CN103103126A - 一种微生物耦合培养生产油脂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微生物耦合培养生产油脂的方法，包括：（1）培养自养微藻种子液，并扩大培养至生物量OD值为5.0～10.0，扩大培养微藻种子液的pH值为9～12；（2）培养兼性厌氧细菌种子液，并进行批式流加发酵；（3）在兼性厌氧细菌进行批式流加发酵过程中，在光照式生物反应器内以步骤（1）中制备好的扩大培养微藻种子液为细菌发酵的碱中和剂，控制兼性厌氧细菌发酵过程的pH值范围为6～9，进行两种微生物的耦合培养。本发明方法具有可以提高自养微藻收获量，提高无机碳源利用率，提高微生物油脂含量，简化培养装置等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说涉是一种利用厌氧细菌与自养产油微藻进行耦合培养来获得高细胞收获量同时收获微生物油脂的方法。
背景技术
随着石油资源的日益紧缺、石油价格的不断上涨、油品供需矛盾的日渐凸显及环境污染问题的更加突出，多渠道开发可再生油脂资源成为必然。来自微生物油脂的柴油具有能量密度高、含硫量低、燃烧充分、润滑性好等性能，还具有可再生、易生物降解、储运安全、抗爆性能好等特点，是石化能源的理想替代品。
微藻是含油微生物之一，微藻富含蛋白质、多糖、不饱和脂肪酸等营养成分（如螺旋藻），可用于食品、医药和能源方面；可以大量积累脂肪酸，有些微藻如小球藻，其体内脂肪酸含量可占干重的30％～60％。利用培养微藻来积累油脂资源，已经成为目前利用太阳能开发可再生资源最热门的研究领域。不仅具有巨大的市场潜力，而且具有非凡的社会价值。
微生物发酵油脂的培养与制备方法一般采用酵母菌为发酵菌种（CN200610113582.X），经过常规的微生物培养进行生物量积累，得到含油微生物菌体，进而处理该菌体，得到生物油脂。该技术过程采用单一微生物发酵培养过程，其生物油脂积累在细胞内，细胞收获量是制约油脂收获量的关键因素。
微藻细胞生长方式分一般为光自养和异养碳源两种，光自养过程要消耗CO2，CO2的有效利用吸收，是实现理想培养效果的关键，同时存在补充CO2与光合作用产生O2的解吸、排出的问题。刘建国等“微藻规模培养的管道光生物反应器”（CN200410020978.0）及缪坚人等“一种微藻工业生产用光合生物反应器系统”（CN03128138.9）均采用在光生物反应器系统中加入一种装置方法，来实现CO2的补给，同时也能实现一定的氧解析效果。异养生长过程是利用有机碳源为底物替代自养过程中的CO2来进行微藻生物质的积累，细胞生长速度较快，但细胞内油脂积累水平相对较低。
目前文献中对于兼性厌氧细菌培养生产油脂和自养微藻进行CO2补给和氧解析过程来生产含油微藻生物质以获取油脂等方面都有所涉及，但都是各自进行培养，且自养培养微藻过程中，CO2补充及其固定效率偏低的问题一直得不到很好的解决，为克服目前CO2补给和氧解析效果不够理想、过程繁琐、投资过大等不利因素。还需要对含油微生物培养过程中CO2补给手段进行优化，改善培养系统的碳源供应，优化培养工艺。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种利用兼性厌氧细菌与自养微藻进行种子制备，进而实现耦合培养的方法，本发明方法具有提高自养微藻收获量，提高无机碳源（CO2）的利用率，提高微生物油脂含量，简化培养装置等优点，同时对兼性厌氧细菌的发酵过程影响较小，实现两者同步进行。
本发明微生物耦合培养生产油脂的方法，包括如下内容：
（1）培养自养微藻种子液，并扩大培养至生物量OD值为5.0～10.0，扩大培养微藻种子液的pH值为9～12；
（2）培养兼性厌氧细菌种子液，并进行批式流加发酵；
（3）在兼性厌氧细菌进行批式流加发酵过程中，在光照式生物反应器内以步骤（1）中制备好的扩大培养微藻种子液为细菌发酵的碱中和剂，控制兼性厌氧细菌发酵过程的pH值范围为6～9，进行两种微生物的耦合培养。
本发明方法中，扩大培养的兼性厌氧细菌进行批式流加发酵过程中使用扩大培养的自养微藻培养液为pH中和剂，实现两种微生物的混合培养，混合培养在光照式生物反应器内进行，耦合培养过程中，流加补充兼性厌氧细菌生长代谢所需的有机碳源。
本发明方法中，兼性厌氧细菌包括芽孢杆菌、梭形杆菌、双歧杆菌、乳杆菌或克雷伯氏菌等，有机碳源为葡萄糖、甘油、果糖、淀粉、纤维素水解液等，兼性厌氧细菌的代谢产物，即兼性厌氧细菌发酵产物一般为醇类和/或有机酸等，不同兼性厌氧细菌得到的发酵产物有所不同，根据兼性厌氧细菌的种类不同而有所不同。兼性厌氧细菌种子液培养和扩大培养是本领域技术人员熟知的方法，如采用搅拌式生物反应器，加入培养基和兼性厌氧细菌，在适宜的条件下进行培养。
本发明方法中，自养微藻包括小球藻、葡萄藻、小环藻、硅藻等，自养微藻种子液培养和扩大培养是本领域技术人员熟知的方法，扩大培养采用较高的pH值范围，如pH值为9～12优选为10～11。自养微藻种子液培养和扩大培养可以采用常规的气升式光照生物反应器。
本发明方法中，种子液培养基分别为兼性厌氧细菌培养基和微藻SE培养基。两种微生物分别进行扩大培养时和扩大培养后的耦合培养所用培养基均为混合培养基。混合培养基以兼性厌氧细菌所需基础培养基为基础，同时添加微藻细胞生长所需的无机盐和微量元素（可以按SE培养基的组成添加相关物质）等。混合培养过程分批次或连续补充兼性厌氧细菌发酵过程所需的有机碳源。
本发明方法中，耦合培养一般采用光照生物反应器，耦合培养的条件一般采用与兼性厌氧细菌发酵过程的条件相似的条件，如温度一般为20℃～37℃，pH值一般为6～9，优选为6.5～7.5等。同步混合培养过程中，可以通入氮气或含二氧化碳的气体。混合培养时间一般为1～5天。混合培养体系中溶解氧量（DO）一般低于1mg/L。
本发明方法利用经过扩大培养后的兼性厌氧细菌细胞和微藻细胞进行耦合培养，兼性厌氧细菌细胞与微藻细胞生长条件和所需碳源的不同，互相补充和促进。兼性厌氧细菌发酵过程pH逐渐降低，需要补充碱中和剂来控制发酵系统的pH值，而制备的自养微藻培养液pH值一般在9.0~12.0，可以作为兼性厌氧细菌发酵的pH调节剂，而自养微藻在pH6.0～12.0范围内自身生长均不受影响。微藻生长需要吸收培养液中的二氧化碳，二氧化碳的溶解性与溶液的酸碱性有一定的关系，二氧化碳在碱性溶液中溶解度显著升高，因此在碱性培养基中可以溶解更多的二氧化碳，提高了对二氧化碳的固定效率，有利于微藻的快速生产。在后续共同培养过程中，体系pH值降低，并利用了兼性厌氧细菌发酵过程产生的二氧化碳，该二氧化碳易于利用，有利于提高微藻油脂积累量。
在耦合培养前，两种微生物经过扩大培养，各自均处于生长最佳期，耦合后培养体系除微生物细胞外，其他组成没有变化，对两种微生物的生长影响较小。兼性厌氧细菌细胞发酵后排放的废弃碳源（CO2）成为以pH控制流加入反应器的微藻细胞生长所需碳源，以此来维持系统较平稳的渗透压条件（pH值），通过补充有机碳源保证兼性厌氧细菌细胞不断生长，通过光条件使微藻细胞不断生长，从而实现兼性厌氧细菌细胞与微藻细胞的耦合培养过程。选择适宜种类兼性厌氧细菌细胞和适宜种类微藻细胞，通过控制扩大培养兼性厌氧细菌细胞和微藻细胞的不同生长时期等条件，使两者形成相互竞争性稳定的共同培养体系，并建立起不同细胞间共生的依存关系，实现了含油微藻的高效生长过程，并提高了油脂的累积效果，提高了单一含油微藻培养过程中单位发酵体系内的油脂收获量，从而为微生物油脂的制备奠定了基础。同时耦合培养不会对兼性厌氧细菌细胞的发酵过程造成影响，可以同时获得所需的发酵产物。微藻对发酵过程使用的碳源和发酵产物均具有耐受性，不影响微藻的生长和油脂的积累。
附图说明
图1是本发明一种具体工艺流程示意图。
其中：1-自养微藻种子，2-兼性厌氧细菌种子，3-自养微藻种子液培养反应器，4-兼性厌氧细菌种子液培养反应器，5-自养微藻扩大培养反应器，6-兼性厌氧细菌扩大培养反应器（也即耦合培养反应器），7-碱中和剂（自养微藻培养液）8-兼性细菌批式发酵流加碳源，9-气升气进气口，10-耦合培养尾气出口。
具体实施方式
本发明微生物耦合培养生产油脂的方法，具体包括如下内容：采用搅拌式生物反应器进行兼性厌氧细菌种子液培养，采用光照式生物反应器进行自养微藻种子液培养，搅拌式生物反应器内包括兼性厌氧细菌、细菌发酵培养基，光照式生物反应器内包括微藻藻种和自养培养基。耦合培养之前，两种微生物分别单独进行细胞的扩大培养，扩大培养液培养合格后，将自养微藻培养液作为兼性厌氧细菌培养过程pH控制碱中和剂，对兼性厌氧细菌进行批次流加控制发酵培养，实现兼性厌氧细菌与自养微藻之间的耦合培养过程。其中混合培养基中的有机碳源用于兼性厌氧细菌生长，而兼性厌氧细菌生长所产生的CO2用于微藻生长。耦合培养过程制备好的自养微藻培养液（pH＝9.0～12.0）来实现正常pH控制，并通过温度和通气量等控制实现培养过程。其中耦合培养时有机碳源最优选采用流加方式补充，有机碳源被兼性厌氧细菌利用生长，兼性厌氧细菌发酵后产生较多的二氧化碳，排出细菌体外进入培养系统中，兼性厌氧细菌细胞排出的CO2处于溶解状态，可以立即被系统中的微藻细胞利用，作为微藻细胞生长的碳源供应。
本发明方法中，光生物反应器可以是板式、管式、气升搅拌式等封闭反应器。可以通入氮气或含二氧化碳气体为返混动力。生物反应器的其它操作条件按常规的细菌和微藻培养条件控制。培养体系可以设置二氧化碳和溶解氧量的测定装置，根据需要调整通气量，以获得良好的效果。
本发明方法中，光生物反应器提供pH电极检测，通过外源加入碱性的自我微藻培养液来实现系统pH的控制。兼性厌氧细菌细胞在有机碳源条件下实现快速生长，兼性厌氧细菌细胞消耗有机碳源，生成细菌生物质和各种代谢产物，同时发酵产生的CO2气体排出体外，使培养体系内无机碳源含量增加，微藻细胞利用这些无机碳源进行光合作用，获得微藻细胞自身的生长。同时兼性厌氧细菌细胞发酵使系统的pH值下降，而随着微藻细胞的生长，利用溶解的CO2，使系统的pH值上升，两者互为作用，进一步调节系统的pH处于适应范围。
本发明方法中，混合培养过程温度控制为内部盘管加热方式。
本发明方法中，混合培养过程通入气体为氮气，通入气体量随培养液体积变化而变化，通入气体体积速率与培养系统装液体积比例为0.1 vvm ~1.0 vvm（单位液体体积每分钟通入的单位气体量）。
本发明方法中，兼性厌氧细菌细胞所需的有机碳源可以是甘油、葡萄糖、果糖、淀粉、纤维素水解液等，该有机碳源的加入采用流加补充方式进行，根据培养液样品成份分析，随时检测系统的有机碳源浓度水平，将配置好的有机碳源母液按消耗速度进行流加。
如图1所示，微藻细胞经自养微藻种子液培养反应器3培养至生长达生物量OD＝2.0～10.0，兼性厌氧细菌经兼性厌氧细菌种子液培养反应器4培养至生物量OD＝5.0～15.0，然后将微藻细胞种子液和兼性厌氧细菌种子液分别转入气升搅拌式光生物反应器（自养微藻扩大培养反应器5和兼性厌氧细菌扩大培养反应器6）中进行扩大培养，当兼性厌氧细菌扩大培养反应器6中兼性厌氧细菌开始生长系统pH下降以后，将已经进入指数生长期（OD＝5.0～10.0）的自养微藻扩大培养反应器5中的微藻细胞培养液，加入到兼性厌氧细菌扩大培养反应器6中，此时其pH已超过9.0，可以作为pH中和剂，实现系统的pH控制在6.0～9.0，优选控制为6.5～7.5。在该耦合培养过程中两种微生物细胞处于相同的体系内实现共同生长。
本发明方法中，耦合培养过程有机碳源经过补加泵进行不断补加，维持有机碳源浓度在1.0%~2.0%（质量）范围内。混合培养条件一般为：温度为25℃~35℃；通气量为0.1 vvm ~1.0 vvm，搅拌转速为100 rpm ~400rpm（转/分钟），混合培养时间为24h~120h。
本发明方法中，扩大培养过程中，种子液接种量为扩大培养反应器体积的5%~20%。
方案1（比较例）
将克雷伯氏菌（中国微生物菌种保藏中心CGMCC0798）在300mL摇瓶中进行培养，所用培养基为兼性厌氧细菌甘油培养基，培养20h后得到所需种子液。将培养的兼性厌氧细菌种子液接入10L生物反应器中进行扩大培养，所用培养基为混合培养基，反应器为气升搅拌式，可以实现培养液的返混，反应器为玻璃体，反应器内有温度控制盘管，以及pH、O2和CO2传感器。
兼性厌氧细菌为克雷伯氏肺炎杆菌，其培养基为甘油培养基。
甘油培养基配方（以每升计）：
NH4Cl 5.35 g，KCl 0.75 g，NaH2PO4 1.38 g，Na2SO4 0.28 g，MgCl2·6H2O 0.26 g，CaCl2·H2O 0.02 g，酵母提取物1.0 g，甘油40 g。
SE培养基配方（以每升计）：
| NaNO3 | 0.20g |
| K2HPO4 . 3H2O | 0.07g |
| MgSO4 . 7H2O | 0.07g |
| CaCl2 . 2H2O | 0.03g |
| KH2PO4 | 0.18g |
| NaCl | 0.03 |
| Soil extract （土壤提取液） | 40mL |
| FeCl3·6H2O | 0.01 |
| Fe—EDTA | 1mL |
10L扩大培养反应器培养条件为，采用混合培养基（以甘油培养基为基础，同时按SE培养基组成添加适宜物质）：接种量（V/V）：10%；温度：30℃；通气量（氮气）：0.4 vvm，搅拌转速：200 rpm，时间：120h。
培养5天后终止培养，收集微生物细胞，测干重与油脂含量，得出单位发酵体系微生物油脂的收获量。其中初始甘油培养基有机碳源（甘油）质量为40.0g/L，过程补加有机碳源维持含量为15g/L左右，培养结束时残余甘油含量为5.0g/L。利用液相色谱分析发酵液离心收集菌体后清液中主要产物1,3-丙二醇浓度来确定兼性厌氧菌的发酵水平。
方案2（比较例）
将小球藻（购自中国科学院水生生物研究所藻种库1＃）在摇瓶中进行光自养培养，所用培养基为SE培养基，培养2天后得到所需种子液。将培养好的小球藻种子液接种至10L光生物反应器中进行扩大，接种量为扩大培养反应器体积的10%。反应器为气升搅拌式，可以实现培养液的返混，反应器为玻璃体，设置日光灯源，自动控制设定光的开关时间（每天按12：12小时比例设置），形成小球藻培养过程中光暗过程转换。反应器内有温度控制盘管，以及pH、O2和CO2传感器，扩大培养过程的pH值控制在10～12范围内。10L反应器培养条件同比较例方案1所示。
藻种为普通小球藻，小球藻扩大培养过程的培养基同方案1的混合培养基。
通气采用空气压缩机压缩氮气通入，通入量为4.0L/min。
培养液在既定的光暗周期下（每天按12：12小时的比例确定），培养5天后终止培养，收集微生物细胞，测干重与油脂含量，得到单位发酵体系的油脂收获量。
方案3（实施例1）
克雷伯氏肺炎杆菌种子液培养方法同比较例方案1，小球藻种子液培养条件同比较例方案2，将克雷伯氏肺炎杆菌和小球藻在摇瓶中使用各自培养基进行单独培养，培养得到所需种子液。然后两种微生物分别进行扩大培养，扩大培养的培养基均为方案1中的混合培养基，培养条件同方案1和方案2中微生物发酵培养过程。克雷伯氏肺炎杆菌在批式流加控制发酵过程的pH中和剂采用小球藻细胞培养液，反应器为气升搅拌式，可以实现培养液的返混，反应器为玻璃体，设置日光灯光源，自动控制设定光的开关时间（12：12小时），以pH中和剂加入的小球藻也可以实现继续生长，控制pH在6.5～7.5，并其培养过程中可进行光暗过程转换（按12：12小时比例）。反应器内有温度控制盘管，以及pH、O2和CO2传感器。混合培养基同方案1的混合培养基，同时按方案2补充有机碳源。
混合培养通气采用气体压缩机压缩氮气通入，通入量4.0L/min。培养液在既定的光暗周期下（按每天12：12小时的比例），培养5天后终止培养，收集微生物细胞，测干重与油脂含量，得到单位发酵体系的油脂收获量。利用液相色谱分析发酵液离心收集菌体后清液中产物1,3-丙二醇浓度来确定兼性厌氧菌的发酵水平。
方案4（实施例2）
克雷伯氏肺炎杆菌种子液培养方法同比较例方案1，葡萄藻（购自中国科学院水生生物研究所藻种库357＃）种子液培养条件同比较例方案2，将克雷伯氏肺炎杆菌和葡萄藻在摇瓶中使用各自培养基进行单独培养，培养得到所需种子液。然后两种微生物分别进行扩大培养，培养基均为方案1中涉及的混合培养基，培养条件同方案1和方案2中微生物发酵培养过程。克雷伯氏肺炎杆菌在批式流加控制发酵过程的pH中和剂采用小球藻细胞培养液，反应器为气升搅拌式，可以实现培养液的返混，反应器为玻璃体，设置日光灯光源，自动控制设定光的开关时间（按每天12：12小时的比例），以pH中和剂加入的小球藻也可以实现继续生长，pH值控为6.5～7.5，并其培养过程中可进行光暗过程转换。反应器内有温度控制盘管，以及pH、O2和CO2传感器。混合培养基同方案1的混合培养基，同时按方案2补充有机碳源。
耦合培养通气采用气体压缩机压缩氮气通入，通入量4.0L/min。培养液在既定的光暗周期下（按每天12：12小时的比例），培养5天后终止培养，收集微生物细胞，测干重与油脂含量，得到单位发酵体系的油脂收获量。利用液相色谱分析发酵液离心收集菌体后清液中产物1,3-丙二醇浓度来确定兼性厌氧菌的发酵水平。
上述实施例实验结果如下表1。油脂含量为质量百分含量。
表1 各实施方案的混合培养结果
| 方案 | 微生物干重 | 油脂含量 | 油脂收获量 | 兼性厌氧菌发酵水平 |
| 1 | 7.02g/L | 2.2% | 0.15g/L | 54.2g/L |
| 2 | 5.21g/L | 7.4% | 0.39g/L | - |
| 3 | 16.20g/L | 36.2% | 5.86g/L | 54.7g/L |
| 4 | 16.80g/L | 36.8% | 6.18g/L | 58.6g/L |
从上述数据可以看出，本发明方法（方案3和4）极大地提高了微生物细胞的收获量，油脂含量也得到了提高。因此采用本发明方法，在相同的培养条件下，与微生物单独培养方法相比，将两种微生物先分别经过扩大培养，再把微藻培养液以碱中和剂的形式调节兼性厌氧细菌的发酵过程，实现两种微生物的耦合培养，得到的油脂收获量得到了较大提高。通过这种方式的耦合培养，其单位发酵体系内油脂收获量得到明显提高。同时通过兼性厌氧细菌的发酵水平对比数据可以看出，在微藻细胞存在与否的情况下，克雷伯氏菌进行厌氧发酵生产1,3-丙二醇的水平基本不受影响。说明该发明方法，在实现生物质收集进而获取生物油脂的同时，还可以实现细菌发酵生产其它目标产物，从而提高微生物的利用效率。
Claims (10)
1.一种微生物耦合培养生产油脂的方法，其特征在于包括如下内容：
（1）培养自养微藻种子液，并扩大培养至生物量OD值为5.0～10.0，扩大培养微藻种子液的pH值为9～12；
（2）培养兼性厌氧细菌种子液，并进行批式流加发酵；
（3）在兼性厌氧细菌进行批式流加发酵过程中，在光照式生物反应器内以步骤（1）中制备好的扩大培养微藻种子液为细菌发酵的碱中和剂，控制兼性厌氧细菌发酵过程的pH值范围为6～9，进行两种微生物的耦合培养。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：兼性厌氧细菌包括芽孢杆菌、梭形杆菌、双歧杆菌、乳杆菌或克雷伯氏菌。
3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：耦合培养过程中，流加补充兼性厌氧细菌生长代谢所需的有机碳源，有机碳源为葡萄糖、甘油、果糖、淀粉或纤维素水解液。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：兼性厌氧细菌种子液培养和扩大培养采用搅拌式生物反应器。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：自养微藻为小球藻、葡萄藻、小环藻或硅藻。
6.按照权利要求1或5所述的方法，其特征在于：自养微藻扩大培养pH值为10～11，自养微藻种子液培养和扩大培养可以采用气升式光照生物反应器。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：种子液培养基分别为兼性厌氧细菌培养基和微藻SE培养基。
8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：自养微藻扩大培养和兼性厌氧细菌扩大培养采用混合培养基，耦合培养采用混合培养基。
9.按照权利要求8所述的方法，其特征在于：混合培养基以兼性厌氧细菌所需基础培养基为基础，同时添加微藻细胞生长所需的无机盐和微量元素。
10.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：耦合培养采用光照生物反应器，耦合培养的温度为20℃～37℃，pH值为6～9，混合培养体系中溶解氧量低于1mg/L。
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