CN1428424A - 一种戊二酰－7－氨基头孢烷酸酰化酶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种戊二酰－7－氨基头孢烷酸酰化酶的制备方法，将大肠杆菌基因工程菌在培养基中进行摇瓶种子培养，发酵种子培养，发酵培养，再通过离心收集菌体，浸泡提取酶液、板框过滤，超滤浓缩、纯化固定化后得产物；本发明是一种通过利用大肠杆菌基因工程菌发酵生产，可使产物有较高收率的戊二酰－7－氨基头孢烷酸酰化酶(GL－7－ACA ACY)的制备方法。
Description
技术领域：
本发明涉及一种半合成头孢菌素合成的关键中间体7-氨基头孢烷酸用的戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶的制备方法。
背景技术：
头孢菌素是有着重要疗效的抗生素，而半合成头孢菌素则具有更强抗菌能力或可使药物动力学性质得到改善。而半合成头孢菌素的关键中间体为7-氨基头孢烷酸(7-ACA)，以往的传统生产的方法主要是通过化学方法，有四大步骤，过程复杂，所用试剂昂贵，污染严重，且收率较低，质量较差。而生物转化方法是一种较好的方法。研究表明，头孢菌素C可被D-氨基酸氧化酶氧化脱氨基，并进一步脱羧反应生成GL-7-ACA，而GL-7-ACA的7-位侧链可被戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶(GL-7-ACA ACY)所水解得到7-ACA，因而戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶(GL-7-ACA ACY)是生成7-ACA的关键酶。
发明内容：
本发明的目的旨在提供一种通过利用大肠杆菌基因工程菌发酵生产，再通过离心收集菌体、浸泡提取酶液、板框过滤，超滤浓缩、纯化固定化后得产物；可使产物有较高收率的戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶(GL-7-ACA ACY)的制备方法。
将大肠杆菌基因工程菌在培养基中进行摇瓶种子培养，发酵种子培养，发酵培养，其中摇瓶种子阶段培养基的成分和含量为：
胰蛋白胨1％ 酵母膏0.5％ 氯化钠1.0％
发酵种子培养基的成分和含量：
酵母膏1.5％ 氯化铵0.24％ 苹果酸0.22％ 磷酸二氢钾0.68％
发酵培养：培养基成分及含量：
氯化铵0.6％ 酵母膏2.4％ 乳糖0.5％ 泡敌0.05％
适合摇瓶种子、发酵种子培养的条件为温度为25℃，PH值为6.1-7.0，培养时间各为10-14小时。
发酵种子培养时的空气流量为1∶1V/V/M。
发酵培养的条件为温度为25±1℃，PH值为6.5-8.2，空气流量为1∶1-1.5V/V/M，培养时间为22-26小时。
本发明所使用的菌为大肠杆菌基因工程菌，GL-7-ACA酰化酶产生菌(代号：E.coli-GLAA2002)，从韩国进美有限公司购进，产生菌为RecombinantEscherichia coli BL21(DE3)，GL-7-ACA酰化酶基因来源为Pseudomonas sp。
其特征为1、细胞尺寸：0.6um×(1-4)um，长度在不同生长期有较大变化，细胞呈典型的杆状；2、菌落表面光滑、湿润，有光泽；3、为革蓝氏阴性菌；4、不产生蛋白酶；
GL-7-ACA酰化酶的提取、纯化及固定化过程为：首先用稀盐酸将发酵液PH调到7.0-7.2，再用20％的氯化钙下调PH到6.6-6.8，然后加入菌体量2％的壳聚糖，最后用稀碱将PH调到7.6-7.8。用高速离心机离心得离心菌液，控制菌液活力5-8u/ml，加入相当于菌液2％(g/l)的表面活性剂，自然搅拌浸泡3-5小时。板框过滤，收集清液，清液超滤浓缩，浓缩酶用30％(W/V)硫酸铵纯化两次，纯化酶液超滤脱盐洗水至洗出液的电导40us/cm以下，然后用固定化用载体固定化。
产物描述
固定化GL-7-ACA酰化酶
白色或类白色球状颗粒
粒径(100um)： ≤1％
含水量 ≤70％
酶活力 40-100(u/g，25℃)
用1500u固定化D-氨基酸氧化酶在20℃下转化，可连续使用120批以上，可将2300g头孢菌素C钾盐转化得到1616g GL-7-ACA，再用1200u固定化GL-7-ACA酰化酶在20℃转化，可连续使用160批以上，可得1035g7-ACA。
具体实施方式：
实施例
GL-7-ACA酰化酶产生菌大肠杆菌基因工程菌(代号：E.coli-GLAA2002)，从韩国进美有限公司购进，产生菌为RecombinantEscherichia coli BL21(DE3)，GL-7-ACA酰化酶基因来源为Pseudomonas sp。将该菌接种至装有100ml的摇瓶种子培养基的500ml三角瓶中，该培养基胰蛋白胨1.0克，酵母膏0.5克，氯化钠1.0克。培养温度控制在25℃，PH值为6.5，培养12小时。再将400ml摇瓶菌丝移入装有100升培养基的发酵罐中进行发酵种子培养，其中酵母膏1500克，，氯化铵240克，苹果酸220克，磷酸二氢钾680克。培养温度为25℃，PH值为6.5，空气流量为1∶1V/V/M，培养12小时。在发酵培养阶段，2500升培养基的发酵罐中，培养基为氯化铵15千克，酵母膏60千克，乳糖12.5千克，泡敌1.25千克。先进行消毒后冷至60℃，加入无菌的KH2PO4-K2HPO4缓冲液(KH2PO423.1g/l，K2HPO4164.3g/l)控制消毒后PH值为6.8。将发酵种子液移至2500升发酵罐中，控制培养温度为25℃，空气流量为1∶1.5V/V/M，PH值为6.5-8.2，培养25小时。发酵结束酶活力可达2.5-4u/ml，2500升发酵液总活力为6.25-10百万单位(滴定法，25℃)。
GL-7-ACA酰化酶的提取、纯化及固定化过程为：首先用稀盐酸将发酵液PH调到7.0-7.2，再用20％的氯化钙下调PH到6.6-6.8，然后加入菌体量2％的壳聚糖，最后用稀碱将PH调到7.6-7.8。用高速离心机离心得离心菌液，控制菌液活力5-8u/ml，加入相当于菌液2％(g/l)的表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵，自然搅拌浸泡3-5小时。板框过滤，收集清液，清液超滤浓缩，浓缩酶用30％(W/V)硫酸铵纯化两次，纯化酶液超滤脱盐洗水至洗出液的电导40us/cm以下，然后用固定化用载体固定化，固定化酶活力为40-100(u/g)，2500升发酵液可得固定化酶0.8-1.4百万，总收率12％-14％(滴定法，25℃)。
Claims (3)
1、一种戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶的制备方法，将大肠杆菌基因工程菌在培养基中进行摇瓶种子培养，发酵种子培养，发酵培养，再通过离心收集菌体，浸泡提取酶液、板框过滤，超滤浓缩、纯化固定化后得产物；所使用大肠杆菌基因工程菌，GL-7-ACA酰化酶产生菌(代号：E.coli-GLAA2002)，产生菌为Recombinant Escherichia coli BL21(DE3)，GL-7-ACA酰化酶基因来源为Pseudomonas sp；
其中摇瓶种子阶段培养基的成分和含量为：
胰蛋白胨1％ 酵母膏0.5％ 氯化钠1.0％
发酵种子培养基的成分和含量：
酵母膏1.5％ 氯化铵0.24％ 苹果酸0.22％ 磷酸二氢钾0.68％
发酵培养：培养基成分及含量：
氯化铵0.6％ 酵母膏2.4％ 乳糖0.5％ 泡敌0.05％
2、根据权利要求1所述的一种戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶的制备方法，适合摇瓶种子、发酵种子培养的条件为温度为25℃，PH值为6.1-7.0，培养时间各为10-14小时。发酵种子培养时的空气流量为1∶1V/V/M。
3、根据权利要求1所述的一种戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶的制备方法，发酵培养的条件为温度为25±1℃，PH值为6.5-8.2，空气流量为1∶1-1.5V/V/M，培养时间为22-26小时。
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|---|---|---|---|---|
| CN100372931C (zh) * | 2006-04-18 | 2008-03-05 | 北京科技大学 | 一种戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶的固定化方法 |
| CN100448997C (zh) * | 2004-10-13 | 2009-01-07 | 清华大学 | 一种表达载体及其应用 |
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