CN1687089A - 叶绿酸合铁钠盐衍生物、制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种叶绿酸衍生物合铁钠盐制备方法和用于制备治疗缺铁性贫血的保健品或药物，该叶绿酸衍生物合铁钠盐，其具有如图结构式：其中R¹＝H、CH₃或CH₂COONa；R²＝COONa；或R¹和R²＝－CH(COONa)C(O)－，……是单键或无键。

Description

叶绿酸合铁钠盐衍生物、制备方法及用途

技术领域：

本发明涉及一种叶绿酸衍生物合铁钠盐衍生物、制备方法及其用途。可以由中药蚕砂为原料或由叶绿酸衍生物制得，具有明显改善缺铁性贫血的功能，可用于制备治疗缺铁性贫血的保健品和药物。

背景技术：

缺铁性贫血是一种常见病，根据世界卫生组织调查统计，全世界约有20亿人口患有不同程度的缺铁。《人民日报》2005年2月14日刊登国家卫生部副部长王陇德的文章《中国人需要一场膳食革命》中说“我国居民营养与健康状况调查显示，与膳食密切相关的慢性非传染性疾病患病率上升迅速，铁、维生素A等微量元素缺乏，在我国城乡普遍存在”。“缺铁是引致我国居民贫血的主要原因，平均贫血患病率为15.2％，2岁以内婴幼儿高达24.2％，即平均4个婴幼儿中就有一个贫血”。中医中药治疗贫血，已积累了丰富的经验，历代文献均有记载。明代《本草纲目》载蚕砂治“妇人血崩”，宋代《内经拾遗方编》载蚕砂能治“血瘀血少。”明代秘方《黄痛效药》中记载治疗血虚萎苔的主要药物为绿矾和醋煅针砂(天然硫酸亚铁和细小铁屑)。中药蚕砂含有丰富的叶绿素，魏克民(CN02111428.5)曾用碱性水解蚕砂法制备，得到降解产物铁钠盐粗品，治疗缺铁性贫血。许德余报导了叶绿素a降解产物铜、钴和锌的金属络合物、制备方法及抗胃溃疡药物(CN99119878.6)，还报导了二氢卟吩e₆-甲酯金属络合物及其合成方法(CN94112189.5)。

本发明将中药蚕砂进行酸性降解、分离、提取等得到叶绿酸衍生物，如叶绿酸a、叶绿酸e₆、叶绿酸e₄、叶绿酸f或脱氢叶绿等化合物，分别络合铁后再制成相应钠盐，经动物实验证明，每个化合物铁钠盐样品，均有明显改善缺铁性贫血的功能。

发明内容：

本发明目的提供一种叶绿酸衍生物合铁钠盐衍生物。

本发明的目的还提供一种上述的叶绿酸衍生物合铁钠盐衍生物的制备方法。

本发明另一目的是提供一种上述的叶绿酸衍生物合铁钠盐衍生物的用途。

本发明的叶绿酸衍生物合铁钠盐具有如下结构式：

其中，R¹＝H，COONa或CH₂COONa，R²＝H或COONa，或者R¹和R²＝-CH(COONa)C(O)-；------单键或无键。

本发明的叶绿酸衍生物合铁钠盐可以如下结构式：

叶绿酸a合铁钠盐                   叶绿酸e₆合铁钠盐              叶绿酸e₄合铁钠盐

或

叶绿酸f合铁钠盐                   脱氢叶绿酸f合铁钠盐

本发明的叶绿酸衍生物合铁钠盐可以由叶绿酸衍生物为原料，在极性溶剂中和PH 3～4条件下，加入亚铁化合物，如氯化亚铁、醋酸亚铁或硫酸亚铁，在40-70℃反应0.5-4小时，过滤，水洗去游离铁离子，加入2-10％NaOH溶液，使其刚刚溶解，干燥，其中叶绿酸衍生物、亚铁化合物和氢氧化钠的摩尔比为1∶1-5∶2-3。

所述的叶绿酸衍生物具有如下的结构式：

其中R¹，R²和------如前所述。

本发明的叶绿酸衍生物合铁钠盐也可由中药蚕砂为原料，提取叶绿酸a，再由叶绿酸a转化为叶绿酸e₆，由叶绿酸e₆分别转化为叶绿酸e₄，叶绿酸f，叶绿酸f还可以进一步转化为脱氢叶绿酸f。

上述叶绿酸的结构式分别如下：

         叶绿酸a                                叶绿酸e₆                          叶绿酸e₄

或

            叶绿酸f                            脱氢叶绿酸f

由叶绿酸a、叶绿酸e₄、叶绿酸e₆、叶绿酸f和脱氢叶绿酸f分别转化成叶绿酸a合铁钠盐、叶绿酸e₄合铁钠盐、叶绿酸e₆合铁钠盐、叶绿酸f合铁钠盐和脱氢叶绿酸f合铁钠盐。

上述叶绿酸合铁钠盐的制备方法可以进一步描述如下：

中药蚕砂为原料、粉碎，加3-5倍体积的有机极性溶剂，在50-70℃浸2-4小时，过滤，滤渣再浸提2次，合并滤液，滤液在50-70℃用等体积非极性有机溶剂提取2-3次，去杂质，浓缩，用酸水介获得叶绿酸a。

将叶绿酸a溶于极性有机溶剂中，与10％～20％NaOH水溶液，叶绿酸a和所述的氢氧化钠水溶液的重量体积比为1∶50～100，在40-70℃反应0.5-2小时，倒入2-4倍水中，用5-20％HCl调节pH3，沉淀，过滤，干燥。获叶绿酸e₆。

将叶绿酸e₆溶于吡啶中，在回流温度下反应0.5-2小时，蒸除吡啶获得叶绿酸e₄。

将叶绿酸e₆溶于吡啶中，加入10-35％的氢氧化钾甲醇溶液，在氧气存在下，反应0.5-2小时，然后在惰性气体下回流1-3小时，加至1-3倍体积水中，用5-20％HCl调至pH3，过滤沉淀，获得叶绿酸f。

将叶绿酸f在二甲基吡啶中回流10-20小时，蒸除溶剂获脱氢叶绿酸f。

将上述叶绿酸a、叶绿酸e₄、叶绿酸e₆、叶绿酸f或脱氢叶绿酸f分别溶于极性有机溶剂中，加入氯化亚铁、醋酸亚铁或硫酸亚铁，在pH3-4条件下40-70℃反应1-4小时，过滤、用水洗去游离铁离子，加入2-10％NaOH溶液，使其刚刚溶解，并干燥，分别获得它们的铁钠盐。

所述的极性溶性可以是丙酮、甲醇、乙醇、乙腈、吡啶、二甲基吡啶或二甲基亚砜等，所述的非极性溶解可以是乙醚、石油醚、C₆-C₁₈的烷烃。

本发明的方法简便，适于工业生产，而且产品经动物试验证明具有改善缺铁性贫血的功能，可制备保健品和药物。

具体实施方式：

通过下述实施例将有助于理解本发明，但并不能限制本发明内容：

实施例中采用岛律10AT高压液相仪(HPLC)仪测定保留时间(Rt)，采用25×0.4mm，5μm的柱，流动相：(1)醋酸铵∶甲醇＝2∶8(V/V)；(2)丙酮∶甲醇＝1∶1(V/V)；梯度：(1)0-15min；(2)0-100％；

紫外光谱仪测定UV吸收峰，采用Ion Spec HiRes，MALDI质谱仪测定质谱；用ThermoE IRIS Duo ICP发射光谱仪测定铁含量。

实施例1

叶绿酸a合铁钠盐的制备；

取中药蚕砂叶绿素提取物粗品200g，加2倍体积乙醚溶解，再加入等体积的36％盐酸，在40-60℃水浴中加热回流45分，蒸去乙醚。冷却，4℃放置过夜分层，取酸液。用40％NaOH调节溶液的pH到3，有沉淀析出。滤取沉淀，水洗，干燥。得墨绿色叶绿酸a粗品。经硅胶柱液相层析(洗脱液，丙酮∶甲醇∶甲酸＝50∶25∶1，V/V)，得产品7.58克。

叶绿酸a的HPLC保留时间，质谱及紫外光谱测定的结果如下：

HPLC保留时间测定：Rt＝11.823分

MS m/z：594(M+H+1)⁺，593(M+H)⁺，592(M)⁺.

UVλmax(nm)：664.5，607.5，536.5，507.0，409.5。

将上述叶绿酸a1g溶于丙酮中，加入1g硫酸亚铁在50℃反应3小时，过滤，水洗，加入4％氢氧化钠水溶液，使其刚刚溶解，干燥，获叶绿酸a合铁钠盐1.15g.叶绿酸a合铁钠盐的质谱、紫外光谱和含铁量的测定如下：

UVλmax(nm)：666.5，623.0，396.5。

MS m/z：649(M+H)⁺，648(M)⁺，647(M-H)⁺，646((M-H-1)⁺.

含铁量测定：6.571％。

实施例2  叶绿酸e₆合铁钠盐的制备

取叶绿酸a固体5克溶于250ml丙酮，加10％NaOH水溶液25ml，置于60℃水浴中反应，保温搅拌1小时，冷却后倒入700ml冷水中，用18％HCl调节溶液的pH到3，有沉淀析出。滤取沉淀，用水洗涤，干燥，得叶绿酸e₆固体。以硅胶柱液相层析(洗脱液，丙酮∶甲醇∶甲酸＝50∶25∶1，V/V)，得叶绿酸e₆固体3.52g。

叶绿酸e₆的HPLC保留时间、质谱及紫外光谱测定的结果如下：

HPLC保留时间测定：Rt＝6.465分。

MS m/z：598(M+H+1)⁺，597(M+H)⁺，596(M+H-1)⁺.

UVλmax(nm)：654.5，601.5，503.5，398。

取叶绿酸e₆ 1.4042g溶于140ml丙酮，加FeCl₂·4H₂O 1.3832g于65℃水浴中搅拌反应3小时，蒸去丙酮，用水洗涤，至无游离铁，真空干燥，得墨绿色叶绿酸e₆合铁(II)粉末1.3539g。

取叶绿酸e₆合铁(II)粉末1.0242g，加入4％NaOH使其刚刚完全溶解，真空干燥，得叶绿酸e₆合铁钠盐1.0672g。

叶绿酸e₆合铁钠盐的质谱、紫外光谱和含铁量测定的结果如下：

UVλmax(nm)：671.5，603.5，395.0。

MS m/z：651(M+H)⁺，650(M)⁺，649(M-H)⁺.

含铁量测定：6.679％。

实施例3

叶绿酸e₄合铁钠盐的制备

取实施例1所述方法制得的叶绿酸e₆ 5g溶于100ml吡啶，在油浴中，115-125℃加热回流1小时，减压蒸馏，蒸去吡啶，得墨绿色固体叶绿酸e₄4.45g。

叶绿酸e₄的HPLC保留时间、质谱及紫外光谱测定结果如下：

HPLC保留时间测定：Rt＝6.632分。

MS m/z：554(M+H+1)⁺，553(M+H)⁺.

UVλmax(nm)：661.5，606.0，528.0，501.5，403.5。

取叶绿酸e₄ 0.1826g溶于40ml甲醇中，加入FeCl₂·4H₂O 0.1810g，于70℃水浴中反应2小时，蒸去甲醇，用水洗涤至无游离铁，真空干燥，得墨绿色叶绿酸e₄合铁(II)钠盐粉末0.1924g。

叶绿酸e₄合铁钠盐的质谱、紫外光谱和含铁量测定的结果如下：

UVλmax(nm)：671.5，612.5，395.5。

MS m/z：607(M+H)⁺，606(M)⁺，605(M-H)⁺，604(M-H-1)⁺

含铁量测定：2.39％.

实施例4

叶绿酸f合铁(II)钠盐的制备

取实施例1所述方法制得的叶绿酸e₆ 5g，溶于50ml吡啶，加25％KOH甲醇溶液250ml，在通氧气条件下反应1小时，再在通氮气条件下回流1小时。冷却后将溶液倒入1000ml冷水中，加18％HCl调节溶液的pH到3，有沉淀析出。滤取沉淀，用水洗涤，干燥，得叶绿酸f。以硅胶柱液相层析(洗脱液，丙酮∶甲醇∶甲酸＝50∶25∶1，V/V)得墨绿色叶绿酸f固体4.15g。

叶绿酸f的HPLC保留时间、质谱及紫外光谱测定结果如下：

HPLC保留时间测定：Rt＝8.532分。

MS m/z：540(M+H+1)⁺，539(M+H)⁺，538(M+H-1)⁺.

UVλmax(nm)：653.5，599.0，501.5，398.5。

取叶绿酸f 2.0055g溶于200ml甲醇，加入FeCl₂·4H₂O 2.0540g，于70℃水浴中搅拌反应3小时，蒸去甲醇，用水洗涤至无游离铁，真空干燥，得墨绿色叶绿酸f合铁(II)粉末2.0860g。

取叶绿酸f合铁(II)粉末1.1803g，加入4％NaOH使之溶解，真空干燥，得叶绿酸f合铁(II)钠盐1.2983g。

叶绿酸f合铁(II)钠盐的质谱、紫外光谱和含铁量测定，结果如下：

UVλmax(nm)：656.5，598.0，394.0。

MS m/z：591(M+H)⁺，590(M)⁺，589(M-H)⁺，588(M-H-1)⁺

含铁量测定：3.27％。

实施例5

脱氢叶绿酸f合铁(II)钠盐的制备

取实施例方法3制得的叶绿酸f2g溶于100ml二甲基吡啶中，180-220℃回流10小时，减压蒸去二甲基吡啶，得脱氢叶绿酸f。经硅胶柱液相层析(洗脱液，丙酮∶甲醇∶甲酸＝50∶15∶1，V/V)，得脱氢叶绿酸f 1.8g.

脱氢叶绿酸f的HPLC保留时间，质谱及紫外光谱测定的结果如下：

HPLC，保留时间：Rt＝8.232分。

MS m/z：538(M+H+1)+，537(M+H)+，536(M+H-1)+.

UV，λmax(nm)：655.0，503.5，354.0。

取脱氢叶绿酸f2.6228g，溶于300ml甲醇中，加入FeSO₄ 2.7659g，于65℃水浴中搅拌反应4小时，蒸去甲醇，用水洗涤至无游离铁，真空干燥，得墨绿色脱氢叶绿酸f合铁(II)粉末2.7602g。

取2.1043g脱氢叶绿酸f合铁(II)粉末，加入4％NaOH，使之刚刚溶解，真空干燥，得脱氢叶绿酸f合铁(II)钠盐2.2367g.

脱氢叶绿酸f合铁钠盐的质谱，紫外光谱和含铁量测定结果如下：

UV，λmax(nm)：658.0，341.0。

MS m/z：589(M+H)⁺，588(M)⁺，587(M-H)⁺

含铁量测定：5.72％。

实施例6

改善大鼠缺铁性贫血的比较动物试验

1材料与方法

1.1样品

样品叶绿酸f合铁(II)钠盐(1#)、叶绿酸e₆合铁(II)钠盐(2#)、脱氢叶绿酸f合铁(II)钠盐(3#)

1.2实验动物

健康SD断乳大鼠50只，雄性，体重55-65g，由复旦大学实验动物部提供，国家实验动物合格证号：SCXK沪2002-0002。

1.3低铁饲料

低铁饲料配方见表1。

                  表1  低铁饲料配方

成分	％	成分	％
				葡萄糖(结晶水)鸡蛋蛋白粉脱脐黄玉米粉明胶玉米油磷酸二氢钠碳酸钙	49.4820.0015.005.005.002.002.00	氯化钠氯化钾混合微量元素①氯化胆碱混合维生素②	0.500.500.270.150.10

①混合微量元素(g％)：MgSO₄·H₂O  73.816g  ZnSO₄·7H₂O  19.657gMnSO₄·H₂O 5.733g，CuSO₄·5H₂O 0.7315g，KIO₃ 0.0625g，

②混合维生素(g％)：维生素A(50万IU/g)1.00g，维生素D₃(20万IU/g)0.75g，α-醋酸生育酚(含25％VE的明胶)12.5g，维生素K 0.04g，盐酸硫胺素0.30g，核黄素0.30g，维生素B₆ 0.30g，泛酸钙0.60g，尼克酸3.00g，叶酸0.10g，维生素B₁₂(含0.1％维生素B₁₂的明胶)2.00g，蔗糖79.11g.

1.4实验步骤

大鼠以低铁饲料和双蒸水喂养，并采用不锈钢笼及食罐，避免实验过程中铁污染。自第3周开始选取部分大鼠采尾血，测定血红蛋白含量(Hb)，直至多数动物Hb低于100g/L以下时，测定全部大鼠的Hb及体重。选取Hb＜100g/L的贫血大鼠作为实验动物，根据贫血大鼠Hb水平和体重，随机分为4组，每组8只，分别为低铁对照组、1#样品组、2#样品组和3#样品组。各组大鼠均继续饲以低铁饲料；各样品组每天分别灌胃给予1#、2#、3#样品1.67mg/b.w.(以元素铁计)，样品溶液以双蒸水制备；低铁对照组灌胃给予等量双蒸水。实验期为30天，实验期末，称量大鼠体重，并采血测定各项血液学指标。

1.5观察指标

1.5.1血红蛋白(氰化高铁法)

1.5.2红细胞内游离原噗啉(荧光分光光度法)

1.5.3动物体重

1.6统计处理

采用SPSS9.0对实验数据进行统计分析，包括ANOVA和Dunnettt检验。

2  实验结果

2.1样品对缺铁性贫血大鼠血红蛋白含量的影响

由表2可见，实验前各组大鼠间血红蛋白含量无显著性差异(P＞0.05)，实验30天后，低铁对照组大鼠的血红蛋白含量继续下降，而1#～3#样品组大鼠的血红蛋白含量及实验前后血红蛋白差值明显升高，与低铁对照组比较差异有显著性(P＜0.05)。

                    表2    实验前后大鼠血红蛋白含量(X±SD)

组别	动物数(只)	血红蛋白含量(g/L)
					实验前	实验后	差值
		低铁对照组1#样品组2#样品组3#样品组	8888	71.1±10.365.9±6.866.9±7.567.1±7.6				61.0±15.681.8±8.3*105.0±11.9*91.4±8.7*	-10.1±8.515.9±7.2*38.1±15.6*24.3±9.9*

^*与低铁对照组比较，P＜0.05

2.2样品对缺铁性贫血大鼠红细胞内游离原噗啉含量的影响

由于缺铁，低铁对照组大鼠的红细胞内游离原噗啉含量升高，而1#样品组、2#样品组和3#样品组大鼠的红细胞内游离原噗啉的含量，与低铁对照组比，明显降低，差异有显著性(P＜0.05)。

        表3  大鼠红细胞内游离原噗啉含量及实验前后体重(X±SD)

组别	动物数(只)	实验前体重(g)	实验后体重(g)	FEP(ug/L)
					低铁对照组1#样品组2#样品组3#样品组	8888	118±14123±16117±13114±19	161±10187±23*192±23*204±27*	1020±274701±145*636±158*711±122*

^*与低铁对照组比较，P＜0.05

2.3  样品对缺铁性贫血大鼠体重的影响

实验前各组大鼠间体重无显著性差异(P＞0.05)，实验30天后，1#样品组、2#样品组和3#样品组大鼠的体重明显高于低铁对照组，提示，补充铁剂减轻了缺铁对大鼠体重增长的不利影响，见表3。

3  结论

1#、2#、3#样品组大鼠实验后血红蛋白含量与低铁对照组比较，明显升高，差异经统计检验有显著性(P＜0.05)，且实验前后血红蛋白差值平均升高10g/L以上，同时红细胞内游离原噗啉含量与低铁对照组比，明显降低(P＜0.05)。按照卫生部“保健食品检验与评价技术规范”中规定的评判标准，可以认为1#、2#、3#样品改善营养性贫血功能动物实验结果阳性。

Claims (6)

1、一种叶绿酸衍生物合铁钠盐，其具有如下结构式：

其中R¹＝H、CH₃或CH₂COONa；R²＝COONa；或R¹和R²＝-CH(COONa)C(O)-；------是单键或无键。

2、如权利要求1所述的叶绿酸衍生物合铁钠盐，其特征是具有如下结构式：

叶绿酸a合铁钠盐                          叶绿酸e₆合铁钠盐                   叶绿酸e₄合铁钠盐

或

叶绿酸f合铁钠盐                        脱氢叶绿酸f合铁钠盐

3、一种如权利要求1所述的叶绿酸衍生物合铁钠盐的制备方法，其特征是将叶绿酸衍生物溶于极性有机溶剂中，与亚铁化合物在40-70℃反应0.5-4小时，过滤，洗去游离铁离子，加入2-10％的氢氧化钠水溶液，使其溶解，干燥；所述的叶绿酸衍生物、亚铁化合物和氢氧化钠的摩尔比为1∶1-5∶2～3；所述的亚铁化合物是氯化亚铁、硫酸亚铁或醋酸亚铁，所述的叶绿酸衍生物具有如下结构式：

其中R¹、R²和------如权利要求1所述。

4、如权利要求3所述的叶绿酸衍生物合铁钠盐的制备方法，其特征是所述的叶绿酸衍生物具有如下结构式：

叶绿酸a                                      叶绿酸e₆                           叶绿酸e₄

或

            叶绿酸f                        脱氢叶绿酸f

5、如权利要求3所述的叶绿酸衍生物合铁钠盐的制备方法，其特征是所述的叶绿酸衍物是由下述(1)，(1)和(2)，(1)～(3)，(1)～(4)或(1)～(5)五种方法获得：

(1)粉碎的中药蚕砂，加3-5倍体积的极性有机溶剂，在50-70℃浸2-4小时，过滤，滤液在50-70℃蒸干，用等体积非极性有机溶剂提取2-3次，用酸水介获叶绿酸a；或

(2)在极性有机溶剂中于40-70℃下，叶绿酸a和10～20％的氢氧化钠水溶液反应0.5-2小时后，倒入2-4倍体积水中，用5-20％HCl调节pH3，沉淀，过滤，干燥，获叶绿酸e₆；或

(3)叶绿酸e₆溶于吡啶中，在回流温度下反应0.5-2小时，获叶绿酸e₄；或

(4)叶绿酸e₆溶于吡啶中，加入10～35％的氢氧化钾甲醇溶液，反应0.5-2小时，然后在惰性气体下回流1-3小时，加至1-3倍体积水中，用HCl调至pH3，过滤，获得叶绿酸f；或

(5)叶绿酸f在二甲基吡啶中回流10-20小时，获脱氢叶绿酸f；

其中叶绿酸a、叶绿酸e₄、叶绿酸e₆、叶绿酸f和脱氢叶绿酸f的结构式同权利要求4所述。

6、一种如权利要求1所述的叶绿酸衍生物合铁钠盐的用途，其特征是用于制备治疗缺铁性贫血的药品或保健品。