CN111024658A - 一种荧光分子定向定位方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种荧光分子定向定位方法和装置，属于超分辨技术领域，包括：步骤1)，发射两束激光光束，并调节两束激光光束，使两束光在空间上光斑中心重合，在时间上脉冲起始位置重合；步骤2)，将经步骤(1)处理的两束激光光束合为一束光；步骤3)，将合束后的光束投射到样品上并对样品进行扫描，扫描时使两束光在样品上均汇聚成空心光斑；步骤4)，通过探测器阵列接收样品在扫描时发出的信号光，并通过接收到的信号光获取相应扫描位置处的图像，同时获取荧光分子的位置信息；步骤5)，通过偏振探测器阵列接收样品发出信号光的偏振信息，获取荧光分子的偶极子取向信息。

Description

一种荧光分子定向定位方法和装置

技术领域

本发明涉及超分辨技术领域，具体地说，涉及一种荧光分子定向定位方法和装置。

背景技术

早在1926年，荧光的偏振特性(Fluorescence Polarization)就已被发现。进一步的研究显示，这种偏振特性由偶极子取向引起，并与被标记的蛋白的空间方向密切相关，进而可以用于研究活细胞中靶蛋白的结构及其动力学变化。

利用荧光偏振原理，采用竞争结合法机制，常用来监测小分子物质如药物、激素在样本中的含量。以药物检测为例，以荧光素标记的药物和含待测药物的样本为抗原，与一定量的抗体进行竞争性结合。荧光标记的药物在环境中旋转时，偏振荧光的强度与其受激发时分子转动的速度成反比。大分子物质旋转慢，发出的偏振荧光强；小分子物质旋转快，其偏振荧光弱(去偏振现象)。因此，在竞争性结合过程中，样本中待测药物越多，与抗体结合的标志抗原就越少，抗原抗体复合物体积越大，旋转速率越慢，从而激发的荧光偏振光度也就越少。当我们知道了已知浓度的标记抗原与荧光偏振光性的关系后就可以测量未知浓度的物质。因此，这项技术可用来检测环境或食品样品中有毒物质如农药的残留量。

近几十年来，荧光偏振显微技术迅速演进，已经是一种比较成熟的光学成像技术。并且，它还拥有很强的兼容性，可与各种成像技术(如：宽场荧光显微、共聚焦扫描显微、全内反射荧光显微等)相结合。但是，这些技术都会受到衍射极限的限制，空间分辨率和定位精度都较低，无法达到单分子水平。这严重限制了其在生物医学领域的应用范围。

近年来，一种新型的纳米分辨技术——最小光通量显微术(MINFLUX)，采用的暗斑中心定位具有很强的光敏感性，定位单个荧光分子所需的光子数极低，且空间分辨能力可以达到亚十纳米。但其在进行单分子定位时，首先需要使用类似随机光学重构显微术(STORM：Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)的活化方法，再进行四次照明才能得到一个荧光分子的位置，作为一种基于随机激活的分时定位技术，定位速度受到较大的限制。

发明内容

本发明的目的为提供一种荧光分子定向定位方法和装置，利用一束空心斑激发，另一束空心斑荧光淬灭的超衍射暗斑，采用探测器阵列和偏振探测系统，结合后期数学模型处理实现荧光分子的定向定位。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供的荧光分子定向定位方法包括以下步骤：

步骤1)，发射两束激光光束，并调节两束激光光束，使两束光在空间上光斑中心重合，在时间上脉冲起始位置重合；

步骤2)，将经步骤(1)处理的两束激光光束合为一束光；

步骤3)，将合束后的光束投射到样品上并对样品进行扫描，扫描时使两束光在样品上均汇聚成空心光斑；

步骤4)，通过探测器阵列接收样品在扫描时发出的信号光，并通过接收到的信号光获取相应扫描位置处的图像，同时获取荧光分子的位置信息；

步骤5)，通过偏振探测器阵列接收样品发出信号光的偏振信息，获取荧光分子的偶极子取向信息。

传统所使用的二维暗斑在衍射极限下只能达到直径约为200nm，使其只能在稀疏荧光分子分布的情况下实施定位。超衍射暗斑的思路来源于受激发射损耗显微术(STED：Stimulated Emission Depletion Microscopy)，区别在于，将其激发光的模式从实心斑改为空心斑。利用受激发射损耗原理，使用一束空心斑激发，另一束空心斑损耗荧光，可以得到超衍射暗斑，其尺寸可以降低至约50nm。理论上，在二维空间获得同等定位精度的情况下，本发明实现的染料浓度可以做到现存实验方法的16倍，更符合真实生物环境的需要。

作为优选，步骤1)中，使用0～2π涡旋位相板对两束光进行相位调制。

作为优选，步骤4)包括：根据探测器阵列不同位置处探测器接收到的光子数以及照射荧光分子样品的超衍射暗斑参数，得到产生该光子流分布的极大似然概率，反解得到荧光分子的发光位置。

作为优选，步骤5)中，偶极子取向过程建模如下：

5.1)在入射光是圆偏振光且正入射的条件下，对于一个发射偶极矩为

静止的分子，探测到的偏振信息满足下式：

其中，I_x、I_y分别为偏振光x、y方向分量的光强，θ为分子和光轴所成的角，

为分子在样品平面上的方向角，a为一个与激发效率、收集效率等有关的因子，

分别为x、y方向的方向向量；

5.2)分子在样品平面上的方向角满足该式

其中，P为偏振因子，且P＝(I_x-I_y)/(I_x+I_y)。

对探测器阵列所接收到的光信号，本发明采用极大似然概率估计函数，并进行反解，即可以获得较为精准的荧光分子定位。在添加噪声的情况下，定位精度仍然可以达到亚十纳米，并且相较于现有方法有所提高。极大似然函数估计公式如下：

其中，n_i代表在第i个探测器上接收到的光子数，p_i代表在其共轭平面上不同探测器相对照射强度的占比，即：

此外，荧光分子发射荧光的行为类似于偶极子辐射。因此，偶极子发出的荧光是偏振的，其发射荧光的偏振分量的强度概率分布与

成正比，其中

是发射偶极矩方向与发射荧光的偏振分量的方向之间的夹角。因此可以使用偏振探测系统来采集荧光信号在两个正交方向的偏振分量强度I_x与I_y，进一步算得P＝(I_x-I_y)/(I_x+I_y)。根据关系式：

即可求得分子的平面方向角。

另一方面，本发明提供的荧光分子定向定位装置包括光源、承载待测样品的样品台，光源与样品台之间依次设有：

用于对两束激光进行相位调制的0～2π涡旋位相板；

用于改变所述光源发出的两束光束的偏振特性的两块1/2波片；

用于改变偏振光的偏振光偏振特性的两块1/4波片；

用于将两束激光合并为一束的二向色镜；

用于改变从二向色镜出射的光束中振光偏振特性的消色差1/4波片；

用于对两束光束进行光路偏转使其投射到样品，并使经过相位调制的两束光在样品上均汇聚成空心光斑，从而对样品进行扫描、且依次设置的扫描振镜系统、扫描透镜、场镜和显微物镜；

用于对信号光进行分束，从而分别汇聚到并行探测系统和偏振探测系统的非偏振分束器，

用于采集样品发出的信号光的并行探测系统；

用于采集样品发出的信号光的偏振信息的偏振探测系统；

用于匹配两束激光脉冲在时间上重合的延时电路。

传统的光子接收只采用一个单光子探测计数器，定位一个荧光分子，需要精准扫描光斑四次，使得暗斑中心分别位于探测圆的圆心位置以及圆周上的三等分点位置。荧光分子受激发后在四个位置产生的光子分布满足多项式分布。但这种定位技术，一是需要纳米尺度上精准扫描光斑，二是实现一次定位的速度较慢，效率较低。本发明将单个探测器换成有多个探测器组成的探测器阵列，一次照明即可获得七个光子数分布，相当于间接实现了照明光斑位置对于荧光分子的相对移动，理论上可以比传统所使用的二维暗斑定位方法在速度上提高4倍。

作为优选，光源与0～2π涡旋位相板之间依次设有用于对所述激光光束进行滤波的单模光纤和进行准直的准直透镜。

作为优选，0～2π涡旋位相板具有可变的调制函数

其中，ρ为光束上某点与光轴的距离，

为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角。

作为优选，显微物镜的数值孔径NA＝1.4。

作为优选，偏振探测系统包括一个偏振分束器、两根保偏光纤和两个雪崩光电二极管(APD)。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)首次提出在超衍射暗斑的基础上利用荧光各向异性，解析超衍射极限的偶极子取向，同时提高了荧光分子定位的精度和偶极子取向的精度；

(2)提高了定位速度，拥有较高的时间分辨率；

(3)装置简单，操作方便。

附图说明

图1为本发明实施例中荧光分子定向定位装置的结构示意图；

图2为本发明实施例中超衍射暗斑的归一化光强分布曲线；

图3为本发明实施例中并行探测共轭平面位置分布仿真图；

图4为本发明实施例中添加噪声后所能得到的定位精度仿真图；

图5为本发明实施例中偶极子中的偏振定向示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合实施例及其附图对本发明作进一步说明。

实施例

参见图1，本实施例的荧光分子定向定位装置包括：激光器1和8，单模光纤2和9，准直透镜3和10，0～2π涡旋位相板4和11，1/2波片5和12，1/4波片6和13，反射镜7、15、19和36，二色镜14和16，消色差1/4波片17，扫描振镜18，扫描透镜20，场镜21，显微物镜22，样品台23，非偏振分束器24，带通滤波片25、31和37，微透镜阵列26，针孔阵列27，光纤束28，探测器阵列29，偏振分束器30，收集透镜32和38，针孔33和39，保偏光纤34和40，单探测器35和41，延时电路42。

其中，单模光纤2和9、准直透镜3和10、0～2π涡旋位相板4和11、1/2波片5和12、1/4波片6和13依次位于激光器1和8出射光束的光轴之上。

二色镜14位于经0～2π涡旋位相板4和11调制后光束的光轴之上。

二色镜16、消色差1/4波片17依次位于二色镜14的出射光经反射镜偏折之后的光轴之上；扫描振镜18位于经二色镜16出射后光束的光轴之上。

扫描透镜20、场镜21、显微物镜22、样品台23依次位于扫描振镜18出射光束的光轴之上。

非偏振分束器24位于经二色镜16后反射镜反射光束的光轴之上，带通滤波片25、微透镜阵列26、针孔阵列27、光纤束28、探测器阵列29，依次位于非偏振分束器24反射光束的光轴之上。针孔阵列27位于微透镜阵列26的焦平面处。

偏振分束器30位于非偏振探测器透射的光轴之上，带通滤波片31、收集透镜32、针孔33、保偏光纤44和单探测器35，依次位于偏振分束器30反射光束的光轴之上。针孔33位于收集透镜32的焦平面处。

反射镜36、带通滤波片37、收集透镜38、针孔39、保偏光纤40和单探测器41，依次位于偏振分束器30透射光束的光轴之上。针孔39位于收集透镜38的焦平面处。

激光器1与激光器8用延时电路42相连，用于调整两束激光脉冲在时间上重合。

上述装置中，显微物镜22的数值孔径NA＝1.4；所用针孔27的直径为0.2个艾里斑直径，探测器阵列29为雪崩二极管阵列(APD)。

采用图1所示的装置进行荧光分子定向定位的方法如下：

从激光器1和8发出的激光光束，经延时电路42在时间上脉冲重合后，首先被导入单模光纤2和9，经过准直透镜3和10完成准直。经过准直后的光束入射到0～2π涡旋位相板4和11受到调制，产生空心光斑。

分别由0～2π涡旋位相板4和11出射的两束光，通过1/2波片5和12变为线偏振光，再经1/4波片6和13变为右旋圆偏光。通过二色镜14重新合为一束光。再通过消色差1/4波片17，补偿因二色镜引起的偏振态改变，使其重新变为右旋圆偏光。

调制后的光入射到扫描振镜18上，经扫描振镜18出射的光束依次被扫描透镜20聚焦、场镜21准直，之后经显微物镜22投射到位于样品台23上的待测样品之上。

入射光在显微物镜22的焦点附近所成的光场分布可由德拜积分确定，具体如下：

式中，

是以显微物镜22的焦点位置为原点的柱坐标系下的坐标，

代表了

处的电矢量强度，i为虚数单位，C为归一化常数，θ为光束孔径角，φ为光束垂直Z轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角，A₁(θ,φ)是入射光的振幅分布，A₂(θ,φ)表征了显微物镜22的结构，

则表示了入射光的偏振信息，k＝2π/λ，n为介质折射率。

由上式计算可以发现，此时入射的两束圆偏光经显微物镜22聚焦之后在待测样品上所成光斑为一个面包圈型空心光斑，其中激发光的光场分布归一化曲线分别如图2所示。

待测样品所出射的信号光被显微物镜22收集，之后依次通过场镜21、扫描透镜20、扫描振镜18，通过二色镜16，最后被反射。信号光束通过非偏振分束器30分为两束，一束通过带通滤波片25滤去杂散光，之后经微透镜阵列26聚焦并通过针孔阵列27进行空间滤波，最终被探测器阵列29接收。

同时，另一束则通过偏振分束器30分为s偏振和p偏振的两束，分别经过带通滤波片31/37滤去杂散光，收集透镜32/38聚焦并通过针孔33/39进行空间滤波，再经过保偏光纤34/40，最终被单探测器35/41接收。

通过控制器调节扫描振镜18，实现对于待测样品的二维扫描。

通过探测器阵列，七个探测器在一次照明下可获得七个光子数分布。采用极大似然概率估计函数，并进行反解，即可以获得较为精准的荧光分子定位，如图3是七个探测器在一次照明情况下在共轭平面上的等效光照分布。在添加噪声的情况下，定位精度仍然可以达到亚十纳米，如图4所示。

如图5所示，双向箭头表示一个荧光分子的偶极子，z轴为光轴的方向，xy平面为样品平面。其中，θ为分子和光轴所成的角，

为分子在样品平面上的方向角。

本实施例中，虽然图1中未示出，但本实施例中的装置还应当包括与各探测器连接的计算机，对探测器阵列所接收到的光信号进行处理，获取相应扫描位置处的图像以及荧光分子的位置信息。

以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种荧光分子定向定位方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1)，发射两束激光光束，并调节两束激光光束，使两束光在空间上光斑中心重合，在时间上脉冲起始位置重合；

步骤2)，将经步骤(1)处理的两束激光光束合为一束光；

步骤3)，将合束后的光束投射到样品上并对样品进行扫描，扫描时使两束光在样品上均汇聚成空心光斑；

步骤4)，通过探测器阵列接收样品在扫描时发出的信号光，并通过接收到的信号光获取相应扫描位置处的图像，同时获取荧光分子的位置信息；

步骤5)，通过偏振探测器阵列接收样品发出信号光的偏振信息，获取荧光分子的偶极子取向信息。

2.根据权利要求1所述的荧光分子定向定位方法，其特征在于，步骤1)中，使用0～2π涡旋位相板对两束光进行相位调制。

3.根据权利要求1所述的荧光分子定向定位方法，其特征在于，步骤4)包括：根据探测器阵列不同位置处探测器接收到的光子数以及照射荧光分子样品的超衍射暗斑参数，得到产生该光子流分布的极大似然概率，反解得到荧光分子的发光位置。

4.根据权利要求1所述的荧光分子定向定位方法，其特征在于，步骤5)中，偶极子取向过程建模如下：

5.1)在入射光是圆偏振光且正入射的条件下，对于一个发射偶极矩为

静止的分子，探测到的偏振信息满足下式：

其中，I_x、I_y分别为偏振光x、y方向分量的光强，θ为分子和光轴所成的角，

为分子在样品平面上的方向角，a为一个与激发效率、收集效率等有关的因子，

分别为x、y方向的方向向量；

5.2)分子在样品平面上的方向角满足该式

其中，P为偏振因子，且P＝(I_x-I_y)/(I_x+I_y)。

5.一种荧光分子定向定位装置，用于实现权利要求1～4中任一权利要求所述的荧光分子定向定位方法，包括光源、承载待测样品的样品台，其特征在于，所述光源与样品台之间依次设有：

用于对两束激光进行相位调制的0～2π涡旋位相板；

用于改变所述光源发出的两束光束的偏振特性的两块1/2波片；

用于改变偏振光的偏振光偏振特性的两块1/4波片；

用于将两束激光合并为一束的二向色镜；

用于改变从二向色镜出射的光束中振光偏振特性的消色差1/4波片；

用于对两束光束进行光路偏转使其投射到样品，并使经过相位调制的两束光在样品上均汇聚成空心光斑，从而对样品进行扫描、且依次设置的扫描振镜系统、扫描透镜、场镜和显微物镜；

用于对信号光进行分束，从而分别汇聚到并行探测系统和偏振探测系统的非偏振分束器，

用于采集样品发出的信号光的并行探测系统；

用于采集样品发出的信号光的偏振信息的偏振探测系统；

用于匹配两束激光脉冲在时间上重合的延时电路。

6.根据权利要求5所述的荧光分子定向定位装置，其特征在于，所述的光源与0～2π涡旋位相板之间依次设有用于对所述激光光束进行滤波的单模光纤和进行准直的准直透镜。

7.根据权利要求5所述的荧光分子定向定位装置，其特征在于，所述的0～2π涡旋位相板具有可变的调制函数

其中，ρ为光束上某点与光轴的距离，

为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角。

8.根据权利要求5所述的荧光分子定向定位装置，其特征在于，所述的显微物镜的数值孔径NA＝1.4。

9.根据权利要求5所述的荧光分子定向定位装置，其特征在于，所述的偏振探测系统包括一个偏振分束器、两根保偏光纤和两个雪崩光电二极管。

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