CN1699558A - 使用生物反应器对造血干细胞来源的细胞因子诱导的杀伤细胞的大规模培养技术 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种使用生物反应器对造血干细胞来源的细胞因子诱导的杀伤细胞的大规模培养技术，包括脐带血造血干细胞的获得，以细胞因子将造血干细胞诱导成DC细胞、并完成对肿瘤抗原的提呈作用，完成对肿瘤具有特异性杀伤作用的杀伤性T淋巴细胞的选择激活，以化学法连接抗CD3单抗的琼脂堂微载体的制备，CIK细胞的激活和CIK细胞在生物反应器中进行连续培养。本发明以共价方法将单抗连接在微载体上，既提高了单抗与细胞的接触面积，增大培养空间，提高细胞密度；又可以在空间实现树突状细胞、辅助性T细胞、杀伤性T细胞之间的接触，便于肿瘤抗原的提呈和杀伤性T细胞的选择激活；CIK细胞使用生物反应器进行大规模培养。
Description
【技术领域】
本发明涉及一种杀伤细胞的培养技术，尤其是涉及一种使用生物反应器对造血干细胞来源的细胞因子诱导的杀伤细胞的大规模培养技术。
【背景技术】
恶性肿瘤是严重威胁人类健康的常见病、多发病，在我国癌症已超过心血管疾病成为第一位致死原因。大量的研究表明，肿瘤的形成和患者的机体免疫机能低下有直接的原因。1909年Ehrlich首先提出，免疫系统不仅负责防御外来病原的侵袭，而且能从肌体内清除改变了宿主成分的细胞。肿瘤细胞是由正常体细胞变异而成，体内存在专门清除肿瘤细胞的机制——肿瘤免疫机制。当肿瘤免疫机能足以清除体内不断产生的肿瘤细胞，人体能够保持健康，反之则形成肿瘤。免疫功能分为细胞免疫和体液免疫两个部分，淋巴细胞是细胞免疫功能的实现者，是免疫系统抵抗肿瘤的主要物质力量。通过了解淋巴细胞抵抗肿瘤的功能，就可以知道肿瘤免疫细胞过继治疗的理论基础。发挥肿瘤免疫功能的淋巴细胞有详细的分工，主要有以下几种：
第一种是抗原提呈细胞(APC)：抗原提呈细胞能够识别并捕获病原体或肿瘤细胞上的非宿主物质(抗原)，提呈给免疫系统激发特异性的应对机制，是免疫系统的“侦察员”。在肿瘤免疫的过程中，免疫系统首先要能够认识肿瘤细胞和正常体细胞的区别，然后才能够引导免疫机制将肿瘤细胞准确清除，这个过程就是依靠抗原提呈细胞捕获和加工“肿瘤抗原”。如前所述，肿瘤细胞是改变了宿主成分的细胞，会表达正常体细胞所没有的标志物(肿瘤抗原)。抗原提呈细胞发现肿瘤抗原，会将其捕获并加工成免疫系统容易识别的组织相容性抗原/肿瘤抗原复合物，传递给负责免疫系统信息处理的T辅助性细胞(Th细胞)，激发免疫系统产生针对肿瘤抗原的特异性反应，引导免疫系统清除肿瘤细胞。树突状细胞是分布最广泛，效率最高的一种抗原提呈细胞。
第二种是辅助性T细胞(Th细胞)：辅助性T细胞是免疫系统中的信息处理和指挥中心。T辅助性细胞刚开始以Th细胞前体的形式存在，在接受抗原提呈细胞递呈的抗原复合物之后，分化成为Th细胞中间期Th0，Th0经过不同的细胞因子诱导，分化成为Th1或Th2，分别负责细胞免疫和体液免疫的动员。在肿瘤免疫机制中，Th1细胞根据获得的肿瘤抗原对体内亿万个Tc细胞进行选择，当Tc细胞上的T细胞受体和肿瘤抗原能够紧密结合，这个Tc细胞就会被选中并被激活，从而获得大量能够识别相关肿瘤抗原并杀灭肿瘤细胞的Tc细胞。根据经典的克隆选择学说，Th2细胞以类似的机制选择分泌特异性抗体的B淋巴细胞，使之大量扩增发挥体液免疫作用。
第三种是杀伤性T细胞(Tc)：杀伤性T细胞(Tc)是根据抗原识别特异性目标，具有特异性杀伤入侵的病原体或内部产生的肿瘤细胞功能的T淋巴细胞。在抵抗肿瘤的过程中，Tc细胞在Th1细胞作用下通过组织相容性抗原/肿瘤抗原复合物与T细胞受体(TCR)结合被特异性选择激活，因而Tc细胞表面的T细胞受体(TCR)能够识别特定的肿瘤抗原，引导Tc细胞发挥细胞毒作用杀伤肿瘤细胞。Tc细胞在识别肿瘤细胞后会释放穿孔素，杀伤效力是非常强大的，是免疫系统中抓捕特异肿瘤细胞的“刑警”；经过Th细胞传递肿瘤抗原激活的Tc细胞，其表面的T细胞受体(TCR)和肿瘤抗原有非常强的亲和力，是引导Tc细胞缉拿肿瘤细胞的“通缉令”。
第四种是自然杀伤细胞(NK)：自然杀伤细胞(NK)是体内的另一类淋巴细胞，能够杀伤无宿主成分的病原体或变异体细胞。肿瘤细胞是改变宿主成分的细胞，除了表达肿瘤抗原这个特点外，还不表达正常体细胞都表达的主要组织相容性抗原I(MHC I)或者MHC I表达变异。在肿瘤免疫体系中自然杀伤细胞发挥的作用很大，能根据MHC I分子变异或不表达这个特点识别肿瘤细胞，而且对肿瘤细胞具有很强的杀伤效力。MHC I分子是正常体细胞的“合法身份证明”，NK细胞就是专门杀伤无“合法身份证明”的肿瘤细胞的武装警察。体内NK细胞数量多、抗瘤谱广、杀伤效力强，是机体抵抗肿瘤的天然屏障。
免疫细胞过继治疗的发展历程和种类
种类有五种：第一种是淋巴因子激活的杀伤细胞(Lymphokine ActivedKiller，LAK细胞)
进入上世纪八十年代，随着分子生物学的发展，许多细胞因子的基因被克隆，运用基因重组技术在原核或真核细胞中进行表达，使那些在生理条件下难以分离的细胞因子得以大量生产，促进了肿瘤免疫治疗的发展。其中最为令人们鼓舞的是又称促淋巴细胞生长因子的白细胞介素-2(IL-2)的出现，几乎所有的淋巴细胞都有IL-2受体，人们希望注射IL-2促进体内淋巴细胞的生长，增强免疫机能对抗肿瘤。但这一想法很快因为发现IL-2在体内有强烈的毒副作用而被否定。Rosenberg在1984年，用IL-2在体外活化和扩增的淋巴细胞，获得了对肿瘤细胞有较强的杀伤活性、抗瘤谱较为广泛、不损伤正常的淋巴细胞，称为淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)。临床研究中应用LAK细胞输入病人体内进行过继免疫治疗，对黑色素瘤、肾细胞癌、淋巴瘤等有一定疗效，尤其那些在常规疗法不能取得疗效的患者中也取得了一些部分缓解和完全缓解的病例。
但是LAK细胞作为最早的免疫细胞过继治疗的方法，有许多的缺点需要完善。首先LAK细胞在体外培养需要使用大量的IL-2，回输到体内仍然会出现水钠潴留等毒副作用，对肿瘤的杀伤又无特异性，而且细胞容易出现老化，生长速度和持续生长能力都不甚理想。
第二种是肿瘤浸润性淋巴细胞(Tumor infitrating lymphocyte，TIL)
1986年Rosenberg的研究组荷瘤小鼠实体瘤中，首次分离到了肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，在体外加入少量的IL-2进行培养，获得的细胞其杀伤效率高于LAK细胞50-100；后来发现肿瘤病人的胸、腹水分离出的淋巴细胞，转移淋巴结获得的淋巴细胞，在体外加入IL-2进行培养，也可以获得杀瘤效率很高的效应细胞。这就是细胞免疫过继疗法的另一种类肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。
TIL在体外扩增的过程中，经流式细胞计数器检测，细胞的表面标志CD4和DC8总数都上升，而CD4/DC8的比例不断下降。CD4是辅助性T细胞的表面标志，CD8是杀伤性T细胞的表面标志，这表明体外扩增的TIL中以杀伤性T细胞为主。在体外扩增的TIL回输到体内，会在肿瘤周围形成较长时间的聚集，对自身的肿瘤有特异性杀伤作用。
第三种是肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte，CTL)
随着对肿瘤抗原、抗原的加工呈递和T细胞识别机制的研究有了突破性进展，基因工程重组细胞因子、人源化基因工程抗体进入临床应用，以及树突状细胞的深入研究，已经可以在体外诱导对肿瘤具有特异性的杀伤性T细胞。研究者们提取外周血单核细胞(PBMCs)，在体外和细胞因子混合培养诱导成为树突状细胞(DC)，在DC中加入肿瘤抗原，然后和自体T淋巴细胞混合培养。DC细胞完成抗原提呈后，通过辅助性T细胞激活杀伤性T细胞，经过培养获得肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)，CTL回输到体内也会形成在肿瘤组织周围的浸润，发挥类似TIL的杀伤肿瘤作用。
第四种是细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokines induce killer cells，CIK)
CIK细胞是通过抽取肿瘤患者自体、同种异体外周血，分离出淋巴细胞，在抗CD3单克隆抗体和IL-2等细胞因子的作用下在体外大量扩增，然后回输到病人体内达到肿瘤免疫治疗的目的。Suthanthiran等(1984)最先显示，用抗CD3单抗预处理人混合淋巴细胞培养中的记忆细胞，能诱导出专一的次级细胞溶解活力和自然杀伤细胞样活力。Uberti等(1994)用固相抗CD3单抗和IL-2处理PBMCs，得到具非MHC限制的细胞毒细胞，用于骨髓移植后的过继细胞免疫治疗。以后CIK细胞逐渐成为肿瘤免疫治疗的重点。
CD3是T淋巴细胞的特征表面标志，大约有67％的成人个体的外周血细胞表达CD3分子。研究表明CD3分子还是在T淋巴细胞分化增殖中起重要调控作用的细胞膜蛋白，至少由5个多肽亚基(γ、δ、ε、ζ、η)组成，在细胞膜上和T细胞受体(TCR)的两个异源二聚体αβ和γδ都偶联。当抗CD3单克隆抗体和CD3分子的特定位点结合后，会使CD3分子的空间构象发生改变，进而使与之偶联的T细胞受体(TCR)受到影响，启动T细胞的信号系统导致T细胞被激活，表面的IL-2受体表达量增多，可在IL-2的协同作用下可以在体外长时间存活并且快速增殖。
CIK细胞具有诸多优点：一是IL-2用量少，引起的毒副反应；二是主要含有CD3 +CD8 +的T杀伤细胞(TC细胞)和CD3 +CD8 +具有自然杀伤细胞作用的细胞，对肿瘤杀伤效率非常强大；三是CIK细胞使用抗CD3单克隆抗体和IL-2两种方式激活，在体外培养不易老化可以较长时间存活和以较快的速度增殖；四是CIK细胞在被激活后能持续较高水平地表达分泌多种细胞因子，回输到体内后促进经过放疗、化疗肿瘤病人淋巴细胞数量迅速回升。
第五种是DC瘤苗(Dendritic Cell Tumor Vaccin)
机体的免疫应答首先由抗原递呈细胞(antigen presenting cell，APC)捕获、加工和处理抗原，再将抗原递呈给T，B淋巴细胞，从而引发一系列的免疫应答。树突状细胞(dendritic cell，DC)作为功能最强的APC，在体内发挥强大的免疫监视功能。肿瘤患者体内DC功能缺陷，不能有效递呈肿瘤抗原，导致免疫无能或免疫耐受。
DC在体内分布虽广，但数量极少，外周血单核细胞中DC的比例还不到1％，在淋巴器官中虽数量较多但难以收集，而且由于分离出的DC具有异质性，难以满足对DC的基础研究及临床应用的需要。此外，体内的DC因为肿瘤分泌的一些因子，如IL-10，TGF，VEGF限制其成熟而发生功能缺陷。因此，利用DC的前体细胞体外诱导分化扩增DC是研究DC瘤苗的必要途径。方法一是利用从骨髓、脐血、外周血分离纯化而来的CD34 +干细胞，GM-CSF、TNF-α等细胞因子的作用下诱导分化成DC；方法二是分离外周血单核细胞体外诱导扩增DC在体外用GM-CSF、IL-4等细胞因子的作用下诱导分化成DC。在获得DC细胞后，使用以已知抗原肽冲击DC、以全肿瘤抗原冲击DC、以基因转染DC、以免疫辅助分子基因转染DC、使用经处理的肿瘤细胞与DC融合等方法构件DC瘤苗，再回输到体内激活免疫系统的特异性抗瘤机制。
随着DC体外诱导扩增技术的发展及分子生物学技术和基因工程技术应用于DC瘤苗构建方法的发现，DC瘤苗用于肿瘤免疫治疗的实验和临床研究更趋成熟，有望成为肿瘤免疫治疗的一种有效方式。
免疫细胞过继治疗面临的问题：从以上的综述可以看出，免疫细胞过继治疗是很有发展前景的，但是也面临着不少的问题制约其进一步发展。第一是对肿瘤的杀伤效力还没有完全发挥：细胞免疫中抗原提呈、效应细胞激活、效应细胞培养等过程是环环相扣的，而且要求各个环节的细胞具有相同的基因背景。而当今所开发的各种免疫细胞培养方法，都只涉及细胞免疫的一个方面，没有实现各种细胞之间的协同作用，不能将细胞免疫功能的效应发挥到最大化。
第二是规模小、成本高：免疫细胞发挥作用受MHC I抗原限制，而当今所开发的各种免疫细胞培养方法，都只涉及细胞免疫的一个方面，为了和肿瘤宿主的其他免疫细胞保持基因背景的统一，只能够实施个体化治疗方案。在现阶段用于过继治疗的免疫细胞，都是来自病人自体或亲属，免疫细胞过继治疗只能是个性化治疗，这就决定了规模受到限制，必然造成治疗的成本比较高，难以大规模推广。
第三是生产标准化程度低，质量不稳定：由于是个性化的治疗，不同患者的情况差别很大，不同个体免疫细胞的生产条件也有不同。生产过程很难依照一定的标准开展，导致培养出来的免疫细胞的质量不统一，制约了免疫细胞过继治疗的大规模推广。
第四是质量控制困难：根据国家食品药品监督管理局颁布的《人的体细胞治疗临床实验指导原则》，对用于临床治疗的人的体细胞的检验项目很多，如果应用于每一个病人的免疫细胞都进行检验，工作量会相当大而且成本高昂，很难实现。
如果免疫细胞过继治疗能够在技术上取得突破，在实际应用中实现规模化、标准化，那么以上的各种问题就可以迎刃而解，肿瘤的生物治疗将会迎来一个新的发展机遇。
【发明内容】为了克服现有免疫细胞培养方法没有实现各种细胞之间的协同作用，不能将细胞免疫功能的效应发挥到最大化，具有规模小、成本高，生产标准化程度低，质量不稳定和质量控制困难的缺点，本发明提供一种使用生物反应器对造血干细胞来源的细胞因子诱导的杀伤细胞的大规模培养技术。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种使用生物反应器对造血干细胞来源的细胞因子诱导的杀伤细胞的大规模培养技术，包括脐带血造血干细胞的获得，以细胞因子将造血干细胞诱导成DC细胞、并完成对肿瘤抗原的提呈作用，完成对肿瘤具有特异性杀伤作用的杀伤性T淋巴细胞的选择激活，以化学法连接抗CD3单抗的琼脂糖微载体的制备，CIK细胞的激活和CIK细胞在生物反应器中进行连续培养，所述以化学法连接抗CD3单抗的琼脂糖微载体的制备是以共价方法将单抗连接在微载体上，提高单抗与细胞的接触面积，增大培养空间，提高细胞密度，又可以在空间实现树突状细胞、辅助性T细胞、杀伤性T细胞之间的接触，便于肿瘤抗原的提呈和杀伤性T细胞的选择激活，由于CIK细胞培养实现立体化，所以可以使用生物反应器进行大规模培养，将琼脂糖微载体在pH为10.5-11的0.1MTris缓冲液中和加入溴化氰使终浓度为0.1M，在摇床上20-25℃作用过夜；1500转/分钟离心5分钟，使琼脂糖微载体和溴化氰反应液分离，用pH为11的Tris缓冲液洗涤/离心5次，将活化的琼脂糖微载体风干备用，将琼脂糖微载体和抗CD3抗体以1g/3-5mg的比例，在pH为9.5-10的0.1MTris缓冲液中混合，在摇床上20-25℃作用1小时，使抗CD3抗体充分结合到琼脂糖微载体上，加入足够量的甘氨酸封闭琼脂糖微载体未反应的位点，用DMEM培养液洗涤离心10次，将微载体在4-8℃风干后，用钴60辐照灭菌后备用；
所述CIK细胞的激活是将完成对肿瘤具有特异性杀伤作用的杀伤性T淋巴细胞的选择激活中处理过的脐带血造血干细胞以0.8-1×108个细胞/1g微载体的比例混合，在培养瓶中以含有10％胎牛血清和终浓度为300-500ng/ml的IL-2的PMRI1640完全培养基培养，这时脐带血造血干细胞中含有的单核细胞和杀伤性T细胞会在连接和微载体上的抗CD3单抗和IL-2的作用下被激活成为CIK细胞，进入快速生长的状态，在抗CD3单抗的支持下生长8-10天后，CIK细胞会逐渐成熟并摆脱对抗CD3单抗的依赖，这时可以将细胞转入到生物反应器中进行大规模连续培养；
所述CIK细胞在生物反应器中进行连续培养：采用搅拌式生物反应器，以搅拌速度60-80转/分钟，溶氧量为45-55％，pH为7.2，温度为37℃，培养基替换速度为1-1.5ml/分钟的条件进行培养，能够为细胞提供稳定而合适的生长条件，而反应器的细胞截留装置使细胞能够保持高密度状态，使CIK细胞能够得到长时间、高密度地培养，当反应器内的细胞密度达到3-5×107之后，就可以每天收集500-800ml的细胞培养液，得到2-4×1010的CIK细胞，剩余的细胞继续在反应器内进行连续培养、连续收集。
所述脐带血造血干细胞的获得是取健康足月婴儿脐带血30-50ml，并加入枸橼酸钠抗凝，用淋巴细胞分离液以2500转/分钟离心25-30分钟，收集脐带血造血干细胞，以胚胎成纤维细胞作为滋养细胞，在含有10％胎牛血清的PMRI1640完全培养基中，加入终浓度为200-250ng/ml的IL-3和50-80ng/ml的CSF，在5％二氧化碳浓度下37℃培养，这时候脐带血造血干细胞能够在不分化的状态下持续快速生长，不断传代，获得大量的脐带血单核细胞，用于CIK细胞的生产。
所述以细胞因子将造血干细胞诱导成DC细胞、并完成对肿瘤抗原的提呈作用是将脐带血造血干细胞在含有终浓度为80-100ng/ml的IL-4、200-250ng/ml的GM-CSF和100-200ng/ml的TNF-α的含有10％胎牛血清的PMRI1640完全培养基中培养，将脐带血造血干细胞诱导成树突状细胞DC，将肿瘤细胞碎片加入到DC细胞中，使DC细胞完成对肿瘤抗原的提呈作用。
所述完成对肿瘤具有特异性杀伤作用的杀伤性T淋巴细胞的选择激活是将经过肿瘤抗原冲击的DC细胞和脐带血造血干细胞共同培养，培养液为含有10％胎牛血清和终浓度为300-400ng/ml的IL-12的PMRI1640完全培养基中共同培养，这时DC细胞会将加工过的肿瘤抗原传递给辅助性T细胞，辅助性T细胞会选择激活对肿瘤具有特异性杀伤作用的杀伤性T淋巴细胞。
本发明的积极效果是：本发明以共价方法将单抗连接在微载体上，既提高了单抗与细胞的接触面积，增大培养空间，提高细胞密度；又可以在空间实现树突状细胞、辅助性T细胞、杀伤性T细胞之间的接触，便于肿瘤抗原的提呈和杀伤性T细胞的选择激活；由于CIK细胞培养实现立体化，所以可以使用生物反应器进行大规模培养。
具体表现是能够使所培养的CIK细胞杀伤肿瘤的效率更高；能够使所培养的CIK细胞克服个体差异依赖性的限制，具有大规模推广的可能；能够引入微载体、运用大规模培养设备，实现使所培养的CIK细胞大规模标准化培养，使CIK细胞实现安全有效、稳定均一、质量可控、经济可行的目标；是一种大规模、连续、高密度培养免疫细胞的方法。
使用了脐带血来源的造血干细胞，获得基因背景相同的各种免疫效应细胞，整合各种免疫细胞培养方法，突破肿瘤免疫治疗的“个体化限制”，并使用生物反应器实现对免疫细胞的大规模培养，实现杀伤肿瘤免的免疫效应细胞大规模、低成本、稳定、高效的产业化生产目标；
【具体实施方式】
一种使用生物反应器对造血干细胞来源的细胞因子诱导的杀伤细胞的大规模培养技术：
步骤1是大量的脐带血造血干细胞的获得：取健康足月婴儿脐带血50ml，并加入枸橼酸钠抗凝，用淋巴细胞分离液以2500转/分钟离心30分钟，收集脐带血造血干细胞；以胚胎成纤维细胞作为滋养细胞，在含有10％胎牛血清的PMRI1640完全培养基中，加入终浓度为200ng/ml的IL-3和50ng/ml的CSF，在5％二氧化碳浓度下37℃培养；这时候脐带血造血干细胞能够在不分化的状态下持续快速生长，不断传代，获得大量的脐带血单核细胞，用于CIK细胞的生产。
步骤2是以细胞因子将造血干细胞诱导成DC细胞，并完成对肿瘤抗原的提呈作用：将步骤1脐带血造血干细胞在含有终浓度为100ng/ml的IL-4、200ng/ml的GM-CSF和100ng/ml的TNF-α的含有10％胎牛血清的PMRI1640完全培养基中中培养，将脐带血造血干细胞诱导成树突状细胞DC；将肿瘤细胞碎片加入到DC细胞中，使DC细胞完成对肿瘤抗原的提呈作用。
步骤3是完成对肿瘤具有特异性杀伤作用的杀伤性T淋巴细胞的选择激活：将步骤2中经过肿瘤抗原冲击的DC细胞和脐带血造血干细胞共同培养，培养液为含有10％胎牛血清和终浓度为300ng/ml的IL-12的PMRI1640完全培养基中共同培养，这时DC细胞会将加工过的肿瘤抗原传递给辅助性T细胞，辅助性T细胞会选择激活对肿瘤具有特异性杀伤作用的杀伤性T淋巴细胞。
步骤4是以化学法连接抗CD3单抗的琼脂堂微载体的制备：将琼脂糖微载体在pH11的0.1MTris缓冲液中和溴化氰混合，在摇床上25℃作用过夜；离心使琼脂糖微载体和溴化氰反应液分离，用pH11的Tris缓冲液洗涤/离心5次，将活化的琼脂糖微载体风干备用；将琼脂糖微载体和抗CD3抗体以1g/5mg的比例，在pH10的0.1MTris缓冲液中混合，在摇床上25℃作用1小时，使抗CD3抗体充分结合到琼脂糖微载体上；加入足够量的甘氨酸封闭琼脂糖微载体未反应的位点，用DMEM培养液洗涤离心10次，用钴60辐照灭菌后备用。
在本实施例中，抗CD3单抗与细胞的接触是免疫细胞培养的关键，接触面积越大细胞培养密度越高。本发明以共价方法将单抗连接在微载体上，提高单抗与细胞的接触面积，增大培养空间，提高细胞密度；又可以在空间实现树突状细胞、辅助性T细胞、杀伤性T细胞之间的接触，便于肿瘤抗原的提呈和杀伤性T细胞的选择激活。由于CIK细胞培养实现立体化，所以可以使用生物反应器进行大规模培养。
步骤5是CIK细胞的激活：将步骤3中处理过的脐带血造血干细胞以108个细胞/1g微载体的比例混合，在培养瓶中以含有10％胎牛血清和终浓度为500ng/ml的IL-2的PMRI1640完全培养基培养，这时脐带血造血干细胞中含有的单核细胞和杀伤性T细胞会在连接和微载体上的抗CD3单抗和IL-2的作用下被激活成为CIK细胞，进入快速生长的状态。在抗CD3单抗的支持下生长8-10天后，CIK细胞会逐渐成熟，这时可以将细胞转入到生物反应器中进行大规模连续培养。
步骤6是CIK细胞在生物反应器中进行连续培养：生物反应器是一种模拟体内环境，提供给细胞适宜的生长条件的设备。本发明使用德国B.Braun公司生产的5L搅拌式生物反应器，以搅拌速度60-80转/分钟，溶氧量为45-55％，pH7.2，温度为37℃，培养基替换速度为1-1.5ml/分钟的条件进行培养，全部参数都是有传感器自动检测，由反应器自动控制，能够为细胞提供稳定而合适的生长条件，而反应器的细胞截留装置使细胞能够保持高密度状态，使CIK细胞能够得到长时间、高密度地培养。当反应器内的细胞密度达到3-5×107之后，就可以每天收集500ml的细胞培养液，得到2×1010的CIK细胞(可以满足20位患者一次的治疗量)。剩余的细胞继续在反应器内进行连续培养、连续收集。
Claims (4)
1、一种使用生物反应器对造血干细胞来源的细胞因子诱导的杀伤细胞的大规模培养技术，包括脐带血造血干细胞的获得，以细胞因子将造血干细胞诱导成DC细胞、并完成对肿瘤抗原的提呈作用，完成对肿瘤具有特异性杀伤作用的杀伤性T淋巴细胞的选择激活，以化学法连接抗CD3单抗的琼脂糖微载体的制备，CIK细胞的激活和CIK细胞在生物反应器中进行连续培养，其特征是：所述以化学法连接抗CD3单抗的琼脂糖微载体的制备是以共价方法将单抗连接在微载体上，提高单抗与细胞的接触面积，增大培养空间，提高细胞密度，又可以在空间实现树突状细胞、辅助性T细胞、杀伤性T细胞之间的接触，便于肿瘤抗原的提呈和杀伤性T细胞的选择激活，由于CIK细胞培养实现立体化，所以可以使用生物反应器进行大规模培养，将琼脂糖微载体在pH为10.5-11的0.1MTris缓冲液中和加入溴化氰使终浓度为0.1M，在摇床上20-25℃作用过夜；1500转/分钟离心5分钟，使琼脂糖微载体和溴化氰反应液分离，用pH为11的Tris缓冲液洗涤/离心5次，将活化的琼脂糖微载体风干备用，将琼脂糖微载体和抗CD3抗体以1g/3-5mg的比例，在pH为9.5-10的0.1MTris缓冲液中混合，在摇床上20-25℃作用1小时，使抗CD3抗体充分结合到琼脂糖微载体上，加入足够量的甘氨酸封闭琼脂糖微载体未反应的位点，用DMEM培养液洗涤离心10次，将微载体在4-8℃风干后，用钴60辐照灭菌后备用；
所述CIK细胞的激活是将完成对肿瘤具有特异性杀伤作用的杀伤性T淋巴细胞的选择激活中处理过的脐带血造血干细胞以0.8-1×108个细胞/1g微载体的比例混合，在培养瓶中以含有10％胎牛血清和终浓度为300-500ng/ml的IL-2的PMRI1640完全培养基培养，这时脐带血造血干细胞中含有的单核细胞和杀伤性T细胞会在连接和微载体上的抗CD3单抗和IL-2的作用下被激活成为CIK细胞，进入快速生长的状态，在抗CD3单抗的支持下生长8-10天后，CIK细胞会逐渐成熟并摆脱对抗CD3单抗的依赖，这时可以将细胞转入到生物反应器中进行大规模连续培养；
所述CIK细胞在生物反应器中进行连续培养：采用搅拌式生物反应器，以搅拌速度60-80转/分钟，溶氧量为45-55％，pH为7.2，温度为37℃，培养基替换速度为1-1.5ml/分钟的条件进行培养，能够为细胞提供稳定而合适的生长条件，而反应器的细胞截留装置使细胞能够保持高密度状态，使CIK细胞能够得到长时间、高密度地培养，当反应器内的细胞密度达到3-5×107之后，就可以每天收集500-800ml的细胞培养液，得到2-4×1010的CIK细胞，剩余的细胞继续在反应器内进行连续培养、连续收集。
2、根据权利要求1所述的使用生物反应器对造血干细胞来源的细胞因子诱导的杀伤细胞的大规模培养技术，其特征是：所述脐带血造血干细胞的获得是取健康足月婴儿脐带血30-50ml，并加入枸橼酸钠抗凝，用淋巴细胞分离液以2500转/分钟离心25-30分钟，收集脐带血造血干细胞，以胚胎成纤维细胞作为滋养细胞，在含有10％胎牛血清的PMRI1640完全培养基中，加入终浓度为200-250ng/ml的IL-3和50-80ng/ml的CSF，在5％二氧化碳浓度下37℃培养，这时候脐带血造血干细胞能够在不分化的状态下持续快速生长，不断传代，获得大量的脐带血单核细胞，用于CIK细胞的生产。
3、根据权利要求1所述的使用生物反应器对造血干细胞来源的细胞因子诱导的杀伤细胞的大规模培养技术，其特征是：所述以细胞因子将造血干细胞诱导成DC细胞、并完成对肿瘤抗原的提呈作用是将脐带血造血干细胞在含有终浓度为80-100ng/ml的IL-4、200-250ng/ml的GM-CSF和100-200ng/ml的TNF-α的含有10％胎牛血清的PMRI1640完全培养基中培养，将脐带血造血干细胞诱导成树突状细胞DC，将肿瘤细胞碎片加入到DC细胞中，使DC细胞完成对肿瘤抗原的提呈作用。
4、根据权利要求1所述的使用生物反应器对造血干细胞来源的细胞因子诱导的杀伤细胞的大规模培养技术，其特征是：所述完成对肿瘤具有特异性杀伤作用的杀伤性T淋巴细胞的选择激活是将经过肿瘤抗原冲击的DC细胞和脐带血造血干细胞共同培养，培养液为含有10％胎牛血清和终浓度为300-400ng/ml的IL-12的PMRI1640完全培养基中共同培养，这时DC细胞会将加工过的肿瘤抗原传递给辅助性T细胞，辅助性T细胞会选择激活对肿瘤具有特异性杀伤作用的杀伤性T淋巴细胞。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CN115478052A (zh) * | 2022-11-01 | 2022-12-16 | 安徽省立医院(中国科学技术大学附属第一医院) | 一种人单核前体细胞体外分离培养的方法 |
-
2005
- 2005-06-09 CN CNA2005100350364A patent/CN1699558A/zh active Pending
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| CN105821000B (zh) * | 2016-03-11 | 2020-01-31 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 生物反应器及其搅拌桨和使用其培养cik细胞的方法 |
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| EP3517600A1 (de) | 2018-01-24 | 2019-07-31 | Zellwerk GmbH | Mäander-bioreaktor und verfahren für die isolierung und vermehrung von zellen aus gewebeteilen von tumoren, metastasen und anderen geweben |
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| WO2020078498A1 (de) | 2018-10-20 | 2020-04-23 | Zellwerk Gmbh | Mäander-perfusions-bioreaktor für die differenzierung, aktivierung, stimulierung und abtrennung von zellen |
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