CS319791A3

CS319791A3 - Process and apparatus for testing micro-organisms forming low-molecular volatile products

Info

Publication number: CS319791A3
Application number: CS913197A
Authority: CS
Inventors: Hans Dr Kulla
Original assignee: Lonza Ag
Priority date: 1990-10-23
Filing date: 1991-10-22
Publication date: 1992-05-13
Also published as: JPH053796A; CZ278186B6; US5348861A; EP0482619A1; DE59105619D1; US5348884A; ATE123312T1; EP0482619B1

Description

- 1

Zařízení a způsob testování kulární těkavá produkty ϊ*> mikroorganismů tvořících nízkomole-

Oblast techniky

Vynález se týká nového zařízení a nového způsobu testování(screening) pro průkaz mikroorganismů, které při mikrobiologickémprocesu tvoří z radioaktivně značeného substrátu radioaktivněznačený nízkomolekulární těkavý produkt látkové přeměny. Proka-zují se mikroorganismy, které přeměňují radioaktivně značený sub-strát na žádoucí produkt, přičemž vzniká radioaktivně značenýnízkomolekulární těkavý produkt látkové přeměny.

Dosavadní stav techniky

Obecně je známo, že lze produkty látkové přeměny vzniklépři mikrobiologickém, popřípadě biochemickém procesu prokázat tak,že se k buněčné suspenzi přidá radioaktivně značená sloučenina. Vše se po určitou dobu inkubuje a pak se po oddělení buněk určívzniklý radioaktivně značený produkt látkové přeměny napříkladpomocí scintilačního měření kapaliny (Firmin, 3.L. a Gray D.O.,Biochem. 3., 1976, 158, str. 223-229).

Velkou nevýhodou této obecně užívané průkazní metody jejejí pracnost a časová náročnost. Nadto se tato metoda nehodí proselekci mikroorganismů s určitými výkony látkové přeměny, protožejsou prokázány všechny vytvořené radioaktivně značené produktylátkové přeměny nezávisle na molekulové hmotnosti. Dále je známá průkazní metoda pro mikroorganismy ve vzorcíchurčených k lékařským testům podle evropská patentové přihlášky124 285. Nedostatek této metody rovněž spočívá v tom, že jsouvšechny radioaktivně značené produkty látkové přeměny stanovenynespecificky vzhledem k molekulové hmotnosti. Tím ani tato meto-da neposkytuje způsob testování (screening) mikroorganismů s urči-tými produkty látkové přeměny. 2

Podstata vynálezu Úlohou předloženého vynálezu je vyvinout citlivý způsobtestování mikroorganismů, kterým lze kvantitativně stanovitvšechny mikrorganismy, které tvoří z určitého substr^uA^ízko-molekulární produkty látkové přeměny.

Tato úloha je vyřešena novým zařízením a novým způsobemtestování. Na obr. 1 je znázorněno zařízení podle vynálezu. Při způsobu testování se prokazují ty mikroorganismy, které přimikrobiologickém procesu tvoří produkty látkové přeměny. Průkazse uskuteční tak, že mikroorganismus přemění radioaktivně značenýsubstrát na radioaktivně značený produkt látkové přeměny. Radio-aktivně značený produkt látkové přeměny se pak určí stanovenímradioaktivity.

Jako radioaktivně značený produkt látkové přeměny se prokazu-"j^^fzkomolekul ární produkt látkové přeměny. Jako nízkomolekulárníprodukty látkové přeměny se označují produkty látkové přeměnyo molekulové hmotnosti nepřesahující hodnotu 500. Výhodně nepřesa-huje molekulová hmotnost produktů látkové přeměny hodnotu 250.

Jako substráty se používají radioaktivně značené substráty, 14 3 35 32 které jsou značené například isotopy C, H, S a P nebo jiný-mi biorelevantními isotopy. Výhodně jsou substráty značeny isotopy3 14

Ha C. Specifická radioaktivita radioaktivně značených substrá-tů leží obvykle v rozmezí mezi 3,7 · 107 až 7,4 · IQ11 Bq/mmol.

Substráty jsou účelně radioaktivně značeny tak, že jako těkavý nízkomolekulární produkt látkové přeměny vzniká bud H-značený nebo 14 3 C-značený produkt látkové přeměny. Jako příklad je H-značená 14 voda, C-značené produkty jako jsou například kysličník uhličitý,ethanol, kyselina mléčná, kyselina octová, kyselina mravenčí,aceton, butanol, butandiol, acetoin nebo jiné produkty látkovépřeměny. Hlavně se používají 3H-značené substráty, při kterých vzr14, 3 14 vzniká H-značená voda a C-značené substráty, při kterých vzniká CO, 3 i těkávej

Radioaktivně značené^sloučeniny látkové přeměny lze proká-zat v oboru běžně používanými metodami, jako je například auto-radiografie nebo měření scintilace kapaliny. Výhodně se určujeprodukt látkové přeměny autoradiografií.

Nedostatky známých způsobů a zařízení do značné míry odstra-ňuje způsob testování a zařízení podle vynálezu znázorněném naobr. 1. Podstata zařízení pro průkaz mikroorganismů, které vytvá-řejí při mikrobiologickém procesu produkty látkové přeměny, spočí-vá v tom, že je tvořeno membránovým filtrem 2> nesoucím rostoucímikrorganismy 2., na kterém je nanesen semipermeabilní filtr 2Psrmea“bilní pro těkavý produkt látkové přeměny, a adsorpční deska 4_. Účelně se kolonie rostoucích mikroorganismů 2 pěstují namembránovém filtru _1, který je umístěn na standardním agarovémmediu, jako je například na vrstvené, agarové desce (Plate-Count--Agar firmy Oifco Laboratories, USA).

Když kolonie mikroorganismů dosáhnou průměru 0,1 až 5 mm,výhodně 0,5 až 2 mm, převrství se inkubačním roztokem, který obsa-huje radioaktivně značený substrát. Ke snížení konvekce v inkubač-ním roztoku na minimun, se přidá činidlo zvyšující viskozitu, jakoje agar. Výhodně se jako membránový filtr 2 použije hydroflinísterilní filtr s velikostí pórů 0,01 až 2^um. Oako sterilní filtryse například používají nitrát celulózy, acetát celulózy, regene-rovaná celulóza, nylon nebo jiné standardně používané sterilnífiltry. výhodně Při průkazu je účelné před inkubací porostlý membráno- vý filtr 1_ zvednout ze ztuhlého živného média a přenést ho,aby se zamezilo nadměrnému zředění ^h^O. Po převrstvení mikro-organismů inkubačním roztokem se umístí hydrofobní nebo hydrofobi-zovaný semipermeabilní filtr 2 θ velikostí pórů účelně oo 0,02 až 2 /Um ,02 až 0,2 /um, který je permeabilní pro produkt látkové přeměny. Výhodně se jako materiál pro semipermeabilní filtr 2 používá bučíGoretexR (polytetrafluorethylen PTFE s velikostí pórů oh 0,2 až na polyesterové podpůrné tkanině), nebo hydrofobizovanýfiltr ze skelných vláken, zejména silanovaný filtr ze skelnýchvláken, nebo silokonová membrána o tločíce vrstvy 0,1 až 1 mm.

Lze také přiložit semipermeabilní vrstvu tvořenou hydrofóbnímiprášKovými materiály, jako je například Aerosil R972 (firmyDegussa, Německo). K zamezení smíchání kolonií se účelně vkládá mezi membráno-vý filtr _1 a semipermeabilní filtr 2 podpůrná tkanina 2· 3okopodpůrná tkanina se používá například bavlněná tkanina nebosííovina, jako gáza. Může však být umístěn další membránový filtr

Na semipermeabilní filtr 3 popřípadě......na podpůrnou· tkaninu- se pak umístí adsorpční deska 2· průkaz ^H20 se s výhodou jako adsorpční deska používá skleněná deska opatřená vrstvou moleku-14 lárního síta nebo křemičitého gelu. Pro průkaz C02 se s výhodoupoucívá skleněná deska opatřená vrstvou vápna. Zejména se opatřískleněná deska vrstvou molekulárního síta o velikosti pórů 0,3až 0,4 nm nebo vrstvou křemičitého gelu, přičemž je tlačtkavrstvy mezi 0,1 a 5 mm. Vhodné jsou rovněž i jiné adsorbenty jakomateriály pro adsorpční desku, jako je například sádra nebo kys-ličník hlinitý.

Ke zpevnění adsorpční desky je vhodné použít pojivo, jakoje například derivát celulózy, škrob, cement, vodní sklo, skelnávlákna nebo jiná pojivá běžná pro přípravu desek pro chromatogra-fii na tenké vrstvě.

Potom se celé zařízení inkubuje 1 až 12 hodin v závislostina materiálu semipermeabilního filtru 2 Při vhodné teplotě od 5do 110 °C, přičemž lze použít v oboru běžná inkubační media.Přiložením závaží se toto zařízení stlačí například na 5 mm.Délka zařízení může být například 5 cm.

Jestliže se použije silikonové memebrány jako semipermea-bilní filtr 2» zářízení se inkubuje výhodně 3 hodiny. Jestližese použije Goretex nebo hydrofobizovaný filtr ze skelných vláken,zařízení se inkubuje výhodně až 1 hodinu. Obvykle je inkubačníteplota závislá na teplotních vlastnostech mikroorganismů.Jestliže se například prokazují mesofilní mikroorganismy, jeinkubační teplota s výhodou mezi 30 a 37 - 5 - Během inkubace přeměňují mikroorganismy radioaktivně značenýsubstrát na žádaný produkt, přičemž se tvoří radioaktivně značenýnízkomolekulární těkavý produkt látkové přeměny. Tento těkavý pro-dukt látkové přeměny difunduje semipermeabilním filtrem 2 a adsor-buje se na absorpční desce 2·

Po inkubaci se adsorpční deska sejme a zpracuje se pro průkaztěkavého produktu látkové přeměny v oboru běžně používanými scinti- o látory, jako je například Enhance (firma DuPont, USA). Mohou sepoužít i jiné scintilační roztoky nebo ty , které jsou popsány B.R.Bochnerem a B.N. Arnesem v Anal.Biochem. 131, str. 510-515 (1984).

Způsob podle vynálezu představuje citlivou metodu pro průkazmikrorganismů, které přeměňují radioaktivně značený substrát v po-žadovaný produkt, přičemž vzniká radioaktivně značený nízkomoleku-lární těkavý produkt látkové přeměny. Tyto mikroorganismy pak mohoubýt na základě této průkazní metody lépe rozděleny. Na rozdíl odznámých postupů pracuje tento postup také s koloniemi mikroorganis-mů, které rostou na povrchu ztužených živných medií. Kapacita setím značně zvýší.

Zařízení se používá pro průkaz mikroorganismů, které tvořínízkomolekulární produkty látkové přeměny. Zejména se zařízenípoužívá pro průkaz těch mikroorganismů, které jsou schopny přemě-ňovat ve sloučeninách methylové skupiny na odpovídající alkohol,aldehyd nebo na odpovídající karboxylovou kyselinu. Například sezařízení používá pro průkaz mikroorganismů, které jsou schopnyoxidovat methylové skupiny 5-methyl-2-chlorpyridinu na odpovídají-cí kyselinu. Radioaktivně značená při tom vzniklá se proka- zuje na adsorpční desce. Příklady provedení Příklad 1

Alcaligenes entrophus (DSM 423, Německá sbírka mikroorganismů a buněčných kultur) a Pseudomonas aerugi.nosa (DSM 50071) se pěstu- jí odděleně v živném prostředí (Nutrient-Broth firmy Oxoid, USA) 5a při 30 °C přes noc na třepačce. Pak se 1 díl kultury Pseudomonas smíchá s 99? díly kultury Alcaligenes. 0,1 ml této směsi ve zře--4 dění 10 se rozprostře na filtr JL z nitrátu celulózy uloženémna vrstvené agarové desce (Plate-Count-Agar PCA firmy difco, USA)Filtr 1_ z nitrátu celulózy má velikost pórů 0,2 /um a průměr 5 cm(firma Sartorius, Německo). Buňky dorůstají přes noc asi na 1000kolonií o průměru od 0,5 až 1 mm. Filtr nesoucí kolonie se oddělíod media agarové desky (PCA medium firmy Oifco, USA) a umístí se 6 do Petriho misky koloniemi navrch. Filtr _1 s koloniemi se pro-vlhčí 0,18 ml radioaktivního roztoku o následujícím složení: 5 g/1 agar (roztavený) 5 g/1 trypton (firma Difco, USA) 2,5 g/1 extrakt kvasnic (firma Difco, USA) 2 mM D-/"6-'3H(N)_7-glukóza 3,7 ·109 Bq/mmol (firma NEN/DuPont, USA).

Okamžitě se na kolonii přiloží druhý filtr z nitrátu celulózy,zvlhčený přiložením na vrstvenou · agarovou desku (Plate-Count--Agar). Na to se okamžitě přiloží hydrofobní filtr 2· Tento hydrofobní filtr je filtr TE35 (pólytetrafluorethylen PTFE na poly-esterech, firma Schleicher a Schuell, Německo) o velikosti pórů0,2 /um a průměru 8 cm. Okamžitě se přiloží adsorpční deska _4s adsorpční vrstvou specifickou pro vodu, která se připravínásledovně: 8 g práškového molekulárního síta 0,4 nm (velikost zrn2 až 3 /um) (firma Aldrich, Německo) se promyje v 7 ml vodya přidá se 0,1 g skelných vláken. Skelná vlákna se připravírozetřením GF/D-filtru (GF/D: skelný filtr druhu D firmyWhatman, USA). Směs se zbaví plynu ve vakuu. Kašovitáhmota se nalije na zdrsněnou skleněnou desku o velikosti6x6 cm, a suší se 1 hodinu při 70 °C a pak 4 hodiny při150 °C se aktivuje ve vysokém vakuu. Výsledná tloušíkavrstvy je přibližně 2mm. Desky se uchovávají nad oxidemfosforečným.

Celé zařízení se stlačí na přibližně 5 mm nasazením závaží ohmotnosti 450 g. Potom se zařízení inkubuje 1 hodinu při 30 °C.Potom se sejme deska s molekulárním sítem a okamžitě postříká s Enhance (firma Oupont, USA). V návaznosti na to se pořídíautoradiografie podle předpisu (R.A.Laskey, Detekce radioizotopůpři fluorografii a zvýšení intenzity testování; firma Amersham,Velká Británie, Review 23, 1984) s dobou expozice 2 dny.Jednotlivě se vyskytující kolonie Pseudomonas se zobrazují jakočerné skvrny o průměru 5 mm, přičemž převažující pozadí kolonií - 7 -

Alcaligenes není viditelné. Pseudomonas spotřebuje tritiovanouglukózu a'produkuje přičemž Alcaligenes neumí použít glu- kózu pro látkovou přeměnu. • Příklad 2 * Postupuje se shodně s příkladem 1 s následujícími modifika-cemi. Radioaktivní inkubační medium : místo ^H-glukózy se pou-žije D-/-14C(ll)_7-glukóza (firma NEN/DuPont, USA). Hydrofobnífiltr 2. : skelnovlákenný filtr GF/A (firma Whatman, USA) se pra-žením při 160 °C vysuší a hydrofobizuje s Repel-silanem (firmaLKB, Švédsko). Výsledná velikost pórů je 1,4 yUia a tloušíkavrstvy 0,27 mm.

Pro CO2 specifická adsorpční deska se připraví takto:Prodyšné vápenné pecičky (firma Oráger, švýcarsko) se roz-drtí a smíchají s vodou v těstovitou hmotu, která se nanese naskleněnou desku 6x6 cm ve vrstvě přibližně 2 mm. Pak se vše sušíněkolik dní nad pecičkami hydroxidu sodného v exikátoru.jinak se postupuje shodně jako v příkladu 1. Kolonie Pseudomonasspotřebovávající glukózu vytvářejí a zobrazují se jako čer- né skvrny o průměru 5 mm. Kolonie Alcaligenes, které jsou inaktiv-ní vůči glukóze, zůstávají neviditelné. Příklad 3

Postupuje se shodně s příkladem 1 s následujícími modifika-cemi. jako agarové medium se nepoužije vrstvená agarova deska(Plate-Count-Agar), ale použije se bezuhlíkaté minerální medium(H. Kulla a spol.; Arch. Microbiol. 135, str. 1-7, 1983). Přiložený membránový filtr 1. z regenerované celulózy (firma • Sartorius, Německo) se přímo naočkuje rozmístěním biomasy z aerob ního stupně čističky, jako zdroj uhlíku a energie slouží xylen, ’ který byl v exikátoru nad plynnou fází. Po týdnu jsou viditelné kolonie o průměru od 1 do 2 mm.

Radioaktivní inkubační roztok: Výše uvedené minerální medium s 0,5 % agaru (roztaveného) 5 mM 2-chlor-5-(methyl-'5H)-pyridinu 3,7 · ÍO^1 Bq/mmol· 3

Hydrofooní filtr 2 : silikonová membrána o tloušíce 0,17 mm se připraví ze Sylgardu 136 (firma Dow Corning, USA).Mezi kolonie a silikonovou membránu se vloží jako podpůrná tkanina 5_ vrstva běžné lékařské gázy. Doba inkubace : 3 hodiny.

Adsorpční deska 2 specifická pro vodu : hotová PSC-deskakřemičitého gelu 60 bez indikátoru fluorescence o tloušíce 2 mm(firma Merck, Německo). Dále se postupuje shodně jako v příkladu 1. Kolonie, které mohouoxidovat methylovou skupinu v 2-chlor-5-methylpyridinu, se zobra-zují jako černé skvrny a lze je izolovat z celulózového filtrutradičními mikrobiologickými metodami.

Průmyslová využitelnost

Způsob podle vynálezu představuje citlivou metodu pro průkazmikroorganismů, které přeměňují radioaktivně značený substrát vpožadovaný produkt, a které na základě této průkazní metody mohoubýt lépe rozděleny. Na rozdíl od známých postupů pracuje tentopostup také s koloniemi mikroorganismů, které rostou na povrchuztužených živných medií. Celková kapacita se tím značně zvýší.

Claims

9 < ~ i -O i cr- í 1 r · »» ' i r-j > ( i '^- ; 1--- ; PATENTOVÉ N Á~R 0 Κ"γ·~-—----— - - ?

1. Zařízení pro průkaz mikroorganismů, které vytvářejí při mikrobiologickém procesu produkty látkové přeměny, v y z n a č ující se tím, že je tvořeno membránovým filtrem /1/nesoucím rostoucí mikroorganismy /2/, na kterém je nanesensemipermeabilní filtr /3/ permeabilní pro produkt látkové pře·měny a adsorpční deska /4/.
2. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tímže jako membránový filtr /1/ je nanesen nydrofilní sterilnífiltr o velikosti pórů od 0,01 až 2 ^um.
3. Zařízení podle alespoň jednoho z nároků la2, vyzna-čující se tím, že jako semipermeabilní filtr /3/je nanesen hydrofobní nebo hydrofobizovaný materiál o veli-kosti pórů od 0,02 až 2 ^um.
4. Zařízení podle nároku 3, vyznačující se tímže jako semipermeabilní filtr /3/ je nanesen hydrofobní nebonydrofobizovaný materiál o velikosti pórů od 0,02 až 0,2 ^um.
5. Zařízení podle alespoň jednoho z nároků 1 až 4, vyzna-čující se tím, že je mezi membránový filtr /1/a semipermeabilní filtr /3/ vložena podpůrná tkanina /5/. ó. Zařízení podle alespoň jednoho z nároků 1 až 5, vyzna-čující se tím, že jako materál pro adsorpčnídesku /4/ je naneseno buď molekulární síto, křemičitý gel,vápno, sádra nebo oxid hlinitý.
7. Použití zařízení podle jednoho z nároků 1 až 6 pro průkaz mikroorganismů, které tvoří nízkomolekulární těkavý produktlátkové přeměny. 10

3. Použití zařízení podle nároku 7 pro průkaz mikroorganismů,které jsou schopny přeměňovat methylované sloučeniny naodpovídající alkohol, aldehyd nebo na odpovídající karboxy-lovou kyselinu.
9. Způsob testování pro průkaz mikroorganismů, vyznaču-jící se tím, že se zařízením podle jednoho z ná-roku 1 až 6 prokazují mikroorganismy, které tvoří při mikro-biologickém procesu nízkomolekulární těkavé produkty látkovépřeměny, přičemž se průkaz uskutečňuje tak, že se radioaktivně značený substrát přeměňuje pomocí mikroorganismu na rádioaktivně značený nízkomolekulární těkavý produkt látkové pře-měny a pak se určí radioaktivně značený nízkomolekulárnítěkavý produkt látkové přeměny.
10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že se jako produkt látkové přeměny prokazuje buň izotopem3 14 vodíku H nebo izotopem uhlíku C značený produkt látkovépřeměny.
11. Způsob podle jednoho z nároků 9 a 10, vyznačujícíse t í m, že se produkt látkové přeměny určí pomocí auto-radiografie.