CN117298043A - 一种纳米水凝胶前驱体及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物合成技术领域，尤其涉及一种纳米水凝胶前驱体及其制备方法与应用。本发明中纳米水凝胶负载的活性成分GOx、Mn2+和HCQ，在手术后的部位通过激活STING通路和调节自噬通路来加强癌症治疗。其中，GOx和Mn2+作为化学动力疗法制剂，Mn2+作为STING激动剂，HCQ作为自噬抑制剂；GOx和Mn2+可以发挥CDT的作用，导致细胞膜dsDNA和线粒体dsDNA的释放，从而进一步诱导STING通路的激活，HCQ能有效抑制与STING通路激活相关的保护性自噬，进一步增强抗肿瘤免疫反应。化学动力疗法制剂、STING激动剂和自噬抑制剂协同作用可产生特异性免疫应答，显著抑制肿瘤复发，从而延长手术后三阴性乳腺癌小鼠的生存率。

Description

一种纳米水凝胶前驱体及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及药物合成技术领域，尤其涉及一种纳米水凝胶前驱体及其制备方法与应用。
背景技术
三阴性乳腺癌是一种雌激素受体(ER)，孕激素受体(PR)和原癌基因HER2均为阴性的特殊分子亚型乳腺癌。三阴性乳腺癌大约占全部乳腺癌的15％左右，常常表现为分化程度比较低，呈干细胞样特性，复发率比较高，患者的总体存活率比较短，是高危的乳腺癌，预后比较差，术后容易出现复发，而且也容易出现其他脏器的转移。
研究表明，肿瘤发生发展与机体免疫系统密切相关，抗肿瘤免疫应答是继肿瘤消融后通过激活机体免疫系统，实现对全身肿瘤细胞清除，防止其转移的又一有力措施。其中，干扰素基因刺激因子(STING)通路在抗肿瘤免疫的启动和“冷”肿瘤向“热”肿瘤的转化中起着至关重要的作用。化学动力学治疗(CDT)是一种通过芬顿/类芬顿反应将过氧化氢转化为活性氧(ROS)，活性氧的种类多是羟基自由基，会诱导肿瘤细胞凋亡和坏死。葡萄糖氧化酶(GOx)可与细胞内的葡萄糖和氧反应生成过氧化氢(H2O2)和葡萄糖酸，可切断癌细胞的营养来源，从而抑制其增殖。研究表面锰离子(Mn2+)可以增强环状GMP-AMP合成酶(cGAS)对双链DNA(dsDNA)的敏感性和放大STING激活。此外Mn2+还能够发生类芬顿反应分解过氧化氢诱导活性氧的产生。同时有研究表明，GOx催化的葡萄糖氧化生成的H2O2促进Mn2+介导的芬顿样反应，导致更多肿瘤细胞死亡。而且，死亡的细胞碎片中产生的dsDNA以及过量的细胞内ROS破坏线粒体并释放的线粒体DNA，可双向激活cGAS-STING信号通路。
然而，单纯依赖cGAS-STING信号通路的激活治疗效果仍然不理想，这是因为肿瘤细胞在应对cGAS-STING信号通路的激活时亦触发了其内部的保护性自噬。自噬作为保守的细胞保护机制，通过细胞捕获自噬体中的细胞质成分并将其传递给溶酶体进行降解以转化为代谢所需底物，进而维持体内平衡。而自噬的激活又会导致随后的STING降解，自噬在STING通路中起负反馈调节作用。此外，自噬还可以减少应激反应，阻止ROS的积累，特别是来自受损线粒体的ROS，限制肿瘤细胞的相关损伤，促进肿瘤生长。因此，在肿瘤的治疗过程中，如何中断自噬降解过程，提升STING信号通路激活所致的免疫治疗效果成为肿瘤免疫治疗发展的关键。
发明内容
为了克服上述问题，本发明提供了一种纳米水凝胶前驱体及其制备方法与应用。本发明中纳米水凝胶负载的活性成分GOx、Mn2+和HCQ，在手术后的部位通过激活STING通路和调节自噬通路来加强癌症治疗。其中，GOx和Mn2+作为化学动力疗法制剂，Mn2+作为STING激动剂，HCQ作为自噬抑制剂；GOx和Mn2+可以发挥CDT的作用，导致细胞膜dsDNA和线粒体dsDNA的释放，从而进一步诱导STING通路的激活，HCQ能有效抑制与STING通路激活相关的保护性自噬，进一步增强抗肿瘤免疫反应。化学动力疗法制剂、STING激动剂和自噬抑制剂协同作用可产生特异性免疫应答，显著抑制肿瘤复发，从而延长手术后三阴性乳腺癌小鼠的生存率。
本发明的第一个方面，提供一种纳米水凝胶前驱体的制备方法，包括以下步骤：
(1)将介孔二氧化硅(MSN)分散于无水乙醇中，向悬浮液中加入氨水(NH3·H2O)和3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTES)，搅拌反应，反应完成后即得氨基化介孔二氧化硅MSN-NH2；
(2)将步骤(1)中制备的MSN-NH2分散于去离子水中，加入葡萄糖氧化酶(GOx)，进行孵育，孵育结束后即得负载GOx的纳米颗粒G@MSN；
(3)将步骤(2)中制备的G@MSN分散于去离子水中，依次加入单宁酸(TA)、二价锰盐溶液和3-吗啉丙磺酸缓冲液(MOPS)，形成MPN涂层，后加入牛血清蛋白溶液(BSA)，涡旋以形成BSA涂层，形成负载GOx和Mn2+的纳米颗粒GM@MSN；
(4)将透析完成后的脂质体置于羟基氯喹(HCQ)溶液中进行孵育，孵育结束后即得负载有羟基氯喹的脂质体LipHCQ；
(5)将海藻酸钠加入到去离子水中，搅拌后加入步骤(3)中制备的纳米颗粒GM@MSN与步骤(4)中制备的LipHCQ，搅拌反应即得纳米水凝胶前驱体溶液H/GM@MSN。
本发明制备的水凝胶前驱体溶液H/GM@MSN与机体内源性钙离子反应生成纳米水凝胶H/GM@Gel。
本发明的第二个方面，提供由上述制备方法制备的纳米水凝胶前驱体。
本发明的第三个方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包括上述纳米水凝胶前驱体。
本发明的第四个方面，提供一种药物制剂，所述药物制剂包括上述纳米水凝胶前驱体。
本发明的第五个方面，提供上述纳米水凝胶前驱体或上述药物组合物或上述药物制剂在制备治疗肿瘤药物中的应用。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明中纳米水凝胶负载的活性成分GOx、Mn2+和HCQ，在手术后的部位通过激活STING通路和调节自噬通路来加强癌症治疗。其中，GOx和Mn2+作为化学动力疗法制剂，Mn2 +作为STING激动剂，HCQ作为自噬抑制剂；GOx和Mn2+可以发挥CDT的作用，导致细胞膜dsDNA和线粒体dsDNA的释放，从而进一步诱导STING通路的激活，HCQ能有效抑制与STING通路激活相关的保护性自噬，进一步增强抗肿瘤免疫反应。化学动力疗法制剂、STING激动剂和自噬抑制剂协同作用可产生特异性免疫应答，显著抑制肿瘤复发，从而延长手术后三阴性乳腺癌小鼠的生存率。
(2)本发明基于静电相互作用实现GOx的负载，基于配位作用实现MPN涂层的构筑，利用氢键的相互作用实现BSA涂层的制备。将带负电性的MSN进行氨基化修饰，将MSN表面电荷进行反转，进而实现负电性GOx的负载。去除未反应的GOx，利用TA的粘附性以及与MnCl2·4H2O之间的强配位作用，实现MPN涂层的构筑。进一步加入MOPS缓冲液增强MPN涂层的稳定性。最后，将所制备纳米颗粒与BSA溶液进行共孵育，利用TA与BSA形成的氢键以实现BSA涂层的制备，BSA涂层可以提高纳米颗粒在生物环境中的稳定性。为了提高HCQ在凝胶体系中的缓释性能，将其包裹在脂质体中，可实现纳米颗粒和药物分子的逐级释放。水凝胶作为载体制备药物制剂具有可注射性，良好的生物相容性和可持续释放药物的能力。使用水凝胶持续释放免疫治疗药物不仅可以提高免疫治疗效果，还可以减少副作用，并且海藻酸盐的水凝胶可与机体内的内源性钙离子在肿瘤部位快速形成交联，形成的水凝胶对残留肿瘤部位具有持续治疗作用，为局部抑制肿瘤复发和转移提供了可能。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1中MSN、G@MSN以及对比例1中M@MSN的透射电镜图像；
图2为实施例1中GM@MSN的透射电镜图像以及EDX图谱；
图3为实施例1中MSN、MSN-NH2、以及GM@MSN和对比例1中M@MSN的Zeta电位图像；
图4中a为纳米水凝胶前驱体溶液H/GM@MSN以及在Ca2+的作用下交联形成水凝胶网络；b为交联形成水凝胶扫描电镜图像；c为放大的水凝胶扫描电镜图像，d为水凝胶的CLSM图像；
图5为实验例1中PBS、LipHCQ、M@MSN、GM@MSN和H/GM@MSN对4T1细胞的体外细胞毒性结果图；
图6为实验例1中PBS、LipHCQ、M@MSN、GM@MSN和H/GM@MSN活/死细胞染色试验结果图；
图7为PBS、LipHCQ、M@MSN、GM@MSN和H/GM@MSN处理的钙网蛋白(CRT)表达水平；
图8为PBS、LipHCQ、M@MSN、GM@MSN和H/GM@MSN处理的高迁移率基团框1(HMGB1)的检测结果；
图9为PBS组、LipHCQ组、M@MSN组、GM@MSN组和H/GM@MSN组的DC成熟率分析，其中a为定量分析结果，b为流式图；
图10中a为PBS组、LipHCQ组、M@MSN组、GM@MSN组和H/GM@MSN组的STING通路蛋白的Western印迹分析图；b为酶联免疫吸附法定量分析IFN-β的分泌结果图；c为LC3B-II/I比值和p62蛋白图；
图11中a为PBS组、LipHCQ组、M@MSN组、GM@MSN组和H/GM@MSN组处理肿瘤的体积变化情况；b为肿瘤质量变化情况；
图12为PBS组、LipHCQ组、M@MSN组、GM@MSN组和H/GM@MSN组处理后复发性肿瘤中CD4+和CD8+T细胞的免疫荧光图像。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明的第一种典型的实施方式，提供一种纳米水凝胶前驱体的制备方法，包括以下步骤：
(1)将介孔二氧化硅(MSN)分散于无水乙醇中，向悬浮液中加入氨水(NH3·H2O)和3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTES)，搅拌反应，反应完成后即得氨基化介孔二氧化硅MSN-NH2；
(2)将步骤(1)中制备的MSN-NH2分散于去离子水中，加入葡萄糖氧化酶(GOx)，进行孵育，孵育结束后即得负载GOx的纳米颗粒G@MSN；
(3)将步骤(2)中制备的G@MSN分散于去离子水中，依次加入单宁酸(TA)、二价锰盐溶液和3-吗啉丙磺酸缓冲液(MOPS)，形成MPN涂层，后加入牛血清蛋白溶液(BSA)，涡旋以形成BSA涂层，形成负载GOx和Mn2+的纳米颗粒GM@MSN；
(4)将透析完成后的脂质体置于羟基氯喹(HCQ)溶液中进行孵育，孵育结束后即得负载有羟基氯喹的脂质体LipHCQ；
(5)将海藻酸钠加入到去离子水中，搅拌后加入步骤(3)中制备的纳米颗粒GM@MSN与步骤(4)中制备的LipHCQ，搅拌反应即得纳米水凝胶前驱体溶液H/GM@MSN。
本发明制备的水凝胶前驱体溶液H/GM@MSN与机体内源性钙离子反应生成纳米水凝胶H/GM@Gel。
在一种或多种实施方式中，所述步骤(1)中，所述MSN质量与无水乙醇的体积比为120～140mg：3.5～4.5mL，优选为130mg：3.9mL。
在一种或多种实施方式中，所述步骤(1)中，所述MSN质量与NH3·H2O和APTES的体积比为120～140mg：200～230μL：120～150μL，优选为130mg：216μL：130μL.
在一种或多种实施方式中，所述步骤(1)中，所述搅拌反应的时间为10～15h，优选为12h。
在一种或多种实施方式中，所述步骤(1)中，反应完成后分别用乙醇和去离子水洗涤三次。
在一种或多种实施方式中，所述步骤(2)中，MSN-NH2与GOx的质量比为20:1～2，优选为20:1.2。
在一种或多种实施方式中，所述步骤(2)中，MSN-NH2与去离子水的质量比为1:800～1200，优选为1:1000。
在一种或多种实施方式中，所述步骤(2)中，孵育的条件为3～5℃孵育5～8h，优选为4℃孵育6h。
在一种或多种实施方式中，所述步骤(2)中，孵育完成后离心去除游离的GOx。
在一种或多种实施方式中，所述步骤(3)中，所述二价锰盐为MnCl2、MnSO4、Mn(CH3COO)2，优选为MnCl2。
在一种或多种实施方式中，所述步骤(3)中，负载GOx的纳米颗粒与去离子水的质量比为1:800～1200，优选为1:1000。
在一种或多种实施方式中，所述步骤(3)中，负载GOx的纳米颗粒与TA、二价锰盐的质量比为20:7～9:1.2～1.5.优选为20:8:1.46。
在一种或多种实施方式中，所述步骤(3)中，所述去离子水与MOPS的体积比为1:0.8～1.2，优选为1:1。
在一种或多种实施方式中，所述步骤(3)中，所述BSA溶液的浓度为0.8～1.2mg/mL，优选为1mg/mL。
在一种或多种实施方式中，所述步骤(3)中，所述BSA溶液与负载GOx的纳米颗粒的质量比为4～6:20，优选为5:20。
在一种或多种实施方式中，所述步骤(3)中，涡旋的条件为常温下涡旋2～4min，优选为3min；转速为1800～2200rpm，优选为2000rpm。
在一种或多种实施方式中，所述步骤(4)中，透析完成后的脂质体其制备方法包括：将氢化大豆磷脂(HSPC)、胆固醇(Chol)和磷脂-甲氧基聚乙二醇(DSPE-mPEG2000)溶于有机溶剂氯仿中，旋蒸去除溶剂，形成脂质体；加入硫酸铵溶液进行水化，使用高压微流化器对该脂质体悬浮液进行挤压，后使用PBS缓冲液对挤压后的脂质体进行透析。
进一步的，所述HSPC、Chol和DSPE-mPEG2000的质量比为3:0.9～1.1:0.9～1.1，优选为3:1:1。
进一步的，所述硫酸铵溶液的浓度为0.2～0.4M，优选为0.3M。
进一步的，高压微流化器中进行挤压的工作压力为13000～18000psi，优选为15000psi。
进一步的，透析的时间为20～30h，优选为24h。
在一种或多种实施方式中，所述步骤(4)中，所述HCQ的投药量为脂质体质量的5％～25％。
在一种或多种实施方式中，所述步骤(4)中，所述孵育的温度为50～70℃，时间为20～40min，优选为60℃，30min。
在一种或多种实施方式中，所述步骤(4)中，孵育完成后离心去除游离的HCQ。
在一种或多种实施方式中，所述步骤(5)中，海藻酸钠与去离子水的质量比为1:800～1200，优选为1:1000。
本发明的第二种典型的实施方式，提供由上述制备方法制备的纳米水凝胶前驱体。
本发明的第三种典型的实施方式，提供一种药物组合物，所述药物组合物包括上述纳米水凝胶前驱体。
在一种或多种实施方式中，所述药物组合物中还包括肿瘤治疗相关药物。
优选的，所述肿瘤治疗相关药物为抗肿瘤药物、免疫佐剂、检查点抑制剂或抗原蛋白。
本发明的第四种典型的实施方式，提供一种药物制剂，所述药物制剂包括上述纳米水凝胶前驱体。
在一种或多种实施方式中，所述制剂为注射剂。
本发明的第五种典型的实施方式，提供上述纳米水凝胶前驱体或上述药物组合物或药物制剂在制备治疗肿瘤药物中的应用。
在一种或多种实施方式中，所述肿瘤包括良性肿瘤和/或恶性肿瘤；所述恶性瘤包括实体瘤和血液瘤，其中，实体瘤包括乳腺癌，优选为三阴性乳腺癌。
需要说明的是，肿瘤在本发明中如本领域技术人员所知的那样加以使用，其包括良性肿瘤和/或恶性肿瘤。良性肿瘤被定义为不能在体内形成侵略性、转移性肿瘤的细胞过度增殖。反之，恶性肿瘤被定义为能够形成全身性疾病(例如在远端器官中形成肿瘤转移)的具有多种细胞异常和生化异常的细胞。
实体瘤如乳腺、膀胱、骨、脑、中枢和外周神经系统、结肠、内分泌腺(如甲状腺和肾上腺皮质)、食道、子宫内膜、生殖细胞、头和颈、肾、肝、肺、喉和下咽的肿瘤、间皮瘤、卵巢、胰腺、前列腺、直肠、肾、小肠、软组织、睾丸、胃、皮肤(如黑色素瘤)、输尿管、阴道和外阴的肿瘤。恶性瘤包括遗传性癌症，例如视网膜母细胞瘤和肾母细胞瘤(Wilmstumor)。此外，恶性瘤包括在所述器官中的原发性肿瘤及在远端器官中的相应继发性肿瘤(肿瘤转移)。血液瘤如侵略性和无痛形式的白血病和淋巴瘤，即非霍奇金病、慢性和急性髓样白血病(CML/AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、霍奇金病、多发性骨髓瘤和T-细胞型淋巴瘤。还包括骨髓增生异常综合征、浆细胞瘤、类肿瘤综合征和未知原发部位的癌症及AIDS相关的恶性瘤。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
纳米水凝胶前驱体的制备
(1)将MSN(110nm，130mg)分散于3.9mL无水乙醇中，向悬浮液中加入216mL NH3·H2O和130μLAPTES，搅拌条件下反应12h，反应完成后，分别用乙醇和水洗涤三次，即得MSN-NH2；
(2)将步骤(1)中制备的MSN-NH2(20mg)分散于去离子水(20mL)中，加入GOx(1.2mg)，在4℃下孵育6h，孵育结束后即得负载GOx的纳米颗粒G@MSN；
(3)将步骤(2)中制备的G@MSN(20mg)分散于去离子水(20mL)中，依次加入0.2mLTA(40mg/mL)、0.2mL MnCl2·4H2O溶液(7.3mg/mL)和20mL MOPS(20mM，pH＝7.4)，形成MPN涂层，后加入5mLBSA溶液(1mg/mL)，常温下在2000rpm的转速下涡旋3min以形成BSA涂层形成负载GOx和Mn2+的纳米颗粒GM@MSN；
(4)将HSPC(75mg)、Chol(25mg)和DSPE-mPEG2000(25mg)溶于10mL氯仿中。用旋转蒸发仪去除溶剂，形成脂质体。然后，加入10mL硫酸铵溶液(0.3M)进行水化，并将脂质体悬浮液通过高压微流化器在15000psi的工作压力下挤压四次。得到的脂质体用PBS缓冲液(10mM)透析24h，将15mg HCQ分散于20mL去离子水中，将透析完成后的脂质体与该溶液混合，在60℃的条件下孵育30min，然后离心(50000g，40min，4℃)以除去游离的HCQ。
(5)将海藻酸钠(50mg)加入到去离子水(5mL)中，剧烈搅拌2h，充分溶解；加入步骤(3)中制备的纳米颗粒GM@MSN与步骤(4)中制备的LipHCQ，混合即得纳米水凝胶前驱体溶液H/GM@MSN。
对比例1
(1)将MSN(110nm，130mg)分散于3.9mL无水乙醇中，向悬浮液中加入216mL NH3·H2O和130μL APTES，搅拌反应12h，反应完成后，分别用乙醇和水洗涤三次，即得MSN-NH2；
(2)将步骤(1)中制备的MSN-NH2(20mg)分散于去离子水(20mL)中，依次加入0.2mLTA(40mg/mL)、0.2mL MnCl2·4H2O溶液(7.3mg/mL)和20mLMOPS(20mM，pH＝7.4)，形成MPN涂层，后加入5mLBSA溶液(1mg/mL)，室温下在2000rpm的转速下涡旋3min形成BSA涂层，形成负载Mn2+的纳米颗粒M@MSN。
实施例2
本实施例对于实施例1中MSN、MSN-NH2、以及GM@MSN和对比例1中M@MSN进行表征。
图1为实施例1中MSN、G@MSN以及对比例1中M@MSN的透射电镜图像，从图1中可以看出MSN-NH2以及M@MSN其形态都没有发生明显变化，这表明MSN具有良好的单分散性，纳米颗粒的大小约为150nm。
图2为实施例1中GM@MSN的透射电镜图像以及EDX图谱，从图2中可以看出，GM@MSN形态没有发生明显变化，同时EDX图谱也证明了纳米颗粒GM@MSN的成功制备。
图3为MSN、MSN-NH2、以及GM@MSN和对比例1中M@MSN的Zeta电位图像，从图3中可以看出MSN的Zeta电位在-16.83mV左右，M@MSN的电位在-9.38mV左右，吸附GOx后电位上升到8.75mV左右。
实施例3
实施例1中制备的纳米水凝胶前驱体溶液H/GM@MSN加入Ca2+后，可以交联形成纳米水凝胶H/GM@Gel，如图4中a所示。图4中b为水凝胶包裹纳米颗粒的扫描电镜图像，显示了水凝胶包裹纳米颗粒的多孔结构。图4中c为水凝胶包裹纳米颗粒放大的SEM图像，图4中d为水凝胶包裹纳米颗粒的CLSM图像，表明了纳米颗粒在水凝胶中分布均匀。
实验例1载药纳米颗粒的细胞毒性验证
CCK-8检测法用于研究不同纳米颗粒对4T1细胞的体外细胞毒性。将4T1肿瘤细胞(每孔9×103)培养到96孔板中，并在细胞培养箱中培养24h。将实施例1中制备的LipHCQ、GM@MSN和H/GM@MSN(等效GOx浓度分别为0.4、0.8、1.6、3.1和6.3μg/mL；等效Mn2+浓度分别为1.2、2.4、4.8、9.3和18.9μg/mL)与对比例1制备的M@MSN分别与细胞培养24h后，在每个孔中加入CCK-8溶液以检测细胞活力(450nm吸光度)。
活/死细胞试验。将4T1细胞以每孔1×105个的密度铺到24孔板中，并在细胞培养箱中培养12h。经LipHCQ、M@MSN、GM@MSN和H/GM@MSN处理后(GOx，0.6μg/mL；Mn2+，1.8μg/mL；HCQ，10μg/mL)，加入Calcein-AM(2μM)和PI(4μM)溶液分别对活细胞和死细胞进行染色，使用荧光显微镜对细胞进行成像。
如图5所示，由于缺乏GOx，M@MSN和LipHCQ组的细胞毒性可忽略不计，而GM@MSN和H/GM@MSN对4T1细胞均表现出剂量依赖性的细胞毒性。M@MSN组和H/GM@MSN组中GOx的IC50值分别为1.15和0.94μg/mL。正如预期的那样，HCQ抑制了内部自噬，增强了STING通路，从而提高了H/GM@MSN组的杀伤效果。
活/死细胞染色试验也评估了这些纳米颗粒的细胞毒性，Calcein-AM染色阳性(绿色信号)代表活细胞，碘化丙啶染色阳性(PI，红色信号)代表死细胞。如图6所示，经M@MSN培养后，大部分细胞存活，表明M@MSN的毒性较低。然而，与H/GM@MSN培养后，近90％的细胞死亡，这与CCK-8的结果一致。这些结果表明，CDT和自噬抑制处理的协同效应增强了细胞毒性。
实验例2体外ICD检测
为了评估H/GM@MSN纳米颗粒诱导的4T1细胞免疫原性细胞死亡(ICD)效应，体外分析了钙网蛋白(CRT)和高迁移率基团框1(HMGB1)蛋白。通过流式细胞术检测CRT的暴露情况。将4T1肿瘤细胞(每孔8×104个)接种到24孔板中，在细胞培养箱中培养24h，然后分别与LipHCQ、M@MSN、GM@MSN和H/GM@MSN(GOx，0.6μg/mL；Mn2+，1.8μg/mL；HCQ，10μg/mL)培养。培养24h后，收集细胞并用DyLight 488标记的Affini纯山羊抗兔IgG进行流式细胞术检测。收集每个孔的上清液，使用HMGB1酶联免疫吸附试剂盒检测细胞外HMGB1蛋白的分泌。
如图7所示，与PBS组、LipHCQ组、M@MSN组和GM@MSN组相比，H/GM@MSN组的CRT表达水平最高。
利用ELISA试剂盒对释放的HMGB1进行了定量测定，如图8所示，H/GM@MSN组的HMGB1释放量也是最高的，约为116ng/mL，分别是GM@MSN组和M@MSN组的1.28倍和2.68倍。
以上结果显示CDT可诱导释放更多的肿瘤抗原，从而诱导ICD并刺激DC成熟，为后续免疫治疗做铺垫。
实验例3体外树突状细胞成熟分析
骨髓衍生树突状细胞(BMDCs)取自6周大的雌性C57BL/6小鼠，在细菌培养皿中以1×106cells/mL的密度培养，培养基为含有GM-CSF(20ng/mL)和IL-4(10ng/mL)的RPMI 1640完全培养基。细胞培养基在第2、4和6天刷新。第7天，收获未成熟的BMDCs，按每孔3×105个的密度重新铺入24孔板，与4T1细胞的上清培养基一起孵育，4T1细胞预先与LipHCQ、M@MSN、GM@MSN和H/GM@MSN(GOx，0.6μg/mL；Mn2+，2.4μg/mL)孵育后，用APC-CD11c、FITC-CD80和PE/Cyanine7-CD86对BMDCs进行染色，然后用流式细胞仪进行分析。
如图9所示，PBS组、LipHCQ组、M@MSN组、GM@MSN组和H/GM@MSN组的DC成熟率分别为26.5％、28.0％、33.1％、42.7％和49.8％。一方面，CDT可诱导释放更多的肿瘤抗原，从而诱导ICD并刺激DC成熟。另一方面，基于Mn2+的CDT与LipHCQ的自噬抑制作用一起增强了STING的活化，从而增加了IFN-β的释放。进一步刺激DC成熟进而激活抗肿瘤免疫反应并调节TME。这些结果表明，CDT与Mn2+释放和自噬抑制相结合，能放大STING信号，有效促进DC成熟，提高细胞内抗肿瘤免疫疗法的效果。
实验例4STING蛋白及自噬蛋白的检测
将4T1细胞转移到密度为3×105个细胞/孔的6孔板中，在37℃细胞培养箱中培养24h。然后分别用LipHCQ、M@MSN、GM@MSN和H/GM@MSN(GOx，0.8μg/mL；Mn2+，2.4μg/mL)处理细胞24h，然后用1.5ml离心管收集细胞，加入RIPA裂解缓冲液和PMSF。孵育30min后，以13800g的速度离心15min，收集上清液，用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白质浓度。用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离等量的蛋白质样品，并将其转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，然后在含5％脱脂牛奶的TBST溶液中封闭1h。用STING、P-STING(Ser366)、LC3B、SQSTM1/p62(p62)的一抗在4℃摇床上孵育15h。最后，用凝胶成像系统得出Western印迹结果。β-actin作为内参抗体。
图10中a所述，Western印迹检测了STING、磷酸化STING(P-STING，Ser366)的表达，反映了GM@MSN联合LipHCQ对STING通路的激活作用。结果，M@MSN组和H/GM@MSN组的P-STING、的表达量明显高于其他组。此外，为了评估H/GM@MSN对STING通路的影响，采用ELISA方法评估了INF-β的释放情况。如图10中b所示，H/GM@MSN组诱导IFN-β因子的释放量最大，证实了CDT结合Mn2+释放可放大STING信号，诱导4T1细胞释放干扰素。LipHCQ与Mn2+联合可引起更强的STING激活。
为了更好地了解STING的激活情况，还对处理后的自噬水平进行了研究。用Western印迹法评估了LC3B-II和SQSTM1/p62(p62)的表达。与PBS组和GM@MSN组相比，LipHCQ处理的细胞中LC3B-II/I比值和p62蛋白明显增加(图10中c)，表明自噬抑制导致细胞内自噬体大量产生。此外，GM@MSN处理的细胞中p62蛋白下调，这可能是由于STING通路的激活导致了保护性自噬。重要的是，H/GM@MSN组的LC3B-II/I比值和p62表达均高于其他组，这表明内部保护性自噬过程在很大程度上受到了抑制。这一途径的阻断应有利于氧化损伤的加剧和dsDNA的积累，从而进一步放大STING途径，增强免疫治疗。
实验例5体内抗肿瘤效果验证
为了验证H/GM@Gel的抑制复发作用，建立了乳腺肿瘤术后模型。简言之，将4T1细胞(2×106)注射到Balb/c小鼠的右侧臀背部。当肿瘤体积达到约100～150mm3时，切除90％的原发肿瘤并缝合切口。手术后，将小鼠随机分为5组，在手术区域注射100μL水凝胶前驱体(海藻酸钠溶液)负载不同的纳米颗粒，包括PBS溶液、LipHCQ、M@MSN、GM@MSN和H/GM@MSN(GOx，3mg/kg；Mn2+，1～2mg/kg；HCQ，10mg/kg)。每3天测量一次体重和复发肿瘤体积，并根据以下公式计算肿瘤大小：
体积(mm3)＝0.5×宽度2(mm2)×长度(mm)。
第24天，收获肿瘤进行进一步分析。具体来说，肿瘤切片的H&E用于研究肿瘤细胞的坏死情况。流式细胞术进一步分析CD4+和CD8+T细胞的表达。
4T1肿瘤模型用于检测对术后肿瘤复发的抑制作用，接种4T1肿瘤细胞后9天行手术切除。肿瘤切除腔在缝合前分别注入水凝胶前驱体(海藻酸钠溶液)负载不同的纳米颗粒，PBS、LipHCQ、M@MSN、GM@MSN和H/GM@MSN。每3天监测一次体重。如图11所示，注射后15天，PBS组、LipHCQ组和M@MSN组的肿瘤体积增加超过1000mm3。GM@MSN组的肿瘤在后期有增大的趋势，这可能与免疫抑制性肿瘤微环境和缺乏肿瘤相关抗原有关。相反，用H/GM@MSN治疗的小鼠能显著抑制肿瘤的复发，表明凝胶介导的GOx与Mn2+和自噬抑制剂结合具有很强的抗肿瘤能力。不同处理后收获的肿瘤的重量证实了H/GM@MSN的抗肿瘤效果优于其他组。
此外，还对肿瘤组织进行了免疫荧光染色，以检测CD4+T细胞和CD8+T细胞的表达。如图12所示，H/GM@MSN组的荧光信号更多，表明H/GM@MSN能提高CD8+T和CD4+T细胞的肿瘤浸润水平。换句话说，CDT明显增强了Mn2+对STING通路的激活，而HCQ则抑制了STING通路激活引起的保护性自噬，从而分泌更多的IFN-β，刺激DC成熟，继而招募更多的细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)。这些结果证实，STING通路激活的增强与自噬抑制相结合，能显著激活抗肿瘤免疫反应。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种纳米水凝胶前驱体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将介孔二氧化硅分散于无水乙醇中，向悬浮液中加入氨水和3-氨丙基三甲氧基硅烷，搅拌反应，反应完成后即得氨基化介孔二氧化硅MSN-NH2；
(2)将步骤(1)中制备的MSN-NH2分散于去离子水中，加入葡萄糖氧化酶，进行孵育，孵育结束后即得负载GOx的纳米颗粒G@MSN；
(3)将步骤(2)中制备的G@MSN分散于去离子水中，依次加入单宁酸、二价锰盐溶液和3-吗啉丙磺酸缓冲液，形成MPN涂层，后加入牛血清蛋白溶液，涡旋以形成BSA涂层，形成负载GOx和Mn2+的纳米颗粒GM@MSN；
(4)将透析完成后的脂质体置于羟基氯喹溶液中进行孵育，孵育结束后即得负载有羟基氯喹的脂质体LipHCQ；
(5)将海藻酸钠加入到去离子水中，搅拌后加入步骤(3)中制备的纳米颗粒GM@MSN与步骤(4)中制备的LipHCQ，搅拌反应即得纳米水凝胶前驱体溶液H/GM@MSN。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，纳米水凝胶前驱体溶液H/GM@MSN与机体内源性钙离子反应生成纳米水凝胶H/GM@Gel。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，MSN-NH2与GOx的质量比为20:1～2，优选为20:1.2；
或，所述步骤(3)中，所述二价锰盐为MnCl2、MnSO4、Mn(CH3COO)2，优选为MnCl2；
或，所述步骤(3)中，负载GOx的纳米颗粒与TA、二价锰盐的质量比为20:7～9:1.2～1.5.优选为20:8:1.46；
或，所述步骤(4)中，所述HCQ的投药量为脂质体质量的5％～25％。
4.权利要求1～3任一项所述的制备方法制备的纳米水凝胶前驱体溶液H/GM@MSN。
5.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求4所述的纳米水凝胶前驱体溶液H/GM@MSN。
6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中还包括肿瘤治疗相关药物。
7.一种药物制剂，其特征在于，所述药物制剂包括权利要求4所述的纳米水凝胶前驱体溶液H/GM@MSN。
8.如权利要求8所述的药物制剂，其特征在于，所述制剂为注射剂。
9.权利要求4所述的纳米水凝胶前驱体溶液H/GM@MSN和/或权利要求5所述的药物组合物和/或权利要求8所述的药物制剂在制备治疗肿瘤药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括良性肿瘤和/或恶性肿瘤；所述恶性瘤包括实体瘤和血液瘤，其中，所述实体瘤包括乳腺癌，优选为三阴性乳腺癌。
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