CS139292A3 - Novel anti-bacterial substance, process of preparing said substance andpharmaceutical compositions containing thereof - Google Patents

Description

' -fa. o 1 -! ř - ’ O Ί O í O Λ » c.

Nová antibakteriální lá^ka^jfotící ywcáAičZ^^ ΛOblast vynálezu OK>

Vynález se týká nové antibakteriální látky, která bylanazvána Thiomarinol a jejíž vzorec bude dále uveden. Vyná-lez se týká rovněž způsobu výroby této látky a farmaceutic-kých prostředků s jejím obsahem. Uvedenou látku je možno zís*·kat při použití mikroorganismu z rodu Alteromonas, jde o no-vý kmen Alteromonas rava SANK 73390. Thiomarinol má raduléčebných, zejména antibakteriálních účinků, takže jej jemožno použít k léčbě nebo profylaxi různých chorob.

Dosavadní stav techniky

Organismy z rodu Alteromonas je možno izolovat z moř-ské vody, některé kmeny produkují látky s potenciálním lé-čebným použitím. Z jednoho kmene byla získána napříkladsloučenina, která byla pojmenována Viscabelin a má proti-nádorovou účinnost, jak bylo popsáno ve zveřejněné japonsképatentové přihlášce Sho 63-27484.

Byla nalezena také řada látek s antibiotickým účinkem,se strukturou podobnou struktuře thiomarinolu, tyto látkyje možno rozdělit do tří skupin. V první skupině se nacházejí kyseliny, které byly po-prvé izolovány z čeledi Pseudomonas spp. Jde o tak zvanoupseudomonovou kyselinu A, produkovanou Pseudomonas fluores-cens, kmen byl popsán v J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 294(1977), dále jde o pseudomonovou kyselinu 8, popsanou tamtéžna str. 313, (1977), pseudomonovou kyselinu C, popsanou vtomtéž časopisu, str. 2327 (1982) a pseudomonovou kyselinuD, popsanou v tomtéž časopisu, str. 2655 (1983). Pseudomonová 2 kyselina A se běžně dodává pod chráněnou slovní známkou"Bactroban" (Beecham) ve formě 2% dermatologického>pro-středku proti bakteriálním onemocněním kůže.

Další deriváty uvedených kyselin byly získány z bak-terií, izolovaných z more a popsaných v Am. Chem. Soc. AbstrPap., 200 (2), (Ί990), tato publikace však nepopisuje žádnýantibakteriální účinek těchto látek.

Druhou skupinou látek s podobnou strukturou jsou slou-čeniny, které zahrnují antibiotika holomycin, Helv. Cnim.Acta, 42, 563, 1959, pyrrothin, 3. Am. Chem. Soc., 77, 2361, 1955, thiolutin, Angew. Chem., 66, 745 1954, aureothricin, 3. Am. Chem. Soc., 74, 6304, 1952 a další. Tato antibiotiká jsou typickými produkty čeledi Actinomycetes a jsoucharakterizována chromoforem, který obsahuje síru. Látkami,příbuznými holomycinu jsou xenorhabdinu I - V, tyto látkybyly izolovány z bakterií a popsány ve W0 84/01775.

Byla provedena řada studií s deriváty obou těchto sku-pin, avšak dosud nebyla popsána látka s molekulovou struk-turou thiomarinolu ani látka s podobnými vlastnostmi. Třetí skupina látek byla popsána například ve zveřej-něných japonských patentových přihláškách č. 52-102279,54-12375, 54-90179, 54-103371 a 54-125672. Tyto publikace popisují deriváty pseudomonových kyselin se strukturou, podob-nou struktuře thiomarinolu, avšak koncová karboxylová aku-pina je v těchto derivátech nahrazena amidovou skupinou.

Tyto (átky nemají srovnatelný antibakteriální účinek a ne-mají široké spektrum antibakteriálního účinku. Tyto látkymají obvykle slabší antibiotický účinek než původní pseudo-monová kyselina. - 3 -

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří nová antibakteriální látkathiomarinol, která je odlišná od všech látek, dosud izolo-vaných z čeledi Alteromonas. Jednou ze strukturních vlast-ností thiomarinolu je přítomnost hydroxylové skopiny, ulo-žená mezi šestičlenným kruhem a alfa,beta-nenasycenou kar-bonylovou skupinou. Svoji strukturou se tedy thiomarinoljasně odlišuje od známých látek.

Thiomarinol, tvořící podstatu vynálezu má lepší účineka širší spektrum antibakteriálního účinku ve srovnání sesvrchu popsanou skupinou antibiotik.

Podstatu vynálezu tvoří tedy thiomarinol vzorce I

Podstatu vynálezu tvoří rovněž způsob výroby thiomarino-lu, který spočívá v tom, že se pěstuje mikroorganismus,pro-dukující thiomarinol z rodu Alteromonas a pak se thiomarinolz kultury izoluje.

Podstatu vynálezu tvoří rovněž farmaceutický prostředek,který jako svou účinnou složku obsahuje thiomarinol spolu snosičem nebo ředidlem, přijatelným z farmaceutického hlediska. 4

Podstatu vynálezu tvoří také použití thiomarinolu provýrobu farmaceutických prostředků, vhodných pro léčbu neboprofylaxi bakteriálních infekcí.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu se užívají tak,aby bylo podáno vždy účinné množství thiomarinolu, látka jevhodná pro podávání savcům' včetně člověka.

Podrobný popis jednotlivých provedení

Ze svrchu uvedeného vzorce je zřejmé, že thiomarinolobsahuje celou řadu asymetrických uhlíkových atomů a něko-lik dvojných vazeb. Může tedy dojít ke tvorbě isomerů na-příklad na alfa,beta-nenasycené karbonylové skupině thio-marinolu. Thiomarinol tedy může tvořit různé optické ageometrické isomery/ Přesto že všechny tyto isomery jsouvyjádřeny jediným molekulárním vzorcem , zahrnuje vynálezjak jednotlivé, izolované isomery, tak jejich směsi včetněracemátů. V případě, že se užije stereospecifických postupůpři syntéze nebo se užijí jako výchozí materiály opticky ak-tivní látky, je možno přímo připravit jednotlivé isomery.

Na druhé straně v případě, že produktem je směs isomerů,je možno jednotlivé isomery získat obvyklým dělením. Přírodně se vyskytující thiomarinol má tendenci kestandardní optické konfiguraci. To znamená, že i když jemožno získat jiné konfigurace, je přírodní konfigurace vý-hodným provedením.

Thiomarinol je možno získat tak, že se pěstuje mikro-organismus z rodu Alteromonas, produkující tuto látku athiomarinol se pak izoluje ze živného prostředí. Variantythiomarinolu s požadovaným antibakteriálním účinkem je mož-no získat i z jiných kmenů Alteromonas, schopných tyto lát-ky produkovat obdobným způsobem, nebo je možno tyto látkyzískat modifikací sloučeniny, získané svrchu uvedenou fer-mentací, nebo je možno je přímo chemicky syntetizovat. 5

Zvláátě vhodné je pro fermentaci užít nový mikroorga-nismus Alteromonas rava, zejména nově izolovaný kmen tétočeledi, který byl označen SANK 73390. Ode o mořský mikro-organismus který byl izolován z mořské vody na pobřeží Koina,Minami-Izu Machi, prefektura Shizuoka, Japonsko, tento kmenbyl uložen do veřejná sbírky kultur Deposition Institute,Research Institute of Microbiological Technology, Agencyof Industrial Science and Technology, Japonsko, 30. dubna 1991pod číslem FERM 8P-3381, podmínky odpovídají podmínkám Buda-peštsbé úmluvy. Dále bude uvedena taxonomická charakteristika nového kme-ne Alteromonas rava SANK 73390. 1. Morfologické vlastnosti

Alteromonas rava kmen SANK 73390 byl pěstován 24 hodinpři teplotě 23 °C na mořském agaru (Difco). Při mikroskopic-kém pozorování mají jednotlivé buňky tvar tyčinek s průměrem0,8 až 1,0 a délkou 2,0 až 3,6 mikrometru. Kmen je gram-nega-tivní a pohybuje se pomocí jednotlivého polárního bičíku. 2. Růst na mořském agaru

Uvedený kmen byl pěstován 24 hodin při teplotě 26 °Cna mořském agaru (Difco). Výslednékolonie mají bleděšedožlutoubarvu, jsou opakní, kruhové, ploché a kompaktní. Nevytvářejíve vodě rozpustný pigment. 3. Fyziologické vlastnosti 1) Kmen SANK 73390 vyžaduje ke svému růstu mořskou vodu. 2) Při oxidativně fermentativním testu podle Kugh-Leifsona, J. Bact., 66, 24 - 26 , 1953 v prostředí, připraveném ve formě umělé mořské vody není možno pozorovat žádnépůsobení na uhlohydráty. 6 3) Oxidasa: + 4) kataláza: + 5) Požadavky na kyslík: kmen je aerobní 6) Redukce nitrátu: - 7) Hydrolýza škrobu: + 8) Rozpouštění agaru: - 9) Zkapalnění želatiny: + 10) Produkce QMázy: + 11) Produkce lipázy: + 12) Teplota růstu: špatný růst v 4 °C, dobrý růst v rozmezí17 až 26 °C, nad 35 °C neroste. 13) Požadavky na růstový faktor: Při použití základníhoprostředí, popsaného v Journal of Bacteriology 107, 268 - 294, 1971, vyžaduje SANK 73390 aminokyselinykaseinu bez vitaminů. 14) Využití uhlíkových zdrojů: na základním prostředí, které bylo popsáno ve svrchu uvedené publikaci, spřísadou 0,1 % hmotnostních aminokyselin kaseinu, prostých vitaminů, ve třepací kultuře: výsledky jsouuvedeny v tabulce:

Tabulka L. Arabinosa: - D-Ribosa: D-xylosa - D-Glukosa + D-galaktosa: - D-fruktosa: - maltosa: + sacharosa: - trehalosa: + cellobiosa: - melibiosa: - mannitol: - sorbitol: - glycerol: - octan sodný: + Na-propionát: + 4. Chemotaxonomické vlastnosti 1) Mol % guaninu a cytosinu (obsah G + C) v ONA: 43,4 %při vysokotlaké kapalinové chromatografii. 2) Chinonový systém: ubichinon Q-8.

Na základě svých taxonomických vlastností, tak jakbyly svrchu popsány, byl Alteromonas rava kmen SANK 73390srovnáván se kmeny, popsanými v Bergey's Manual of SystematicBacteriology, sv. 1, 1984 a také s těmi kmeny, které byly vposlední době popsány v International Oournal of SystematicBacteriology. Bylo zjištěno, že Alteromonas rava kmen SANK73390 má určité podobnosti s Alteromonas citrea, dalším moř-ským mikroorganismem. Oba kmeny, tj. SANK 73390 a Slteromonascitrea, ATCC 29719, standardní kmen, byly pěstovány a paksrovnávány.

Ve srovnání s bleděšedožlutou barvou kolonií kmeneSANK 73390, byly kolonie kmene ATCC 29719 zelenavěžluté. SANK 73390 se od Alteromonas citrea liší také tím,že jeschopen růst při teplotě 4 °C a svou schopností využívattrehalosu a propionát sodný jako zdroje uhlíku. Oe tedymožno uzavřít, že Alteromonas rava kmen SANK 73390 je novýmkmenem nové čeledi Alteromonas rava a liší se podstatnýmivlastnostmi od nejbližší známé čeledi, uložená ve sbírcekultur pod číslem ATCC 29719.

Svrchu uvedené vlastnosti jsou typické pro kmen SANK73390. Oe však dobře známo,že vlastnosti čeledi Alteromonasse mohou měnit jak v přírodě, tak uměle. Svrchu uvedenévřastnosti definují kmen Alteromonas rava tak jak byl uložen,avšak nejsou nutně typické pro jiné čeledi Alteromonas nebopro kmeny Alteromonas rava, které jsou schopné produkovatthiomarinol nebo pro přírodně se vyskytující varianty těch-to kmenů. Oe tedy zřejmé, že tyto kmeny rovněž spadají dorozsahu vynálezu.

Je zřejmé, že SANK 73390 nebo jakýkoliv další kmen,schopný produkovat thiomarinol nebo některá z jeho variantmůže být pěstován v subkultuře nebo biotechnologicky pozmě_něn nebo modifikován k získání organismu s odlišnými vlast-nostmi. Jediným požadavkem je, aby výsledný organismus bylschopen produkovat požadovanou látku.

Uvedené změny a modifikace mohou mít jakoukoliv poža-dovanou formu nebo mohou být důsledkem například podmínekpěstování. Kmeny mohou být modifikovány způsobem pěstovánía podrobeny selekci tak, aby byly získány některé výhodnévlastnosti, například rychlejší růst nebo růst při nižšíchnebo vyšších teplotách.

Biotechnologické modifikace jsou obvykle cílené amohou například vést k zavedení vlastností, usnadňujícíchselekci, například odolnosti proti bakteriostatickým lát-kám nebo naopak vnímavosti k těmto látkám, nebo může jíto kombinace různých vlastností, které mohou pomoci udržetčistotu nebo usnadnit čištění kultury, zejména kultury,určené k očkování, alespoň v časových intervalech.

Dalšími vlastnostmi, které je možno zavést pomocí ge-netických manipulací mohou být jakékoliv vlastnosti, přípustné pro čeleď Alteromonas. Je například možno zařadit plasmi-dy, které jsou kódem pro různé typy odolnosti nebo je možnojakýkoliv přírodně se vyskytující plasmid vyjmout. Výhodnéplasmidy jsou například ty, které jsou příčinou auxotrfie.Tyto plasmidy je možno získat z jakéhokoliv vhodného zdrojenebo je možno je zkonstruovat tak, že se izoluje přírodněse vyskytující plasmid z čeledi Alteromonas a do něj seuloží požadovaný gen nebo geny z jiného zdroje. Přírodníplasmidy je možno modifikovat i dalšími způsoby, které mo-hou být považovány za žádoucí.

Aby bylo možno získat thiomarinol z kultury příslušnéhomikroorganismu, je nutno mikroorganismus pěstovat ve vhodném 9 živném prostředí. Tato prostředí jsou v oboru velmi dobře známa a často se užívají i při získávání jiných fermentačníchproduktů. Živné prostředí obvykle musí obsahovat jakoukoliv kom-binaci zdroje uhlíku, zdroje dusíku a jedné nebo většíhopočtu anorganických solí, které použitý mikroorganismusmůže využít. Minimální požadavek na živné prostředí je, žetoto prostředí musí obsahovat ty složky, které jsou nezbytnépro růst zvoleného mikroorganismu.

Vhodnými zdroji uhlíku jsou například glukosa, fruktosa,maltosa, sacharosa, mannitol, glycerol, dextrin, ovesná mou-ka, žito, kukuřičný škrob, bramborový škrob, kukuřičná mouka,sojová mouka, bavlníkový olej, melasa, kyselina citrónová akyselina vinná, tyto zdroje mohou být užity jednotlivě nebove směsi dvou nebo většího počtu složek. Typické množstvíje v rozmezí 1 až 10 g/100 ml prostředí, ačkoliv množstvíje možno měnit podle ptřeby v závislosti na požadovanémvýsledku.

Vhodnými zdroji dusíku jsou jakékoliv látky, které ob-sahují bílkoviny, representativními příklady dusíkových zdro-jů jsou organické zdroje dusíku z živočichů a rostlin, můžejít například o extrakty z přírodních zdrojů jako jsou sojo-vá mouka, výpalky, arašídová mouka, mouka z bavlníkových se-men, hydrolyzát kaseinu, fermamin, rybí moučka, kukuřičnývýluh, pepton, extrakt z masa, kvasinky, extrakt z kvasinek,sladový extrakt. Z anorganických zdrojů dusíku je možno uvéstdusičnan sodný, dusičnan amonný a síran amonný. Stejné jakov případě uhlíkových zdrojů, je možno užít zdroje dusíkujednotlivě nebo ve směsích. Vhodné množství se typicky pohy-buje v rozmezí 0,1 až 6 g/100 ml prostředí.

Vhodné anorganické soli jsou zejména ty soli, kterákromě hlavní složky soli poskytují také stopové prvky. 10

Soli by s výhodou měly dodat potřebné ionty, jako iontysodné, draselné, amonné, vápenaté, horečnaté, ionty žele-za, fosfátové, sulfátové, chloridové a karbonátové ionty.Mohou být přítomny i soli stopových kovů, jako kobaltu,manganu a stroncia nebo soli, schopné dodat tyto ionty,například bromidy, fluoridy, boritany nebo křemičitany. Čeled Alteromonas rava se vyskytuje přirozeně v mořskévodě, takže v případě, že není uveden opak, jsou ideálnímipodmínkami v kultuře podmínky, odpovídající prostředí vmoři. Je tedy vhodné do prostředí pro pěstování těchto mik-roorganismů včlenit stopové ionty, které se obvykle vyskytu-jí v mořské vodě. V případě, že se mikroorganismus pěstuje v kapalnémživném prostředí, je výhodné přidávat protipěnivé činidlo,například silikonový olej nebo rostlinný olej nebo jiné vhod-né povrchově aktivní činidlo.

Je výhodné udržovat pH živného prostředí pro Alteromo-nas rava, kmen SAMK 73390 při produkci thiomarinolu v rozmezí5,0 až 8,0, přesto že jediným požadavkem je, aby použité pHnebránilo růstu mikroorganismu a aby neovlivnilo nepříznivěirreversibilně kvalitu výsledného produktu. Může být výhodnépřidat přebytek kyseliny nebo zásady k zastavení fermentace.

Alteromonas rava, kmen SANK 73390 obvykle roste přiteplotě v rozmezí 4 až 32 °C, dobře roste v teplotním roz-mezí 17 až 26 °C. Jiné teploty, nespadající do uvedenéhorozmezí je možno použít v případě, že se podaří vyvinoutkmen, schopný růst při vyšší nebo nižší teplotě. Pro výrobuthiomarinolu je vhodné použít výhodného teplotního rozmezí20 až 26 °C.

Thiomarinol je výhodné získávat z aerobní kultury,k tomuto účelu je možno užít jakéhokoliv pěstování za 11 aerobních podmínek, například v kultuře na pevném prostředí,třepací kultuře nebo v kapalném živném prostředí za provzduš-nění a míchání. V případě, že se kmen pěstuje v malém rozměru, je ob-vykle výhodné použít pěstování několik dnů v třepací kultuřepři teplotě 20 až 26 °C. Při založení fermentační kultury se s výhodou užíváočkovacího materiálu, připraveného v jednom nebo ve dvoustupních, například v Erlenmeyerově baňce. V živném prostře-dí se obvykle užívá směs zdroje uhlíku a zdroje dusíku. Baň-ky se protřepávají v termostatu při teplotě 23 °C celkemjeden až tri dny nebo tak dlouho, až se dosáhne dostatečné-ho růstu. Výsledná očkovací kultura se pak užije k naočko-vání další očkovací kultury nebo přímo k naočkování produkč-ní kultury. V případě, že se užije druhé očkovací kultury,může tato kultura být založena obdobným způsobem a pak jeji možno Částečně použít k naočkování produkčního živnéhoprostředí. Baňka, v níž je založena očkovací kultura se pro-třepává 1 až 3 dny nebo tak dlouho, až se dosáhne maximálníprodukce, užije se vhodné teploty. Po ukončení inkubace jemožno mikroorganismus od živného prostředí oddělit odstře-děním nebo filtrací. V případě, že se mikroorganismus pěstuje ve velkém mě-řítku, může být výhodná kultura ve vhodném fermentačním za-řízení za současného provzdušnění a míchání. Při tomto po-stupu je možno živné prostředí připravit přímo ve fermentač-ním zařízení. Po sterilizaci při teplotě 125 °C se živnéprostředí zchladí a naočkuje očkovacím materiálem, předběž-ně vypěstovaným na sterilizovaném živném prostředí. Kulturase inkubuje za míchání a provzdušnění při teplotě 20 až 26 °CTento postup je vhodný v případě, že má být získáno velkémnožství výsledného produktu. 12 ¢-

Mnozství thimiarinolu, produkované kulturou v průběhučasu je možno sledovat například vysokotlakou kapalinovouchromatografi£. Obvykle je možno dosáhnout maximálního množ-ství produkovaného thiomarinolu v časovém rozmezí 19 hodinaž 96 hodin.

Po vhodné době pěstování je možno thiomarinol izolovata čistit jakýmkoliv známým způsobem. Je například možno thio-marinol ze živného prostředí izolovat tak, že se odfiltrujepevný podíl, například při použití diatomitu jako pomocnéhoprostředku při filtraci nebo odstředěním, pak se supernatantextrahuje a thiomarinol se čistí na základě svých fyzikálně--chemických vlastnostech. Thiomarinol je z filtrátu nebo zesupernatantu možno extrahovat například organickým rozpouštědlem, nemísitelným s vodou, jako ethylacetátem, chloroformem,ethylenchloridem, metnylenchloridem nebo jakoukoliv směsítěchto rozpouštědel v neutrálním nebo kyselém prostředí, pakje možno extrahovaný thiomarinol čistit.

Jako adsorpční činidla je možno užít aktivní uhlí neboadsorpční pryskyřici, například Amberlit XAD-2, XAD-4 (Rohma Haas) nebo Diaion HP-1Q, HP-20, CHP-2D, HP-5D (MitsubishiXasei Corporation). Nečistoty je možno po adsorpci odstranittak, že se kapalina s obsahem thiomarinolu nechá projít vrst-vou adsorpčního činidla, nebo je možno thiomarinol čistit poadsorpci elucí pomocí vhodného elučního činidla, napříkladpři použití vodného methanolu, vodného acetonu nebo směsibutanolu a vody.

Intracelulární thiomarinol je možno čistit extrakcívhodným rozpouštědlem, například 50 až 90¾ vodným acetonemnebo vodným metnanolem s následným odstraněním organickéhorozpouštědla s následnou extrakcí, tak jak byla popsánasvrchu při izolaci thiomarinolu z filtrátu nebo ze super-natantu. 13 Výsledný thiomarinol je možno dále čistit známým způ-sobem, například chromatografií na sloupci při použití no-siče, například silikagelu nebo silikagelu s obsahem hořčíku,který se dodává naoříklad pod obchodním názvem Florisil, dáledělicí chromatografií na sloupci při použití adsorpčního či-nidla, například Sephadexu LH-20 (obchodní název, Pharmacia),nebo vysokotlakou kapalinovou chromatografií v obvyklé fázinebo na sloupci v reverzní fázi. Jak je známo, je možno všech-ny tyto postupy, vedoucí k izolaci a čistění výsledného pro-duktu provádět jednotlivě nebo v jakékoliv vhodné kombinacia popřípadě ještě opakovat, tak, aby bylo dosaženo dostateč-ná izolace a čištění výsledného produktu. V případě, že sloučeniny podle vynálezu mají být užityk léčebným účelům, je možno je podávat jako takové nebo veformě vhodného farmaceutického prostředku, obsahujícíhokromě účinné složky ještě jedno nebo větší počet běžnýchředidel, nosičů, popřípadě dalších pomocných látek. Povahafarmaceutického prostředku bude záviset především na před-pokládaném způsobu podání. Například pro perorální podáníse účinná složka obvykle zpracovává na prášky, granule,tablety, kapsle nebo sirupy. Pro parenterální podání jevhodné zpracování na injekční roztoky, které je možno pro-dávat nitrožilně, nitrosvalově nebo podkožně, mimoto padajív úvahu také kapky nebo čípky.

Tyto farmaceutické prostředky je možno připravit zná-mým způsobem při použití běžných nosných prostředí, pojiv,látek, napomáhajících rozpadu, kluzných látek, stabilizátorů,prostředků pro úpravu chuti, prostředků pro lepší rozpouště-ní, pro vznik suspenze nebo pro tvorbu povlaku. Přestože sedávka může měnit v širokém rozmezí v závislosti napříkladna příznacích choroby, věku nemocného, povaze a závažnostiinfekce a zvoleném způsobu podání, v případě perorálníhopodání dospělému člověku s sloučeniny podle vynálezu obvyklepodávají v denní dávce v rozmezí 20 až 2000 mg. Sloučeniny 14 je možno podat jako jednotlivou dávku nebo ve formě několikdílčích dávek, například dvakrát nebo třikrát denně.

Vzhledem k tomu, že thiomarinol má antibakteriálníúčinky proti gram-positivním i gram-negativním bakteriímu různých živočichů, například u člověka, psa, kočky, nebokrálíka, může být často žádoucí podávat uvedenou látku místně, typicky ve formě krému, mazání nebo gelu. Při tomtozpůsobu podání je stejně jako svrchu možno užít nejrůzněj-ších pomocných látek, jinak se prostředky pro místní podánípřipravují obvyklým způsobem.

Praktické provedení vynálezu, zejména příprava thio-marinolu a jeho antibakteriální účinnost budou osvětlenynásledujícími příklady, které však nemají sloužit k omezenírozsahu vynálezu. Příklady provedení vynálezu Příklad 1

Fermentace thiomarinolu v baňce A) Kultura

Alteromonas rava kmen SAUK 73390 se pěstuje 3 dny přiteplotě 22 °C na šikmém mořském agaru (Qifco). Výsledná kultura se uvede do suspenze ve 3 ml umělé mořské vody. Pak se0,1 ml suspenze asepticky odebere a užije k naočkováníErlenmeyerovy baňky s objemem 500 ml, obsahující 100 mlsterilizovaného živného prostředí, získaného rozpuštěním 37,4 g mořského bujónu (Oifco) v 1 litru deionisované vodybez úpravy pH.

Baňka se inkubuje 24 hodin při teplotě 23 °C při pro-třepávání rychlostí 200 ot/min při poloměru otáčení 70 mmna rotační třepačce. Po této době se materiál užije k naoč-kování čtyř velkých fermentačních nádob s objemem 30 litrů, 15 z nichž každá obsahuje 15 litrů svrchu popsaného sterilníhoživného prostředí, k naočkování se užije vždy 15 ml kultury,asepticky odebrané z Erlenmeyerovy baňky. Velké fermentačnínádoby se inkubují 23 hodin při teplotě 23 °C, provzdušněnírychlostí 7,5 litr/min za současného míchání rychlostí 100ot/min. 9) Izolace

Po 23 hodinách se obsah fermentačních nádob spojí,čímž se získá 60 litrů materiálu. Pak se pH kapaliny upravína hodnotu 3 přidáním kyseliny chlorovodíkové s následnýmpřidáním 60 litrů acetonu a směs se 30 minut extrahuje zamíchání. Přidá se 1,2 kg Celitu 545 jako pomocného prostředkupro filtraci (slovní známka, Johns Manville Co.) a roztok sezfiltruje. 110 litrů výsledného filtrátu se pak extrahujepři použití 60 litrů ethylacetátu a pak ještě dvakrát vždy30 litry ethylacetátu. Organická vrstva se promyje 30 litryroztoku hydrogenuhličitanu sodného v množství 5 g/100 ml apak ještě 30 litry nasyceného vodného roztoku chloridu sod-ného, vysuší se bezvodým síranem sodným a odpaří do suchaza sníženého tlaku, čímž se získá 14 g olejovitého materiálu. Získaný olejovitý materiál se rozpustí v methylenchlo-ridu a roztok se nechá adsorbovat na sloupec, naplněný 200 gsilikagelu v methylenchloridu. Výsledná látka se vymývá tak,že se zvyšuje polarita vyvíjecího roztoku v pořadí směsmethylenchloridu a ethylacetátu, ethylacetát a směs ethyl-acetátu a methanolu. Eluát se odebírá po frakcích s objemem19 ml a dále se zpracovávají frakce, vymytá směsí ethylace-tátu a methanolu, které obsahují thiomarinol.

Uvedené frakce se odpaří do sucha, čímž se získá 7 golejovité látky, která se rozpustí ve 400 ml 50¾ vodnéhomethanolu a roztok se nanese na sloupec s objemem 600 mls náplní pryskyřice Diaion HP-20 (slovní známka, Mitsubishi 16

Cnem. Ind.) ve vodě. Po promytí 50¾ vodným methanolem sevýsledný produkt vymývá 90¾ vodným methanolem, čímž se poodpaření do sucha za sníženého tlaku získá 1 g žlutéhoprášku. Tento žlutý prášek se nanese na chromatografickýsloupec s náplní pryskyřice Sephadex LH-20, sloupec se pakvyvíjí směsí methylenchloridu, ethylacetátu a methanolu vobjemovém poměru 19 :19 : 2 a odebírají se frakce s obsahemproduktu. Tímto způsobem se získá 750 mg tniomarinolu veformě žlutého prášku.

Takto získaný výsledný thiomarinol má vlastnosti, kte-ré jsou dále uvedeny. 1) Povaha a vzhled: žlutý prášek

2) Teplota tání: 84 až 39 °C 3) Molekulový vzorec: £39^44^2^9^2 4) Molekulová hmotnost: 640, stanoveno metodou FAB-MS,to znamená hmotovou spektrometrií při bombardovánírychlými atomy 5) Hmotové spektrum: C30H45N2°9S2 /(M+H)+ metodou FAB-MS/vypočteno: 641,2567nalezeno: 641,2535. 6) Elementární analýza:

Vypočteno: C 56,23, H 6,92, N 4,37, S 10,01 %nalezeno : C 55,92, H 6,82, N 4,23, S 9,90 %. 7) Spektrum v infračerveném světle v K3r má následujícímaxima v cm-^: 3394, 2930, 1649, 1593, 1526, 1283, 1216, 1154, 1102,1052. 3) Spektrum v ultrafialovém světle: V methanolu nebo v methanolu s kyselinou chlorovodíkovoumá thiomarinol následující maxima v ultrafialovém světlev nm (£): 17 387 (12 000), 300 (3 500), 214 (26 000), av methanolu s hydroxidem sodným má thiomarinolnásledující spektrum v ultrafialovém světle v n'm (£) 336 (9 600), 306 (3 200), 206 (25 000)7 9) Specifická otáSivost: /alfa/g5= +4,3° (C = 1,0, methanol). 10) Vysokotlaká kaplinová chromatografie:

Bylo užito dělicího sloupce Senshu-Pak 00S H-2151,rozměry sloupce 6 x 150 mm, (Senshu Scientific Co., Ltd.)Rozpouštědlo: 40¾ vodný acetonitril

Rychlost průtoku: 1,5 ml/min

Vlnová délka: 220 až 350 nm (průkaz fotodiodou)

Ooba retence: 5,9 minut. 11) 1H-NMR (ppm):

Spektrum v nukleární magnetické resonanci bylo prove-deno v hexadeuterovaném dimethylsulfoxidu při použitítetrametnylsilanu jako vnitrního standardu: 0,91 (3H, dublet, 0 = 6,8 Hz), 0,95 (3H, dublet, 0 = 5,9 Hz), 1,30 (6H, široký multiplet), 1,55 ('5H, široký multiplet), 2,03 (3H, singlet), 2,09 (3H, multiplet), 2,34 (2H, triplet, 0 = 7,3 Hz), 3,33 (1H, doblet, J = 10,7 Hz), 3,52 (2H, multiplet), 3,64 (2H, multiplet), 3,73 (1H, dublet dubletu), 4,02 (2H, triplet, 0 = 6,6 Hz), 4,13 (1H, široký dublet, 0 = 7,3 Hz), 4,30 (1H, dublet, 0 = 4,4 Hz), 4,44 (1H, dublet, 0 = 7,3 Hz), 4,63 (1H, dublet, 0 = 3,4 Hz), 4,39 (1H, dublet, 0 = 7,3 Hz), 5,37 (2H, multiplet), 13 5,97 (1H, široký singlet), 7,04 (1H, singlet), 9,30 (1H, široký singlet), 10,63 (1H, široký singlet. 12) 13C-NMR spektrum: ppm, spektrum v nukleární, magnetické resonanci byloprovedeno při 63 MHz v tetradeuterovaném methanolu připoužití tetrametnylsilanu jako vnitřního standardu, 174.3 (singlet), 170,4 (singlet), 163,6 (singlet), 161.1 (singlet), 137,9 (singlet), 135,7 (dublet),135,1. (singlet), 129,3 (dublet), 116,3 (dublet), 115,3 (singlet), 113,7 (dublet), 77,6 (dublet), 74,4 (dublet),. 72.1 (dublet), 71,3 (dublet), 66,0 (triplet), 65,7(dublet), 64,9 (triplet), 45,3 (dublet), 43,9 (dublet), 36,6 (triplet), 33,4 (triplet), 30,1 (triplet), 30,0(triplet), 29,7 (triplet), 27,0 (triplet), 26,7 (triplet) 20.3 (kvartet), 16,6 (kvartet), 16,3 (kvartet). 13) Rozpustnost:

Thiomarinol je rozpustný v alkoholech, například v metha-nolu, ethanolu, propanolu a butanolu, dále je rozpustnýv dimethylsulfoxidu, dimethylformamidu, chloroformu,ethylacetátu, acetonu a ethyletheru, je však nerozpustnýv hexanu a ve vodě. 14) Barevné reakce:

Positivní barevná reakce je na kyselinu sírovou, na joda na manganistan draselný. 15) Chromatografie na tenké vrstva:

Rf = 0,57

Absorpční činidlo silikagel (Merck and Co. Inc.,výrobek č. 5715)

Eluční činidlo: směs methylenchloridu a methanolu vobjemovém poměru 35 : 15. 19

Zkušební příklad 1

Antibakteriální účinnost thiomarinolu 3yly určeny minimální inhibiční koncentrace MIC pro thiomarinol v mikrogramech/ml pro ťjrampositivní a gramnegativníbakterie na agaru při použití zřeďovací rady, jako živnéprostředí byl užit živný agar (Eiken Schemical Co. Ltd.). Získané výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 1

Ta bulka 1 bakteriální kmen MIC (/ug/ml)

Staphylococcus aureus 209P a. 0,01 Staphylococcus aureus 56R 0,01 Staphylococcus aureus 535 (MRSA) i. i— 0,01 Enterococcus feacalis 681 0,02 Escherichia coli NHIO 0,3 Escherichia coli 609 0,3 Salmonella enteritidis 0,4 Klebsiella pneumoniae 806 0,8 Klebsiella pneumoniae 846 (R) 0,2 Enterobacter cloacae 963 1,5 Serratia marcescens 1134 3,1 Próteus vulgaris 1420 0,05 Morganella morganii 1510 6,2 Pseudomonas aeruginosa 1001 0,2 Pseudomonas aeruginosa N07 0,4 20

Zkušeoní příklad 2 Účinnost thiomarinolu proti mycoplasmatům 3ylo použito stejného postupu jako ve zkušebním pří-kladu 1, v tomto případě byla stanovena účinnost thioma-rinolu proti různým čeledím mycoplasmat. Získaná výsledkyjsou shrnuty v následující tabulce 2.

Tabulka 2 kmen MIC C/ug/ml)

Mycoplasma bovis Oonetta 0,0125 Mycoplasma gallisepticum PG-31 0,05 Mycoplasma gallisepticum S-6 0,10 Mycoplasma gallisepticum K-l 0,05 Mycoplasma synoviae WVU1853 4 0,006 Mycoplasma hyosynoviae S-16 0,025 Očkovací materiál: 0,005 ml lQ^CFli/ml

Prostředí, užité ke zkouškám: M. bovis a M. gallisepticum: Chanockovo prostředí, připravenézpůsobem podle publikace P.N.A.S., 43, 41 - 49 (1962)a doplněné 20 % koňského sera. M. synoviae: Freyovo prostředí, připravené způsobem podle publikace Am. 0. Vet. Res., 29, 2163 - 2171 (1963)a doplněné 12 % sera vepře M. hyosynoviae: agarová prostředí Mucin PPLOX, doplněné15 % koňského sera. 21

Podmínky při pastování:

Teplota 37 °C, 5 dnů, mítně aerobní podmínky. 3ylo užito metody, při níž se kultivace provádí v prostředígenerátoru oxidu uhličitého pro jedno použití (3ectonOickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MO 2103USA), metoda se označuje ,33L gas pack method.

Agarová prostředí Mucin PPLOX obsahuje materiál z mikro-organismů, podobných organismům, vyvolávajícím pleuropneu-monii a má následující složení: PPLO bujón bez CV (Oifco) 21 g bakteriologický mucin (Difco) 5 g destilovaná voda 800 ml agar Noble (Oifco) 12 g koňské sérum 150 ml 25% čerstvý extrakt z kvasnic 50 ml.

Zastup

advokátfca

Claims (11)

1. 22

   1. Tniomarinol vzorce I

   (I)
2. 2. Sloučenina s následujícími vlastnostmi: 1) Povaha a vzhled: žlutý prášek 2) Teplota tání: 34 až 39 °C 3) Molekulový vzorec: C^gH^M-jQ^S? 4) Molekulová hmotnost: 640, stanoveno metodou FA3-MS,to znamená hmotovou spektrometrií při bombardovánírychlými atomy 5) Hmotové spektrum: C30H45H2a9S2 rošádou FA3-MS/ vypočteno: 641,2567nalezeno: 641,2535. 6) Elementární analýza: Vypočteno: C 56,23, H 6,92, M 4,37, 5 10,01 %nalezeno : C 55,92, H 6,32, II 4,23, S 9,90 ?s. 7) Spektrum v infračerveném světle v !<3r má následujícímaxima v cm~^: 3394, 2930, 1649, 1593, 1526, 1233, 1216, 1154, 1102,1052. 23 8) Spektrum v ultrafialovém světle: V methanolu nebo v methanolu s kyselinou chlorovodíkovoumá thiomarinol následující maxima v ultrafialovém světlev nm (£): 337 (12 000), 300 (3 500), 214 (26 000), av methanolu s hydroxidem sodným má thiomarinolnásledující soektrum v ultrafialovém světla v nm (£) 336 (9 600), 306 (3 200), 206 (25 000). 9) Specifická otáoivost: /alfa/^5= +4,3° (0 = 1,0, methanol). 10) Vysokotlaká kaolinová chromatografie: 3ylo užito dělicího sloupce Ssnshu-Pak OOS H-2151,rozměry sloupce 6 x 150 mm, (Senshu Scientific Co., Ltd.)Rozpouštědlo: 40¾ vodný acetonitril Rychlost průtoku: 1,5 ml/min Vlnová dálka: 220 až 350 nm (průkaz fotodiodou) Doba retenca: 5,9 minut. 11) 1H-MMR (ppm): Soaktrum v nukleární magnetické resonanci bylo prove-deno v hexadeuterovaném dimetnylsulfoxidu při použitítetrametnyIsilanu jako vnitřního standardu: 0,91 (3H, dublet, 0 = 6,3 Hz), 0,95 (3H, dublet, 0 = 5,9 Hz), 1,30 (6H , široký multiplet), 1,55 ('5H , široký multiplet), 2,03 (3H, singlst), 2,09 (3H, multiplet), 2,34 (2H, triplet, 0 = 7,3 Hz), 3,33 (1H, doblet, 0 = 10,7 Hz), 3,52 (2H, multiolet), 3,64 (2H, multiplet), 3,73 (1H, dublet dubletu), 4,02 (2H, triplet, 0 = 6,6 Hz), 4,13 (1H, široký dublet, 0 = 7,3 Hz), 4,30 (1H, dublet, 0 = 4,4 Hz), 4,44 (1H, dublet, 0 = 7,3 Hz), 4,63 (1H, dublet, 0 = 3,4 Hz), 4,39 (1H, dublet, 0 = 7,3 Hz), 5,37 (2H, multiplet), 24 5,97 (1H, široký singlet), 7,04 (1H, singlet), 9,30 (1H, široký singlet), 10,63 (1H, široký singlet. 12) ^^C-řlMR spektrum: pom, spektrum v nukleární magnetická resonanci byloprovedeno při 63 MHz v tetradeuterovanem methanolu připoužití tetrametnylsilanu jako vnitřního standardu, 174.3 (singlet), 170,4 (singlet), 163,6 (singlet), 161.1 (singlet), 137,9 (singlet), 135,7 (dublet),135,1(singlet), 129,3 (dublet), 1Ϊ6,3 (dublet), 115,3 (singlet), 113,7 (dublet), 77,6 (dublet), 74,4 (dublet), 72.1 (dublet), 71,3 (dublet), 66,0 (triplet), 65,7(dublet), 64,9 (triplet), 45,3 (dublet), 43,9 (dublet), 36,6 (triplet), 33,4 (triplet), 30,1 (triplet), 30,0(triplet), 29,7 (triplet), 27,0 (triplet), 26,7 (triplet), 20.3 (kvartet), 16,6 (kvartet), 16,3 (kvartet). 13) Rozpustnost: Thiomarinol je rozpustný v alkoholech, například v metha-nolu,- ethanolu, propanolu a butanolu, dále je rozpustnýv dimethylsulfoxidu, dimethylformamidu, chloroformu,ethylacetátu, acetonu a ethyletheru, je však nerozpustnýv hexanu a ve vodě. 14) Barevné reakce: Positivní barevná reakce je na kyselinu sírovou, na joda na manganistan draselný. 15) Chromatografie na tenké vrstvě: Rf = 0,57 Absorpční činidlo silikagel (Merck and Co. Inc.,výrobek č. 5715) Eluční činidlo: směs methylenchloridu a methanolu vobjemovém poměru 35 : 15. 25
3. 3. Biologicky čistá kultura Alteromonas rava.
4. 4. Biologicky čistá kultura Alteromonas rava kmenBANK 73390, identifikovaný číslem ve veřejné sbírce kulturFERM 8P-3331.
5. 5. Farmaceutický prostředek, vyznačující s e t í m , že jako svou účinnou složku obsahuje slouče-ninu podle nároku 1 nebo 2 a nosič, přijatelný z farmaceu-tického hlediska.
6. 6. Farmaceutický prostředek podle nároku 5, vyzna-čující se tím, že je určen pro dermatologickéúčelY.
7. 7. Způsob léčení nebo profylaxe bakteriálních infekcí,vyznačující se tím, že se savcům, kteří trpíbakteriální infekcí nebo jsou jí ohroženi podává účinné množ-ství sloučeniny podle nároku 1 nebo 2.
8. 8. Způsob podle nároku 7, vyznačující setím, že se sloučeniny podle nároku 1 nebo 2 podávajíčlověku.
9. 9. Způsob výroby sloučenin podle nároku 1 nebo 2,vyznačující se tím, že se pěstuje m ikro-organismus rodu Alteromonas, schopný takovou sloučeninuprodukovat a sloučenina se z kultury izoluje.
10. 10. Způsob podle nároku 9, vyznačující set í m, že mikroorganismem je Alteromonas rava.
11. 11. Způsob podle nároku 9, vyznačující setím, že mikroorganismem je Alteromonas rava kmen SANK 73390,FERM 3P-3331. Zastupuje:

    advokátka