CN120683098A - 嵌合体逆转录引物及其在精准基因编辑中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了嵌合体逆转录引物及其在精准基因编辑中的应用，通过合成的嵌合体引物即包含了sgRNA和5’端20bp同源重组模板（HDR）上的DNA序列的RNA:DNA嵌合体为模板，以体外转录HDR形成的RNA为模板，进行一轮逆转录并最终形成共价RNA:DNA嵌合物。嵌合物在阴离子聚合物多聚谷氨酸的协同下与CRISPR/Cas9蛋白形成RNP复合物用于编辑哺乳动物细胞基因，能够显著提高电转的效率、细胞活率以及RNP入核的效率并最终实现基因组DNA精准、高效地编辑，对于提高哺乳动物细胞基因编辑率具有较高的实用价值。

Description

嵌合体逆转录引物及其在精准基因编辑中的应用

技术领域

本发明涉及基因编辑技术领域，具体为嵌合体逆转录引物及其在精准基因编辑中的应用。

背景技术

基因编辑技术是生命科学领域的革命性突破，其发展历程体现了人类对基因操控能力的不断提升。自从2012年Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier团队首次证明CRISPR/Cas9系统可在体外切割特定DNA序列，提出其作为基因编辑工具的潜力之后，2013年张锋团队首次在哺乳动物细胞中成功应用CRISPR/Cas9进行基因编辑，标志着其向实际应用的飞跃。CRISPR/Cas技术自诞生以来，已从基础科学工具发展为跨学科的革命性平台，其低成本、高效率的特点推动了生物医学、农业和工业的变革。尽管面临脱靶效应、递送挑战和伦理争议，但通过持续的技术优化（如精准编辑工具、新型递送系统）和全球合作治理，CRISPR有望在未来实现更安全、更广泛的应用，为人类健康、粮食安全和可持续发展提供关键解决方案。

CRISPR/Cas是一种基于细菌天然免疫系统的基因编辑工具，通过RNA引导的核酸酶靶向切割特定DNA序列。CRISPR系统的体内外递送是临床应用的关键瓶颈，现有的CRISPR递送系统包括：

1）病毒载体，包括腺相关病毒（AAV）、慢病毒（LV），具有 高转导效率、长期表达的优势，但在免疫原性、载体容量（AAV仅~4.7kb）等方面存在短板；

2）非病毒载体，包括脂质纳米颗粒（LNP）、金纳米颗粒，具有低免疫原性、可大规模生产的优势，但同时存在体内靶向性差、细胞毒性的缺陷；

3）物理方法，包括电穿孔、微注射，可直接递送、适用于体外细胞，但对组织损伤大、难以体内应用；

生物载体，如外泌体、工程化细菌，具有天然靶向性、可穿透生物屏障，但负载效率低、制备复杂除了递送以外，如何实现靶标基因的精准修复而降低非必须的脱靶率也是CRISPR/Cas系统面临的重要挑战之一。现有的精准基因编辑的方法主要包括通过外源提供基因编辑的模板从而使被切割的位点在同源重组修复过程中按照既定的模板修复为目的基因。而随着目标基因缺失或者插入的片段过大，这将使得递送靶标片段成为难点。一般大于1000bp的片段通常会采用病毒载体来递送，虽然极大地调高了目的片段导入，但是这也造成了不可控遗传风险。同时，相较于双链DNA同源修复模板，单链DNA模板能较少的激活细胞凋亡通路，并且更大的提供基因编辑的效率。基于此，本发明将用于引导Cas9与靶标DNA序列结合的导引RNA序列以及用来提供同源重组修复的模板DNA（同时在同源重组模板两端添加添加氨基端含有4个核苷酸突变的Cas9识别序列及PAM结构）的部分核苷酸序列，在体外利用化学合成的方法合成一段导引RNA和含有23 bp DNA同源重组模板的核苷酸序列形成嵌合体引物。利用该引物进行一轮逆转录反应，并将结合在cDNA上的RNA消化掉，就可以得到一段导引RNA和单链同源重组模板。同时我们利用阴离子聚合物PGA与CRISPR/Cas系统的Cas9蛋白和我们体外逆转录形成的导引RNA与单链同源重组模板进行孵育。由于Cas9蛋白能识别位于同源重组两端的Cas9识别序列，但是由于识别序列含有突变而没法切割靶序列，使得CRISPR/Cas系统的RNP在体外形成一个复合物。该复合物在Cas9蛋白含有的核定位序列引导下可以高效精准的定位到我们要靶向的基因组旁，从而实现高效精准的编辑靶标基因。本发明极大地提高了基因编辑的效率，并有效的减少了脱靶率，同时降低了细胞毒性。下面将以人免疫细胞CD4⁺T细胞为例说明。

发明内容

本发明提供了嵌合体逆转录引物及其在精准基因编辑中的应用，解决现有精准基因技术编辑率低和细胞毒性及脱靶的缺陷，为难转细胞编辑提供更优方案。

有鉴于此，本发明的方案为：

本发明的第一个方面在于，提出嵌合体逆转录引物，包含sgRNA3:ssHDR3和sgRNA7:ssHDR7 两条引物，所述sgRNA3、sgRNA7对应分别靶向如SEQ ID NO.1、2所示的核苷酸序列，所述ssHDR3、ssHDR7对应核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5、6所示。

进一步地，sgRNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；和/或，所述sgRNA7的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的第二个方面在于，提出RNA:DNA 嵌合体，包括sgRNA3:ssHDR3嵌合体和sgRNA7:ssHDR7嵌合体，分别以HDR3和HDR7为模板经第一个方面所述嵌合体逆转录引物进行逆转录，并消化掉结合的RNA得到，所述HDR3和HDR7分别含有CTS序列和PAM序列。

进一步地，所述HDR3、HDR7分别对应由核苷酸序列如SEQ ID NO.7、8所示的同源修复模板转录得到。

本发明的第三个方面在于，提出RNP复合物，由第二个方面所述的RNA：DNA 嵌合体，与Cas9蛋白经PGA孵育得到。

进一步地，所述PGA浓度为100mg/ml。

本发明的第四个方面在于，提出转染有第三个方面所述RNP复合物的哺乳动物细胞。

本发明的第五个方面在于，提出第三个方面所述的RNP复合物在哺乳动物细胞基因编辑中的应用。

优选地，以上所述哺乳动物细胞为人体细胞，包括但不限于造血干细胞、免疫细胞等，更优选为CD4⁺T细胞。

本发明的第六个方面在于，提出一种高效的CD34⁺ 造血干细胞CCR5△32/△32基因的精准编辑方法，使用第三个方面所述的RNP复合物电转至野生型CCR5基因的CD34⁺ 造血干细胞内，或将第四个方面所述CD34⁺ 造血干细胞进行电转染，再经培养得到大量的可用于临床移植的CCR5△32/△32基因型的CD34⁺造血干细胞。

本发明的第七个方面在于，CCR5△32/△32基因型的CD34⁺造血干细胞在制备HIV-1治疗药物中的应用，所述CCR5△32/△32基因型的CD34⁺ 造血干细胞由第六个方面所述的方法得到。

与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：

本发明所述嵌合体逆转录引物通过在ssHDR两端加入含有5‘端突变4个核苷酸的cas9蛋白20nt识别序列及PAM结构的Cas9 CTS从而可以结合Cas9但并不会切割外源嵌合体的序列，有利于在干细胞基因编辑中提高靶向基因切割和修复的准确性。

本发明所述RNP复合物通过将带有核定位序列的Cas9与同源重组模板及sgRNA以合适的比例在PGA的协助下形成紧密的纳米复合物，即包裹Cas9蛋白、sgRNA或核糖核蛋白复合物（RNP），防止被血清核酸酶降解，延长体内循环时间。PGA纳米颗粒通过表面电荷修饰增强细胞膜穿透能力，尤其在难转染的原代细胞或干细胞中效果显著，进而提高靶向基因切割和修复的准确性及终产品造血干细胞的活性。

本发明所述基因编辑方法利用外源转入含有Cas9蛋白和guide RNA的RNP复合物及CCR5△32 缺失的CCR5序列作为同源修复模板（HDR）来得到精准高效的CCR5△32基因编辑型CD34⁺ 造血干细胞。同源修复的模板两端含有Cas9蛋白靶标序列及Cas9识别的PAM序列。HDR两端加入Cas9识别序列可以通过和Cas9蛋白结合从而提高Cas9蛋白、导引RNA（guide RNA）及HDR在PGA的帮助下形成稳定的RNP复合物纳米颗粒，从而提高电转的效率、细胞活率以及RNP入核的效率并最终实现CCR5精准、高效的缺失32bp的突变，对于提高造血干细胞编辑率具有显著的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中所述体外组装导引RNA(sgRNA)以及两端包含Cas9识别序列的单链（ssHDR）同源重组模板嵌合体的示意图。

图2为本发明实施例1中所述双链（dsHDR）同源重组模板以及双靶点介导CCR5基因编辑的示意图。

图3为本发明实施例1中双链（dHDR）同源重组模板及sgRNA:ssHDR嵌合物凝胶电泳图。

图4为本发明实施例1中嵌合体基因修饰效率混样测序图谱。

图5为本发明实施例1中单克隆测序CCR5△32基因图谱。

图6为本发明实施例2中基因编辑后测序图谱。

图7为本发明实施例3中基因编辑后测序图谱。

具体实施方式

下面将结合优选的实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

术语解释

Cas蛋白：具有核酸酶活性的效应蛋白（如Cas9、Cas12a），负责切割DNA。

sgRNA：single guide RNA，是CRISPR-Cas9基因编辑系统中的关键组成部分，通过引导Cas9蛋白靶向特定DNA序列实现精准基因编辑。

HDR：Homology directed repair，同源介导的双链DNA修复序列。

ssHDR：single strand homology directed repair，单链同源修复序列。

sgRNA:ssHDR：为sgRNA 3'端与 ssHDR 的5'端首尾结合形成的序列。

CTS：Cas9 target sequence，为Cas9靶序列。

PAM：Protospacer Adjacent Motif原间隔相邻序列，长度为3-4个核苷酸，用于Cas9蛋白识别互补外源DNA并形成RNP复合物。

PGA：‌Poly-L-glutamic acid‌，聚谷氨酸。

MCTS，mutant Cas9 target sequence, 经过突变改造的CRISPR/Cas9系统中的Cas9蛋白的靶序列。

RNP：Ribonucleoprotein complex，核糖核蛋白复合体，是由特定蛋白与特定RNA形成的复合体。

在一个实施例中，通过优化递送系统提高造血干细胞CD34⁺细胞基因编辑率，利用化学合成法合成一段含有sgRNA、crRNA和20 nt ssHDR序列的RNA:DNA chimera片段，并利用该片段作为逆转录的引物，以体外转录的HDR3和HDR7的RNA作为模版，进行一轮逆转录反应。反应结束后使用RNase H消化掉结合的RNA即可以得到RNA:DNA 单链chimera。通过在ssHDR两端加入含有核苷酸突变的MCTS及Cas9识别的PAM序列及通过体外实验将ssHDR与sgRNA连接。MCTS序列可以通过和Cas9蛋白结合从而提高Cas9蛋白、sgRNA及HDR在PGA的帮助下形成稳定的RNP复合物纳米颗粒并高效入核，从而提高电转的效率、细胞活率以及CCR5精准、高效的缺失32bp的突变。

在另一个实施例中，提出高效产生CCR5△32的方法，其步骤如下：

利用外源转入含有Cas9蛋白和sgRNA的RNP复合物及CCR5△32 缺失的CCR5单链序列作为ssHDR来得到精准高效的CCR5△32/△32基因型细胞。ssHDR两端含有Cas9蛋白靶标序列及Cas9识别的PAM序列。HDR两端加入Cas9识别序列可以通过和Cas9蛋白结合但不切割模版从而提高Cas9蛋白、sgRNA及ssHDR在多PGA的帮助下形成稳定的RNP复合物颗粒，从而提高电转入核的效率以并最终实现CCR5精准、高效的缺失32bp的突变。

基于上述方法的细胞，具体指利用外源转入含有Cas9蛋白和sgRNA的RNP复合物及ssHDR得到精准高效的CCR5△32/△32基因型的某类细胞，如CD34⁺造血干细胞；在上述实施例中，所述CCR5△32/△32基因型的造血干细胞及其RNP复合物或纳米颗粒能够用于制备艾滋病治疗药物。

实施例1

本实施例通过体外组装单链DNA并含有cas9识别序列和PAM序列的模版和sgRNA嵌合体，并在PGA帮助下和Cas9充分孵育形成纳米复合物，从而在电转染后在核定位序列（NLS）的引导下高效入核，从而提高基因编辑的效率和细胞的活率。

如图1所示，我们在将要缺失序列的负链上分别设计了两条guide RNA，即sgRNA3和sgRNA7。利用化学合成的方式分别合成两条针对CCR5基因的sgRNA，以及含有N端4个突变碱基的MCTS及PAM序列的ssDNA的嵌合体引物，即primer 3和primer 7。以体外转录HDR3和HDR7的RNA作为模版，使用primer 3和primer 7进行一轮逆转录反应，反应结束后使用RNase H消化掉结合的RNA，得到sgRNA3:ssHDR3和sgRNA7:ssHDR7嵌合体，其浓度为80mΜ。上述双链（dsHDR）同源重组模板以及双靶点介导CCR5基因编辑的示意图如图2所示。

涉及的靶点或模板序列如下：

靶点3(sgRNA3靶向序列)：（SEQ ID NO.1）

CAGAATTGATACTGACTGTATGG

靶点7(sgRNA7靶向序列)：（SEQ ID NO.2）

AAGATGACTATCTTTAATGTCTGG

sgRNA3（SEQ ID NO.3）：

CAGAAUUGAUACUGACUGUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC

sgRNA7（SEQ ID NO.4）：

AGAUGACUAUCUUUAAUGUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC

ssHDR3（SEQ ID NO.5）：AGTGATTGATACTGACTGTA

ssHDR7（SEQ ID NO.6）：GTGCGACTATCTTTAATGTC

HDR3（SEQ ID NO.7）：

CAGAATTGATACTGACTGTATGGTTATGCACAGGGTGGAACAAGATGGATTATCAAGTGTCAAGTCCAATCTATGACATCAATTATTATACATCGGAGCCCTGCCAAAAAATCAATGTGAAGCAAATCGCAGCCCGCCTCCTGCCTCCGCTCTACTCACTGGTGTTCATCTTTGGTTTTGTGGGCAACATGCTGGTCATCCTCATCCTGATAAACTGCAAAAGGCTGAAGAGCATGACTGACATCTACCTGCTCAACCTGGCCATCTCTGACCTGTTTTTCCTTCTTACTGTCCCCTTCTGGGCTCACTATGCTGCCGCCCAGTGGGACTTTGGAAATACAATGTGTCAACTCTTGACAGGGCTCTATTTTATAGGCTTCTTCTCTGGAATCTTCTTCATCATCCTCCTGACAATCGATAGGTACCTGGCTGTCGTCCATGCTGTGTTTGCTTTAAAAGCCAGGACGGTCACCTTTGGGGTGGTGACAAGTGTGATCACTTGGGTGGTGGCTGTGTTTGCGTCTCTCCCAGGAATCATCTTTACCAGATCTCAAAAAGAAGGTCTTCATTACACCTGCAGCTCTCATTTTCCATACATTAAAGATAGTCATCTTGGGGCTGGTCCTGCCGCTGCTTGTCATGGTCATCTGCTACTCGGGAATCCTAAAAACTCTGCTTCGGTGTCGAAATGAGAAGAAGAGGCACAGGGCTGTGAGGCTTATCTTCACCATCATGATTGTTTATTTTCTCTTCTGGGCTCCCTACAACATTGTCCTTCTCCTGAACACCTTCCAGGAATTCTTTGGCCTGAATAATTGCAGTAGCTCTAACAGGTTGGACCAAGCTATGCAGGTGACAGAGACTCTTGGGATGACGCACTGCTGCATCAACCCCATCATCTATGCCTTTGTCGGGGAGAAGTTCAGAAACTACCTCTTAGTCTTCTTCCAAAAGCACATTGCCAAACGCTTCTGCAAATGCTGTTCTATTTTCCAGCAAGAGGCTCCCGAGCGAGCAAGCTCAGTTTACACCCGATCCACTGGGGAGCAGGAAATATCTGTGGGCTTGTGACACGGACTCAAGTGGGCTGGTGACCCAGTCAGAGTTGTGCACATGGCTTAGTTTTCATACACAGCCTGGGCTGGGGGTGGGGTGGGAGAGGTCTTTTTTAAAAGGAAGTTACTGTTATAGAGGGTCTAAGATTCATCCATTTATTTGGCATCTGTTTAAAGTAGATTAGATCTTTTAAGCCCATCAATTATAGAAAGCCAAATCAAAATATGTTGATGAAAAATAGCAACCTTTTTATCTCCCCTTCACATGCATCAAGTTATTGACAAACTCTCCCTTCACTCCGAAAGTCCATACAGTCAGTATC AATTCTG

HDR7（SEQ ID NO.8）

CAGAGACTATCTTTAATGTCTGGTTATGCACAGGGTGGAACAAGATGGATTATCAAGTGTCAAGTCCAATCTATGACATCAATTATTATACATCGGAGCCCTGCCAAAAAATCAATGTGAAGCAAATCGCAGCCCGCCTCCTGCCTCCGCTCTACTCACTGGTGTTCATCTTTGGTTTTGTGGGCAACATGCTGGTCATCCTCATCCTGATAAACTGCAAAAGGCTGAAGAGCATGACTGACATCTACCTGCTCAACCTGGCCATCTCTGACCTGTTTTTCCTTCTTACTGTCCCCTTCTGGGCTCACTATGCTGCCGCCCAGTGGGACTTTGGAAATACAATGTGTCAACTCTTGACAGGGCTCTATTTTATAGGCTTCTTCTCTGGAATCTTCTTCATCATCCTCCTGACAATCGATAGGTACCTGGCTGTCGTCCATGCTGTGTTTGCTTTAAAAGCCAGGACGGTCACCTTTGGGGTGGTGACAAGTGTGATCACTTGGGTGGTGGCTGTGTTTGCGTCTCTCCCAGGAATCATCTTTACCAGATCTCAAAAAGAAGGTCTTCATTACACCTGCAGCTCTCATTTTCCATACATTAAAGATAGTCATCTTGGGGCTGGTCCTGCCGCTGCTTGTCATGGTCATCTGCTACTCGGGAATCCTAAAAACTCTGCTTCGGTGTCGAAATGAGAAGAAGAGGCACAGGGCTGTGAGGCTTATCTTCACCATCATGATTGTTTATTTTCTCTTCTGGGCTCCCTACAACATTGTCCTTCTCCTGAACACCTTCCAGGAATTCTTTGGCCTGAATAATTGCAGTAGCTCTAACAGGTTGGACCAAGCTATGCAGGTGACAGAGACTCTTGGGATGACGCACTGCTGCATCAACCCCATCATCTATGCCTTTGTCGGGGAGAAGTTCAGAAACTACCTCTTAGTCTTCTTCCAAAAGCACATTGCCAAACGCTTCTGCAAATGCTGTTCTATTTTCCAGCAAGAGGCTCCCGAGCGAGCAAGCTCAGTTTACACCCGATCCACTGGGGAGCAGGAAATATCTGTGGGCTTGTGACACGGACTCAAGTGGGCTGGTGACCCAGTCAGAGTTGTGCACATGGCTTAGTTTTCATACACAGCCTGGGCTGGGGGTGGGGTGGGAGAGGTCTTTTTTAAAAGGAAGTTACTGTTATAGAGGGTCTAAGATTCATCCATTTATTTGGCATCTGTTTAAAGTAGATTAGATCTTTTAAGCCCATCAATTATAGAAAGCCAAATCAAAATATGTTGATGAAAAATAGCAACCTTTTTATCTCCCCTTCACATGCATCAAGTTATTGACAAACTCTCCCTTCACTCCGAAAGTCCAGACATTAAAGATA GTCTCTG

上述HDR3和HDR7中划横线部分为CTS和PAM，PAM序列为TGG。

体外组装sgRNA:ssHDR chimera的方法，其步骤如下：

1.基于以上靶点用化学合成法分别合成两条含有sgRNA和ssHDR的序列，ssHDR为N端突变4个碱基的MCTS及PAM序列的ssDNA，得到sgRNA3:ssHDR3（Primer 3）和sgRNA7:ssHDR7（Primer 7）。

它们的序列如下：

Primer of sgRNA-DNA chimera sequence：

sgRNA3:ssHDR3（Primer 3）：

CAGAAUUGAUACUGACUGUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAA CUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUAGTGATTGATACTGACTGTA

primer of sgRNA7:ssHDR7（Primer 7）：

AGAUGACUAUCUUUAAUGUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAA CUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUGTGCGACTATCTTTAATGTC

上述划横线部分为sgRNA序列，后面为含20 nt MCTS和PAM的部分ssHDR序列。

2.以含有CTS和PAM的HDR3和HDR7为模板，利用一轮PCR合成T7体外转录的模板。并以合成的产物为模板，利用T7体外转录试剂盒转录成RNA待用。

1）体外转录模板合成

a.配置PCR反应体系：

b.根据以下设置进行PCR：

c.向PCR产物中加入10μL 6 x loading buffer，混合均匀后加入至琼脂糖凝胶中，180V电泳20分钟后，于蓝光切胶仪下切取900 bp条带按每1 g凝胶加入1 ml BindingBuffer的比例，加入适量的Binding Buffer，并在55-60℃水浴中加热7-10分钟至凝胶完全溶解，期间每2-3分钟轻轻振荡一次。注意观察溶液颜色，若颜色变为紫色或红色，加入5 µl5M NaAc (pH 5.2) 调整pH值。将溶解的DNA/凝胶混合液转移至HiBind DNA柱子中，并在10,000xg离心1分钟。弃去滤液后，加入300µl Binding Buffer，再次离心1分钟，随后加入700 µl已用无水乙醇稀释的SPW Wash Buffer，离心1分钟，并重复该洗涤步骤一次。最后，空转柱子2分钟以甩干基质，将柱子转移至干净的1.5ml离心管中，加入30-50µl预热至65℃的Elution Buffer，静置2分钟后，以13,000xg离心2分钟，收集洗脱的DNA并测其浓度。

2）体外转录

a.配置体外转录反应体系：

b.将体外转录体系混合均匀后，于37 ℃孵育4 小时（孵育时间可适当延长以获得最大RNA得率）；

c.孵育完成后，向体系中加入1 μL TURBO DNase，充分混匀后在37°C孵育30分钟；

d.向消化后的体外转录混合液中加入42 μL（2倍体积）RNA结合液，混匀后加入等体积无水乙醇（3倍体外转录混合液体积），将上述混合物加入CR纯化柱中，离心后去滤液，分别用RNA预洗液及RNA洗涤液清洗1次及两次，空离后晾干五分钟确保无乙醇残留，加入适量无酶水，室温放置五分钟后离心洗脱并测定浓度。

3.利用步骤1中的引物primer3和primer7对步骤2产生的HDR3和HDR7 RNA模板进行一轮逆转录反应，反应结束后使用RNase H消化结合的RNA得到RNA:DNA chimera。

1）准备逆转录混合液

将上述体系混合后在65℃加热5分钟，然后冰浴2分钟。

2）向冰浴后的混合液中加入如下试剂

3）设置温度梯度进行逆转录

4）RNase H消化

将逆转录后的产物于98 ℃变性5分钟，变性结束后以0.1℃/s退火至25℃；向退火产物中加入3 μL RNaseH Reaction Buffer及2 μL RNaseH并加水补齐至30 μL，混匀后于37 ℃反应1小时。

5）sgRNA:ssHDR chimera回收

a.向消化后的反应液中加入90 μL（1:3体积比）混匀RNA Cleanup XP磁珠，混匀后静置30分钟以使磁珠充分吸附单链DNA模板；

b.将离心管放置在磁性分离架上，静置5分钟，直到溶液澄清，小心地移除并丢弃上清液，注意不要扰动磁珠；

c.保持管子在磁性分离架上，向磁珠中加入1 mL新鲜配制的75%无水乙醇。轻轻混匀后，再静置1分钟。小心地移除并丢弃洗涤液，重复此步骤共两次；

d.吸去洗涤液后，在磁性分离架上，打开管盖，空气干燥磁珠2-5分钟，注意不要过度干燥，以免影响回收率；

e.向磁珠中加入适量体积无酶水。轻轻混匀后，将管子从磁性分离架上取下，室温静置5分钟，以最大限度地洗脱单链DNA。将管子重新放置在磁性分离架上，静置5分钟后，小心移取上清液，该液体即为纯化后的单链HDR模板。

设计一对用于鉴定基因组修饰的鉴定引物，其中上游引物或下游引物的序列位于我们所选择HDR3’端所在的基因组的位置的下游，这样有一端引物落在染色体上，可以排除扩增出我们外源转入HDR模版的干扰。本发明中使用的是双链HDR及sgRNA:sDNA嵌合物凝胶电泳图如图3所示。嵌合体基因修饰效率混样测序图谱如图4所示。

4.CD4⁺T细胞的电转染过程

以1x10⁶个CD4⁺T细胞的电转染体系为例，需要准备的材料及具体步骤如下：

10 μg/ul 的Cas9蛋白（#632678, takara），分子质量为15000-50000的PGA（#P4761, Sigma Aldrich）100 mg/ml。电转仪Celetrix(CTX-1500A LE+)，电转液Celetrix（#13-01095）。

1）将PGA、sgRNA3:ssHDR3+mCTS嵌合体和sgRNA7:ssHDR7+mCTS嵌合体以及Cas9以0.8:1:1:1的比例混匀，置于37 ℃水浴锅15分钟。在此期间取1x10⁶个处于对数生长期的CD4⁺T细胞，PBS洗一次，1000g离心3分钟后重悬于18 ul的电转液（9ul A+9 ul B）中，置于培养箱中待用。15分钟结束后取出PGA:sgRNA:ssHDR:Cas9混合物，水浴结束后立即将提前置于电转液中的细胞转移到RNP复合物中，轻轻混匀后立即加入到20 ul的电转杯中，使用PBMC模式调节电压为1350 V电转，电转结束后迅速将细胞重悬到含有15% FBS不含双抗(p+S)的DMEM培养基中继续培养过夜，第二天将细胞培养基更换为含有1% P+S双抗的15% FBS的 DMEM中继续培养24小时。

2）扩增得到的片段连接到T载体上并转化大肠杆菌从而得到单克隆。利用此嵌合体得到基因修饰的细胞，细胞活率较高，且修饰的基因型较为单一。通过单克隆测序CCR5△32基因图谱如图5所示。

表1：嵌合体基因修饰效率和细胞活率

实施例2

通过体外组装单链DNA和sgRNA的嵌合体，并在PGA帮助下和Cas9充分孵育形成纳米复合物，从而在电转染后在核定位序列（NLS）的引导下入核，从而提高基因编辑的效率和细胞的活率。具体步骤如下：分别合成与实施例1相同的两条针对CCR5基因的sgRNA和同源重组模版的ssDNA的嵌合体引物，分别命名为靶点3-1（sgRNA3:ssHDR3）和靶点7-1(sgRNA7:ssHDR7)以其为引物逆转录得到sgRNA3:ssHDR3-1和sgRNA7:ssHDR7-1嵌合体，其浓度为80mΜ。

将组装好的嵌合体sgRNA3:ssHDR3-1和sgRNA7:ssHDR7-1与PGA和Cas9按照实施例1中的比例在体外形成纳米颗粒，并使用高频电压电转到CD4⁺T细胞中，这些步骤都与实施例1相同。最后检测目标细胞的基因编辑效率如表2所示。只含有sgRNA不含HDR基因编辑后测序图谱如图6所示。

表2：双靶点基因修饰效率和细胞活率表

实施例3

本例调整HDR为双链DNA模板（dsHDR）且该dsHDR 5’端也含有突变了4个核苷酸的cas9识别序列即MCTS（dsHDR序列与实施例1相同，只不过是双链），分别商业化合成两条sgRNA，并且sgRNA的序列与实施例1中相同。将PGA与两条sgRNA、Cas9蛋白按照比例在37℃水浴锅孵育15min后加入dsHDR并在高频电压1350V电穿孔。结束后立即将细胞置于培养基中培养。收取部分电转染之后的细胞测序得到的混样效率如表3所示，基因编辑后测序图谱如图7所示。

表3：

实施例4

通过体外组装单链DNA并含有cas9识别序列和PAM序列的模版和sgRNA嵌合体，体系中除了PGA以外，其余的操作同实施例1，1350V电转染后，收取部分细胞裂解液，提取基因组，扩增目的基因后送公司测序。基因修饰效率和细胞活率如表4所示。

表4：

除此以外，我们检测本发明中涉及的嵌合体编辑方法和双链模板及其他不含PGA等的RNP的脱靶率可以显著发现：将两端含有mCTS的ssHDR与sgRNA在PGA协同下与Cas9蛋白形成复合物之后的脱靶率为0.10%，显著低于dsHDR（0.13%）、ssHDR不含PGA组（0.12%）等其他组合。

由以上四个实施例能够说明，体外组装sgRNA和含有mCTS的ssHDR的嵌合体并且在PGA帮助下孵育形成复合物对提高目的基因的编辑率及细胞活率都得到了明显的上调且保持了较低的脱靶率。采用电转染双靶点RNP的系统，同时转入同源修复的模板可以在CD4⁺T细胞中产生高效率的Δ32 CCR5型突变。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.嵌合体逆转录引物，其特征在于，包含sgRNA3:ssHDR3和sgRNA7:ssHDR7 两条引物，所述sgRNA3、sgRNA7对应分别靶向如SEQ ID NO.1、2所示的核苷酸序列，所述ssHDR3、ssHDR7对应核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5、6所示。

2.根据权利要求1所述的嵌合体逆转录引物，其特征在于，sgRNA3的核苷酸序列如SEQID NO.3所示；和/或，所述sgRNA7的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.RNA:DNA 嵌合体，其特征在于，包括sgRNA3:ssHDR3嵌合体和sgRNA7:ssHDR7嵌合体，分别以HDR3和HDR7为模板经权利要求1所述嵌合体逆转录引物进行逆转录，并消化掉结合的RNA得到，所述HDR3和HDR7分别含有CTS序列和PAM序列。

4.根据权利要求3所述的RNA:DNA 嵌合体，其特征在于，所述HDR3、HDR7分别对应由核苷酸序列如SEQ ID NO.7、8所示的同源修复模板转录得到。

5.RNP复合物，其特征在于，由权利要求3所述的RNA:DNA 嵌合体，与Cas9蛋白经PGA孵育得到。

6.根据权利要求5所述的RNP复合物，其特征在于，所述PGA浓度为100mg/ml。

7.转染有权利要求5或6所述RNP复合物的哺乳动物细胞。

8.权利要求5或6所述的RNP复合物在哺乳动物细胞基因编辑中的应用。

9.一种CD34⁺造血干细胞CCR5△32/△32基因的精准编辑方法，其特征在于，使用权利要求5或6所述的RNP复合物电转至野生型CCR5基因的CD34⁺造血干细胞内，或将权利要求7所述CD34⁺造血干细胞进行电转染，再经培养得到可用于临床移植的CCR5△32/△32基因型CD34⁺造血干细胞。

10.CCR5△32/△32基因型CD34⁺造血干细胞在制备HIV-1治疗药物中的应用，所述CCR5△32/△32基因型CD4⁺造血细胞由权利要求9所述的方法得到。