CN108721602A - 一种联合ha促进毛发再生的干细胞新型生发剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种联合HA促进毛发再生的干细胞新型生发剂，其特征在于：包含KGF、PDGF、VEGF、透明质酸溶液，所述KGF、PDGF和VEGF的含量为320μg/ml、120μg/ml和180μg/m，透明质酸溶液的浓度为0.5wt％。本发明采用HA溶液+条件培养基形成的生发剂可有效的改善脂溢性脱发小鼠毛发出油情况，可有效缓解脂溢性脱发和斑秃小鼠体内的激素水平，使其达到正常小鼠的水平，并且通过脱发部位皮肤的病理染色分析可以得出，脂溢性脱发和斑秃小鼠经过新型生发剂的治疗，相比较于未使用新型生发剂的小鼠，其毛囊周围堆积的油脂减少、毛囊数量增多、毛囊结构完整，这为毛发的持续生长提供了必备的营养物质。

Description

一种联合HA促进毛发再生的干细胞新型生发剂

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及生发剂，尤其是一种联合HA促进毛发再生的干细胞新型生发剂。

背景技术

头发脱落的现象叫脱发，正常人的脱发一般每天在50-100根，脱发量和新生头发呈动态平衡，发量基本上不会出现明显的变化。如果头发发量有明显的减少，可考虑为病理性脱发。随着人们生活节奏的日益加快，每个人都处于紧张的工作氛围之中，过度的用脑和身体的疲劳都会引起脱发。据不完全统计，仅在中国就有约1.6亿人饱受脱发的困扰。

目前常见的脱发类型有：脂溢性脱发、物理性脱发、神经性脱发、产后脱发、化学性脱发、斑秃等。脂溢性脱发，又称男性型脱发、雄激素性脱发。这种疾病临床症状多表现为头发密度逐渐减少，头皮油脂分泌过量，头发及头皮油腻感十足，常伴瘙疼、头屑增加等。通常先从前额、头顶及两鬓角开始发病，逐渐蔓延到整个头顶部，脱发区光亮无发，残余的头发干枯细软发黄。

神经性脱发，是精神压力过大时常常出现的脱发现象，在精神压力的作用下，人体立毛肌收缩、头发直立，植物神经或中枢神经机能发生紊乱，毛囊毛乳头发生改变和营养不良，从而导致毛发生长功能移植，毛发进入休止期而出现脱发。

斑秃，是一种自身免疫性非瘢痕斑状脱发，表现为身体任何毛发覆盖区域的毛发呈斑片状脱落，最常见的部位就是头皮。斑秃患者，其毛囊、毛乳头结构逐渐缩小，毛囊结构所处的位置在逐步上移，并且在毛囊周围可见淋巴细胞的浸润，因此目前认为斑秃的发生可能存在自身免疫的发病机制。

近年来，随着人们对脐带间充质干细胞(UC-MSCs)研究的逐渐加深，了解到UC-MSCs可以向多种细胞、组织方向分化。以及在我们前期的研究中也证实了UC-MSCs不仅可以平衡机体的激素水平，还可以有效的提高机体的免疫力。这都取决于UC-MSCs分泌的细胞因子—角蛋白细胞生长因子(KGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、内皮细胞生长因子(VEGF)等细胞生长因子，其均可以参与激素和免疫调控。

透明质酸(HA)，是一种酸性粘多糖。低分子量的HA可以改善皮肤营养代谢，是皮肤肉能、光滑、增加弹性、防止衰老，同时也是良好的透皮吸收促进剂，与其他营养成分配合，可以起到促进营养吸收的效果。

本发明中UC-MSCs分泌的细胞因子如：KGF、PDGF、VEGF等可平衡机体的激素水平，以及有效提高机体的免疫力，最为重要的是其分泌的细胞因子具有趋化性，可显著改善机体各项功能；低分子量的HA可有效的促进皮肤对其他营养成分的吸收；基于他们的优势，有效的将二者结合起来，用于治疗临床常见的脱发症状。

发明内容

本发明提的目的在克服现有技术的不足之处，提供一种联合HA促进毛发再生的干细胞新型生发剂，本发明通过临床志愿者通过对新型生发剂的使用，其脱发部位的毛发得到了再生，并且脱发志愿者的掉发数量减少、头发出油情况得到了缓解，并且志愿者摆脱了头皮屑的困扰。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种联合HA促进毛发再生的干细胞新型生发剂，包含KGF、PDGF、VEGF、透明质酸溶液。

而且，所述KGF、PDGF和VEGF的含量为320μg/ml、120μg/ml和180μg/m。

而且，透明质酸溶液的浓度为0.5wt％。

制备联合HA促进毛发再生的干细胞新型生发剂的方法，步骤如下：

⑴脐带间充质干细胞的分离：获取无菌的脐带组织，无菌条件下剥离脐带组织的外膜和脐带组织内动、静脉，分离出脐带华通氏胶并剪碎至2-3mm3，将剪碎的华通氏胶贴于培养瓶底面，1-4h后向培养瓶内添加适量培养液，培养液采用DMEM/HAM’SF-12+10％FBS；

⑵脐带间充质干细胞的消化、传代，待脐带间充质干细胞长至80％时，采用0.05％的胰蛋白酶+0.02％的EDTA对其进行消化，以10000cells/cm2传至新的培养瓶中，继续培养；

⑶UC-MSCs培养至P3代，待细胞长至70％时用磷酸缓冲液清洗UC-MSCs，将培养UC-MSCs的培养液更换为无血清的DMEM/HAM’SF-12培养基，继续培养72h，收集培养UC-MSCs后的DMEM/HAM’SF-12培养液、1000g离心10min，去除死细胞，作为新型生发剂的原料之一；

⑷对收集到的条件培养基进行蛋白定量检测，确定培养基中KGF、PDGF、VEGF因子的含量，KGF浓度为156.53±56μg/ml、PDGF浓度为76.85±18μg/ml、VEGF浓度为82.73±27μg/ml；

⑸采用低温超速离心的方式对其进行浓缩，超速离心时选用截留3K分子量蛋白的滤网，浓缩后KGF的含量为779.43±23μg/ml、PDGF的含量为289.55±13μg/ml、VEGF的含量为421.51±11μg/ml；

⑹配制HA溶液：采用DMEM/HAM’SF-12培养液溶解分子量为3K的HA，最终配制成浓度为5％的HA溶液；作为新型生发剂原料之一，备用；

⑺采用浓度为0.5％的HA溶解稀释条件培养基，最终制备出新型生发剂，其中新型生发剂中的KGF、PDGF和VEGF的含量为320μg/ml、120μg/ml和180μg/ml。

本发明与现有技术相比的优点和积极效果如下：

1、本发明采用HA溶液+条件培养基形成的生发剂可有效的改善脂溢性脱发小鼠毛发出油情况，可有效缓解脂溢性脱发小鼠体内的激素水平，使其达到正常小鼠的水平，并且通过脱发部位皮肤的病理染色分析可以得出，脂溢性脱发小鼠经过新型生发剂的治疗，相比较于未使用新型生发剂的小鼠，其毛囊周围堆积的油脂减少、毛囊数量增多、毛囊结构完整，这为毛发的持续生长提供了必备的营养物质。

2、本发明中斑秃小鼠经过新型生发剂的治疗，其脱发部位已长出了新的毛发，并且新长出的毛发质地与正常小鼠的毛发无任何差别；而未经过新型生发剂治疗的斑秃小鼠，其脱发部位没有再生出新的毛发；对斑秃小鼠和经过新型生发剂治疗后的斑秃小鼠体内激素水平进行检测，发现经过新型生发剂治疗后的斑秃小鼠，其体内的激素水平与正常小鼠完全一致；病理染色分析斑秃小鼠脱发部位的皮肤组织，发现相比较于未经过新型生发剂治疗的斑秃小鼠，经过新型生发剂治疗的斑秃小鼠其脱发部位皮肤组织中的毛囊数量增多，并且毛囊结构完成，具备毛发再生以及持续为毛发提供营养的条件。

3、本发明通过临床志愿者通过对新型生发剂的使用，其脱发部位的毛发得到了再生，并且脱发志愿者的掉发数量减少、头发出油情况得到了缓解，并且志愿者摆脱了头皮屑的困扰。

附图说明

图1为本发明新型生发剂促进脂溢性脱发动物模型毛发再生照片。

图2为本发明新型生发剂恢复脂溢性脱发动物模型体内激素水平(不同组别C57小鼠体内激素水平)。

图3为本发明新型生发剂重塑脂溢性脱发动物毛囊结构。

图4为本发明新型生发剂促进斑秃动物模型毛发再生照片。

图5为本发明新型生发剂恢复斑秃动物模型体内激素水平(不同组别C3H/HEJ小鼠体内激素水平)。

图6为本发明新型生发剂重塑斑秃动物毛囊结构。

图7为本发明新型生发剂临床试用效果。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本申请作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能依次限定本申请的保护范围。

本发明将收集UC-MSCs分泌的细胞因子，采用低温高速离心的方式浓缩收集的UC-MSCs分泌的细胞因子，定量分析浓缩的细胞因子中KGF、PDGF、VEGF的含量；用分子量为3K，浓度为0.5％的HA溶液稀释浓缩过的UC-MSCs分泌的细胞因子，最终制备出新型生发剂用于治疗脂溢性脱发和斑秃。

应用本发明制备出的新型干细胞生发剂治疗脂溢性和斑秃动物。脂溢性和斑秃动物的脱发部位经过本发明的干细胞生发剂的治疗，脱发部位均长出了新的毛发，并且新生的毛发结构与正常毛发无任何差别。

将本发明的干细胞生发剂应用于临床，治疗脂溢性脱发和斑秃，均取得了显著的效果。相比较传统的毛发再生剂，应用本发明制备出干细胞生发剂无任何毒副作用，并且新生的毛发在停止使用干细胞生发剂后不会再脱落。

一种联合HA促进毛发再生的干细胞新型生发剂，制备方法如下：

⑴脐带间充质干细胞的分离：获取无菌的脐带组织，无菌条件下剥离脐带组织的外膜和脐带组织内动、静脉，分离出脐带华通氏胶并剪碎至2-3mm3，将剪碎的华通氏胶贴于培养瓶底面，1-4h后向培养瓶内添加适量培养液，培养液采用DMEM/HAM’SF-12+10％FBS；

⑵脐带间充质干细胞的消化、传代，待脐带间充质干细胞长至80％时，采用0.05％的胰蛋白酶+0.02％的EDTA对其进行消化，以10000cells/cm²传至新的培养瓶中，继续培养；

⑶UC-MSCs培养至P3代，待细胞长至70％时用磷酸缓冲液清洗UC-MSCs，将培养UC-MSCs的培养液更换为无血清的DMEM/HAM’SF-12培养基，继续培养72h，收集培养UC-MSCs后的DMEM/HAM’SF-12培养液、1000g离心10min，去除死细胞，作为新型生发剂的原料之一(条件培养基)；

⑷对收集到的条件培养基进行BCA蛋白定量，确定培养基中KGF、PDGF、VEGF因子的含量，KGF浓度为156.53±56μg/ml、PDGF浓度为76.85±18μg/ml、VEGF浓度为82.73±27μg/ml；

⑸采用低温超速离心(低温超速离心条件为4℃、4000g、60min)的方式对其进行浓缩，超速离心时选用截留3K分子量蛋白的滤网，浓缩后KGF的含量为779.43±23μg/ml、PDGF的含量为289.55±13μg/ml、VEGF的含量为421.51±11μg/ml；

⑹配制HA溶液：采用DMEM/HAM’SF-12培养液溶解分子量为3K的HA，最终配制成浓度为5％的HA溶液；作为新型生发剂原料之一，备用；

⑺采用浓度为0.5％的HA溶解稀释条件培养基，最终制备出新型生发剂，其中新型生发剂中的KGF、PDGF和VEGF的含量为320μg/ml、120μg/ml和180μg/ml；

⑻采用丙酸睾酮建立脂溢性脱发动物模型，将100μl的5mg/ml的丙酸睾酮注射到C57小鼠背部皮下，两天一次，持续注射30天，随着注射丙酸睾酮时间的延长C57小鼠背部的毛发开始变的稀疏，并且背部皮肤有大量的油脂析出，停止注射丙酸睾酮30天后，受试小鼠背部毛发继续变的稀疏，出油情况依然存在，说明我们采用丙酸睾酮成功建立了脂溢性脱发动物模型；

⑼采用咪喹莫特建立斑秃动物模型，将50mg咪喹莫特涂抹于C3H/HEJ小鼠背部毛发的根部，每天一次，持续涂抹15天，随着涂抹咪喹莫特时间的延长，C3H/HEJ小鼠背部毛发开始脱落，并且C3H./HEJ小鼠的背部皮肤逐渐完全暴露出来，形成了一个直径为1cm的圆形斑秃，停止涂抹咪喹莫特30天后，受试小鼠背部涂抹咪喹莫特的部位依然没有毛发长出，说明我们采用咪喹莫特成功建立了斑秃动物模型；

⑽将DMEM/HAM’SF-12培养基和新型生发剂分别涂抹于脂溢性脱发动物模型背部，每天涂抹一次，一次100μl，持续涂抹30天，每天观察脂溢性脱发动物背部毛发的生长情况；

⑾将DMEM/HAM’SF-12培养基和新型生发剂分别涂抹于斑秃动物模型背部，每天涂抹一次，一次100μl，持续涂抹30天，每天观察斑秃动物背部毛发的生长情况；

⑿分别在涂抹新型生发剂的第0d，15d和30d采集受试动物眼眶静脉丛外周血和背部皮肤组织，进行受试动物体内激素水平和毛囊结构的病理学检测分析，进一步验证新型生发剂对于毛发再生的效果；

⒀将无菌的新型生发剂涂抹于脂溢性和斑秃志愿者脱发部位，定期采集脱发部位的图像，以比较志愿者在使用新型生发剂后毛发的生长情况，进一步验证新型生发剂在临床上的效果。

Claims (4)

1.一种联合HA促进毛发再生的干细胞新型生发剂，其特征在于：包含KGF、PDGF、VEGF、透明质酸溶液。

2.根据权利要求1所述的联合HA促进毛发再生的干细胞新型生发剂，其特征在于：所述KGF、PDGF和VEGF的含量为320μg/ml、120μg/ml和180μg/m。

3.根据权利要求1所述的联合HA促进毛发再生的干细胞新型生发剂，其特征在于：质量分数为3K的透明质酸溶液的浓度为0.5wt％。

4.制备权利要求1-3之一所述的联合HA促进毛发再生的干细胞新型生发剂的方法，其特征在于：步骤如下：

⑴脐带间充质干细胞的分离：获取无菌的脐带组织，无菌条件下剥离脐带组织的外膜和脐带组织内动、静脉，分离出脐带华通氏胶并剪碎至2-3mm3，将剪碎的华通氏胶贴于培养瓶底面，1-4h后向培养瓶内添加适量培养液，培养液采用DMEM/HAM’SF-12+10％FBS；

⑵脐带间充质干细胞的消化、传代，待脐带间充质干细胞长至80％时，采用0.05％的胰蛋白酶+0.02％的EDTA对其进行消化，以10000cells/cm2传至新的培养瓶中，继续培养；

⑶UC-MSCs培养至P3代，待细胞长至70％时用磷酸缓冲液清洗UC-MSCs，将培养UC-MSCs的培养液更换为无血清的DMEM/HAM’SF-12培养基，继续培养72h，收集培养UC-MSCs后的DMEM/HAM’SF-12培养液、1000g离心10min，去除死细胞，作为新型生发剂的原料之一；

⑷对收集到的条件培养基进行蛋白定量检测，确定培养基中KGF、PDGF、VEGF因子的含量，KGF浓度为156.53±56μg/ml、PDGF浓度为76.85±18μg/ml、VEGF浓度为82.73±27μg/ml；

⑸采用低温超速离心的方式对其进行浓缩，超速离心时选用截留3K分子量蛋白的滤网，浓缩后KGF的含量为779.43±23μg/ml、PDGF的含量为289.55±13μg/ml、VEGF的含量为421.51±11μg/ml；

⑹配制HA溶液：采用DMEM/HAM’SF-12培养液溶解分子量为3K的HA，最终配制成浓度为5％的HA溶液；作为新型生发剂原料之一，备用；

⑺采用浓度为0.5％的HA溶解稀释条件培养基，最终制备出新型生发剂，其中新型生发剂中的KGF、PDGF和VEGF的含量为320μg/ml、120μg/ml和180μg/ml。