CN121081402A - 一种高活性水蛭素冻干制剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种高活性水蛭素冻干制剂及其制备方法与应用，其制备方法包括以下步骤：(1)导入水蛭素基因到底盘细胞上，构建重组工程菌株；(2)将所述工程菌株接种至配置好的培养基中，于设定温度下进行发酵培养，待菌体密度达到目标密度后，切换为甲醇诱导表达，持续诱导预设时间后提取发酵液；(3)对所得发酵液进行超滤浓缩及层析纯化，获得纯化的水蛭素溶液；(4)在获得的水蛭素溶液中添加稳定剂，预冻以使水蛭素溶液完全固化，经过干燥处理后获得目标水蛭素冻干制剂。本发明通过基因工程菌株构建、高密度发酵、多步纯化及冻干工艺的协同优化，实现了水蛭素冻干制剂的高活性、高纯度、高稳定性及低成本工业化生产。

Description

一种高活性水蛭素冻干制剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及制备水蛭素技术领域，尤其涉及一种高活性水蛭素冻干制剂及其制备方法与应用。

背景技术

水蛭素(Hirudin)作为迄今发现的最强凝血酶特异性抑制剂，其抗血栓活性是肝素的12-15倍(Markwardt et al.,1989)。据WHO 2024年报告，全球心血管疾病患者超5.2亿，年需抗凝药物剂量达380吨，其中天然水蛭素因无血小板减少症风险，成为替代肝素的优选方案。然而，传统水蛭提取法每1000只医用水蛭仅能获得1mg纯品(《中国药学杂志》2023)，产量较低，难以满足临床需求。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种高活性水蛭素冻干制剂及其制备方法与应用，其可实现水蛭素冻干制剂的高活性、高纯度、高稳定性及低成本工业化生产。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

作为第一方面，本发明涉及一种高活性水蛭素冻干制剂的制备方法，其包括以下步骤：

(1)导入水蛭素基因到底盘细胞上，构建重组工程菌株；

(2)将所述工程菌株接种至配置好的培养基中，于设定温度下进行发酵培养，待菌体密度达到目标密度后，切换为甲醇诱导表达，持续诱导预设时间后提取发酵液；

(3)对所得发酵液进行超滤浓缩及层析纯化，获得纯化的水蛭素溶液；

(4)在获得的水蛭素溶液中添加稳定剂，预冻以使水蛭素溶液完全固化，经过干燥处理后获得目标水蛭素冻干制剂。

进一步设置：所述步骤(1)包括：

获取水蛭素基因，根据底盘细胞选择兼容性的载体以搭载水蛭素基因；

将搭载有水蛭素基因的载体形成重组质粒，导入重组质粒至底盘细胞，筛选与验证具有水蛭素蛋白表达的重组工程菌株。

进一步设置：在将搭载有水蛭素基因的载体形成重组质粒中，通过限制性内切酶或Gibson组装来将水蛭素基因插入载体，转化感受态细胞节进行质粒扩增，测序验证所插入水蛭素基因序列的正确性。

进一步设置：采用电转化或热激法将上述重组质粒导入底盘细胞中，所述底盘细胞包括酵母菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、蓝藻菌中的至少一种。

进一步设置：在所述步骤(2)中，工程菌株置于灭菌后发酵罐内进行发酵，发酵罐在灭菌后冷却25-28℃再接入工程菌株，按发酵罐体积的5％-10％接入工程菌株，待菌体密度达到OD₆₀₀＝20-30时，切换为甲醇诱导表达，甲醇诱导阶段通过流加控制残余甲醇浓度为0.5-1％，溶氧维持在20-30％。

进一步设置：在所述步骤(3)中，先对提取到的发酵液进行离心和0.45μm过滤后，采用截留分子量3-10kDa的超滤膜进行浓缩，再通过阳离子交换层析和肝素亲和层析两步纯化，获得纯度大于或等于目标纯度的水蛭素溶液。

进一步设置：所述的稳定剂包括体积含量为5-10％的甘露醇和体积含量为1-5％的蔗糖。

进一步设置：在所述步骤(4)中，将添加了稳定剂的水蛭素溶液预冻至-40℃，依次进行在-20℃的条件下的一次干燥和在25℃条件下的二次干燥，获得冻干制剂。

作为第二方面，本发明涉及一种高活性水蛭素冻干制剂，由上述高活性水蛭素冻干制剂的制备方法制备获得。

作为第三方面，一种如上所述的高活性水蛭素冻干制剂在医美制剂中的应用。

相比现有技术，本发明的方案具有以下优点：

1、在本发明涉及的高活性水蛭素冻干制剂的制备方法中，通过基因工程菌株构建、高密度发酵、多步纯化及冻干工艺的协同优化，实现了水蛭素冻干制剂的高活性、高纯度、高稳定性及低成本工业化生产。

2、在本发明涉及的高活性水蛭素冻干制剂的制备方法中，通过基因工程高效表达与两步层析纯化，使得所得水蛭素的活性与纯度显著提升，且批次稳定性高，活性差异＜±5％，远低于天然提取法的不稳定性。

3、在本发明涉及的高活性水蛭素冻干制剂的制备方法中，通过发酵技术可大大缩短了生产周期，产能可控，所用原料成本低且可再生，不受水蛭资源的限制，具有良好的规模化生产优势。

4、在本发明涉及的高活性水蛭素冻干制剂的制备方法中，底盘细胞与载体系统成熟，可快速适配其他重组蛋白生产。

5、在本发明涉及的高活性水蛭素冻干制剂的制备方法中，采用冻干技术保存水蛭素，能够高效保留活性成分、提升产品品质、延长保存期限并提高生产效率。

本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，这些将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明上述的和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为本发明的一种高活性水蛭素冻干制剂的制备方法的工艺流程图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。

本技术领域技术人员可以理解，除非特意声明，这里使用的“所述”和“该”也可包括复数形式。应该进一步理解的是，本发明的说明书中使用的措辞“包括”是指存在所述特征、零件和/或组件，但不排除实现为本技术领域所支持其他特征、零件、组件和/或它们的组合等。这里使用的术语“和/或”指该术语所限定的项目中的至少一个，例如“A和/或B”可以实现为“A”，或者实现为“B”，或者实现为“A和B”。

在本发明的描述中，词语“中心”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方向或位置关系，为基于附图所示的示例性的方向或位置关系，是为了便于描述或简化描述本发明的实施例，而不是指示或暗示所指的装置或部件必须具有特定的方位、或以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

实施例一

本实施例涉及一种高活性水蛭素冻干制剂的制备方法，请结合图1，其包括以下步骤：

(1)导入水蛭素基因到底盘细胞上，构建重组工程菌株。

首先，获取水蛭素基因，具体可采用天然基因提取法从水蛭唾液腺细胞中提取mRNA，通过反转录合成cDNA以获得水蛭素基因序列；还可以通过化学合成法，通过PCR技术来扩增水蛭素基因。

同时，根据底盘细胞来选择兼容性载体以搭载水蛭素基因，本发明的底盘细胞可选择为酵母菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、蓝藻菌中的至少一种，在选择载体时，需要考虑启动子类型、筛选标记、蛋白分泌信号或载体拷贝数等。将搭载有水蛭素基因的载体形成重组质粒，通过限制性内切酶或Gibson组装来将水蛭素基因插入载体，转化感受态细胞节进行质粒扩增，具体可通过化学转化法和电转化法来进行感受态细胞的转化，随后挑选单克隆接种至抗生素培养基，在37℃下以200rpm振荡培养12-16小时，使用质粒提取试剂盒来提取重组质粒，以完成质粒扩增，再通过测序验证所插入水蛭素基因序列的正确性，保证载体构建的精确性。

导入重组质粒至底盘细胞，同样可采用化学转化法和电转化法的来构建水蛭素工程菌株，然后筛选与验证具有水蛭素蛋白表达的重组工程菌株，在筛选重组工程菌株时，可采用抗生素筛选、蓝白斑筛选、菌落PCR、酶切鉴定等方式进行筛选，再通过SDS-PAGE检测、Western blot验证等方式来验证水蛭素蛋白表达。

将构建的重组工程菌株置于-80℃的环境中进行保存。

(2)将所述工程菌株接种至配置好的培养基中，于设定温度下进行发酵培养，待菌体密度达到目标密度后，切换为甲醇诱导表达，持续诱导预设时间后提取发酵液。

本实施例的培养基原料包括C_5/6葡萄糖、C₃甘油、C₁甲烷及其衍生物等，而后在121℃下对培养基进行灭菌处理，将工程菌株从-80℃取出后，先置于-20℃过渡30分钟，再冰上缓慢解冻，随后将解冻后的工程菌株接种到培养基中进行首次扩繁，接种量在1％-5％，随后将工程菌株置于灭菌后的发酵罐内进行发酵，发酵罐在灭菌后冷却25-28℃再接入工程菌株，按发酵罐体积的5％-10％接入工程菌株，待菌体密度达到OD₆₀₀＝20-30时，切换为甲醇诱导表达，甲醇诱导阶段通过流加控制残余甲醇浓度为0.5-1％，溶氧维持在20-30％。

(3)对步骤(2)所得的发酵液进行超滤浓缩及层析纯化，获得纯化的水蛭素溶液。

先对提取到的发酵液进行预处理，以8000-12000rpm对发酵液离心15-20分钟，以去除发酵液中菌体、细胞碎片等固体杂志，然后采用0.45μm微孔滤膜或深层过滤装置，进一步去除悬浮颗粒，防止后续采用超滤膜出现堵塞的情况。此外，还可进一步添加聚丙烯酰胺(PAM)或壳聚糖，通过电荷中和或架桥作用聚集微小颗粒，提高固液分离效率。

在对发酵液进行超滤浓缩时，选用截留分子量在3-10kDa的超滤膜进行超滤浓缩，在压力0.5-1.5bar的条件下，控制跨膜压力在0.2-0.5bar以使发酵液通过超滤膜，直至体积缩小5-10倍，再用纯水冲洗膜表面残留蛋白，采用0.1mol/L的氢氧化钠溶液循环消毒30min，最后用起始缓冲液平衡发酵液的pH值。

在进行层析纯化时，采用阳离子交换层析和肝素亲和层析进行两步层析，阳离子交换层析作为首步纯化，采用SP Sepharose Fast Flow或CM Sepharose Fast Flow作为层析介质，缓冲液采用pH值为6.0，20mmol/L的磷酸盐溶液，上样过程将超滤浓缩液稀释至电导率≤5mS/cm，且流速为1-2mL/min。随后进行肝素亲和层析，具体使用Heparin Sepharose6Fast Flow作为层析介质，肝素与水蛭素的高亲和力可实现特异性结合，从而将发酵液进一步精制纯化获得纯度大于等于目标纯度的水蛭素。

本发明的水蛭素的目标纯度为98，则纯度大于或等于98的水蛭素在抗凝血、溶血栓、改善微循环及协同修复血管方面具有显著效果。

(4)在获得的水蛭素中添加稳定剂，预冻以使水蛭素完全固化，经过干燥处理后获得目标水蛭素冻干制剂。

通过添加稳定剂、预冻固化、冷冻干燥等步骤，可制备出活性稳定、便于储存运输的水蛭素冻干制剂。本实施例的稳定剂包括体积含量为5-10％的甘露醇和体积含量为1-5％的蔗糖，稳定剂的添加比例为水蛭素质量的10％-30％。

通过预冻的方式将呈液体状态的水蛭素转化为固态，必然干燥时活性成分会随水分迁移，本实施例的预冻温度为-40℃，且在该温度下持续2-4小时，确保水蛭素完全固化。

将固化后的水蛭素进行冷冻干燥，首先在-20℃的条件下进行一次干燥，可去除90％以上的水分，接着在25℃的条件下进行二次干燥，最终通过压力升测试来确认水蛭素的干燥完全，所得冻干制剂的残余水分≤3％，复溶时间≤30秒，且比活性≥20000ATU/g，4℃保存24个月活性损失<5％。

根据上述高活性水蛭素冻干制剂的制备方法所制得的高活性水蛭素冻干制剂活性可达20000ATU/g，是天然提取法的10-20倍，且批次间活性差异＜±5％。由于本发明的高活性水蛭素冻干制剂的制备方法采用了基因工程基础，经过多步纯化，可有效必然杂质引发的过敏风险及活性干扰，并且采用规模化发酵生产，可以不受自然资源的制约，生产周期段，有效降低生产成本，价格稳定可控，适配大规模商业需求。本发明通过基因编辑搭配发酵技术来进行水蛭素的生产，废料排放少，低碳且原料可再生。

将上述高活性水蛭素冻干制剂在不同条件下保存的实施例与采用天然提取法所提取的水蛭素进行对比。

实施例1

将在4℃保存24个月的水蛭素冻干制剂进行复溶：在无菌环境下，抽取1ml生理盐水注入含10mg水蛭素冻干制剂的冻干制剂瓶内，轻弹瓶身使溶剂湿润水蛭素冻干制剂，并静置1分钟，缓慢旋转瓶身至冻干粉完全溶解，检查溶液澄清度，确认无颗粒后方可使用。

实施例2

将在25℃保存24个月的水蛭素冻干制剂进行复溶：在无菌环境下，抽取1ml生理盐水注入含10mg水蛭素冻干制剂的冻干制剂瓶内，轻弹瓶身使溶剂湿润水蛭素冻干制剂，并静置1分钟，缓慢旋转瓶身至冻干粉完全溶解，检查溶液澄清度，确认无颗粒后方可使用。

实施例3

将在4℃保存小于1个月的水蛭素冻干制剂进行复溶：在无菌环境下，抽取1ml生理盐水注入含10mg水蛭素冻干制剂的冻干制剂瓶内，轻弹瓶身使溶剂湿润水蛭素冻干制剂，并静置1分钟，缓慢旋转瓶身至冻干粉完全溶解，检查溶液澄清度，确认无颗粒后方可使用。

实施例4

将在25℃保存小于1个月的水蛭素冻干制剂进行复溶：在无菌环境下，抽取1ml生理盐水注入含10mg水蛭素冻干制剂的冻干制剂瓶内，轻弹瓶身使溶剂湿润水蛭素冻干制剂，并静置1分钟，缓慢旋转瓶身至冻干粉完全溶解，检查溶液澄清度，确认无颗粒后方可使用。

对比实施例

采用天然提取法提取水蛭素：准备已处死的吸血类水蛭鲜品或其干燥品作为原料，将水蛭鲜品或干燥品进行匀浆或粉碎处理，加入适量干净水浸提1～3小时，通过离心操作去除杂质，取上清液，采用酸沉等方法对上清液进一步纯化，调pH值至近中性，确保溶液环境适宜后续处理，随后去除溶液中的盐分并浓缩，再高效液相色谱(HPLC)法或反相高效液相色谱(RP-HPLC)法进一步纯化水蛭素，在水蛭素中添加适当的辅料并干燥，最终获得天然水蛭素纯品。

本发明采用凝血酶滴定法来测定的水蛭素的比活性，具体通过测定水蛭素中和凝血酶的能力计算活性单位(ATU)，1g水蛭素中和5g凝血酶(摩尔比1:1)定义为1ATU，向试管中加入水蛭素样品，加入含纤维蛋白原的缓冲液，37℃水浴5分钟，滴加凝血酶溶液(每分钟5μl)，记录凝固时消耗的凝血酶体积。

计算活性：其中，U为ATU/g，C1为凝血酶浓度，V1为消耗体积，C2为样品浓度，V2为样品体积。

上述实验步骤需重复3次，取平均值以减少误差，比活性测

定结果如下表：

采用本发明的高活性水蛭素冻干制剂的制备方法所制得高活性水蛭素通过基因优化与高效表达系统，其比活性远优于采用天然提取法所提取到的新鲜水蛭素，采用天然提取法容易在提取过程中导致水蛭素的活性流失。其次，低温保存是维持水蛭素活性的关键手段，而室温保存仅适用于短期临时存储。

应用实施例高活性水蛭素冻干制剂在医学美容领域的应用

制备一种皮肤保护剂，其按质量百分比计，包括水蛭素冻干制剂40-60％和羟丙基环糊精40-60％，所得产物为白色至淡黄色粉末，可应用于各类化妆品中，并且对该皮肤保护剂进行评估，该皮肤保护剂在化妆品中建议添加量≤0.3％时，在正常、合理及可预见的使用情况下不会对人体健康造成危害。该皮肤保护剂的核心组分水蛭素具有高活性的抗凝血分子，用在皮肤表面可改善微循环受阻，还可通过减少肌肤修复进程中胶原过度增生，从而有效抑制疤痕产生，应用于眼部产品，可显著淡化细纹、黑眼圈、水肿；应用于面部产品，可显著淡化细纹、提亮肤色。

从而可将上述皮肤保护剂应用在面膜与眼霜等的护肤品中，由该皮肤保护配比得到的面膜能够解决肌肤色素沉着及斑点困扰问题，由该皮肤保护剂配比得到的眼霜能够针对熬夜黑眼圈，并能起到拯救“熬夜脸”的作用。

以上所述仅是本发明的部分实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种高活性水蛭素冻干制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)导入水蛭素基因到底盘细胞上，构建重组工程菌株；

(2)将所述工程菌株接种至配置好的培养基中，于设定温度下进行发酵培养，待菌体密度达到目标密度后，切换为甲醇诱导表达，持续诱导预设时间后提取发酵液；

(3)对所得发酵液进行超滤浓缩及层析纯化，获得纯化的水蛭素溶液；

(4)在获得的水蛭素溶液中添加稳定剂，预冻以使水蛭素溶液完全固化，经过干燥处理后获得目标水蛭素冻干制剂。

2.根据权利要求1所述的高活性水蛭素冻干制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)包括：

获取水蛭素基因，根据底盘细胞选择兼容性的载体以搭载水蛭素基因；

将搭载有水蛭素基因的载体形成重组质粒，导入重组质粒至底盘细胞，筛选与验证具有水蛭素蛋白表达的重组工程菌株。

3.根据权利要求2所述的高活性水蛭素冻干制剂的制备方法，其特征在于，在将搭载有水蛭素基因的载体形成重组质粒中，通过限制性内切酶或Gibson组装来将水蛭素基因插入载体，转化感受态细胞节进行质粒扩增，测序验证所插入水蛭素基因序列的正确性。

4.根据权利要求3所述的高活性水蛭素冻干制剂的制备方法，其特征在于，采用电转化或热激法将上述重组质粒导入底盘细胞中，所述底盘细胞包括酵母菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、蓝藻菌中的至少一种。

5.根据权利要求1所述的高活性水蛭素冻干制剂的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，工程菌株置于灭菌后发酵罐内进行发酵，发酵罐在灭菌后冷却25-28℃再接入工程菌株，按发酵罐体积的5％-10％接入工程菌株，待菌体密度达到OD₆₀₀＝20-30时，切换为甲醇诱导表达，甲醇诱导阶段通过流加控制残余甲醇浓度为0.5-1％，溶氧维持在20-30％。

6.根据权利要求1所述的高活性水蛭素冻干制剂的制备方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，先对提取到的发酵液进行离心和0.45μm过滤后，采用截留分子量3-10kDa的超滤膜进行浓缩，再通过阳离子交换层析和肝素亲和层析两步纯化，获得纯度大于或等于目标纯度的水蛭素溶液。

7.根据权利要求1所述的高活性水蛭素冻干制剂的制备方法，其特征在于，所述的稳定剂包括体积含量为5-10％的甘露醇和体积含量为1-5％的蔗糖。

8.根据权利要求1所述的高活性水蛭素冻干制剂的制备方法，其特征在于，在所述步骤(4)中，将添加了稳定剂的水蛭素溶液预冻至-40℃，依次进行在-20℃的条件下的一次干燥和在25℃条件下的二次干燥，获得冻干制剂。

9.一种高活性水蛭素冻干制剂，由权利要求1-8任一项所述的高活性水蛭素冻干制剂的制备方法制备获得。

10.一种如权利要求9所述的高活性水蛭素冻干制剂在医美制剂中的应用。