CN109761994B - 降碳类愈创木烷型倍半萜内酯类化合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种降碳类愈创木烷型倍半萜内酯类化合物及其制备方法，所述降碳类愈创木烷型倍半萜内酯类化合物是从千叶蓍（Achillea millefolium L.）的全草中采用薄层层析法和分析型高效液相色谱法检测分析，用有机溶剂提取，然后通过溶剂萃取法、正相硅胶柱层析法、小孔树脂柱层析法、Sephadex LH‑20凝胶柱层析法、半制备高效液相色谱法中的四种至五种方法进行分离，得到三个新的降碳类愈创木烷型倍半萜内酯类单体化合物，通过高分辨质谱和核磁共振波谱等方法确定三个单体化合物为新的降碳类愈创木烷型倍半萜内酯类化合物，并对其进行了结构鉴定。并进行了抗炎活性测定，结果表明：所述三个新的降碳类愈创木烷型倍半萜内酯类化合物均有不同程度的抗炎活性，可用于制备抗炎药物。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及降碳类愈创木烷型倍半萜内酯类化合物及其制备方法。
背景技术
萜类化合物是天然有机化合物中的一个重要组成部分，它由数个异戊烯首尾相接而成，其中以三个异戊烯构成的为倍半萜。而倍半萜内酯则是基本骨架为三个异戊烯单元构成的内酯化合物。愈创木烷型倍半萜内酯类化合物是自然界存在的一类非常重要的倍半萜，其分子骨架由一个典型的[5,7]并环结构组成，具有多种生物活性，包括抗炎、抗菌、抗肿瘤等。目前自然界中已分离鉴定的愈创木烷型倍半萜已有数百种，其结构之所以丰富，是因为其骨架上常具有各种取代基，如羟基、乙酰氧基、丙酰氧基、异丁酰氧基等。这些取代基在环上的位置不同，数目不同，构型不同，形成了这类化合物结构上的丰富多变性。目前从千叶蓍中已报道得到的化合物有160余个，主要包括酚类、黄酮及其苷、甾醇、单萜、倍半萜、三萜等，其中愈创木烷型倍半萜内酯类共报道了14个。本次研究中的三个新型化合物为千叶蓍中发现的新愈创木烷型倍半萜内酯类化合物，其结构特征在于原有愈创木烷型倍半萜内酯类化合物的3位碳被氧取代，且具有环戊烯酮酯结构，与原有愈创木烷型倍半萜内酯类化合物在骨架上有一定区别。本研究对千叶蓍化学成分的研究，可为明确千叶蓍中次生代谢产物提供参考，也为揭示其药效作用的物质基础提供科学依据。
目前认为，巨噬细胞是哺乳动物硝酸盐的主要来源。巨噬细胞内NO是通过NOS途径合成，其合成能力与抗炎作用密切相关。NO的合成可由干扰素所诱导，然而该诱导过程通常需要第二信号(如脂多糖LPS)的存在。干扰素或第二信号单独作用时，诱导巨噬细胞合成低量的NO并在许多情形下，没有直接的细胞毒性作用，但干扰素和第二信号共同作用可显著提高NO的产生，并增加巨噬细胞的细胞毒性作用。在合成NO的细胞中，以L-精氨酸(L-Arg)和分子氧为底物，在一氧化氮合酶(NOS)和还原型辅酶(NADPH)存在的条件下，生成中间体对羟基L-Arg，后者与O2发生反应，生成等克分子量的NO和L-瓜氨酸，其中NOS是NO生成的最主要限速因子，NADPH、黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)是重要的辅助因子。NO是一种自由基气体，其化学性质非常活泼，能迅速与分子氧、超氧阴离子以及铁、铜、镁等发生反应，氧化生成终末代谢物硝酸盐(NO)和亚硝酸盐(NO)而失活。巨噬细胞中的NOS主要是iNOS，对LPS/IFN-γ激活的RAW264.7细胞研究表明，iNOS不存在于非激活的细胞中，它的活性是细胞浆性的、需要L-Arg和NADPH。
先导化合物的发现是创新药物研究的前提,也是影响创新药物周期的决定性因素。先导化合物的来源有多种途径,从天然产物中寻找有活性的化合物作先导物创制新药是世界药学工作者公认的有效途径之一。本研究旨在对千叶蓍中的倍半萜内酯类成分进行进一步的挖掘研究，以期发现结构新颖且抗炎活性突出的倍半萜内酯类化合物，以天然产物丰富的分子结构为基础构建以天然产物为模板的化合物库，为高通量药物筛选提供大量含有丰富结构多样性的化合物。以化合物库所提供的大量构效关系信息为基础，研究人员可以对药物的药理活性和药代动力学性质进行研究，对结构进行修饰或优化，提供简便有效的合成方法，从而得到药物先导化合物甚至药物本身，进而为抗炎药物的开发提供参考。
发明内容
本发明目的在于，提供一种降碳类愈创木烷型倍半萜内酯类化合物及其制备方法，所述降碳类愈创木烷型倍半萜内酯类化合物是从千叶蓍(Achillea millefolium L.)的全草中采用薄层层析法和分析型高效液相色谱法检测分析，用有机溶剂提取，然后通过溶剂萃取法、正相硅胶柱层析法、小孔树脂柱层析法、Sephadex LH-20凝胶柱层析法、半制备高效液相色谱法中的四种至五种方法进行分离，得到三个新的降碳类愈创木烷型倍半萜内酯类单体化合物，通过高分辨质谱和核磁共振波谱等方法确定三个单体化合物为新的降碳类愈创木烷型倍半萜内酯类化合物，并对其进行了结构鉴定，结果表明：所述三个新的降碳类愈创木烷型倍半萜内酯类化合物均有不同程度的抗炎活性，可用于制备抗炎药物。
本发明所述的一种降碳类愈创木烷型倍半萜内酯类化合物，该化合物的结构式为：
其中：
式(Ⅰ)化合物为(4R,6S,7R,8S,10S,11S)-2-酮-3-氧-10-羟基-8-[(E)-2-甲基-2-丁烯酰氧基]-愈创木-1-烯-12,6-内酯；
式(Ⅱ)化合物为(4R,6S,7R,8S,10S,11S)-2-酮-3-氧-10-羟基-4-甲氧基-8-[(E)-2-甲基-2-丁烯酰氧基]-愈创木-1-烯-12,6-内酯；
式(Ⅲ)化合物为(4R,6S,7R,8S,10S,11S)-2-酮-3-氧-4,10-二羟基-8-[(E)-2-甲基-2-丁烯酰氧基]-愈创木-1-烯-12,6-内酯。
所述的一种降碳类愈创木烷型倍半萜内酯类化合物的制备方法，按下列步骤进行：
a、取千叶蓍全草为原料，粉碎后用5-10倍量体积浓度为50-99％的乙醇水溶液、无水乙醇、纯丙酮、体积浓度为50-99％的甲醇水溶液或无水甲醇进行室温下的渗漉、冷浸提取或加热回流提取，浓缩得到千叶蓍的粗提物；
b、将步骤a得到的粗提物用水分散，依次加入石油醚、正己烷或环己烷，乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷，正丁醇萃取3-5次，将乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷萃取液浓缩，得到乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷萃取物浸膏；
c、将步骤b得到的乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷萃取物浸膏经正相硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、小孔树脂柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、制备高效液相色谱法中的两种或三种进行分离，即得到式(Ⅰ)化合物为(4R,6S,7R,8S,10S,11S)-2-酮-3-氧-10-羟基-8-[(E)-2-甲基-2-丁烯酰氧基]-愈创木-1-烯-12,6-内酯；式(Ⅱ)化合物为(4R,6S,7R,8S,10S,11S)-2-酮-3-氧-10-羟基-4-甲氧基-8-[(E)-2-甲基-2-丁烯酰氧基]-愈创木-1-烯-12,6-内酯和式(Ⅲ)化合物为(4R,6S,7R,8S,10S,11S)-2-酮-3-氧-4,10-二羟基-8-[(E)-2-甲基-2-丁烯酰氧基]-愈创木-1-烯-12,6-内酯。
步骤c中所用正相硅胶柱层析法为常压或加压柱层析，所用填料为正相硅胶，所用洗脱剂为石油醚、环己烷或正己烷，丙酮、三氯甲烷、二氯甲烷或乙酸乙酯，甲醇中至少两种溶剂的混合物，采用等度洗脱或梯度洗脱。
步骤c中所用反相硅胶柱层析法为常压或加压柱层析，洗脱剂为体积浓度为40-99％的甲醇水溶液或30-99％的乙腈水溶液，采用等度洗脱或梯度洗脱。
步骤c中所用Sephadex LH-20凝胶柱层析法为常压柱层析，洗脱剂为甲醇、二氯甲烷、三氯甲烷或至少两种溶剂的混合物，采用等度洗脱或梯度洗脱。
步骤c中所用小孔树脂层析法为常压或加压柱层析，洗脱剂为体积浓度40-99％的甲醇水溶液或30-99％的乙腈水溶液，采用等度洗脱或梯度洗脱。
步骤c中所用制备高效液相色谱法为加压柱层析，洗脱剂为体积浓度40-99％的甲醇水溶液或30-99％的乙腈水溶液，采用等度洗脱或梯度洗脱。
本发明所述的一种降碳类愈创木烷型倍半萜内酯类化合物，可通过从植物中分离纯化得到，也可以经本领域技术人员熟知的化学修饰方法合成获得。
本发明所述的一种降碳类愈创木烷型倍半萜内酯类化合物，采用高分辨质谱、一维和二维核磁共振谱等现代波谱手段确定其结构，结构鉴定过程如下：
式(Ⅰ)化合物为(4R,6S,7R,8S,10S,11S)-2-酮-3-氧-10-羟基-8-[(E)-2-甲基-2-丁烯酰氧基]-愈创木-1-烯-12,6-内酯，白色无定型粉末，
-13.0(c 0.1,MeOH)；UV(MeOH)216nm；ECD(MeOH)201(Δε+18.02)，224(Δε-19.80)nm；通过其高分辨质谱中准分子离子峰[M-H]-m/z 363.1444(计算值为363.1449)确定其分子式为C19H23O7。根据1H，13C NMR以及二维核磁共振数据确定其结构骨架类型为降碳类愈创木烷型倍半萜内酯(Guaianesesquiterpenes)类化合物，命名为(4R,6S,7R,8S,10S,11S)-2-酮-3-氧-10-羟基-8-[(E)-2-甲基-2-丁烯酰氧基]-愈创木-1-烯-12,6-内酯,，其1H和13C NMR归属见表1[600MHz(1H)，150MHz(13C)，CDCl3]。
式(Ⅱ)化合物为(4R,6S,7R,8S,10S,11S)-2-酮-3-氧-10-羟基-4-甲氧基-8-[(E)-2-甲基-2-丁烯酰氧基]-愈创木-1-烯-12,6-内酯，白色无定型粉末，
-5.0(c0.1,MeOH)；UV(MeOH)217nm；ECD(MeOH)210(Δε+26.70)，232(Δε-14.18)，259(Δε+3.80)nm；通过高分辨质谱中准分子离子峰[M-H]-m/z 393.1554(计算值为393.1554)确定其分子式为C20H26O8；根据1H，13C以及二维核磁共振数据确定其结构，骨架类型为降碳类愈创木烷型倍半萜内酯(Guaiane sesquiterpenes)类化合物，命名为(4R,6S,7R,8S,10S,11S)-2-酮-3-氧-10-羟基-4-甲氧基-8-[(E)-2-甲基-2-丁烯酰氧基]-愈创木-1-烯-12,6-内酯；其1H和13CNMR归属见表1[400MHz(1H)，100MHz(13C)，CDCl3]。
式(Ⅲ)化合物为(4R,6S,7R,8S,10S,11S)-2-酮-3-氧-4,10-二羟基-8-[(E)-2-甲基-2-丁烯酰氧基]-愈创木-1-烯-12,6-内酯，白色无定型粉末，[α]D 20-34.0(c 0.1,MeOH)；UV(MeOH)217nm；ECD(MeOH)202(Δε+19.33)，221(Δε-22.02)；通过其高分辨质谱中准分子离子峰[M-H]-379.1393(计算值为379.1398)确定其分子式为C19H24O8；根据1H，13C NMR以及二维核磁共振数据确定其结构，骨架类型为降碳类愈创木烷型倍半萜内酯(Guaianesesquiterpenes)类化合物，命名为(4R,6S,7R,8S,10S,11S)-2-酮-3-氧-4,10-二羟基-8-[(E)-2-甲基-2-丁烯酰氧基]-愈创木-1-烯-12,6-内酯；其1H和13C NMR归属见表1[400MHz(1H)，100MHz(13C)，DMSO-d6]。
表1式(Ⅰ)、式(Ⅱ)、式(Ⅲ)化合物的1H和13C NMR数据[δ(ppm),J(Hz)]
附图说明
图1为本发明式(Ⅰ)化合物的1H NMR(600MHz,CDCl3)谱图；
图2为本发明式(Ⅰ)化合物的13C NMR(150MHz,CDCl3)谱图；
图3为本发明式(Ⅱ)化合物的1H NMR(400MHz,CDCl3)谱图；
图4为本发明式(Ⅱ)化合物的13C NMR(100MHz,CDCl3)谱图；
图5为本发明式(Ⅲ)化合物的1H NMR(400MHz,DMSO-d6)谱图；
图6为本发明式(Ⅲ)化合物的13C NMR(100MHz,DMSO-d6)谱图。
具体实施方式
所用试剂均为分析纯，高效液相色谱中乙腈为高效液相色谱级别(德国默克公司)。柱层析正相硅胶(100-200目，200-300目)：青岛海洋化工厂生产；薄层层析硅胶为HSGF254：烟台市黄务硅胶开发试验厂生产；Sephadex LH-20凝胶：美国通用电气医疗集团生产；小孔树脂小孔树脂凝胶MCI(CHP 20/120)：日本三菱株式会社生产；反相硅胶ODS：德国默克公司生产；高效液相色谱(美国戴安公司)配置如下：P680HPLC泵，ASI-100自动进样器，TCC-100柱温箱，UVD170U紫外检测器(四波长)，四元溶剂系统，在线脱气机，变色龙色谱工作站。制备高效液相色谱(美国戴安公司)配置如下：P680HPLC泵，UVD170U紫外检测器(四波长)，四元溶剂系统，在线脱气机，变色龙色谱工作站。质谱用四极杆-飞行时间杂交质谱仪(美国应用生物系统公司)测定；核磁共振用瓦里安Vnmrs 600/400型核磁共振仪(美国瓦里安公司)测定。
千叶蓍全草采自新疆维吾尔自治区哈密地区，由中国科学院新疆生态地理研究所标本馆冯缨副研究员鉴定为Achillea millefolium L.。
实施例1
a、取千叶蓍全草5kg，粉碎后用50L的浓度为50％的乙醇-水溶液室温下冷浸提取，减压蒸干溶剂得到千叶蓍全草粗提物；
b、将步骤a得到的粗提物用水分散，加入石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次进行萃取3次，合并乙酸乙酯层并减压蒸干得到乙酸乙酯层萃取物浸膏；
c、将步骤b得到的乙酸乙酯层萃取物浸膏用正相硅胶柱分离，用体积比50:1-0:1的石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱，流分经硅胶薄层层析分析，合并相同流分，得9个组分F1-F9；将组分F4经Sephadex LH-20凝胶柱分离，用体积比为1:1的三氯甲烷-甲醇洗脱，得到组分F4A-F4E；将组分F4C经MCI柱分离，以浓度为40％-100％的甲醇-水溶液梯度洗脱，收集60％甲醇-水溶液F4C3，减压蒸干，对F4C3段采用制备反相柱C18,5μm，10×150mm分离，以浓度为50％的乙腈-水溶液等度洗脱，得到式(Ⅰ)化合物为(4R,6S,7R,8S,10S,11S)-2-酮-3-氧-10-羟基-8-[(E)-2-甲基-2-丁烯酰氧基]-愈创木-1-烯-12,6-内酯和式(Ⅱ)化合物为(4R,6S,7R,8S,10S,11S)-2-酮-3-氧-10-羟基-4-甲氧基-8-[(E)-2-甲基-2-丁烯酰氧基]-愈创木-1-烯-12,6-内酯；将组分F5经Sephadex LH-20凝胶柱分离，用体积比为1:1的三氯甲烷-甲醇洗脱，得到组分F5A-F5F；将组分F5B经MCI柱分离，以浓度为50％-100％的甲醇-水溶液梯度洗脱，收集60％甲醇-水溶液F5B2，减压蒸干，对F5B2段采用制备反相柱C18，5μm，10×150mm分离，以浓度为60％的乙腈-水溶液等度洗脱，得到式(Ⅲ)化合物为(4R,6S,7R,8S,10S,11S)-2-酮-3-氧-4,10-二羟基-8-[(E)-2-甲基-2-丁烯酰氧基]-愈创木-1-烯-12,6-内酯。
实施例2
a、取千叶蓍全草5kg，粉碎后用40L浓度为95％的乙醇-水溶液温度80℃下回流提取，减压蒸干溶剂得到千叶蓍全草粗提物；
b、将步骤a得到的粗提物用水分散，依次加入正己烷、二氯甲烷和正丁醇进行萃取4次，合并二氯甲烷层，并减压蒸干得到二氯甲烷萃取物浸膏；
c、将步骤b得到的二氯甲烷萃取物浸膏用正相硅胶柱分离，用体积比100:1-0:1的正己烷-丙酮进行梯度洗脱，流分经硅胶薄层层析分析，合并相同流分，得到9个组分F1-F9；将组分F4经Sephadex LH-20凝胶柱分离，用体积比为1:1的三氯甲烷-甲醇洗脱，得到组分F4A-F4E；将组分F4C经ODS反相柱分离，以浓度为50％-100％的甲醇-水溶液梯度洗脱，收集60％甲醇-水溶液F4C2，减压蒸干，F4C2段采用正相硅胶柱分离，采用体积比为20:1-0:1的正己烷-乙酸乙酯进行梯度洗脱，得到组分F4C2A-F4C2H，对F4C2E段采用制备反相柱C18,5μm，10×150mm分离，以浓度为65％的甲醇-水溶液等度洗脱，得到式(Ⅰ)化合物为(4R,6S,7R,8S,10S,11S)-2-酮-3-氧-10-羟基-8-[(E)-2-甲基-2-丁烯酰氧基]-愈创木-1-烯-12,6-内酯和式(Ⅱ)化合物为(4R,6S,7R,8S,10S,11S)-2-酮-3-氧-10-羟基-4-甲氧基-8-[(E)-2-甲基-2-丁烯酰氧基]-愈创木-1-烯-12,6-内酯；将组分F5经Sephadex LH-20凝胶柱分离，用体积比为1:1的三氯甲烷-甲醇洗脱，得到组分F5A-F5F；将组分F5B经RP-18反相柱柱分离，以浓度为40％-100％的甲醇-水溶液梯度洗脱，收集60％甲醇-水溶液(F5B3)，减压蒸干，对F5B3段采用制备反相柱C18，5μm，10×150mm分离，以浓度为60％的乙腈-水溶液等度洗脱，得到式(Ⅲ)化合物为(4R,6S,7R,8S,10S,11S)-2-酮-3-氧-4,10-二羟基-8-[(E)-2-甲基-2-丁烯酰氧基]-愈创木-1-烯-12,6-内酯。
实施例3
a、取千叶蓍全草5kg，粉碎后用40L的无水乙醇室温下渗漉提取，减压蒸干溶剂得到千叶蓍全草粗提物；
b、将步骤a得到的粗提物用水分散，依次加入环己烷、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取5次，合并乙酸乙酯层并减压蒸干得到乙酸乙酯萃取物浸膏；
c、将步骤b得到的乙酸乙酯萃取物浸膏用正相硅胶柱分离，用体积比50:1-0:1的环己烷-丙酮进行梯度洗脱，流分经硅胶薄层层析分析，合并相同流分，得到9个组分F1-F9；将组分F4经ODS反相柱分离，以浓度为40％-100％的甲醇-水溶液梯度洗脱，收集60％甲醇-水溶液F4B，减压蒸干，F4B段采用正相硅胶柱分离，采用体积比为20:1-0:1的石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱，得到组分F4B1-F4B8，对F4B4段采用制备反相柱C18,5μm，10×250mm分离，以浓度为55％的乙腈-水溶液等度洗脱，得到式(Ⅰ)化合物为(4R,6S,7R,8S,10S,11S)-2-酮-3-氧-10-羟基-8-[(E)-2-甲基-2-丁烯酰氧基]-愈创木-1-烯-12,6-内酯和式(Ⅱ)化合物为(4R,6S,7R,8S,10S,11S)-2-酮-3-氧-10-羟基-4-甲氧基-8-[(E)-2-甲基-2-丁烯酰氧基]-愈创木-1-烯-12,6-内酯；将组分F5进行正相硅胶柱分离，以体积比为100:1-0:1的石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱，得到组分F5A-F5D，将组分F5C经Sephadex LH-20凝胶柱分离，用体积比为1:1的氯仿-甲醇洗脱，得到式(Ⅲ)化合物为(4R,6S,7R,8S,10S,11S)-2-酮-3-氧-4,10-二羟基-8-[(E)-2-甲基-2-丁烯酰氧基]-愈创木-1-烯-12,6-内酯。
实施例4
a、取千叶蓍全草5kg，粉碎后用40L纯丙酮室温下渗漉提取，减压蒸干溶剂千叶蓍全草粗提物；
b、将步骤a得到的粗提物用水分散，依次加入环己烷、二氯甲烷、正丁醇萃取3次，合并二氯甲烷层并减压蒸干得到二氯甲烷萃取物浸膏；
c、将步骤b得到的二氯甲烷萃取物浸膏用正相硅胶柱分离，用体积比100:1-0:1的石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱，流分经硅胶薄层层析分析，合并相同流分，得到9个组分F1-F9；将组分F4进行正相硅胶柱分离，以体积比为100:0-0:100的氯仿-甲醇进行梯度洗脱，得到组分F4A-F4F；将组分F4C经ODS反相柱分离，以浓度为40％-100％的乙腈-水溶液梯度洗脱，收集50％乙腈-水溶液F4C2，减压蒸干，F4C2段采用制备反相柱C18,5μm，10×250mm分离，以浓度为50％的甲醇-水溶液等度洗脱，得到式(Ⅰ)化合物为(4R,6S,7R,8S,10S,11S)-2-酮-3-氧-10-羟基-8-[(E)-2-甲基-2-丁烯酰氧基]-愈创木-1-烯-12,6-内酯和式(Ⅱ)化合物为(4R,6S,7R,8S,10S,11S)-2-酮-3-氧-10-羟基-4-甲氧基-8-[(E)-2-甲基-2-丁烯酰氧基]-愈创木-1-烯-12,6-内酯；将组分F5进行正相硅胶柱分离，以体积比为100:0-0:100的正己烷-乙酸乙酯进行梯度洗脱，得到组分F5A-F5E，将组分F5C经Sephadex LH-20凝胶柱分离，用体积比为1:1的二氯甲烷-甲醇洗脱，得到式(Ⅲ)化合物为(4R,6S,7R,8S,10S,11S)-2-酮-3-氧-4,10-二羟基-8-[(E)-2-甲基-2-丁烯酰氧基]-愈创木-1-烯-12,6-内酯。
实施例5
a、取千叶蓍全草5kg，粉碎后用50L的浓度为50％的甲醇-水溶液温度80℃下回流提取，减压蒸干溶剂得到千叶蓍全草粗提物；
b、将步骤a得到的粗提物用水分散，依次加入正己烷、二氯甲烷、正丁醇萃取4次，合并二氯甲烷层并减压蒸干得到二氯甲烷萃取物浸膏；
c、将步骤b得到的二氯甲烷萃取物浸膏用正相硅胶柱分离，用体积比100:1-0:1的正己烷-乙酸乙酯进行梯度洗脱，流分经硅胶薄层层析分析，合并相同流分，得到9个组分F1-F9；将组分F4进行MCI柱分离，以浓度为30％-100％的乙腈-水溶液梯度洗脱，收集40％的乙腈-水溶液F4B，减压蒸干，F4B段经Sephadex LH-20凝胶柱分离，用体积比为1:1的三氯甲烷-甲醇洗脱，得到组分F4B1-F4B6，对F4B3段采用制备反相柱C18,5μm，10×250mm分离，以浓度为45％的乙腈-水溶液等度洗脱，得到式(Ⅰ)化合物为(4R,6S,7R,8S,10S,11S)-2-酮-3-氧-10-羟基-8-[(E)-2-甲基-2-丁烯酰氧基]-愈创木-1-烯-12,6-内酯和式(Ⅱ)化合物为(4R,6S,7R,8S,10S,11S)-2-酮-3-氧-10-羟基-4-甲氧基-8-[(E)-2-甲基-2-丁烯酰氧基]-愈创木-1-烯-12,6-内酯；将组分F5进行正相硅胶柱分离，以体积比为100:0-0:100的正己烷-丙酮进行梯度洗脱，得到组分F5A-F5E，将组分F5C经Sephadex LH-20凝胶柱分离，用无水甲醇洗脱，得到式(Ⅲ)化合物为(4R,6S,7R,8S,10S,11S)-2-酮-3-氧-4,10-二羟基-8-[(E)-2-甲基-2-丁烯酰氧基]-愈创木-1-烯-12,6-内酯。
实施例6
a、取千叶蓍全草5kg，粉碎后用50L的无水甲醇室温下渗漉提取，减压蒸干溶剂得到千叶蓍全草粗提物；
b、将步骤a得到的粗提物用水分散，依次加入正己烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取5次，合并乙酸乙酯层并减压蒸干得到乙酸乙酯萃取物浸膏；
c、将步骤b得到的乙酸乙酯萃取物浸膏用正相硅胶柱分离，用体积比100:1-0:1的环己烷-乙酸乙酯进行梯度洗脱，流分经硅胶薄层层析分析，合并相同流分，得到9个组分F1-F9；将组分F4进行经Sephadex LH-20凝胶柱分离，用体积比为1:1的三氯甲烷-甲醇洗脱，得到组分F4A-F4E；将组分F4B经ODS反相柱分离，以浓度为40％-100％的乙腈-水溶液梯度洗脱，收集50％乙腈-水溶液F4B2，减压蒸干，对F42K段采用制备反相柱C18,5μm，10×250mm分离，以浓度为55％的甲醇-水溶液等度洗脱，得到式(Ⅰ)化合物为((4R,6S,7R,8S,10S,11S)-2-酮-3-氧-10-羟基-8-[(E)-2-甲基-2-丁烯酰氧基]-愈创木-1-烯-12,6-内酯和式(Ⅱ)化合物为(4R,6S,7R,8S,10S,11S)-2-酮-3-氧-10-羟基-4-甲氧基-8-[(E)-2-甲基-2-丁烯酰氧基]-愈创木-1-烯-12,6-内酯；将组分F5进行正相硅胶柱分离，以体积比为100:0-0:100的石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱，得到组分F5A-F5D，将组分F5B经SephadexLH-20凝胶柱分离，用体积比为1:1的三氯甲烷-甲醇洗脱，得到式(Ⅲ)化合物为(4R,6S,7R,8S,10S,11S)-2-酮-3-氧-4,10-二羟基-8-[(E)-2-甲基-2-丁烯酰氧基]-愈创木-1-烯-12,6-内酯。
实施例7
本发明所述的从千叶蓍全草中分离的倍半萜内酯类化合物在制备抗炎药物中的用途，以巨噬细胞株(RAW264.7细胞)为例；
式(Ⅰ)—式(Ⅲ)化合物的细胞毒测试：
1.筛选模型:
名称：NFkB pathway(抑制剂)；
英文全称：NFkB pathway；
中文全称：NFkB信号途径抑制剂的筛选；
简介：NF-κB是一种转录因子，通过与靶DNA结合，调控多种基因的表达。实验证明，NF-κB在多种癌症细胞中都是高表达。它的高表达与肿瘤发生，血管生成，凋亡等过程都有密切联系；另一方面，NF-κB被证明在肿瘤治疗中是产生抗肿瘤药抗性的重要因素。因此，选择性的，高活性的NF-κB抑制剂在癌症治疗方面有潜在的价值；
2.筛选方法：
Protocol name：NFkB pathway luciferase assay(抑制剂)；
筛选仪器：EnVisionTM，Biomek®；FX；
筛选材料：TNFa，96孔白板(PE)；
筛选过程：50μL混匀后的细胞液加入到96孔筛选板，每孔10000个，过夜培养，加入20ng/mL TNFα50μL,终浓度10ng/mL；1μL取自96孔化合物母板和对照化合物母板的化合物加入96孔筛选板；6小时后，从96孔筛选板中取走80μL液体，再加入20μL底物，避光孵育30分钟后，EnVisionTM检测luciferase信号强度；
3.样品处理：
样品用DMSO溶解，低温保存，DMSO在最终体系中的浓度控制在不影响检测活性的范围之内；
4.数据处理及结果说明：
初筛选择单浓度条件下，例如20μg/mL，对样品的活性进行测试；对于在一定条件下表现出活性的样品，例如抑制率％Inhibition大于50，测试活性剂量依赖关系，即IC50/EC50值，通过样品活性对样品浓度进行非线性拟和得到，计算所用软件为Graphpad Prism4，拟合所使用的模型为sigmoidaldose-response(varible slope)，对于大多数抑制剂筛选模型，将拟合曲线底部和顶部设定为0和100；一般情况下，每个样品在测试中均设置复孔(n≥2)，在结果中以标准偏差(Standard Deviation,SD)或者标准误差(Standard Error,SE)表示；
表2参照化合物以及式(Ⅰ)-式(Ⅲ)化合物细胞毒测试数据
| 样品名称 | 浓度 | 类型 | 单位 | 结果 | 误差 | 备注 |
| PS-341 | IC50 | μM | 0.072 | 0.013 | ||
| 式(Ⅰ) | 20μg/mL | ％Activity | percent | 85.872 | 3.590 | 无毒性 |
| 式(Ⅱ) | 20μg/mL | ％Activity | percent | 67.607 | 6.241 | 无毒性 |
| 式(Ⅲ) | 20μg/mL | ％Activity | percent | 77.198 | 8.723 | 无毒性 |
5.结论:一共有0个化合物表现出一定程度活性；
式(Ⅰ)-式(Ⅲ)化合物抗炎活性测试：
实验材料：
样品准备：
式(Ⅰ)-式(Ⅲ)化合物初始浓度为10mM，依次索取液体0.5μL,2.5μL,5μL，稀释1000，200，100倍，稀释后浓度依次为10μM,50μM,100μM；
实验耗材：
材料与试剂：15mL离心管购自Thermo公司(生产批号：339605)；24孔板购自CORNING公司(生产批号：3524)；NO检测试剂盒购自碧云天公司(生产批号：S0023)；
实验用细胞：RAW264.7细胞，细胞类型为贴壁细胞，培养基为HG-DMEM(添加成分10％血清+1％P/S+1mM N-pyruvate)。
实验步骤：
培养RAW264.7细胞，培养基为HG-DMEM，1:5传代并计数1×105cells/mL接种24孔板；
贴壁6h后，加入化合物预处理细胞1h，后加入LPS(1mg/mL)刺激18h后收取上清60μL；
按照碧云天Griess试剂盒中的要求依次加入以下试剂：
表3
用吸光度值制作标准曲线并计算化合物对NO释放的抑制值；
实验结果：
表4式(Ⅰ)-式(Ⅲ)化合物抗炎活性测试
| 化合物 | 一氧化氮 | 空白组 | LPS(1μg/mL) | 10μM | 50μM | 100μM |
| 编号 | 含量 | (Blank) | 炎症组(Control) | 药物组1 | 药物组2 | 药物组3 |
| 式(Ⅰ) | NO(μmol/L) | 1.12±0.037 | 9.29±0.043 | 8.13±0.223 | 6.52±0.388 | 5.95±0.261 |
| 式(Ⅱ) | NO(μmol/L) | 1.12±0.037 | 9.29±0.043 | 7.17±0.633 | 5.15±0.239 | 5.11±0.872 |
| 式(Ⅲ) | NO(μmol/L) | 1.12±0.037 | 9.29±0.043 | 7.50±0.138 | 5.07±0.037 | 4.86±0.457 |
结论：
本发明所述的3个化合物均能抑制小鼠巨噬细胞的NO释放量，具有抗炎活性，且随着浓度的增加呈现梯度依赖性降低趋势；
式(Ⅰ)化合物的浓度依赖性更好，式(Ⅱ)和式(Ⅲ)化合物的抗NO生成能力更强，50μM即可将NO释放量降低50％左右。
Claims (7)
1.一种降碳类愈创木烷型倍半萜内酯类化合物，其特征在于该化合物的结构式为：
其中：
式(Ⅰ)化合物为(4R,6S,7R,8S,10S,11S)-2-酮-3-氧-10-羟基-8-[(E)-2-甲基-2-丁烯酰氧基]-愈创木-1-烯-12,6-内酯；
式(Ⅱ)化合物为(4R,6S,7R,8S,10S,11S)-2-酮-3-氧-10-羟基-4-甲氧基-8-[(E)-2-甲基-2-丁烯酰氧基]-愈创木-1-烯-12,6-内酯；
式(Ⅲ)化合物为(4R,6S,7R,8S,10S,11S)-2-酮-3-氧-4,10-二羟基-8-[(E)-2-甲基-2-丁烯酰氧基]-愈创木-1-烯-12,6-内酯。
2.根据权利要求1所述的一种降碳类愈创木烷型倍半萜内酯类化合物的制备方法，其特征在于按下列步骤进行：
a、取千叶蓍全草为原料，粉碎后用5-10倍量体积浓度为50-99％的乙醇水溶液、无水乙醇、纯丙酮、体积浓度为50-99％的甲醇水溶液或无水甲醇进行室温下的渗漉、冷浸提取或加热回流提取，浓缩得到千叶蓍的粗提物；
b、将步骤a得到的粗提物用水分散，依次加入石油醚、正己烷或环己烷，乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷，正丁醇萃取3-5次，将乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷萃取液浓缩，得到乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷萃取物浸膏；
c、将步骤b得到的乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷萃取物浸膏经正相硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、小孔树脂层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、制备高效液相色谱法中的两种或三种进行分离，即得到式(Ⅰ)化合物为(4R,6S,7R,8S,10S,11S)-2-酮-3-氧-10-羟基-8-[(E)-2-甲基-2-丁烯酰氧基]-愈创木-1-烯-12,6-内酯；式(Ⅱ)化合物为(4R,6S,7R,8S,10S,11S)-2-酮-3-氧-10-羟基-4-甲氧基-8-[(E)-2-甲基-2-丁烯酰氧基]-愈创木-1-烯-12,6-内酯和式(Ⅲ)化合物为(4R,6S,7R,8S,10S,11S)-2-酮-3-氧-4,10-二羟基-8-[(E)-2-甲基-2-丁烯酰氧基]-愈创木-1-烯-12,6-内酯。
3.根据权利要求2所述的降碳类愈创木烷型倍半萜内酯类化合物的制备方法，其特征在于步骤c中所用正相硅胶柱层析法为常压或加压柱层析，所用填料为正相硅胶，所用洗脱剂为石油醚、环己烷或正己烷，丙酮、三氯甲烷、二氯甲烷或乙酸乙酯，甲醇中至少两种溶剂的混合物，采用等度洗脱或梯度洗脱。
4.根据权利要求2所述的降碳类愈创木烷型倍半萜内酯类化合物的制备方法，其特征在于步骤c中所用反相硅胶柱层析法为常压或加压柱层析，洗脱剂为体积浓度为40-99％的甲醇水溶液或30-99％的乙腈水溶液，采用等度洗脱或梯度洗脱。
5.根据权利要求2所述的降碳类愈创木烷型倍半萜内酯类化合物的制备方法，其特征在于步骤c中所用Sephadex LH-20凝胶柱层析法为常压柱层析，洗脱剂为甲醇、二氯甲烷、三氯甲烷或至少两种溶剂的混合物，采用等度洗脱或梯度洗脱。
6.根据权利要求2所述的降碳类愈创木烷型倍半萜内酯类化合物的制备方法，其特征在于步骤c中所用小孔树脂层析法为常压或加压柱层析，洗脱剂为体积浓度40-99％的甲醇水溶液或30-99％的乙腈水溶液，采用等度洗脱或梯度洗脱。
7.根据权利要求2所述的降碳类愈创木烷型倍半萜内酯类化合物的制备方法，其特征在于步骤c中所用制备高效液相色谱法为加压柱层析，洗脱剂为体积浓度40-99％的甲醇水溶液或30-99％的乙腈水溶液，采用等度洗脱或梯度洗脱。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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