CN114373505A - 一种基于肠道微生物早期预测奶牛产后亚临床酮病的系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于肠道微生物早期预测奶牛产后亚临床酮病的系统，利用围产前期奶牛后肠道预后标志微生物丰度预测奶牛产后亚临床酮病，所述的预后标志微生物包括属水平Parabacteroides、Shigella、Cellulosilyticum、Roseburia、Sporobacter、Acetanaerobacterium。本发明筛选了所述6种亚临床酮病的预后标志微生物，并基于判别分析建立了预后的判别模型。本发明对奶牛产后的亚临床酮病具有准确且稳定的预测能力，可以通过无创直肠取样方法对围产期奶牛进行预警筛查，为奶牛场尽早防治奶牛产后酮病和亚临床酮病提供有效手段。

Description

一种基于肠道微生物早期预测奶牛产后亚临床酮病的系统

技术领域

本发明涉及围产期奶牛健康领域，具体是一种基于产前肠道微生物预测奶牛产后一周血液β-羟丁酸水平进而预测产后亚临床酮病的系统。

背景技术

我国奶牛养殖业在二十一世纪发展迅速，奶牛年单产水平从不足4,000公斤上升到超过8,000kg，但是随着奶牛产量不断攀升，产生的健康问题日益突出。产后由于采食饲料供应的能量无法满足产奶需要，奶牛通常出现不同程度的能量负平衡，因此需要通过动员自身体组织进行供能。在这一过程中，体脂中大量的长链脂肪酸被分解成非酯化脂肪酸进入肝脏，不能被完全氧化的游离脂肪酸，进一步形成BHBA、乙酰乙酸、丙酮等酮体，部分再酯化形成甘油三酯。当肝脏中聚集大量的BHBA和甘油三酯时，无法及时利用和清除，便可造成奶牛脂质代谢障碍，同时BHBA向血液中扩散，引发酮病、脂肪肝等代谢性疾病。据报道，我国围产后期奶牛酮病发病率占泌乳奶牛群的10％～30％，严重危害奶牛健康和牛场经济效益。

酮病最常用的判定指标是血液BHBA浓度，可分为亚临床型和临床型酮病。亚临床酮病定义为无临床症状，但机体检测酮体含量过多，血浆BHBA浓度大于1.2mmol/L的奶牛产后疾病。研究统计由于产奶量减少造成的总经济损失约占24％，主要原因是酮病引起低血糖降低乳糖合成，从而导致产奶量下降。亚临床酮病比临床酮病发生的频率更高，隐蔽性更强，会造成奶牛奶产量降低、奶牛淘汰率增加、治疗费用增加、产犊周期延长等多方面经济损失，据报道大约30％～50％的奶牛在围产后期、泌乳初期会发生亚临床酮病。

目前，有关奶牛亚临床酮病和酮病的防治剂和产品已有较多研究，包括葡萄糖推注、糖皮质激素促糖异生、胰岛素减少脂肪分解、维生素B12/磷促进糖异生、丙二醇作为糖异生前体等方法，但由于亚临床酮病症状较高的潜伏性，不加针对的实施上述防治会产生高额成本和对健康个体的副作用。因此，亟需简便、精准的预测方法判定产后易发亚临床酮病的奶牛，进而精准实施早期干预，减少奶牛围产期经济损失。

后肠道微生物在研究中与机体健康密不可分，奶牛的食糜在消化道从前往后的过程中，营养物质被吸收，代谢废物丰度通过累积效应逐渐增加，在后肠道蓄积。人类和单胃动物研究中，后肠道微生物通过肠-脑、肠-肝、肠-心脏等轴诱导或参与机体的健康调控，大量新型微生物标志物被报道。随着微生物16S rRNA基因测序技术的快速发展，使得通过微生物测序获得标志微生物成为可能。在现有的反刍动物研究中，前胃微生物的研究非常丰富，前胃中的微生物被证明与奶牛的生产性能如产奶量、乳蛋白含量和氮代谢效率、饲料转化效率等存在关联。后肠道微生物被认为与奶牛机体的疾病和生理状态密切相关，但相关研究报道非常匮乏。肠道微生物对奶牛健康调控和预测的潜在价值有待挖掘。

本发明首次成功建立了一种基于产前奶牛后肠道标志微生物预测产后一周血液BHBA浓度的机器学习模型，具有较高的模型效能(AUROC:0.876-0.917(95％CI 0.778-0.993))和准确率(Accuracy:0.839-0.857)。本发明为产后酮病的精准防治提供新型解决方案，对精准缓解围产期高产奶牛代谢负担、改善应激状态、提高健康和生产水平具有重要指导意义和应用价值。

发明内容

本发明目的在于针对现有技术的不足，提出一种基于肠道微生物早期预测奶牛产后亚临床酮病的系统，基于产前奶牛后肠道标志微生物预测产后一周血液BHBA浓度的机器学习模型，具有较高的模型效能和准确率。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种基于肠道微生物早期预测奶牛产后亚临床酮病的系统，该系统包括微生物采集模块和产后血液β-羟丁酸预测模块；

所述微生物采集模块用于采集奶牛产前3周的微生物输入产后血液β-羟丁酸预测模块，所述微生物为预后标志肠道微生物，包括六种微生物属Parabacteroides、Shigella、Cellulosilyticum、Roseburia、Sporobacter、Acetanaerobacterium；

所述产后血液β-羟丁酸预测模块包括判别模型，用于预测奶牛产后一周血液β-羟丁酸水平，判别模型具体如下：

其中g_i为判别系数，数值如下表所示；Abundance_i为判别模型输入数据，为奶牛产前直肠内容物中第i种微生物16S rRNA基因测序所得的属水平丰度；Score表示判别模型输入6种微生物的属水平丰度后就算得到的分值。当Score>-0.004时，认为奶牛在产后一周具有发生亚临床酮病的风险。

标志微生物	系数g<sub>i</sub>
		Parabacteroides	0.502
Shigella	-11.255
		Cellulosilyticum	2.669
Roseburia	2.202
		Sporobacter	-19.538
Acetanaerobacterium	-8.803

进一步地，针对产前三周奶牛肠道内所有微生物样本，选择出在50％的样本中丰度高于0.01％的样本，通过随机森林Boruta方法对所有产前三周微生物进行产后亚临床酮病预测效力的特征筛选后，根据交叉验证所得错误率最低的最少变量数量(6个)，按照平均Gini指数的高低排序(MeanDecreaseGini)得到的前6种微生物。

进一步地，微生物的属水平丰度为微生物的16S rRNA基因V3-V4区的扩增丰度。

进一步地，所述判别系数系数g_i为将6种微生物的16S rRNA基因可变区V3-V4区微生物标志片段的丰度进行经典判别分析(Canonical discriminant analysis)后获得。

进一步地，所述标志微生物的16S rRNA基因可变区V3-V4区微生物特征片段丰度的测定方法包括但不限于PCR、扩增子测序、二代高通量测序、Panomics或Nanostring宏基因组测序。

本发明具有的有益效果是，本发明通过对产前3周的奶牛后肠标志微生物(Parabacteroides、Shigella、Cellulosilyticum、Roseburia、Sporobacter、Acetanaerobacterium)的16S rDNA可变区V3-V4区微生物特征片段丰度的检测，利用本发明判别模型可预测奶牛产后亚临床酮病的发病情况、进行预警诊断，进而有助于通过采取疾病前有效的防控措施降低发病率，为围产期奶牛的精准防控打下基础。本发明为产后酮病的精准防治提供新型解决方案，对精准缓解围产期高产奶牛代谢负担、改善应激状态、提高健康和生产水平具有重要指导意义和应用价值。

附图说明

图1是奶牛产后一周根据BHBA分组数值的情况，产后一周健康组和亚临床酮病组。

图2是使用随机森林方法进行重复5次的交叉验证之后，绘制的错误率曲线，分割线显示当变量为6个时，可保证错误率最低且变量数量最小。

图3是通过随机森林模型的MeanGini指数对微生物变量的重要性进行排序，并选择前6种genus水平的物种。

图4是差异t检验下，有5种微生物在产后发生亚临床酮病的个体和不发生亚临床酮病的个体之间在产前三周的丰度存在显著差异。

图5是基于交叉验证对判别分析预测模型进行性能测试，判别模型预测的ROC曲线。

图6是本发明的系统框图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

如图6所示，本发明提供了一种基于奶牛产前肠道微生物预测产后亚临床酮病的系统，该系统包括微生物采集模块和产后血液β-羟丁酸预测模块；如图1所示，在预测产后血液中总BHBA水平之前，首先进行血样采集和指标测定，具体过程如下：

1、后肠道内容物采集

与杭州集约化奶牛场选取年龄、体况、胎次相近的奶牛54头，跟踪奶牛于奶牛产前三周、产后后一周晨饲之前采用直肠取粪的方法，从直肠取出粪便并立即在液氮中淬灭。在进行16SrDNA测定之前都保存在-80℃超低温冰箱中。

2、血浆采集及血常规分析

在上述的粪便微生物采集的同时，从奶牛尾静脉血管采集血液样品，于EDTA真空采血管，并提前启动低温离心机，设置温度为4℃。血样采集后立即在4℃、3000×g条件下离心15分钟得到血浆，使用1mL移液枪吸取最上层血浆，避免吸入中下层，并且分装保存于1.5ml离心管，置入-80℃冰箱中。使用日立7020全自动生化分析仪(Hitachi High-technologies corporation,Tokyo,Japan)和配套的生化试剂盒(Ningbo Medical SystemBiotechnology Co.,Ltd)，启动多样本自动分析，测定产后一周各样本的血浆中总BHBA水平。以奶牛行业亚临床酮病标准1.2mmol/L作为二分类分组分界点，血液中总BHBA水平低于1.2umol/L被定义为正常奶牛，大于1.2umol/L的奶牛被定义为发生亚临床酮病奶牛，群体中并未出现临床酮病即总BHBA水平高于2.0mmol/L的奶牛。

基于微生物属水平的标志微生物筛选，通过微生物采集模块采集筛选后的标志微生物；

利用16S rRNA基因测序后获得的微生物属水平注释丰度信息进行后续分析，在去除了在50％样本中丰度低于0.01％的低丰度物种之后，剩余73种属水平微生物。由于产后一周亚临床酮病和正常奶牛的个体数量分别为6:39，组间样本数量悬殊，使用DMwR包中的SMOTE方法对这两组不平衡样本进行平衡拓展。SMOTE方法的参数选择为perc.over＝500，perc.under＝300。

样本平衡处理后，基于产前三周的微生物进行随机森林的Boruta的变量筛选方法，选取鉴别为“Comfirmed”的变量。使用R包“RandomForest”进行随机森林预测建模。使用“RandomForest”R包将变量输入进入randomForest函数中构建随机森林模型，通过随机森林Boruta方法对所有产前三周微生物进行产后亚临床酮病预测效力的特征筛选后，使用该R包的rfcv函数进行重复5次的交叉验证之后，绘制错误率曲线，观查错误率与使用Markers数量的变化关系如图2，选取在最少变量下且预测错误率最低的变量6个。在去除在16SrRNA基因测序下未分类的属水平微生物之后，如图3基于随机森林按照MeanDecreaseGini排序的变量重要性排序选择前6个微生物属：Parabacteroides、Shigella、Cellulosilyticum、Roseburia、Sporobacter、Acetanaerobacterium作为标志微生物，该六种微生物的功能如下表1所示。

表1六种标志肠道微生物功能

图4中差异t检验显示，在产前三周，有5种微生物丰度在产后健康和亚临床酮病个体之间存在显著差异。产后血液β-羟丁酸预测模块包括判别模型，具体构建过程如下：

由于随机森林模型是基于bagging的集成模型，模型由数十上百棵决策树构成，需要以编程语言对象的形式存储，在畜牧生产和诊断中难以普及，无法通过快速的手动计算获得预测结果。因此使用微生物采集模块采集到的6种微生物的丰度矩阵进行经典判别分析(Canonical discriminant analysis)以获得能够基于标志微生物丰度进行运算的产后亚临床酮病预测判别计算公式。判别模型被定义为标志微生物的微生物丰度的线性组合。其计算公式如下：

在公式中，判别系数g_i如上表所示，Abundance_i为第i中微生物产前三周预后标志微生物的16S rRNA基因可变区V3-V4区微生物特征片段丰度。计算得到的Score值通过以下贝叶斯公式计算后验概率,

P(k|X)∝P(X|k)*P(k)

其中，k代表亚临床酮病的发病概率，P(k)为先验概率，似然P(X|k)是每个类别(发病与不发病)中出现目标预测变量X的概率。似然的计算是通过将数据投影到判别函数上，基于判别函数值的分布，使用R中MASS包中的fitdistr函数计算不同类别判别数值从属的正态分布N(μ₁,σ₁ ²)和N(μ₂,σ₂ ²)，基于发病与不发病两类正态分布的概率密度函数估算Score的分界值。计算得在Score小于-0.004时，只有0.001的概率在产后一周发病。当Score大于-0.004时，认为奶牛在产后有发生亚临床酮病的风险。

模型的交叉验证和性能测试：

使用交叉验证对判别分析预测模型进行性能测试，模型预测的ROC曲线如图5，基于混淆矩阵计算每一折交叉验证的模型Accuracy、AUROC值，经过交叉验证，该判别模型的AUROC范围为AUROC:0.876-0.917(95％CI 0.778-0.993)，准确率为0.839-0.857。每一折交叉验证中经典判别预测系统的Accuracy大于0.839，AUC大于0.870。

实施案例：

于杭州某集约化牧场通过微生物采集模块随机采取产前三周内奶牛后肠道内容物并进行16S rRNA测序，获得六种微生物丰度，使用判别模型进行评价，预测的准确性为0.818，如表2所示，表2基于6种标志微生物的实施效果

奶牛编号	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
												g__Cellulosilyticum	0.67	0.21	0.19	0.07	0.64	0.17	0.16	0.21	0.1	0.16	0.25
g__Parabacteroides	0.18	0.44	0.28	0.64	0.45	0.6	0.64	0.43	0.58	0.51	0.44
												g__Roseburia	0.09	0.26	0.27	0.11	0.24	0.23	0.24	0.16	0.31	0.3	0.2
g__Shigella	0.01	0.07	0.15	0.02	0.01	0.02	0.02	0	0.04	0.03	0.01
												g__Acetanaerobacterium	0.01	0.07	0.04	0.05	0.04	0.08	0.09	0.02	0.01	0.01	0.04
g__Sporobacter	0.06	0.07	0.04	0.06	0.06	0.03	0.04	0.03	0.02	0.03	0.04
												Score	1.51	-0.8	-1	-0.3	1.6	0.51	0.08	1.04	0.98	0.96	0.77
实际发病情况	0	0	0	1	1	1	1	1	1	1	1
												产后发病推测	1	0	0	0	1	1	1	1	1	1	1

综上所述，本发明通过Parabacteroides、Shigella、Cellulosilyticum、Roseburia、Sporobacter、Acetanaerobacteriu这六项奶牛后肠道微生物丰度，根据判别模型计算预测测试样本产后发生的风险概率，为奶牛健康维护和预警提供依据。

上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种基于肠道微生物早期预测奶牛产后亚临床酮病的系统，其特征在于，该系统包括微生物采集模块和产后血液β-羟丁酸预测模块；

所述微生物采集模块用于采集奶牛产前3周的肠道微生物，输入产后血液β-羟丁酸预测模块，所述微生物为预后标志肠道微生物，包括六种微生物属Parabacteroides、Shigella、Cellulosilyticum、Roseburia、Sporobacter、Acetanaerobacterium；

所述产后血液β-羟丁酸预测模块包括判别模型，用于预测奶牛产后一周血液β-羟丁酸水平，判别模型具体如下：

其中g_i为判别系数，数值如下表所示；Abundance_i为判别模型输入数据，为奶牛产前直肠内容物中第i种微生物16S rRNA基因测序所得的属水平丰度；Score表示判别模型输入6种微生物的属水平丰度后计算得到的分值。当Score>-0.004时，认为奶牛在产后一周具有发生亚临床酮病的风险。

标志微生物 系数g_i Parabacteroides 0.502 Shigella -11.255 Cellulosilyticum 2.669 Roseburia 2.202 Sporobacter -19.538 Acetanaerobacterium -8.803

2.根据权利要求1所述的一种基于肠道微生物早期预测奶牛产后亚临床酮病的系统，其特征在于，针对产前三周奶牛肠道内所有微生物样本，选择出在50％的样本中丰度高于0.01％的样本，通过随机森林Boruta方法对所有产前三周微生物进行产后亚临床酮病预测效力的特征筛选后，根据交叉验证所得错误率最低的最少变量数量(6个)，按照平均Gini指数的高低排序(MeanDecreaseGini)得到的前6种微生物。

3.根据权利要求1所述的一种基于肠道微生物早期预测奶牛产后亚临床酮病的系统，其特征在于，微生物的属水平丰度为微生物的16S rRNA基因V3-V4区的扩增丰度。

4.根据权利要求1所述的一种基于肠道微生物早期预测奶牛产后亚临床酮病的系统，其特征在于，所述判别系数g_i为将6种微生物的16S rRNA基因可变区V3-V4区微生物标志片段的丰度进行经典判别分析(Canonical discriminant analysis)后获得。

5.根据权利要求4所述的一种基于肠道微生物早期预测奶牛产后亚临床酮病的系统，其特征在于，所述标志微生物的16S rRNA基因可变区V3-V4区微生物特征片段丰度的测定方法包括但不限于PCR、扩增子测序、二代高通量测序、Panomics或Nanostring宏基因组测序。

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