CN103333239A - 固相合成胰高血糖素 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胰高血糖素的固相合成方法，所述方法包括步骤：以固相合成树脂为起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有Fmoc保护基团的氨基酸或多肽，获得保护的二十九肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团，用缩合剂进行接肽反应，得保护的二十九肽树脂后，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得胰高血糖素。
Description
技术领域
本发明涉及医药多肽类原料药的化学合成，尤其涉及一种高温下固相合成胰高血糖素。
背景技术
胰高血糖素（glucagon）亦称胰增血糖素或抗胰岛素或胰岛素B。是一种由胰脏胰岛α-细胞分泌的激素，由29个氨基酸组成直链多肽，分子量为3485道尔顿。与胰岛素相对抗，起着增加血糖的作用。于1953年，被分离沉淀而取得结晶。
目前制备胰高血糖素的方法有DNA重组和化学固相合成法。00112488.9公开了一种胰高血糖素的制备工艺，采用废弃的胰岛素钠盐结晶母液为原料，用Zn++沉淀或稀释母液，调pH值上阳离子交换凝胶柱的方法制取胰高血糖素，优点是变废为宝，提高综合经济效益。CN1225126A涉及在基因改造酵母细胞中生产胰高血糖素的一种新方法。
胰高血糖素（glucagon）是一种比较难合成的29肽，目前合成方法都在常温下进行（10-30℃），一个氨基酸的脱保护过程至少需要30分钟，缩合反应需要至少2小时，且多个氨基酸需要重复投料或封端处理，耗时长，产率却低，方法成本高。在高温下进行固相多肽自1989年以来就有报道，但迄今为止报道的篇幅十分有限，且研究也局限在手性杂质或消旋副反应的影响上。商业上推广应用基本没有。伪脯氨酸工艺是比较新颖的Fmoc固相合成方法，可有效减少肽的聚合，降低长肽或困难肽的合成难度。高温法合成胰高血糖素（glucagon）的方法还未见报道。
因此，本领域迫切需要提供一种既能缩短反应时间，同时又能避免副反应发生、产率较高的固相合成胰高血糖素的方法。
发明内容
本发明旨在提供一种胰高血糖素的固相合成方法。
在本发明的第一方面，提供了一种胰高血糖素的固相合成方法，所述方法包括步骤：
以固相合成树脂为起始原料，采用Fmoc/t-Bu固相合成策略依次连接保护氨基酸或多肽，得多肽树脂后，同步进行脱侧链保护基团及切肽，所述多肽合成温度不限于常温下进行，所述Fmoc保护氨基酸为Fmoc保护氨基酸单体或Fmoc保护二肽。
在另一优选例中，所述方法中2-28#胰高血糖素合成在35-80℃下进行。
在另一优选例中，所述方法中2-28#胰高血糖素合成在50-80℃下进行。
在另一优选例中，所述方法中2-28#胰高血糖素合成在60-80℃下进行。
在另一优选例中，所述方法中2-28#胰高血糖素合成在35-59℃和在61-85℃下进行。
在另一优选例中，所述方法中1#胰高血糖素合成在常温下进行；更佳地，1#胰高血糖素合成在15-25℃下进行。
在另一优选例中，可采用伪脯氨酸保护二肽进行氨基酸缩合反应；所述伪脯氨酸二肽可以是Fmoc-Gly-Thr(ψMe,Me Pro),Fmoc-Thr(tBu)-Ser(ψMe,MePro),Fmoc-Tyr(tBu)-Ser(ψMe,MePro),Fmoc-Asp(OtBu)-Ser(ψMe,Me Pro)中的一种或多种。
在另一优选例中，脱去一个Fmoc-保护基团的时间为20秒-4分钟。
在另一优选例中，连续两次脱去Fmoc-保护基团，一次进行20-40秒，一次2-4分钟。
在另一优选例中，所述接肽反应时间为每次5-25分钟。
在另一优选例中，依次连接具有Fmoc保护基团的氨基酸，获得保护的二十九肽树脂，依次包括如下步骤：
(a)装载Fmoc-Thr(tBu)-Wang树脂；
(b)在35-80℃下，用含有DMF的溶液连续两次进行脱保护处理，然后树脂用DMF洗涤；
(c)在35-80℃下在DMF中使用DIC/HOBt进行接肽反应，然后再加入脱保护剂处理，再加入具有Fmoc保护基团的氨基酸，如此重复，获得多肽树脂。
据此，本发明提供了一种既能缩短反应时间，同时又能避免副反应发生、产率较高的固相合成胰高血糖素的方法。
附图说明
图1是实施例1的HPLC图谱。
图2是实施例1的质谱图。
图3是实施例3和固相常温反应分别所获得的胰高血糖素粗品的HPLC检测图谱；
其中A是实施例3的图谱，B是图形常温反应得到的粗肽的图谱。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，惊奇地发现选择适当的溶剂和缩合剂可以在高温下使用较短的时间固相合成胰高血糖素，并且没有通常所认为的高温下会产生的副产物。
具体地，本发明提供的胰高血糖素的固相合成在35-80℃下进行，使用的溶剂是DMF，缩合剂为DIC/HOBt。
本发明中所使用的缩写或英文全称的含义列于下表：
| Fmoc | 9芴甲氧羰基 |
| DMF | N，N-二甲基甲酰胺 |
| MeOH | 甲醇 |
| HOBt | 1－羟基苯并三唑 |
| DIC | N，N′-二异丙基碳二亚胺 |
| Piperidine | 哌啶 |
| Piperazine | 哌嗪 |
| thioanisole | 茴香硫醚 |
| Phenol | 苯酚 |
| EDT | 1,2-乙二硫醇 |
| TFA | 三氟乙酸 |
| TIS | 三异丙基硅烷 |
| MTBE | 甲基叔丁基醚 |
| Boc | 叔丁氧羰基 |
| tBu | 叔丁基，-C(CH3)3 |
| OtBu | -O-C(CH3)3 |
| Trt | 三苯甲基 |
| Pbf | 2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基 |
如本文所用，“固相合成”或“多肽固相合成（solid phase peptide synthesis）”是一种本领域熟知的多肽合成技术，包括但不限于下述方法：将一个氨基被保护的氨基酸共价连接（键合）在固相载体上；在去保护剂存在下，脱掉氨基的保护基，使第一个氨基酸接到固相载体上；然后氨基被封闭（保护）的第二个氨基酸的羧基通过活化，羧基被活化的第二个氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应（缩合）形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽；重复上述肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度；最后脱去氨基的保护基，水解肽链和固相载体之间的酯键（切割），得到合成好的肽。
如本文所用，“胰高血糖素粗品”是指HPLC纯度在40%-70%的胰高血糖素产品。
胰高血糖素的结构式如式Ⅰ所示：
H-His1-Ser2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9
-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Ser16-Arg17-Arg18-Ala19-Gln20-Asp21-Phe I
22-Val23-Gln24-Trp25-Leu26-Met27-Asn28-Thr29-OH
如本文所用，“去保护剂”或“脱保护剂”可以互换使用，都是指可以将连接在氨基酸上的氨基保护剂去除的化学试剂，所述的氨基保护剂可以使本领域熟知的，例如但不限于，Fmoc，Boc；所述的去保护剂可以使本领域熟知的，例如但不限于，以其总体积计，是含有15-25v/v％哌啶和0.5-2w/v％1－羟基苯并三唑（HOBt）的DMF溶液。
如本文所用，“缩合剂”、“活化剂”、“活化试剂”或“缩合活化剂”可以互换使用，都是指使一个氨基酸的氨基和另一个氨基酸的羧基缩合形成肽键的化学试剂，在本发明中优选使用DIC/HOBt。
如本文所用，“切割剂”是指将同树脂键合的多肽和树脂分离的化学试剂，可以使本领域熟知的，例如但不限于，含有TFA的弱酸性溶液、HCl溶液，优选含有TFA、TIS和EDT的苯酚水溶液。
如本文所用，“HPLC纯度”是指将制备得到的胰高血糖素产品，经过HPLC检测，根据所得到的色谱图谱，进行面积归一法而得到的如式I所示化合物的峰面积在所有峰面积总和中所占有的百分数。
在本发明的一个实例中，本发明胰高血糖素的固相合成方法包括以下步骤：
第一步，树脂装载：
将Fmoc-Thr(tBu)-wang树脂和一定量的DMF溶剂混合，反应20-40分钟；
第二步，脱保护：
在35-80℃下用含有15-25v/v％哌啶和0.5-2w/v％HOBt的DMF溶液进行脱保护；
第三步，氨基酸缩合
在35-80℃下,将1.0-5.0倍量Fmoc保护氨基酸（1.0-5.0当量相对于Fmoc-Thr(tBu)-wang树脂）、1.0-5.0倍量HOBt、2.0-10.0倍量DIC（2.0-10.0当量相对于Fmoc-Thr(tBu)-wang树脂）和5-10ml/g树脂的DMF溶剂混合，反应8-25分钟，用茚三酮监控反应是否完全；
重复脱保护和氨基酸缩合步骤，按序列使用Fmoc保护氨基酸，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Met-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Tyr(tBu)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Tyr(tBu)-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-His(Trt)-OH；用茚三酮检测，最后用DMF和MEOH洗涤，得到多肽树脂Fmoc-His1(Trt)-Ser2(tBu)-Gln3(Trt)-Gly4-Thr5(tBu)-Phe6-Thr7(tBu)-Ser8(tBu)-Asp9(OtBu)-Tyr10(tBu)-Ser11(tBu)-Lys12(Boc)-Tyr13(tBu)-Leu14-Asp15(OtBu)-Ser16(tBu)-Arg17(Pbf)-Arg18(Pbf)-Ala19-Gln20(Trt)-Asp21(OtBu)-Phe22-Val23-Gln24(Trt)-Trp25(Boc)-Leu26-Met27-Asn28-Thr29(tBu)-树脂；
第四步，切割、沉降：
将多肽用切割液从树脂上切割下来，沉降、过滤、干燥得到胰高血糖素粗品。
在本发明的一个实施例中，上述第二步中连续进行两次脱保护，一次进行20-40秒，一次2-4分钟；更佳地，抽干脱保护液，35-80℃下用DMF洗涤5-8次，用茚三酮检测脱保护效果。
在本发明的一个实施例中，上述第三步中每次连接Fmoc保护氨基酸进行的接肽反应是在35-80℃下,将1.0-5.0倍量Fmoc保护氨基酸、1.0-5.0倍量HOBt、1.0-5.0倍量DIC和5-10ml/g树脂的DMF溶剂混合，反应3-8分钟，再加入1.0-5.0倍量DIC反应5-15分钟，用茚三酮监控反应是否完全，在35-85℃下用DMF、MeOH洗涤树脂。
本发明上述第二、三步在40-80℃下进行，优选在50-80℃下进行，更优选在60-80℃下进行。
在本发明的一个实施例中，上述第四步中用冷却的（20－30℃）TFA/TIS/EDT/水（体积比为30－50∶1.5－3∶1∶1.5－3）作为切割液；上述第四步中用MTBE沉降，并冷却静置结晶；结晶后过滤或离心得到滤饼，并用20－30℃的MTBE洗涤滤饼；更佳地，将得到的多肽粗品进行干燥。
有关茚三酮显色法（Kaiser）、水合茚三酮试验（Ninhydrin test），及其监控方法可以参见文献VIRENDER K.SARIN,et al.“Quantitative Monitoring ofSolid-Phase Peptide Synthesis by the Ninhydrin Reaction”ANALYTICALBIOCHEMISTRY117，147－157（1981）、E.KAISER,et al.“Color Test for Detectionof Free Terminal Amino Groups in the Solid-Phase Synthesis of Peptides”SHORTCOMMUNICATIONS595-598(Received October28,1969)、和THORKILDCHRISTENSEN“A Qualitative Test for Monitoring Coupling Completeness in SolidPhase Peptide Synthesis Using Chloranil”Acta Chemica Scandinavica B33(1979)763-766。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的主要优点在于：
1、本发明提供的高温合成胰高血糖素的方法与常温下反应得到的粗品相比，纯度更高，杂质含量更少。
2、本发明提供的高温合成胰高血糖素的方法在35-80℃下，在常用溶剂中可完成胰高血糖素（glucagon）的合成，反应时间短。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
下述实施例中涉及的HPLC方法如下：
固定相：C8柱柱温35℃
流动相：157mM磷酸二氢钠，2.7ml L-Cystetine水溶液(pH2.6)/乙腈(73:27,v/v)
流速：1.0ml/min
检测波长：210nm
实施例1
合成胰高血糖素粗品Ⅰ
树脂装载：在30ml夹层反应器中加入3.4g Fmoc-Thr(tBu)-Wang树脂，加入40ml DMF搅拌30min,抽掉反应液；
脱保护：在50℃下，用含有1%HOBT/20%piperidine（v/v）的DMF溶液连续两次脱保护，第一次30秒，第二次3min,然后用40mlDMF洗涤6次；
氨基酸缩合：在50℃下，把2.0倍量的Fmoc保护氨基酸(7#和8#氨基酸采用伪脯氨酸Fmoc-Thr(tBu)-Ser(ψMe,Me Pro)，2.0倍量的HOBT溶剂在17ml DMF中，并将上述溶液加入到反应器中，随后加入2.0倍量的DIC，反应5min后，再加入2.0倍量的DIC，再反应10min，抽干，树脂DMF和MeOH洗涤，用茚三酮监控反应过程；末尾氨基酸采用Fmoc-His(Trt)-OH在15℃条件下合成。
切割：配置120ml冷却的TFA/TIS/EDT/水(100ml/5ml/2.5ml/5ml)作为切割液，搅拌回温至25℃±5℃反应2小时。浓缩好的滤液倒入冷却好的甲基叔丁基醚(MTBE)中沉降，冷却静置结晶0.5-1.5小时。过滤或者离心得到滤饼，用冷却的MTBE彻底洗涤滤饼。将粗品多肽转移到真空干燥器中，真空干燥至少24小时。得到5.8g粗品。
粗品检测：纯度检测得到58%，收率为118%，粗品中[D-His]杂质为0.45%。见附图1和2。
实施例2
合成胰高血糖素粗品Ⅱ
树脂装载：在80ml夹层反应器中加入8.34gFmoc-Thr(tBu)-Wang树脂，加入80mlDMF搅拌30min,抽掉反应液。
脱保护：在80℃下，用含有1%HOBT/20%piperidine（v/v）的DMF溶液连续两次脱保护，第一次30秒，第二次3min,然后用80mlDMF洗涤6次。
氨基酸缩合：在80℃下，把Fmoc保护氨基酸（Fmoc-Asn(Trt)-OH），HOBT溶解在35mlDMF中，并将上述溶液加入到反应器中，随后加入DIC，反应5min后，再加入DIC，再反应10min，抽干，树脂用DMF和甲醇洗涤，用茚三酮监控反应过程。重复上述脱保护和氨基酸缩合步骤得到2-28#多肽树脂，4-5#氨基酸采用Fmoc-Gly-Thr(ψMe,Me Pro),。降低温度值常温25C,同样缩合工艺进行1#氨基酸Fmoc-His(Trt)-OH缩合。
切割：配置250ml冷却的TFA/TIS/EDT/水(100ml/5ml/2.5ml/5ml)作为切割液，搅拌回温至25℃±5℃反应2小时。浓缩好的滤液倒入冷却好的甲基叔丁基醚(MTBE)中沉降，冷却静置结晶0.5-1.5小时。过滤或者离心得到滤饼，用冷却的MTBE彻底洗涤滤饼三次。将粗品多肽转移到真空干燥器中，真空干燥至少24小时。
得到12克粗品。粗品纯度达到55%。收率70%。粗品中D-His含量<1.0%。
实施例3
合成胰高血糖素粗品Ⅲ
树脂装载：4.0gFmoc-Thr(tBu)-Wang树脂中加入40mlDMF搅拌30min,抽掉反应液。
脱保护：在35℃下，用含有1%HOBT/20%piperidine（v/v）的DMF溶液连续两次脱保护，第一次30秒，第二次3min,然后用40mlDMF洗涤6次。
氨基酸缩合：在35℃下，加入Fmoc保护氨基酸（Fmoc-Asn(Trt)-OH），HOBT溶剂的lDMF溶液，并将上述溶液加入到反应器中，随后加入DIC，反应5min后，再加入DIC，再反应10min，抽干，树脂用40mlDMF和甲醇洗涤，用茚三酮监控反应过程。重复上述脱保护和氨基酸缩合步骤得到2-28#多肽树脂（7-8#采用Fmoc-Thr(tBu)-Ser(ψMe,Me Pro)。降低温度值常温15C,同样缩合工艺进行1#氨基酸Fmoc-His(Trt)-OH缩合。
切割：配置120ml冷却的TFA/TIS/EDT/水(100ml/5ml/2.5ml/5ml)作为切割液，搅拌回温至25℃±5℃反应2小时。浓缩好的滤液倒入冷却好的甲基叔丁基醚(MTBE)中沉降，冷却静置结晶0.5-1.5小时。过滤或者离心得到滤饼，用冷却的MTBE彻底洗涤滤饼三次。将粗品多肽转移到真空干燥器中，真空干燥至少24小时。
得到6.1粗品。收率73%。粗品纯度达40.5%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。
Claims (10)
1.一种胰高血糖素的固相合成方法，所述方法包括步骤：
以固相合成树脂为起始原料，采用Fmoc/t-Bu固相合成策略依次连接保护氨基酸或多肽，得多肽树脂后，同步进行脱侧链保护基团及切肽，其特征在于，所述多肽合成温度不限于常温下进行，所述Fmoc保护氨基酸为Fmoc保护氨基酸单体或Fmoc保护二肽。
2.如权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述方法中2-28#胰高血糖素合成在35-80℃下进行。
3.如权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述方法中2-28#胰高血糖素合成在50-80℃下进行。
4.如权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述方法中2-28#胰高血糖素合成在60-80℃下进行。
5.如权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述方法中1#胰高血糖素合成在常温下进行；较佳地，1#胰高血糖素合成在15-25℃下进行。
6.如权利要求1所述的合成方法，其特征在于，可采用伪脯氨酸保护二肽进行氨基酸缩合反应；所述伪脯氨酸二肽可以是Fmoc-Gly-Thr(ψMe,Me Pro),Fmoc-Thr(tBu)-Ser(ψMe,MePro),Fmoc-Tyr(tBu)-Ser(ψMe,MePro),Fmoc-Asp(OtBu)-Ser(ψMe,Me Pro)中的一种或多种。
7.如权利要求1所述的合成方法，其特征在于，脱去一个Fmoc-保护基团的时间为20秒-4分钟。
8.如权利要求7所述的合成方法，其特征在于，连续两次脱去Fmoc-保护基团，一次进行20-40秒，一次2-4分钟。
9.如权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述接肽反应时间为每次5-25分钟。
10.如权利要求1所述的合成方法，其特征在于，依次连接具有Fmoc保护基团的氨基酸，获得保护的二十九肽树脂，依次包括如下步骤：
(a)装载Fmoc-Thr(tBu)-Wang树脂；
(b)在35-80℃下，用含有DMF的溶液连续两次进行脱保护处理，然后树脂用DMF洗涤；
(c)在35-80℃下在DMF中使用DIC/HOBt进行接肽反应，然后再加入脱保护剂处理，再加入具有Fmoc保护基团的氨基酸，如此重复，获得多肽树脂。
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