CS66392A3 - Microbiological process of terminal hydroxylation of aromatic heterocyclesethyl groups - Google Patents
Microbiological process of terminal hydroxylation of aromatic heterocyclesethyl groups Download PDFInfo
- Publication number
- CS66392A3 CS66392A3 CS92663A CS66392A CS66392A3 CS 66392 A3 CS66392 A3 CS 66392A3 CS 92663 A CS92663 A CS 92663A CS 66392 A CS66392 A CS 66392A CS 66392 A3 CS66392 A3 CS 66392A3
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- reaction
- carried out
- plasmid
- microorganisms
- deposited
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 title claims abstract description 8
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 title claims abstract description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 63
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 23
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims abstract description 10
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims abstract description 7
- 150000001335 aliphatic alkanes Chemical class 0.000 claims abstract description 6
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 claims abstract description 5
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 23
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 19
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 claims description 13
- 241001452028 Escherichia coli DH1 Species 0.000 claims description 11
- 125000004070 6 membered heterocyclic group Chemical group 0.000 claims description 7
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 7
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 6
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical group N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- GAWIXWVDTYZWAW-UHFFFAOYSA-N C[CH]O Chemical class C[CH]O GAWIXWVDTYZWAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 4
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 claims description 3
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims description 3
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims description 3
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 claims description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical group [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 claims description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 2
- 150000003216 pyrazines Chemical class 0.000 claims description 2
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical group [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 claims 1
- 239000011593 sulfur Chemical group 0.000 claims 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 abstract description 4
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 16
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 8
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 7
- 125000000954 2-hydroxyethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 5
- 241000589781 Pseudomonas oleovorans Species 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 1-Octanol Chemical compound CCCCCCCCO KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- NTSLROIKFLNUIJ-UHFFFAOYSA-N 5-Ethyl-2-methylpyridine Chemical compound CCC1=CC=C(C)N=C1 NTSLROIKFLNUIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KNCHDRLWPAKSII-UHFFFAOYSA-N 5-ethyl-2-methylpyridine Natural products CCC1=CC=NC(C)=C1 KNCHDRLWPAKSII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100323010 Acinetobacter baylyi (strain ATCC 33305 / BD413 / ADP1) alkR gene Proteins 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- BIPUHAHGLJKIPK-UHFFFAOYSA-N dicyclopropylmethanone Chemical compound C1CC1C(=O)C1CC1 BIPUHAHGLJKIPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- DHKHKXVYLBGOIT-UHFFFAOYSA-N 1,1-Diethoxyethane Chemical compound CCOC(C)OCC DHKHKXVYLBGOIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MFEIKQPHQINPRI-UHFFFAOYSA-N 3-Ethylpyridine Chemical compound CCC1=CC=CN=C1 MFEIKQPHQINPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 102000005369 Aldehyde Dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108020002663 Aldehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 102000005297 Cytochrome P-450 CYP4A Human genes 0.000 description 2
- 108010081498 Cytochrome P-450 CYP4A Proteins 0.000 description 2
- YNQLUTRBYVCPMQ-UHFFFAOYSA-N Ethylbenzene Chemical compound CCC1=CC=CC=C1 YNQLUTRBYVCPMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N Furan Chemical compound C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KYQCOXFCLRTKLS-UHFFFAOYSA-N Pyrazine Chemical compound C1=CN=CC=N1 KYQCOXFCLRTKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N Pyrrole Chemical compound C=1C=CNC=1 KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 101150094416 alkF gene Proteins 0.000 description 2
- 101150035861 alkG gene Proteins 0.000 description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 150000001923 cyclic compounds Chemical class 0.000 description 2
- MWKFXSUHUHTGQN-UHFFFAOYSA-N decan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCO MWKFXSUHUHTGQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- KVFIJIWMDBAGDP-UHFFFAOYSA-N ethylpyrazine Chemical compound CCC1=CN=CC=N1 KVFIJIWMDBAGDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- -1 for example Chemical group 0.000 description 2
- ZSIAUFGUXNUGDI-UHFFFAOYSA-N hexan-1-ol Chemical compound CCCCCCO ZSIAUFGUXNUGDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000640 hydroxylating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- GQRIDUHWMWZTCL-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methylpyrimidin-5-yl)ethanol Chemical compound CC1=NC=C(CCO)C=N1 GQRIDUHWMWZTCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MHDJZGMTVSLZDB-UHFFFAOYSA-N 2-pyrazin-2-ylethanol Chemical compound OCCC1=CN=CC=N1 MHDJZGMTVSLZDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DWPYQDGDWBKJQL-UHFFFAOYSA-N 2-pyridin-4-ylethanol Chemical compound OCCC1=CC=NC=C1 DWPYQDGDWBKJQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000339 4-pyridyl group Chemical group N1=C([H])C([H])=C([*])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- MTLVCZCTTNTNHX-UHFFFAOYSA-N 5-ethyl-2-methylpyrimidine Chemical compound CCC1=CN=C(C)N=C1 MTLVCZCTTNTNHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241001136782 Alca Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- YTPLMLYBLZKORZ-UHFFFAOYSA-N Divinylene sulfide Natural products C=1C=CSC=1 YTPLMLYBLZKORZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101000836620 Homo sapiens Nucleic acid dioxygenase ALKBH1 Proteins 0.000 description 1
- 108010020056 Hydrogenase Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 241001676573 Minium Species 0.000 description 1
- 102100027051 Nucleic acid dioxygenase ALKBH1 Human genes 0.000 description 1
- YNPNZTXNASCQKK-UHFFFAOYSA-N Phenanthrene Natural products C1=CC=C2C3=CC=CC=C3C=CC2=C1 YNPNZTXNASCQKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N Phenazine Natural products C1=CC=CC2=NC3=CC=CC=C3N=C21 PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WTKZEGDFNFYCGP-UHFFFAOYSA-N Pyrazole Chemical compound C=1C=NNC=1 WTKZEGDFNFYCGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 1
- FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N Thiazole Chemical compound C1=CSC=N1 FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N [1,10]phenanthroline Chemical compound C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1 DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 101150069317 alcA gene Proteins 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 150000007824 aliphatic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 150000003797 alkaloid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- XJITTZAUZHVBLF-UHFFFAOYSA-N butanoyl cyanide Chemical compound CCCC(=O)C#N XJITTZAUZHVBLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- PIXLZMHERIHLJL-UHFFFAOYSA-N dicyclopropylmethanol Chemical compound C1CC1C(O)C1CC1 PIXLZMHERIHLJL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 101150036185 dnaQ gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 101150077745 ex gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000014726 immortalization of host cell Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N octane Chemical compound CCCCCCCC TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- PBMFSQRYOILNGV-UHFFFAOYSA-N pyridazine Chemical compound C1=CC=NN=C1 PBMFSQRYOILNGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 108060007223 rubredoxin Proteins 0.000 description 1
- 108010060589 rubredoxin-NAD+ reductase Proteins 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229930192474 thiophene Natural products 0.000 description 1
- SYRHIZPPCHMRIT-UHFFFAOYSA-N tin(4+) Chemical compound [Sn+4] SYRHIZPPCHMRIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
- C12N9/0077—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with a reduced iron-sulfur protein as one donor (1.14.15)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
- C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
- C12Y114/15—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with reduced iron-sulfur protein as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.15)
- C12Y114/15003—Alkane 1-monooxygenase (1.14.15.3)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
9 ύ Ιο
Mikrobiologický způsob terminální hydroxylace ethylových skupinaromatických heterocyklů
Oblast techniky
Vynález se týká nového mikrobiologického způsobu terminálníhydroxylace ethylových skupin na aromatických pětičlenných nebošestičlenných heterocyklech a nového hybridního plasmidu protento způsob.
Dosavadní stav techniky 2-hydroxyethylové deriváty jsou důležité meziprodukty provýrobu farmaceuticky účinných látek, jako je například 2-(4-py-ridyl)ethanol pro výrobu derivátů kyseliny pěnici 1inové.
Je známo. že biochemická oxidace alkanů probíhá v mikroor-ganismech rodu Pseudomonas oleovorans ve třech stupních. Působe-ním komplexu alkan-hydroxylasa, CalkBA geny, které jsou dále oz-načovány jako alkBFGH geny) vzniká nejprve odpovídající alkohol.Ten se pak převádí' na kyselinu v dalších dvou stupních za kata-lytického působení alkoholdehydrogenázy <alkC geny) a aldehydde-hydrogenázy Cchromosomál.ně nebo plasmidově kódované). V tomtokmeni jsou geny. které řídí enzymy oxidace, umístěné na plasmiduOCT (Vitholt a spol.. TIBTECH. sv. 8. 1990. str.46-52). Dále je znám z EP-A 277 674 mikrobiologický způsob termi-nální hydroxylace apolárních alifatických sloučenin s 6 až 12atomy uhlíku. Například je známá výroba 1-oktanolu pomocí mikro-organismů rodu Pseudomonas oleovorans nebo Pseudomonas putIda.které jsou resistentní vůči apolárním fázím. Z příkladu provedníje zřejmé. že je nutné uskutečnit hydroxylaci těchto sloučeninv nákladném dvoufázovém systému-
Chemickými postupy jsou 2-hydroxyethylderiváty pětičlennýchnebo šestičlenných heterocyklů rovněž obtížně dostupné. 2
Podstata vynálezu Úkolem předloženého vynálezu je tedy vypracovat jednoduchýmikrobiologický způsob terminální hydroxylace ethylových skupinna aromatických pětičlenných nebo šestičlenných heteročýklech. Úkol je řešen podle patentového nároku 1.
Způsob podle vynálezu se provádí pomocí mikroorganismů, které a) obsahují geny z Pseudomonas OCT-plasmidu, které tvoří ak-tivní alkanmonooxygenázu, b) netvoří účinnou chromosomálně nebo plasmidově kódovanoua1koho1dehydrogenázu a jsou proto schopné hydroxylovat ethylové skupiny aromatickýchpětičlenných nebo šestičlenných heterocyklů na odpovídájícíhydroxylové deriváty. Heterocyklus slouží jako substrát pro re-akci a hydroxyethylderivát není dále metabolizován.
Mikroorganismy obsahují účelně geny alkBFGH z PseudomonasOCT-plasmidu, které kódují komplex alkan-hydroxyláza. Účelně sepřitom odstraní nebo inaktivují alkC geny nebo jiné geny, kterékódují aktivní alkoholdehydrogenázu.
Zdroj genů alkanmonooxygenázy
Jako zdroj genů alkanmonooxygenázy slouží OCT-plasmid na-příklad z Pseudomonas oleovorans nebo jiných mikroorganismů vy-užívajících alkanů.
Vhodné jsou rovněž vytvořené hybridní plasmidy s genyalkanmonooxygenázy, které jsou obsaženy v jiných mikroorganis-mech, jako například v E.coli nebo v Pseudomonas putida. Jakotakovýto hybridní plasmid může například sloužit plasmidpGEc41, obr- 1, uložený buď v E.coli DH1 (uložený u holandskéCentrální sbírky plísňových kultur CBS č. 102-87) nebo v E.coliDH1 (uložený u Německé sbírky mikroroganismů a buněčných kulturDSM č. 6726). Nově vytvořený hybridní plasmid PGMK921, obr. 3,uložený buď v Pseudomonas putida PpS81 (DSM 6676) nebo v Pseudo-monas putida GPO12 (DSM 6775) může rovněž sloužit jako zdroj ge-nů alkanmonooxygenázy.
Genetickou informaci, která kóduje alkanmonooxygenázu, lze získat takovým způsobem, kdy a) se z mikrooragnismů izoluje buď 3 DNA OCT-plasmidu nebo DNA hybridního plasmidu, pak b) se tatoDNA pro izolaci genu a1kanmonooxygenázy štěpí a tato specifickágenová sekvence c) se pak vnese do expresního vektoru, čímžvznikne hybridní plasmid d). Tento hybridní plasmid se pak můževnést do vhodného e) mikroorganismu (hostitelský kmen) pomocí f)transformace. Tento transformovaný hostitelský kmen e) předsta-vuje pak produkční kmen g) pro postup podle vynálezu. a) Isolace DNA OCT-plasmidu (DNA hybridního plasmidu)
Jak DNA OCT-plasmidu, tak také DNA hybridního plasmidu lzezískat metodami běžnými v oboru. Například se mikroorganismuszcela lyžuje a požadovaná DNA plasmidu se získá pomocí odstředě-ní v gradientu hustoty. Lze například postupovat podle učebnice"Current Protocols in Molecular Biology", Asubel a spol-.vyd.,J. Viley. New York, 1989, odd. 2. b) Štěpení DNA plasmidu restrikčními enzymy
Po isolaci DNA plasmidu ji lze štěpit restrikčními enzymypostupy běžnými v oboru tak. že DNA netvoří žádnou plasmidověkódovanou alkoholdehydrogenázu. Získaný štěp DNA (alkBFGH). kte-rý kóduje aktivní alkanmonooxygenázu, lze pak například izolovatgelovou elektroforézou na agarovém gelu. c) Ligace štěpu DNA do expresního vektoru
Takto získaný štěp genu alkBFGH lze ligovat pomocí běžnýchmolekulárněbiologických postupů s DNA expresního vektoru předempodobně rozštěpenou. jako je například popsáno autory M.Kóka spol. v J. Biol. Chem. 1989. 264. str. 5442-5451.
Expresní vektory obyčejně obsahují vhodný, většinou regulo-vatelný promotor. Za tímto promotorem leží vhodně ve směru tran-skripce jedno nebo více singulárních míst štěpení pro restrikčníenzymy. Do tohoto štěpného místa se pak obvykle inzeruje požado-vaný genový štěp, o jehož expresi je zájem.
Transkripci genů alkBFGH lze iniciovat jak alk-promotorem za přirozené regulace (pGEc41), tak také promotorem tací jako alk-promotorem za přirozené regulace (pGMK921). V zásadě jsou vhodné všechny expresní vektory, které mohou rep- likovat a exprimovat genový štěp alkBFGH ve zvoleném hostiteli. - 4 d) Hybridní plasmidy
Takto účelně vzniklé hybridní plasmidy mají široké hosti-telské spektrum a mohou být proto umístěny do hostitelských kme-nů s velkou substrátovou a eduktovou tolerancí. Zvláště se pou-žívá hybridní plasmid pGEc41, který byl uložen v E.coli DH1 jed-nak 15. ledna 1987 u holandské sbírky "Centralbureau voor Schim-melcultures at Baarm" s číslem CBS 102-87 a jednak 30. září1991 u Německé sbírky, pro mikroorganismy a buněčné kultury GmbHCDSM). Mascheroderueg lb, D-3300 Braunschweig, pod číslem DSM6726.
Další zvláště vhodný hybridní plasmid je hybridní plasmidPGMK921, obr. 3. který byl uložen jak v Pseudomonas putidaPpS81 DSM 6776, tak také v Pseudomonas putida GP012 DSM 6775 6.listopadu 1991 u Německé sbkultur. Tento hybridní plasmidvývoj již známého hybridníhoBlol. Chem., 1989, 264. str. plasmidu pGMK921 je schematicky rky mikroorganismů a buněčnýchpodle vynálezu představuje dalšíplasmidu pGEc285 uvedného v J.5442-5451. Vytvoření hybridníhoznázorněno na obr. 2. e) Hostitelské kmeny
Takto získané hybridní plasmidy lze vložit do velkého množ-ství hostitelských kmenů. Účelně se používají hostitelské kmenys velkou substrátovou a eduktovou tolerancí, jako jsou napříkladmikroorganismy rodu Pseudomonas, Acinetobacter, Rhizobium, Agro-bacterium nebo Escherichia. Výhodně se jako hostitelské kmenypoužívají E.coli DH1, Pseudomonas putida Pp81 nebo Pseudomonasputida GP012. f) Transformace
Transformace hostitelských buněk hybridními plasmidy, čímžvznikají produkční kmeny podle vynálezu, je rovněž známá a pop-sána ve výše uvedené učebnici. g) Produkční kmeny
I
Jako produkční kmeny mohou sloužit všechny hostitelské kme- ny. které jsou transformovány hybridními plasmidy, které obsahu- jí genový štěp alkBFGH. Přirozená regulace alk-operonu může být 5 ponechána nebo odstraněna. Jako produkční kmeny zvláště sloužíE.coli DH1. transformované hybridním plasmidem pGEc41 (CBS102-87 nebo DSM 6726), Pseudomoňas putida Pp81 (DSM 6776) neboPseudomonas putida GP012 (DSM 6775). oba transformované hybrid-ním plasmidem pGMK921. nebo účinné mutanty těchto kmenů. V těch-to produkčních kmenech je ponechána přirozená regulace alk-ope-ronu (alkR = álkST).
Selekce transformovaných mikroorganismů (produkčních kmenů)
Izolace (selekce) transformovaných hostitelských buněk seuskutečňuje s výhodou ze selektivního živného media, kterému sepřidá biocid. vůči kterému propůjčuje resistenci značený gen ob-sažený v hybridním plasmidu. Jestliže hybridní plasmid pGEc4lvýhodně obsahuje gen pro tetracykllnovou resistenci, přidá sek živnému mediu tetracyklin. V případě hybridního plasmiduPGMK921. který obsahuje gen pro streptomycinovou resistenci,přidá se k živnému mediu streptomycin. Růst buněk, které tentohybridní plasmid neobsahují, je v takovémto mediu brzděn.
Způsob fermentace
Podle vynálezu lze použít jako produkční kmeny všechny ty,které' jsou transformované hybridním plasmidem, který obsahuještěp genu alkBFGH. Jako příklad lze uvést mikroorganismy roduPseudomonas. Acinetobacter, Rhizobium, Agrobacterium nebo Esche-richia.
FermentaČní postup je objasněn v následujícím textu na pro-dukčním kmenu E.coli DH1, který je transformovaný hybridním plas-midem pGEc41.
Jako substráty reakce mohou sloužit ethylováné aromaticképětičlenné nebo šestičlenné heterocykly, které obsahují jedennebo více heteroatomů vybraných ze skupiny tvořené kyslíkem, du-síkem. sírou.Jako aromatické pětičlenné heterocykly mohou na-příklad sloužit ethylderiváty thiofenu, furanu. pyrrolu. thiazo-lu, pyrazolu nebo imidazolu. Vhodné aromatické šestičlenné hete-rocykly jsou například ethylderiváty pyridinu, pyrimidinu. pyra-zinu nebo pyridazinu. Obzvláště vhodné jsou jako aromatickéethylované šestičlenné heterocykly deriváty z třídy sloučeninpyrazinu nebo pyridinu. - 6 - U E.coli DH1 obsahující pGEc41 v úloze produkčního kmenulze indukovat enzymy alk-operonu, které jsou odpovědné za hydro-xylaci, pomocí sloučenin, které popisuje Grund a spol.. J. Bac-teriol.. 123. str. 546-556. 1975. K tomu patří sloučeniny, kteréslouží například pro Pseudomonas oleovorans jako zdroj uhlíkua energie, jako například alkany. alkanoly nebo alkylované cyk- lické sloučeniny. Jako alkanykan nebo hexan. Jako alkanolydekanol nebo hexanol. Jako lze například použít oktan, dode-lze například použít oktanol. do-zástupce alkylovaných cyklických sloučenin lze použít například ethylbenzen.
Sloučeniny. které například neslouží jako zdroj uhlíkua energie pro Pseudomonas oleovorans, které však přesto indukujígeny alk-operonu, jsou například dicyklopropylketon, dicyklopro-pylmethanol nebo diethoxyethan. U E.coli DH1 obsahujícím pGEc41se indukce enzymů výhodně provádí pomocí dicyklopropylketonu.
Reakce substrátu může probíhat buď za přítomnosti enzymové-ho induktoru nebo i v jeho nepřítomnosti.
Pro růst jmenovaných produkčních kmenů lze použít všechnyv oboru běžné zdroje uhlíku a energie, jako například sukcinátsodný.
Ke stabilizaci plasmidu pGEc41 se účelně před reakcí sub-strátu (při napěstování buněk) přidá ke kultivačnímu mediu te- tracyklin.
Jako kultivační media slouží media běžná v oboru, jako na-příklad komplexní medium (živné medium "Nutrient Broth No.2",Oxoid Ltd., Velká Británie) nebo medium obsahující minerální so- li. jako je například popsáno v Kulla a spol.. Arch.Microbiol..135. 1983. str. 1-7. Před přidáním substrátu se buňky pěstují obvyklým způsobema pak se účelně uskuteční reakce substrátu při hodnotě optickéhustoty od 1 do 200 při 650 nm v kultivačním mediu, výhodně přihodnotě optické hustoty od 5 do 100 při 650 nm.
Reakce probíhá buď při jednorázovém nebo při kontinuálnímpřidání substrátu tak, aby koncentrace substrátu v kultivačnímmediu nepřesáhla 20 % hmotnosti/objem. Výhodně se přidává sub-strát tak. aby koncentrace substrátu nepřesáhla 5 %hmotnosti/objem, zvláště výhodně koncentrace nepřesáhne 1 %hmotnosti/objem. 7
Reakce se účelně provádí v rozmezí pH od 4 do 11, výhodněod 6 do 10.
Obvykle se reakce provádí při teplotě od 15 do 50 °C, vý-hodně pří teplotě od 25 do 40 °C.
Reakce se účelně provádí po dobu 1 hodiny až několik dní,výhodně se provádí kontinuálně po několik dní. Po skončení reak- ..ce se odpovídající 2-hydroxyethylderiváty mohou isolovat známýmzpůsobem, například extrakcí. Příklady provedení vynálezu Příklad 1 E. coli DH1 CpGEc41). CBS 102-87 se pěstuje v mediu obsahu-jícím minerální soli CKulla a spol.. Arch. Microbiol. 135,1983. str. 1-7) s 0,6 hmotnosti/objem stavelanu sodného jakolediného zdroje uhlíku a energie. Ke stabilizaci plasmidu sek mediu přidá 25 mg/1 tetracyklinu. Jako enzymový induktor sepoužije dicyklopropylketon v koncentraci 1 mmol/1-
Ke 100 ml buněčné suspenze o optické hustotě 10 při 650 nmse přidá 1 mmol 5-ethyl-2-methylpyridinu, což odpovídá koncen-traci 0,12 % hmotnosti/objem. Buněčná suspenze se inkubuje po dobu dalších 16 hodin při teplotě 30 °C a při hodnotě pH 7. Zátěchto podmínek zreagoval 1 mmol C121 mg/100 ml) 5-ethyl-2--methylpyridinu na 0,8 mmol 5-(hydroxyethy1)-2-methyl-pyridinu.To odpovídá 80 % výtěžku, vztaženo na vnesený 5-ethyl-2-methyl-pyridin.
Obdobně se provádí reakce pomocí E.coli DH1 <pGEc41) DSM 6726. Příklady 2 a 3 se provádějí podle příkladu 1 a jsou souhrn-ně uvedeny v tabulce 1. Příklad 4 I) Vytvoření hybridního plasmidu pGMK921 (obr. 2) - Vytvoření pGMK921 je další regulativní vývoj pGEc285 Cviz obr.2). pGEc285 popsali M. Kok a spol. v J. Biol.Chem. 264 ¢1989), str. 5442-5451. Tento plasmid je derivát vektoru pMMB24 8 “mu1ticopy number broad host range". (Gene 26 (1983),str.273-282) a obsauhje fragment Pstl-DNA OCT-plasmidu respekti-ve pGEc41 <J. Biol, Chem. 262 <1987). str. 17712-17718). který kóduje cytoplasmatickou membránovou komponentu alkanhydroxylázy(alklB), dva rubretoxiny ~<alkF, alkG) a aldehyddehydrogenázu , CalkH). Transkripce alkBFGH < = alkBA) lze iniciovat jak pomocí alk-promotoru, tak také pomocí tací-promotoru. Pro genovou ex-s, pres i pres alk-promotor za přirozené regulace se ligu jí do pGEc285 alkST-cístrony <=alkR) z OCT-plasmidu. popřípadě z pGEc41. pGEc41 se štěpí pomocí Sáli <4 jednotky na 1 <ug DNA plasmi-,du) a fragmenty DNA se uvolní pomocí preparativní elektroforézyna agarozovém gelu <0.6 % hmotnosti/objem agarózy v TBE-pufru<0.09 M Tris-borát. 2,5 mM Na2EDTA. pH 8.3, ethidiumbromid <100(ug/100 ml)). Sall-fragment velikosti 2,5 kb, který kóduje alkST,se izoluje'přímo z gelu agarózy pomocí membrány z DEAE-celulózy.Nabóbtnalá DNA se vymyje z membrány pomocí 0,5 ml elučního pufru<20 mM Tris-HCl, pH 7,5. 1 mM NazEDTA. 1,5 M NaCl) během 1 hodi-ny při 65 °C. Ethidiumbromid se extrahuje ze vzorku DNA pomocín-butanolu nasyceného vodou a DNA pak precipituje s isopropano-lem. Vysušená sraženina tohoto fragmentového preparátu, dále oz-načovaného jako preparát <a), se zředí 0.01 M Tris-HCl pufru, pH8.0, 0.001 M NazEDTA. pGEc285 se štěpí pomocí Xhol <4 jednotky na 1 (tig plasmidovéDNA) a stejným způsobem se precipituje. Vysušený plasmidový pre-parát, dále označovaný jako preparát <b), se zředí stejným puf-rem.
Oba preparáty, <a) a <b). 0,1-4 |ug DNA ve 20 (Ul, se podrobíKlenově reakci podle předpisu uvedeného Maniatisem a spol., Mo-lecular Cloning 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. odst.5.40-5,43). KlenovQv pufr má složení: 50 mM Tris-HCl.. pH 7.5,10 mM MgCl2. I mM dithiothreitol, 50 {ug/ml hovězího serumalbu-minu. K reakční směsi se přidá 1 £il 0.5 mM každého dNTP <desoxy-nukleotidtrifosfát). Po přidání 1-5 jednotek Klenwovy polymerázyse směs inkubuje při 30 °C po dobu 15 min. Pak se reakce přerušína 10 min zahřátím na 75 °C.
Pro ligaci se preparáty <a) a <b) s "tupými konci" <to jsou 9 hladké konce DNA bez přečnívajících jednotlivých vláken) přeci-pitují s isopropanolem a zředí· se ve 100 jal llgačního pufru (20mM Tris-HCl, pH 7.2, 10 mM DTT. 10 mM MgCl2. 0,6 mM ATP). Ligacese uskuteční po přidání T4-DNA-1 i gázy (1 jednotka/^ig DNA) přesnoc při 15 °C.
Transformace se uskutečnila v E.coli za selekce v komplex-ním mediu s 30 mg streptomycinu na liter živného agaru (Nutri-entagar). Jedná se o elektrotransformaci podle Maniatise a Spol.,Molecular cloning 1989, CoId Spring Harbor Laboratory Press,odst. 1.75. Plasmid je označen jako pGMK920 a nepřinesl hosti-telskému kmeni žádnou schopnost hydroxylace alkylových skupin.Teprve transformace v E.coli (mutD, propagace (spouštěníPGMK920) v "pozadí mutátoru") a následující konjugativní trans-fer (s pomocným plasmidera pRK2013) v Pseudomonas putida.(Ps.putida) PpS81 vede k fenotypu alk+ kmene příjemce, který ne-se plasmid a je schopný hydroxylovat alkylové skupiny.
Ke konjugativnímu transferu se E.coli elektrotransformujes alk-hybridním plasmidem. dodatečně s pomocným plasmideraPRK2013 podle výše citovaného Maniatise a spol. Selekce se usku-teční na komplexním mediu (Nutrientagar) se streptomyčinem 30mg/1 (hybridní plasmid) a kanamyčinem 25 mg/1 (pomocný plasmid).
Každý 1 ml této kultury dárce a kultury příjemce(Ps.putida PpS81) se několikrát promyjí živným roztokem (Nutri-ent Broth), zředí pokaždé 50 1 živného roztoku, spojí se a in- kubují se přes noc při 30 °C na suchém živném agaru (Nutrient-· · agar). Buňky se suspendují v 0.9 roztoku chloridu sodného a vhodná zředění (10~7) 109 buněk/ml suspenze se umístí na deskyselekčního media (150 mg streptomycinu na litr). Plasmid posky-tující fenotyp alk* je označen jako pGMK921. II) Biotransformace
Produkční kmen Ps.putida PpS81 obsahující pGMK921 je ob-vzláště vhodný z důvodu alcA mutace hostitele, nebot alkanhydro-xylázová aktivita vzniká před pozadím zcela bez alkohodehydroge-názy. Ps.putida PpS81 s pGMK921 se pěstuje na mediu obsahujícímminerální soli (Arch.Microbiol. 135 (1983). str. 1-7) s 0.2 %(hmotnost/objem) glukózou. Pro stabilizaci palsmidu se přidávástreptomycin (150 mg/1).- Pro indukci přirozeného promotoru pro - 10 expres i a1kanmonooxygenázy se př i dává 1 mM d i cy k1opropy1ketonu. Při hodnotě optické hustoty ODesonm = 10 (kultury s nižší hodnotou OD se zahustí na OD » 10) se ke kultuře přidá 0.1 %(objem/objem) 5-ethy1-2-methylpyrimidinu. Při teplotě 30 °Ca při neutrální hodnotě pH (7.0) tento substrát po 6 hodináchúplně zreagoval na 5-(2-hydroxyethy1)-2-methylpyrimidin. • Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1 pGEc41 se skládá z vektoru pLAFRl (Gene 16 (1986). str.289-296) a fargmentu EcoRI o velikosti 30 kb z DNA OCT-plasmidukterý kóduje část alkBFGHCJ-operonu (delece v alkC-genu) a k to-mu nese alkR-locus. Čárkovaně označený fragment označuje deleciv alkBFGHC^-operonu ve směru proudu. ·&1 Rámečky představují velikost a pozici proteinů, čísla sevztahují k molekulární hmotě v kilodaltonech. V pGEc41 je orien-tace sekvence alk-DNA a sekvence alkBFGHC1 shodná (J. Biol.Chem. 262 (1987). str. 17712-17718).
Obrázek 2 Představuje konstrukční schéma pro přípravu pGMK921.
Obrázek 3 PGMK920 je odvozen od pGEc285 a pGEc41.
Smer transkripce alkBFGH je proti směru hodinových ručiček.alkST (alkR) cistrony se transkribují ve směru hodinových ruči-ček. Restrikční mapa pGMK921. který obsahuje alk+ mutaci, jeshodná s pGMK920.
Plasmid kóduje: - membránovou komponentu alkanhydroxylázy (alkB) - rubredoxin (alkG) - rubredoxln-F (alkF) 11 - aldehyddehydrogenázu CalkH) - rubredoxinreduktázu CalkS) - pozitivní regulátor CalkS) pGMK921 se může konjugativně transferovat z E-coli pomocí pomoc-ného plasmidu CpRK2013) do Pseudomonas.
Selekce: streptomycin 35 mg/1 CE.coli) streptomycin 150 mg/1 CPseudomonas putida)
Tabulka 1 Pří- klad Substrát Koncen- trace substrátu na 100 ml Doba reakce v hod. Konečný produkt Výtě- žek v % 2 3-ethylpyridin 1 mmol 16 3 - C 2-hydroxyethy1) - pyridin 50 3 2-ethy1pyrazin 1 mmol 16 2- ( 2-hydroxyethy1) - pyrazin 80
Průmyslová využitelnost 2-hydroxyethylové deriváty jsou důležité meziprodukty provýrobu farmaceuticky účinných látek, jako je například 2-C4-py-ridyl)ethanol pro výrobu derivátů kyseliny pěnici 1inové.
Claims (12)
1. Mikrobiologický způsob terminální hydroxylace ethylovýchskupin aromatických heterocyklú, vyznačuj ícíse tím, že se reakce provádí s mikroorganismy, které a) obsahují geny Pseudomonas OCT-plasmidu,které tvoří aktivní alkanmonooxygenázu, b) netvoří účinnou chromosomálně nebo plasmidově kódovanoualkoholdehydrogenázu a jsou tím schopné hydroxylovat ethylové skupiny aromatickýchpětičlenných nebo šestičlenných heterocyklú na odpovídajícíhydroxyethylderiváty, přičemž heterocyklus slouží jako sub-strát pro reakci a hydroxyethylderivát se dále nemetaboli-zu je.
,.2.- Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím.že se reakce provádí s mikroorganismy, které obsahují genyalkBA z Pseudomonas OCT-plasmidu.
3. Způsob podle jednoho z nároků 1 nebo 2. vyznačují-cí se tím, že se reakce provádí s mikroorganismy,které patří k rodu Pseudomonas, Acinetobacter, Rhizobium.Agrobacterium nebo Escherichia.
4. Způsob podle jednoho z nároků 1 až 3. vyznačuj ícíse tím. že se reakce provádí buď s E.coli DH1. uloženéu holandské Centrální sbírky kultur CBS pod č. 102-87. nebos E.coli DH1, uložené u Německé sbírky mikroorganismů abuněčných kultur DSM pod č. 6726, oba transformovanéhybridním plasmidem pGEc41,nebo se reakce provádí s účinný-mi mutanty těchto kmenů.
5. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 1 až 4, vyzna-čující se tím. že se reakce provádí buď s Pseu-domonas putida PpS81, uloženého u Německé sbírky mikroorga-nismů a buněčných kultur DSM č. 6776, nebo s Pseudomonas 13 putida GP012, uloženého u DSM č. 6775. oba transformovanéhybridním plasmidem pGMK921. nebo se reakce provádí s účin-nými mutanty těchto kmenů.
6. Způsob podle jednoho z nároků 1 až 5, vyznačující se tím. že se jako substrát použije ethylovaný aroma- «. tický pětičlenný nebo Šestičlenný heterocyklus, který ζobsahuje jeden nebo více heteroatomů vybraných ze skupinytvořené kyslíkem, dusíkem, sírou.
7. Způsob podle jednoho z nároků lažó. vyznačujícíse tím. že se jako substrát použije ethylovaný pyrazinnebo pyridin.
8. Způsob podle jednoho z nároků 1 až 7 vyznačujícíse tím. že jsou enzymy mikroorganismů indukovány buďsloučeninami, které mikroorganismu slouží jako zdroj uhlíkua energie, nebo sloučeninami, které mikroorganismu nesloužíjako zdroj uhlíku a energie.
Způsob podle jednoho z nároků 1 až 8,se tím. že se reakce provádíkontinuálním přidávání substrátu tak.nepřesáhlo 20 % hmotnosti/objem. vyznačujícípři jednorázovém neboaby přidání substrátu
10. Způsob podle jednoho z nároků 1 až 9. vyznačující s e 11. tím. že se reakce provádí při hodnotě pH od 4 do
11. Způsob podle jednoho z nároků 1 až 10, vyznačují-cí se tím. že se reakce provádí při teplotěod 15 do 50 °C.
12. Hybridní plasmid pGMK921 uvedený na obr. 3. jak je uložený v Pseudomonas putida PpS81, který je uložen u Německé sbírkymikroorganismů a buněčných kultur DSM č. 6776. a v Pseudo-monas putida GP012. který je uložen u DSM č. 6775.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH69691 | 1991-03-07 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS66392A3 true CS66392A3 (en) | 1992-09-16 |
| CZ279503B6 CZ279503B6 (cs) | 1995-05-17 |
Family
ID=4193039
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5306625A (cs) |
| EP (1) | EP0502524B1 (cs) |
| JP (1) | JPH06181789A (cs) |
| AT (1) | ATE138103T1 (cs) |
| CA (1) | CA2062357A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ279503B6 (cs) |
| DE (1) | DE59206267D1 (cs) |
| DK (1) | DK0502524T3 (cs) |
| ES (1) | ES2087327T3 (cs) |
| HU (1) | HU212922B (cs) |
| IE (1) | IE75349B1 (cs) |
| IL (1) | IL101154A0 (cs) |
| MX (1) | MX9200963A (cs) |
| PL (1) | PL169440B1 (cs) |
| RO (1) | RO109866B1 (cs) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6156946A (en) * | 1996-04-12 | 2000-12-05 | Exxon Research And Engineering Company | Biological activation of aromatics for chemical processing and/or upgrading of aromatic compounds, petroleum, coal, resid, bitumen and other petrochemical streams |
| DE19951768A1 (de) * | 1999-10-27 | 2001-05-03 | Basf Ag | Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung aromatischer Aldehyde und/oder Carbonsäuren |
| ATE444284T1 (de) * | 2002-06-17 | 2009-10-15 | Saltigo Gmbh | Verfahren zur herstellung von mono-n- sulfonylierten diaminen |
| DE102010015807A1 (de) | 2010-04-20 | 2011-10-20 | Evonik Degussa Gmbh | Biokatalytisches Oxidationsverfahren mit alkL-Genprodukt |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK149080C (da) * | 1980-06-06 | 1986-07-28 | Sankyo Co | Fremgangsmaade til fremstilling af derivater af ml-236b-carboxylsyre |
| NL8700085A (nl) * | 1987-01-15 | 1988-08-01 | Rijksuniversiteit | Werkwijze voor het bereiden van verbindingen met eindstandige hydroxyl- of epoxygroep; daarvoor bruikbare microorganismen. |
-
1992
- 1992-03-03 IE IE920681A patent/IE75349B1/en not_active IP Right Cessation
- 1992-03-05 MX MX9200963A patent/MX9200963A/es unknown
- 1992-03-05 AT AT92103779T patent/ATE138103T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-03-05 DK DK92103779.2T patent/DK0502524T3/da not_active Application Discontinuation
- 1992-03-05 IL IL101154A patent/IL101154A0/xx unknown
- 1992-03-05 CA CA002062357A patent/CA2062357A1/en not_active Abandoned
- 1992-03-05 DE DE59206267T patent/DE59206267D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-03-05 EP EP92103779A patent/EP0502524B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-05 ES ES92103779T patent/ES2087327T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-05 CZ CS92663A patent/CZ279503B6/cs unknown
- 1992-03-05 RO RO92-200262A patent/RO109866B1/ro unknown
- 1992-03-06 PL PL92293733A patent/PL169440B1/pl unknown
- 1992-03-06 JP JP4049998A patent/JPH06181789A/ja not_active Withdrawn
- 1992-03-06 HU HU9200763A patent/HU212922B/hu not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-08-03 US US08/101,098 patent/US5306625A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK0502524T3 (da) | 1996-06-03 |
| PL293733A1 (en) | 1992-11-02 |
| PL169440B1 (pl) | 1996-07-31 |
| JPH06181789A (ja) | 1994-07-05 |
| IE75349B1 (en) | 1997-08-27 |
| CA2062357A1 (en) | 1992-09-08 |
| CZ279503B6 (cs) | 1995-05-17 |
| HU212922B (en) | 1996-12-30 |
| EP0502524A1 (de) | 1992-09-09 |
| HU9200763D0 (en) | 1992-05-28 |
| ES2087327T3 (es) | 1996-07-16 |
| MX9200963A (es) | 1992-09-01 |
| DE59206267D1 (de) | 1996-06-20 |
| RO109866B1 (ro) | 1995-06-30 |
| IE920681A1 (en) | 1992-09-09 |
| IL101154A0 (en) | 1992-11-15 |
| ATE138103T1 (de) | 1996-06-15 |
| US5306625A (en) | 1994-04-26 |
| EP0502524B1 (de) | 1996-05-15 |
| HUT62929A (en) | 1993-06-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2653398B2 (ja) | ｔｆｄＡ−２，４−Ｄ−モノオキシゲナーゼ遺伝子突然変異体及びｔｆｄＡ遺伝子を含有するプラスミドの同定及び単離法 | |
| Warren et al. | The biosynthesis of adenosylcobalamin (vitamin B12) | |
| US5032514A (en) | Metabolic pathway engineering to increase production of ascorbic acid intermediates | |
| Seo et al. | Genome mining in streptomyces. Elucidation of the role of Baeyer− Villiger monooxygenases and non-heme iron-dependent dehydrogenase/oxygenases in the final steps of the biosynthesis of pentalenolactone and neopentalenolactone | |
| Dutka-Malen et al. | Molecular cloning and overexpression of the glucosamine synthetase gene from Escherichia coli | |
| Newman et al. | The Rhodobacter sphaeroides ECF sigma factor, σE, and the target promoters cycA P3 and rpoE P1 | |
| JP2799380B2 (ja) | 新規酵素 | |
| JP2002512802A (ja) | 芳香族代謝／ｉｉｉ物質の微生物による製造 | |
| ZHAO et al. | An allosterically insensitive class of cyclohexadienyl dehydrogenase from Zymomonas mobilis | |
| Kiyasu et al. | Contribution of cysteine desulfurase (NifS protein) to the biotin synthase reaction of Escherichia coli | |
| CS66392A3 (en) | Microbiological process of terminal hydroxylation of aromatic heterocyclesethyl groups | |
| JP3734466B2 (ja) | コバラミンおよび／またはコバミドの生合成に関与するポリペプチド、それらのポリペプチドをコードするｄｎａ配列、それらの調製および使用 | |
| RU2088667C1 (ru) | Способ микробиологического гидроксилирования метильных групп ароматических 5- или 6-членных гетероциклов, рекомбинантная плазмидная днк pl04, рекомбинантная плазмидная днк pl05, штамм микроорганизма escherichia coli, используемый для получения гидроксиметильных производных ароматических 5- или 6-членных гетероциклов, и штамм микроорганизма pseudomonas putida, используемый для получения гидроксиметильных производных ароматических 5- или 6-членных гетероциклов | |
| Crockett et al. | Uroporphyrinogen III synthase: Studies on its mechanism of action, molecular biology and biochemistry | |
| Naranjo et al. | Conversion of pipecolic acid into lysine in Penicillium chrysogenum requires pipecolate oxidase and saccharopine reductase: characterization of the lys7 gene encoding saccharopine reductase | |
| JPS62155081A (ja) | 新規微生物およびそれを用いる醗酵法によるビオチンの製造法 | |
| US20250171815A1 (en) | Production of psychedelic compounds | |
| Hong et al. | Functional role of the Ti plasmid-encoded catabolic mannopine cyclase in mannityl opine catabolism by Agrobacterium spp | |
| Mayerl et al. | Functional expression of 8-hydroxy-5-deazaflavin-dependent DNA photolyase from Anacystis nidulans in Streptomyces coelicolor | |
| WO1999015632A1 (es) | UN PROCEDIMIENTO ENZIMATICO PARA PREPARAR ACIDO 7β-(4-CARBOXIBUTANAMIDO) CEFALOSPORANICO UTILIZANDO LA ENZIMA D-AMINOACIDO OXIDASA DE TRIGONOPSIS VARIABILIS MODIFICADA PRODUCIDA EN ESCHERICHIA COLI. | |
| SU1532585A1 (ru) | Рекомбинантна плазмидна ДНК @ 33, кодирующа метилазу S @ 11, и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент метилазы S @ 11 | |
| CN119546622A (zh) | 制备可用于合成贝组替凡的羟基化茚满酮中间体的工程酶 | |
| JPWO1994000576A1 (ja) | ビタミンｄ類水酸化酵素遺伝子 | |
| Garnon | Characterization of Escherichia coli K12 mutants that can use glycine as sole source of carbon and energy | |
| Adenylyltransferase | Escherichia coli The |