进行无菌分装，装入一次性注射器中。即得到注射用的丝素蛋白透明质酸复合凝胶35g，可用作皮下注射产品。取丝素蛋白透明质酸复合凝胶用蒸馏水作等质量比稀释（配比见表1所示），混合均匀后，室温（25℃）静置半小时，测量溶液的pH值，每个样本重复三次，并取平均值作为样本的pH值，结果见表1所示。
实施例2丝素蛋白透明质酸复合凝胶
（1）根据实施例1步骤（1）所述的方法，制备过200目筛的丝素蛋白颗粒3.5g，质量浓度为3.23%。
（2）将0.7g透明质酸钠溶解在7ml质量浓度1%氢氧化钠溶液中制成0.1g/ml透明质酸钠溶液，并向透明质酸溶液中加入步骤（1）获得的丝素蛋白颗粒1.0836g（0.035/0.0323=1.0836g），充分混合后加入56μl的BDDE，混合均匀后，置于40℃条件下静置6小时进行交联，形成丝素蛋白透明质酸复合凝胶材料。
将上述丝素蛋白透明质酸复合凝胶材料进行透析处理，其它操作同实施例1，得到注射用的丝素蛋白透明质酸复合凝胶35g，可用作组织填充注射产品。取丝素蛋白透明质酸复合凝胶用蒸馏水作等质量比稀释（配比见表1所示），混合均匀后，室温（25℃）静置半小时，测量溶液的pH值，每个样本重复三次，并取平均值作为样本的pH值，结果见表1所示。
实施例3：丝素蛋白透明质酸复合凝胶
（1）根据实施例1步骤（1）所述的方法，制备过200目筛的丝素蛋白颗粒3.5g，质量浓度为3.23%。
（2）将0.7g透明质酸钠溶解在7ml质量浓度1%氢氧化钠溶液中制成0.1g/ml的透明质酸钠溶液，并向透明质酸钠溶液中加入2.167g（0.07/0.0323=2.167g）丝素蛋白颗粒，充分混合后加入56μl的BDDE，混合均匀后，置于40℃条件下静置5小时进行交联，形成丝素蛋白透明质酸复合凝胶材料。
将丝素蛋白透明质酸复合凝胶材料进行透析处理，其它操作同实施例1，得到注射用的丝素蛋白透明质酸复合凝胶35g，可用作皮下填充注射产品。取丝素蛋白透明质酸复合凝胶用蒸馏水作等质量比稀释（配比见表1所示），混合均匀后，室温（25℃）静置半小时，测量溶液的pH值，每个样本重复三次，并取平均值作为样本的pH值，结果见表1所示。
实施例4：透明质酸凝胶的制备
将0.7g透明质酸钠溶解在7ml质量浓度1%氢氧化钠溶液中制成0.1g/ml的透明质酸钠溶液，充分混合后加入56μl BDDE，混合均匀后，置于40℃条件下静置5小时进行交联，即可得到透明质酸凝胶。
将透明质酸凝胶进行透析处理后，其它操作同实施例1，即得到注射用的透明质酸凝胶35g。取丝素蛋白透明质酸复合凝胶用蒸馏水作等质量比稀释（配比见表1所示），混合均匀后，室温（25℃）静置半小时，测量溶液的pH值，每个样本重复三次，并取平均值作为样本的pH值，结果见表1所示。
表1丝素蛋白透明质酸复合凝胶pH值
表1可以看出，实施例1~4所制备的丝素蛋白透明质酸复合凝胶、透明质酸凝胶的pH值均在7.4。
实施例5：体外抗降解能力试验
交联透明质酸经过酶解后，会分解成葡萄糖醛酸，葡萄糖醛酸与咔唑试剂作用产生红紫色，颜色的深浅与葡萄糖醛酸的含量成正比。可以通过吸光值确定葡萄糖醛酸的含量。
通过考察不同比例丝素蛋白加入量制成的丝素蛋白透明质酸复合凝胶中，葡萄糖醛酸含量的多少，来判断复合凝胶的体外抗酶解能力，从而判断复合凝胶及单纯透明质酸交联凝胶的体外抗酶解能力。
具体实施方案如下：
把实施例1~3制备的丝素蛋白透明质酸复合凝胶进行体外抗降解能力的测定。
（1）标准曲线的绘制
用水配制70、60、50、40、30μg/ml的葡萄糖醛酸标准液，取0.5ml标准液置于试管中，以0.5ml蒸馏水作为对照。将标准管及对照管一起置于冰水浴（0℃）中，用玻璃移液管缓慢地向每管中分别加入四硼酸钠硫酸2.5ml，边加边摇匀（注意，需要充分混匀），置于沸水浴中煮沸20min后取出，冷却至室温（可以冰浴，加速冷却）。各试管中加入0.1%的咔唑乙醇液（称取0.1g咔唑，加无水乙醇100ml溶液）0.1ml，充分混匀后，置于室温放置2h，分别用分光光度计测定530nm处各样品液的吸光值。根据标准液浓度和吸光值绘制葡萄糖醛酸标准曲线（拟合度大于等于0.995），见图1所示，曲线方程为y=0.0384x+0.1383，R2=0.9981。
（2）分别取实施例1~3制备的丝素蛋白透明质酸复合凝胶0.5g，分别加入300U/ml透明质酸酶液2ml（透明质酸酶的活力为838U/mg，sigma），37℃保温降解65h，再分别用pH值为7.4的PBS缓冲液将上述反应液定容至10ml，各取1ml定容后的反应液加入无水乙醇4ml，在10000r/min离心15min，分别取上清液2ml加pH值为7.4的PBS缓冲液3ml，作为样品液，平行对照一组。
分别取0.5ml样品液置于试管中，以0.5ml蒸馏水作为对照。将样品管及对照管一起置于冰水浴中，用玻璃移液管缓慢地向每管中分别加入四硼酸钠硫酸2.5ml，边加边摇匀（注意，需要充分混匀），置于沸水浴中煮沸20min后取出，冷却至室温（可以冰浴，加速冷却）。各试管中加入质量浓度0.1%的咔唑乙醇液0.1ml，充分混匀后，置于室温放置2h，用分光光度计测定530nm处样品液的吸光值。丝素蛋白透明质酸复合凝胶中透明质酸钠降解后释放出葡萄糖醛酸，降解的越多形成的葡萄糖醛酸就越多，根据葡萄糖醛酸标准曲线的线性回归方程，查得样品液的葡萄糖醛酸浓度，进而获得丝素蛋白透明质酸复合凝胶体外抗降解能力，结果如表2和图2所示。透明质酸酶酶解情况计算方法为：
CS—线性回归得出的稀释样品中的葡萄糖醛酸的均浓度（ug/ml）；Ws-称量凝胶的重量（1g=1ml）；
401.3=双糖的分子量；
194.1=D-葡萄糖醛酸的分子量；
N=稀释倍数；
可以看出，随着丝素蛋白加入量的不断增加，凝胶的抗酶解能力增加，体外保持的时间增加。
表2丝素蛋白透明质酸复合凝胶体外抗降解能力
| 样本 | 葡萄糖醛酸浓度 | 透明质酸酶酶解 |
| 实施例1 | 56.76ug/ml | 29.34mg/ml |
| 实施例2 | 37.24ug/ml | 19.25mg/ml |
| 实施例3 | 22.31ug/ml | 11.53mg/ml |
实施例6：细胞毒性试验
细胞毒性试验是为了考察丝素蛋白透明质酸复合凝胶的安全性。
具体实施方案如下：
细胞培养液终浓度组成为：10%FBS，90%H-DMEM，溶剂为超纯水，pH值为7.0~7.2。
试验细胞为L929成纤维细胞，试验用细胞为传代48h-72h生长旺盛的细胞。
（1）将实施例1~3制备的丝素蛋白透明质酸复合凝胶和实施例4制备的透明质酸凝胶用细胞培养液配制成1mg/ml的混合液，分别置于37±1℃下浸提24±2h，离心，取浸提液（上清液）。
（2）用细胞培养液配制1×104个/ml L929（购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心）细胞悬液，分注于96孔培养板内，设空白对照、阳性对照和试验组，每组至少6孔，每孔接100μL。置于含5%（V/V）二氧化碳空气的，37℃的培养箱内培养24h。24h后弃去原培养基，空白对照组加入新鲜细胞培养液，阳性对照组加入阳性对照溶液，即二甲基亚砜（DMSO），试验组加入步骤（1）配制的浸提液，每孔100μL，放入上述的培养环境中保持72h。
（3）在步骤（2）培养板的每孔加入20μL质量浓度为5g/L的MTT溶液，继续在相同条件下培养4h，吸去原液，加入150μL/孔的二甲基亚砜（DMSO）。震荡10min，在酶标仪（infinite200，Tecan）上测试570nm波长处的吸光度值，并根据公式（1）计算细胞的相对增殖度（RGR），进行细胞毒性的结果评价，结果见表3所示：
RGR(%)=实验组平均吸光度值/空白对照组平均吸光度值公式（1）
表3细胞的相对增殖度
从上述结果中可以看出，四种材料的体外细胞相对增殖度均在90%以上，材料毒性极小或几乎无毒。
实施例7：SD大鼠注入试验
SD大鼠体内试验，可以有效的证明材料的生物相容性，若生物相容性好，组织炎症反应小；反之，生物相容性差，组织炎症反应大。
通过对比丝素蛋白透明质酸复合凝胶和单纯透明质酸交联凝胶体内的炎症反应情况，考察材料的生物相容性。
具体实施案例如下：
麻醉12只200-250g的SD大鼠，把实施例1~3制备的丝素蛋白透明质酸复合凝胶、实施例4制备的透明质酸凝胶以及pH值为7.4的PBS缓冲液（对照）分别注射到SD大鼠皮下，每组3只，皮内给予量为0.5cc，每个动物注射6个点，以脊背为中心线，左右对称，每侧3个点，注射位点之间的间隔为2cm。在2、4、6、8周，每组分别取1只SD大鼠，对各个部位的组织进行取样，制作固定包埋的组织切片，进行HE染色，并在显微镜下观察组织反应，结果见图3和图4所示。
图3中A图为实施例1制备的丝素蛋白透明质酸复合凝胶在体内植入两周后的组织切片显微图，B图为实施例1制备的丝素蛋白透明质酸复合凝胶在体内植入八周后的组织切片显微图，箭头所指位置为凝胶材料与组织的交接位置。图3可以看出，随着时间的推移，植入样本在体内引起的炎症反应在慢慢变小，八周后，几乎没有炎症反应现象。
图4是通过观察四种样本体内植入2周的情况，来考察不同样本的炎症反应情况。其中，A为实施例1样本（丝素蛋白透明质酸复合凝胶）体内植入两周的HE染色图片，B为实施例2样本（丝素蛋白透明质酸复合凝胶）体内植入两周的HE染色图片，C为实施例3样本（丝素蛋白透明质酸复合凝胶）体内植入两周的HE染色图片，D为实施例4样本（透明质酸凝胶）体内植入两周的HE染色图片，E为对照样本（PBS）体内植入两周后的HE染色图片。从图4中可以看出，四组样本跟PBS相比，体内植入会出现一定的炎症反应；A、B、C三个样本与D相比，炎症反应情况没有明显的差别，并且随着丝素蛋白浓度不断增加（从A到C丝素蛋白的加入量为透明质酸钠质量的1/30，1/20，1/10），材料的生物相容性并未明显改变，故丝素蛋白的加入，并不会影响材料的生物相容性。
Claims (10)
1.一种注射用丝素蛋白透明质酸复合凝胶，其特征在于所述复合凝胶由如下质量配比的原料组成：丝素蛋白微球1份，透明质酸盐1~50份和交联剂0.08~4份；所述丝素蛋白微球是将质量浓度5%的丝素蛋白溶液在25℃下静置凝胶后，在24000rpm/min条件下均质5min，过筛，收集过200~325目筛的丝素蛋白微球；所述交联剂为二乙烯基砜、乙二醇二缩水甘油醚、丁二醇二缩水甘油醚或聚丙二醇二缩水甘油醚中的一种或两种以上任意比例的混合。
2.如权利要求1所述注射用丝素蛋白透明质酸复合凝胶，其特征在于所述透明质酸盐为透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸镁中的一种或两种以上任意比例的混合。
3.如权利要求1所述注射用丝素蛋白透明质酸复合凝胶，其特征在于所述复合凝胶由如下质量配比的原料组成：丝素蛋白微球1份，透明质酸盐10~30份和交联剂0.8~2.4份。
4.如权利要求1所述注射用丝素蛋白透明质酸复合凝胶，其特征在于所述复合凝胶由如下质量配比的原料组成：丝素蛋白微球1份，透明质酸盐30份和交联剂2.4份。
5.如权利要求1所述注射用丝素蛋白透明质酸复合凝胶，其特征在于所述复合凝胶由如下质量配比的原料组成：丝素蛋白微球1份，透明质酸盐20份和交联剂1.6份。
6.如权利要求1所述注射用丝素蛋白透明质酸复合凝胶，其特征在于所述复合凝胶由如下质量配比的原料组成：丝素蛋白微球1份，透明质酸盐10份和交联剂0.8份。
7.如权利要求1所述注射用丝素蛋白透明质酸复合凝胶的制备方法，其特征在于所述方法为：（1）丝素蛋白微球的制备：将桑蚕蚕丝加入到质量浓度0.2%的碳酸钠水溶液中，96~100℃水浴60min，过滤，取滤饼重复水浴操作3次，取最后一次过滤的滤饼干燥后用9mol/L的溴化锂水溶液溶解，在60℃水浴6h，然后在8000rpm的条件下离心5min，收集上清液，用截留分子量为8000~14000的透析袋在室温下进行透析，以纯化水为透析液，磁力搅拌透析3天，取截留液用水配制成质量浓度5%的丝素蛋白溶液；将质量浓度5%的丝素蛋白溶液在25℃下静置凝胶后，在24000rpm/min条件下均质5min，过筛，收集过200~325目筛的丝素蛋白微粒；所述碳酸钠水溶液的体积用量以桑蚕蚕丝质量计为67.5~125ml/g，所述溴化锂水溶液的体积用量以桑蚕蚕丝质量计为5~6.25ml/g；（2）注射用丝素蛋白透明质酸复合凝胶的制备：将配方量的透明质酸盐用质量浓度1%的氢氧化钠水溶液配制成0.1g/ml的透明质酸盐溶液，然后将配方量的丝素蛋白微粒加入到上述透明质酸盐溶液中充分混匀，再加入配方量交联剂混匀，25~60℃条件下静置2~8h，形成丝素蛋白透明质酸复合凝胶材料，将丝素蛋白透明质酸复合凝胶材料置于截留分子量为8000~14000的透析袋中，以pH为7.4的PBS缓冲液为透析液进行透析处理，取透析后的复合凝胶材料，在24000rpm/min条件下均质5~15min，过60目筛，收集粒径为60目筛的颗粒即为所述注射用丝素蛋白透明质酸复合凝胶；所述透明质酸盐为透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸镁中的一种或两种以上任意比例的混合，所述交联剂为二乙烯基砜、乙二醇二缩水甘油醚、丁二醇二缩水甘油醚或聚丙二醇二缩水甘油醚中的一种或两种以上任意比例的混合。
8.如权利要求7所述注射用丝素蛋白透明质酸复合凝胶的制备方法，其特征在于步骤（2）所述反应温度为30~40℃。
9.如权利要求7所述注射用丝素蛋白透明质酸复合凝胶的制备方法，其特征在于步骤（2）再加交联剂混匀后在30~40℃条件下静置时间为4~6h。
10.如权利要求1所述注射用丝素蛋白透明质酸复合凝胶在制备软组织填充材料中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210314947.0A CN102836465B (zh) | 2012-08-30 | 2012-08-30 | 一种注射用丝素蛋白透明质酸复合凝胶及其制备与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210314947.0A CN102836465B (zh) | 2012-08-30 | 2012-08-30 | 一种注射用丝素蛋白透明质酸复合凝胶及其制备与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102836465A true CN102836465A (zh) | 2012-12-26 |
| CN102836465B CN102836465B (zh) | 2014-06-04 |
Family
ID=47364361
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210314947.0A Active CN102836465B (zh) | 2012-08-30 | 2012-08-30 | 一种注射用丝素蛋白透明质酸复合凝胶及其制备与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102836465B (zh) |
Cited By (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014176158A1 (en) * | 2013-04-22 | 2014-10-30 | Allergan, Inc. | Cross linked silk-hyaluronic acid composition |
| CN104774337A (zh) * | 2014-08-20 | 2015-07-15 | 江阴市柏御天谷生物医药有限公司 | 注射用含琼脂糖微球交联透明质酸钠凝胶及制备方法 |
| CN105985529A (zh) * | 2015-03-05 | 2016-10-05 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | 一种丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶及其制备方法 |
| CN106492279A (zh) * | 2016-11-04 | 2017-03-15 | 武汉纺织大学 | 一种丝素蛋白‑透明质酸复合凝胶的快速制备方法 |
| CN106589424A (zh) * | 2016-12-12 | 2017-04-26 | 华熙福瑞达生物医药有限公司 | 一种注射用交联透明质酸凝胶及其制备方法 |
| CN106668958A (zh) * | 2017-02-22 | 2017-05-17 | 浙江星月生物科技股份有限公司 | 一种双层防黏连复合膜及其制备方法 |
| CN107118361A (zh) * | 2017-04-21 | 2017-09-01 | 浙江大学 | 一种丝素蛋白/羧甲基壳聚糖复合凝胶及其制备方法 |
| CN107376032A (zh) * | 2017-08-16 | 2017-11-24 | 复旦大学 | 一种膀胱输尿管反流注射治疗用填充剂及其制备方法 |
| US10300169B2 (en) | 2016-08-24 | 2019-05-28 | Allergan, Inc. | Co-crosslinked hyaluronic acid-silk fibroin hydrogels for improving tissue graft viability and for soft tissue augmentation |
| CN109810267A (zh) * | 2019-01-31 | 2019-05-28 | 重庆科技学院 | 一种可实现细胞三维装载的丝素蛋白/透明质酸双网络水凝胶的制备方法 |
| CN110522942A (zh) * | 2019-10-16 | 2019-12-03 | 浙江星月生物科技股份有限公司 | 一种皮肤修护敷料及皮肤修护敷料的制备方法 |
| CN111263646A (zh) * | 2017-06-26 | 2020-06-09 | 自然进化公司 | 基于丝-透明质酸的组织填充物及其使用方法 |
| WO2020132331A1 (en) * | 2018-12-19 | 2020-06-25 | Evolved By Nature, Inc. | Silk-hyaluronic acid tissue fillers and methods of making and using the same |
| CN112402364A (zh) * | 2020-10-23 | 2021-02-26 | 中科细胞科技(广州)有限公司 | 一种注射用的含脐带间充质干细胞-富含血小板血浆的复合修复凝胶 |
| CN112587721A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-04-02 | 广州益诚生物科技有限公司 | 一种注射填充材料及制备工艺 |
| CN113877001A (zh) * | 2021-09-27 | 2022-01-04 | 广州益诚生物科技有限公司 | 一种注射用丝素蛋白复合凝胶 |
| CN114288389A (zh) * | 2021-12-07 | 2022-04-08 | 尚诚怡美(成都)生物科技有限公司 | 一种抗酶解胶原蛋白复合物及其应用 |
| CN114917410A (zh) * | 2022-07-19 | 2022-08-19 | 媄典(北京)生物科技有限公司 | 石榴式凝胶球及其制备方法 |
| CN115246938A (zh) * | 2020-12-18 | 2022-10-28 | 兰州理工大学 | 具有中药多糖活性的丝素蛋白水凝胶、及其制备方法和应用 |
| WO2022262012A1 (zh) * | 2021-06-15 | 2022-12-22 | 一种化学交联透明质酸水凝胶及其制备方法与应用 | 一种化学交联透明质酸水凝胶及其制备方法与应用 |
| CN115612124A (zh) * | 2022-10-31 | 2023-01-17 | 徐州医科大学 | 一种包含bmp2模拟肽和sdf-1的可注射透明质酸水凝胶的制备方法 |
| US11660372B2 (en) | 2017-06-26 | 2023-05-30 | Evolved By Nature, Inc. | Silk-hyaluronic acid based tissue fillers and methods of using the same |
| CN117018269A (zh) * | 2023-08-15 | 2023-11-10 | 苏州大学 | 一种仿贻贝多功能丝素蛋白基粘合剂及其制备方法与应用 |
| CN117599247A (zh) * | 2023-12-14 | 2024-02-27 | 浙江来益美生物医药有限公司 | 丝素蛋白微载体皮肤填充制剂及其制备方法和应用 |
| CN119751919A (zh) * | 2024-12-20 | 2025-04-04 | 浙江星月生物科技股份有限公司 | 一种丝素蛋白/透明质酸钠复合微球凝胶及其制备方法和应用 |
| CN120617619A (zh) * | 2025-06-24 | 2025-09-12 | 北京新力妍生物科技有限公司 | 一种丝素蛋白凝胶及其制备方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010036992A2 (en) * | 2008-09-26 | 2010-04-01 | Trustees Of Tufts College | Active silk muco-adhesives, silk electrogelation process, and devices |
| CN102120833A (zh) * | 2011-01-10 | 2011-07-13 | 深圳市资福药业有限公司 | 一种透明质酸盐凝胶颗粒及其制备方法 |
| CN102188712A (zh) * | 2010-03-04 | 2011-09-21 | 上海其胜生物制剂有限公司 | 一种可注射用凝胶微粒的制备方法 |
| CN102552974A (zh) * | 2012-02-17 | 2012-07-11 | 上海白衣缘生物工程有限公司 | 皮肤注射填充用凝胶组合物及其制备 |
-
2012
- 2012-08-30 CN CN201210314947.0A patent/CN102836465B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010036992A2 (en) * | 2008-09-26 | 2010-04-01 | Trustees Of Tufts College | Active silk muco-adhesives, silk electrogelation process, and devices |
| CN102188712A (zh) * | 2010-03-04 | 2011-09-21 | 上海其胜生物制剂有限公司 | 一种可注射用凝胶微粒的制备方法 |
| CN102120833A (zh) * | 2011-01-10 | 2011-07-13 | 深圳市资福药业有限公司 | 一种透明质酸盐凝胶颗粒及其制备方法 |
| CN102552974A (zh) * | 2012-02-17 | 2012-07-11 | 上海白衣缘生物工程有限公司 | 皮肤注射填充用凝胶组合物及其制备 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| XIAO HU等: "Biomaterials from Ultrasonication-Induced Silk Fibroin-Hyaluronic Acid Hydrogels", 《BIOMACROMOLECULES》, vol. 11, no. 11, 13 October 2010 (2010-10-13) * |
| 王艳果等: "交联透明质酸钠凝胶的制备工艺研究", 《化工技术与开发》, vol. 40, no. 9, 30 September 2011 (2011-09-30) * |
| 邓春闽等: "再生丝素蛋白水凝胶", 《现代丝绸科学与技术》, no. 6, 30 June 2012 (2012-06-30) * |
Cited By (46)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014176158A1 (en) * | 2013-04-22 | 2014-10-30 | Allergan, Inc. | Cross linked silk-hyaluronic acid composition |
| US10758470B2 (en) | 2013-04-22 | 2020-09-01 | Allergan, Inc. | Cross linked silk-hyaluronic acid composition |
| US10154951B2 (en) | 2013-04-22 | 2018-12-18 | Allergan, Inc. | Cross linked silk-hyaluronic acid composition |
| AU2014257319B2 (en) * | 2013-04-22 | 2018-01-04 | Allergan, Inc. | Cross linked silk-hyaluronic acid composition |
| CN104774337B (zh) * | 2014-08-20 | 2017-08-29 | 江阴市柏御天谷生物医药有限公司 | 注射用含琼脂糖微球交联透明质酸钠凝胶及制备方法 |
| CN104774337A (zh) * | 2014-08-20 | 2015-07-15 | 江阴市柏御天谷生物医药有限公司 | 注射用含琼脂糖微球交联透明质酸钠凝胶及制备方法 |
| CN105985529A (zh) * | 2015-03-05 | 2016-10-05 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | 一种丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶及其制备方法 |
| CN105985529B (zh) * | 2015-03-05 | 2020-11-10 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | 一种丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶及其制备方法 |
| US10744227B2 (en) | 2016-08-24 | 2020-08-18 | Allergan, Inc. | Co-crosslinked hyaluronic acid-silk fibroin hydrogels for improving tissue graft viability and for soft tissue augmentation |
| US10300169B2 (en) | 2016-08-24 | 2019-05-28 | Allergan, Inc. | Co-crosslinked hyaluronic acid-silk fibroin hydrogels for improving tissue graft viability and for soft tissue augmentation |
| CN106492279A (zh) * | 2016-11-04 | 2017-03-15 | 武汉纺织大学 | 一种丝素蛋白‑透明质酸复合凝胶的快速制备方法 |
| CN106589424A (zh) * | 2016-12-12 | 2017-04-26 | 华熙福瑞达生物医药有限公司 | 一种注射用交联透明质酸凝胶及其制备方法 |
| CN106668958A (zh) * | 2017-02-22 | 2017-05-17 | 浙江星月生物科技股份有限公司 | 一种双层防黏连复合膜及其制备方法 |
| CN107118361A (zh) * | 2017-04-21 | 2017-09-01 | 浙江大学 | 一种丝素蛋白/羧甲基壳聚糖复合凝胶及其制备方法 |
| CN107118361B (zh) * | 2017-04-21 | 2020-04-28 | 浙江大学 | 一种丝素蛋白/羧甲基壳聚糖复合凝胶及其制备方法 |
| EP3645063A4 (en) * | 2017-06-26 | 2021-04-14 | Evolved by Nature, Inc. | SILK HYALURONIC ACID TISSUE FILLERS AND METHOD OF USING THEREOF |
| CN111263646A (zh) * | 2017-06-26 | 2020-06-09 | 自然进化公司 | 基于丝-透明质酸的组织填充物及其使用方法 |
| EP4169539A1 (en) * | 2017-06-26 | 2023-04-26 | Evolved by Nature, Inc. | Silk-hyaluronic acid based tissue fillers and methods of using the same |
| IL271692B2 (en) * | 2017-06-26 | 2023-06-01 | Evolved By Nature Inc | Tissue fillers based on hyaluronic acid and silk and methods of using them |
| US20230190997A1 (en) * | 2017-06-26 | 2023-06-22 | Evolved By Nature, Inc. | Silk-hyaluronic acid based tissue filers and methods of using the same |
| US11660372B2 (en) | 2017-06-26 | 2023-05-30 | Evolved By Nature, Inc. | Silk-hyaluronic acid based tissue fillers and methods of using the same |
| CN107376032A (zh) * | 2017-08-16 | 2017-11-24 | 复旦大学 | 一种膀胱输尿管反流注射治疗用填充剂及其制备方法 |
| US12296067B2 (en) | 2018-12-19 | 2025-05-13 | Evolved By Nature, Inc. | Silk-hyaluronic acid tissue fillers and methods of making and using the same |
| CN113677320A (zh) * | 2018-12-19 | 2021-11-19 | 自然进化公司 | 丝-透明质酸组织填充物及其制备和使用方法 |
| JP2022514349A (ja) * | 2018-12-19 | 2022-02-10 | エボルブド バイ ネイチャー， インコーポレイテッド | 絹－ヒアルロン酸組織フィラー、及びそれを製造及び使用する方法 |
| WO2020132331A1 (en) * | 2018-12-19 | 2020-06-25 | Evolved By Nature, Inc. | Silk-hyaluronic acid tissue fillers and methods of making and using the same |
| CN109810267A (zh) * | 2019-01-31 | 2019-05-28 | 重庆科技学院 | 一种可实现细胞三维装载的丝素蛋白/透明质酸双网络水凝胶的制备方法 |
| CN110522942A (zh) * | 2019-10-16 | 2019-12-03 | 浙江星月生物科技股份有限公司 | 一种皮肤修护敷料及皮肤修护敷料的制备方法 |
| CN112402364B (zh) * | 2020-10-23 | 2023-08-04 | 中科细胞科技(广州)有限公司 | 一种注射用的含脐带间充质干细胞-富含血小板血浆的复合修复凝胶 |
| CN112402364A (zh) * | 2020-10-23 | 2021-02-26 | 中科细胞科技(广州)有限公司 | 一种注射用的含脐带间充质干细胞-富含血小板血浆的复合修复凝胶 |
| CN115246938B (zh) * | 2020-12-18 | 2024-05-03 | 兰州理工大学 | 具有中药多糖活性的丝素蛋白水凝胶、及其制备方法和应用 |
| CN115246938A (zh) * | 2020-12-18 | 2022-10-28 | 兰州理工大学 | 具有中药多糖活性的丝素蛋白水凝胶、及其制备方法和应用 |
| CN112587721A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-04-02 | 广州益诚生物科技有限公司 | 一种注射填充材料及制备工艺 |
| WO2022262012A1 (zh) * | 2021-06-15 | 2022-12-22 | 一种化学交联透明质酸水凝胶及其制备方法与应用 | 一种化学交联透明质酸水凝胶及其制备方法与应用 |
| CN113877001A (zh) * | 2021-09-27 | 2022-01-04 | 广州益诚生物科技有限公司 | 一种注射用丝素蛋白复合凝胶 |
| CN114288389A (zh) * | 2021-12-07 | 2022-04-08 | 尚诚怡美(成都)生物科技有限公司 | 一种抗酶解胶原蛋白复合物及其应用 |
| CN114917410B (zh) * | 2022-07-19 | 2022-09-30 | 媄典(北京)生物科技有限公司 | 石榴式凝胶球及其制备方法 |
| CN114917410A (zh) * | 2022-07-19 | 2022-08-19 | 媄典(北京)生物科技有限公司 | 石榴式凝胶球及其制备方法 |
| CN115612124A (zh) * | 2022-10-31 | 2023-01-17 | 徐州医科大学 | 一种包含bmp2模拟肽和sdf-1的可注射透明质酸水凝胶的制备方法 |
| CN115612124B (zh) * | 2022-10-31 | 2025-06-10 | 徐州医科大学 | 一种包含bmp2模拟肽和sdf-1的可注射透明质酸水凝胶的制备方法 |
| CN117018269A (zh) * | 2023-08-15 | 2023-11-10 | 苏州大学 | 一种仿贻贝多功能丝素蛋白基粘合剂及其制备方法与应用 |
| CN117599247A (zh) * | 2023-12-14 | 2024-02-27 | 浙江来益美生物医药有限公司 | 丝素蛋白微载体皮肤填充制剂及其制备方法和应用 |
| CN117599247B (zh) * | 2023-12-14 | 2024-05-31 | 浙江来益美生物医药有限公司 | 丝素蛋白微载体皮肤填充制剂及其制备方法和应用 |
| CN119751919A (zh) * | 2024-12-20 | 2025-04-04 | 浙江星月生物科技股份有限公司 | 一种丝素蛋白/透明质酸钠复合微球凝胶及其制备方法和应用 |
| CN119751919B (zh) * | 2024-12-20 | 2025-11-25 | 浙江星月生物科技股份有限公司 | 一种丝素蛋白/透明质酸钠复合微球凝胶及其制备方法和应用 |
| CN120617619A (zh) * | 2025-06-24 | 2025-09-12 | 北京新力妍生物科技有限公司 | 一种丝素蛋白凝胶及其制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102836465B (zh) | 2014-06-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102836465B (zh) | 一种注射用丝素蛋白透明质酸复合凝胶及其制备与应用 | |
| He et al. | A novel gene recombinant collagen hemostatic sponge with excellent biocompatibility and hemostatic effect | |
| Dang et al. | Fabrication and evaluation of thermosensitive chitosan/collagen/α, β-glycerophosphate hydrogels for tissue regeneration | |
| CN103230617B (zh) | 一种胶原/壳聚糖微纳纤维复合止血膜材料及其制备方法 | |
| Cai et al. | Multifunctional fish-skin collagen-based hydrogel sealant with dual-dynamic-bond cross-linked for rapid hemostasis and accelerated wound healing | |
| CN103083713A (zh) | 一种无菌聚合创面覆盖物敷料 | |
| CN104086788A (zh) | 一种注射用修饰透明质酸钠凝胶 | |
| Cheng et al. | Chitin/corn stalk pith sponge stimulated hemostasis with erythrocyte absorption, platelet activation, and Ca2+-binding capabilities | |
| CN106589424A (zh) | 一种注射用交联透明质酸凝胶及其制备方法 | |
| Mo et al. | Protamine-grafted carboxymethyl chitosan based hydrogel with adhesive and long-term antibacterial properties for hemostasis and skin wound healing | |
| Zhou et al. | A wet-adhesive carboxymethylated yeast β-glucan sponge with radical scavenging, bacteriostasis and anti-inflammatory functions for rapid hemostasis | |
| CN104857575B (zh) | 丝素蛋白防粘连膜及其制备方法 | |
| CN107029282A (zh) | 一种温敏性医用壳聚糖衍生物制剂及其制备方法 | |
| CN107854729A (zh) | 一种丝素蛋白基自愈合水凝胶及其制备方法 | |
| CN103251980A (zh) | 全氟三丁胺与纤维蛋白水凝胶复合的神经导管制备方法 | |
| CN115429935A (zh) | 一种可注射性的交联硫酸软骨素水凝胶及其制备方法 | |
| WO2026008079A1 (zh) | 一种可控的注射用丝素蛋白细胞外骨架凝胶材料及其制备方法 | |
| Li et al. | A polysaccharide/chitin hydrogel wound dressing from a Periplanattica americana residue: coagulation, antioxidant activity, and wound healing properties | |
| Chen et al. | Preparation, characterization, and potential biomedical application of composite sponges based on collagen from silver carp skin | |
| Guan et al. | Carboxymethyl cellulose-enhanced recombinant human collagen hydrogel promotes hemostasis and wound healing | |
| CN102532564A (zh) | 一种水凝胶及其制备方法 | |
| CN105126153B (zh) | 一种含有凝血酶的复合止血膜及其制备方法 | |
| CN105327389B (zh) | 基于胶原聚集体的絮状抗菌止血材料及其制备方法 | |
| Li et al. | A double network hydrogel dressing enhanced by catechin-loaded mesoporous silica for accelerating wound repair in conjunction with red-light therapy | |
| Yang et al. | Double-alternating injectable multifunctional hydrogel based on chitosan for skin wound repair |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20250208 Address after: Building 2, No. 66 Shicheng East Avenue, Dongcheng Street, Yongkang City, Jinhua City, Zhejiang Province, 321300 Patentee after: SRM Biotechnology (Zhejiang) Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: 311121 2nd Floor, Building 3, No. 9 Haishu Road, Cangqian Street, Yuhang District, Hangzhou City, Zhejiang Province Patentee before: ZHEJIANG XINGYUE BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Country or region before: China |
|
| TR01 | Transfer of patent right |