CS9100988A2 - Inhibition of allotransplants and agreeing xenotransplants rejection - Google Patents

Description

TV <1Μ> - 77 7

advokát íts 04 PHAhA i, Ziítíá lí«

Vynález se týká farmaceutických přípravků, vhodných proošetřování chronického odhojování alotransplantátů a odho-jování souhlasných xenotransplantátů. Vynález se rovněž tý-ká napomáhání přežití nebo prevence ztráty transplantátuu hostitele.

Dosavadní stav techniky

Alotrapsplantace je transplantace tkání mezi dvěmačleny stejného druhu. Xenotransplantace, která je transplan-tací tkáni mezi dvěma různými druhy, byla podle biologickýchkriterií rozdělena na dvě podskupiny (Calne, Transplant«,Proč. II 550-556 (1970)) · Tyto dvě podskupiny jsou shodnéxenotransplantáty a neshodné xenotransplantáty. Rozdíl mezitěmito dvěma skupinami je v tom, že vaskulaEizovaný orgá-nový transplantát, transplantovaný mezi nesouhlasnými dru-hy je hyperakutně odmítnut, to jest v několika minutáchnebo hodinách po'revaskularizaci. Mezi souhlasnými druhynemá hyperakutni rejekce xenotransplantátů místo. Trans-plantáty nicméně budou rejektovány a často zrychleným způ-sobem, ale v rozmezí několika dnů a ne hodin nebo minut.

Obecně se předpokládá, že ačkoliv formálně evidentnípro tuto situaci je ztráta, že mezi nesouhlasnými rody jehyperakutni rejekce výsledkem působení přírodních proti-látek vůči druhům dárce. Souhlasné transplantáty přežívají na jedné straně o něco kratší dobu, jestliže takové protilát-ky schopné jejich destrukce nejsou přítomny. V literatuřeje mnoho příkladů pro doložení takových rozdílů. Snad nej-elegantnější jsou příklady od Hammera (v "Xenograft 25" (Mark A.Hardy, vyd. Elsevier, Amsterodam 1989)). ^a použití -2- vždy psa jako příjemce nammer uvádí, ževínových transplantátů jsou následující: doby přežití led- pes - pesdingo - pesvlk - pesliška - peslev - pestigr - peskočka - pesvepř - pes 11.4 dny 11.5 dnů19,4 dny 6,5 dne 10-24 hodin10-24 hodin10 -24 hodin10-30 minut

Poslední čtyři interakce jsou na bázi nesouhlasnýchxenotransplantátů, zatímco první čtyři xenotransplantátyjsou souhlasné. Hammer hodnotil tyto rozdíly mezi neshod-nými a shodnými transplantáty přítomností nebo nepřítom-ností křížových druhů hemaglutinačních protilátek. Z akademického hlediska jsou obtíže s vytvořením defi-nice vztahů souhlasných a nesouhlasných druhů. Z praktic-kého hlediska pro účely předloženého vynálezu jsou dvarozdílné druhy hodnoceny jako souhlasné, jestliže nenížádná hyperakutní rejekce xenotransplantátů z jednoho dodruhého. Pro účelní předloženého vynálezu jsou druhy hodno-ceny souhlasně i když by normálně mohlo dojít k hyperakut-ní rejekci, nicméně mohou být podrobeny určitému postupu,např. genetické manipulaci, takže se zabrání hyperakutní-mu odmítnutí. International Patent Application PCT/GB90/01575např. uvádí ve specifickém provedení zvířecí dárci xeno-transplantátů, kteří byli transgenně modifikováni k expre-si spodních regulátorů recipientova komplementu (jako jerozkfed urychlující faktor (DAF) nebo membránový kofaktoro-vý protein (UCP)). Orgány od zvířecího dárce nejsou hyper-akutně vypuzeny, když jsou transplantovány zvířeti, kteréby normálně bylo označeno jako nesouhlasný druh. ^ro úče-ly tohoto vynálezu takoví transgenní dárci mohou být hodno- -3- ceni jako souhlasní vzhledem k zamýšleným cílovým druhům. Příklady druhů, majících souhlasný vztah jak je defi-nováno výše, zahrnují t>ypy zajíc-králík, křeček-krysa a ne-člověčí primét-člověk,.zahrnující například typy pavién-člověk, šimpanz-člověk a makak-elověk.

Podpoření přežití transplantátu bylo dosaženo v ob-lasti xenotransplantátů (nesouhlasných a souhlasných) a alo-transplantátů. První podněty byly provedeny pro podporupřežiti nesouhlasných xenotransplantátů, Adac&amp;i a spol.(Transplant.Proc. XIX (1) 1149-1152 (1987)) studovali pře-žití nesouhlasných srdečních xenotransplantátů u krys. Zpotenciálních promotorů přežití byly studovány cyklospo-rin A, aspirin a faktor jedu kobryu Dále byla studovánakombinace cyklosporinu A a faktoru jedu kobry. Adachi aspol. uvádějí "v naší studii nebyl podstatný rozdíl v prů-měrné době přežití mezi skupinou ošetřenou cyklosporinem Aa faktorem jedu kobry a skupinou ošetřenou samotným fakto-rem jedu kobry". Průměrná doba přežitá byla mezi 40 a 50hodinami. Kemp a spol. (Traspiant* Proč. XIX (6) 4471-4474(1987) také studovali různé potenciální promotory přežitínesouhlasných xenotransplantátů u koček. Možné promotory pře-žití zahrnuji captopril, enalapril, nifedipine, prostacyk-lin, chromoglykát sodný, kombinaci azathioprine/kortiko-steroid, c.yklosporin A a faktor, jedu kobry. Hyperakutnímuvypuzení nebylo zabráněno jakýmkoliv z uvedených léčiv svýjimkou faktoru jedu kobry, který podle autorů "měl pře-kvapující účinek s prodloužením přežití transplantátu aždo 7 dnů".

Vypuzení souhlasných xenotransplantátů bylo studovánoHardym a spol. (Transplantation 33 (3) 237 - 242 (1982$),kteří zkoušeli vliv selektivního lymfoidního ozařování (SLI)palladium-109-hematoporfyrinem v kombinaci s antilymfoid-ním globulinem, terapii, která je primárně vedena vůči vypu-zení působenému T-buňkami. Průměrná doba přežití byla v -4- tomto případě 12,5 dne ve srovnání s neošetřenou kontrolou,která přežívala průměrně 2,9 dne. Homan a spol. (Trans-plantation 31 (3) 164-166 (1981)) studovali vliv cyklospo-rinu A na zlepšení přežití souhlasných xenotransplantátů.Nejlepší přežití transplantátu bylo 21 dní ve srovnání se2 dny pro neošetřenou kontrolu. Monden a spol. (Transplan-tation 43 (5) 745-746 (1987)) studovali jaterní xenotrans-plantáty křeček-krysa a zjistili, že cyklosporin A nemávýznamný vliv na zlepšení přežití transplantátu ve srovné-nís neošetřenými kontrolami. Valdevere a spol. (Transplant.Proč. XIX (1) 1158-1159 (1987) také studovali jaterníxenotransplantáty křeček-krysa a nalezli významné zlepše-ní v době přežití ve srovnání s kontrolami, když byl cyk-losporin podán společně se splenektomií, přežití bylo zlep-šeno z průměru 3,6 dnů na průměr 17,6 dnů. Knechtle a spol.(Transplant. Proč. XIX (1)' 1 137-1139 (1987)) podobně jakoskupina ^ardyho a spol. uvedená výše, studovali vliv celko-vého lymfoidního ozařování (TLI), ale současně s terapiícyklosporinem A, na zlepšení přežití souhlasných xenotrans-plantátů. Uvádějí, že u srdečních xenotransplantátů křeček-krysa, cyklosporin A ve vysokých dávkách výrazně prodlužu-je přežívání, ale pouze nahodilý příjemce měl dlouhodoboufunkci transplantátu. TLI v kombinaci s cyklosporinem Adále výrazně podporuje přežití transplantátu. Běžnou terapií vůči vyouzení alotransplanétu je použi-tí c.yklosporinu A buď samotného nebo v kombinaci se ste-roidy nebo azathioprinem n-bo oběma těmito látkami. Podleněkterých názorů, kombinace trojité terapie nepředstavujezlepšení terapie, používající samotný cyklosporin A. I'ytoterapie jsou účinné při prevenci a zvratu akutního vypuzenítransplantátu a pravděpodobně zpomalují nástup chmaickéhovypuzení transplantátu, ale jeví se, že mají malý nebožádný vliv na zvrat chronického vypuzování po nástupu. -5-

Podstata vynálezu Předložený vynález se snaží podporovat zlepšení přeži-tí nebo zabránit vypuzení souhlasných xenotransplantátů a/nebo alotransplantátů. Vynález je založen na skutečnosti,že přežití souhlasných xenotransplantátů a také přežitíalotransplantátů, může být výrazně zvýšeno ošetřením kom-binací cyklosporinu A a faktoru jedu kobry, nebo kombina-cemi sloučenin, majících stejný model působení. V souladu s prvním aspektem předloženého vynálezu jeposkytnout farmaceutický přípravek, obsahující inhibitorkomplementu a imunosupresant s účinností podobnou cyklospo-rinu A. farmaceutické přípravky podle vynálezu mají alespoňdvě složky. První složkou je inhibitor komplementu.Inhi-bitor komplementu může buď bránit aktivaci komplementu nebojeho odstranění nebo vypuštění, nebo jedné nebo více jehosložek. Výhodně inhibitor komplementu bude inhibovat jakklasické tak alternativní způsoby aktivace komplementu. Jeproto výhodné, že inhibitor komplementu působí blokovánícestou C3, buď inhibicí nebo odstraněním nebo vypuštěním.

Je třeba si uvědomit, že protilátky (např. monoklonálníprotilátky) vůči G3 mohou být použity jako inhibitor kom-plementu v předloženém vynálezu, další vhodné inhibitory kom·plementu zahrnují rozpustný rozklad aktivující faktor (DAF)a rozpustný membránový kofaktorový protein (MCP). Jednímz nejpreferovanějších inhibitorů komplementu je faktor jedukobry.

Hadí jedy jsou většinou komplexy živočišných sekretů, obsahující obrovský počet složek s rozdílnými farmakologic- kými a biochemickými aktivitami. Ařítomnost složek v jedech, působících na komplement je známa více než sto let. Působě- -6- ní jedu kobry (Naja naja kaouthia) na sérový komplementbylo detailně studováno. Aktivním faktorem je glykopropeins molekulovou hmotností 144 kDa, který se spojuje s fak-torem 3 sera za přítomnosti iontů hořčíku, ^aktor B jepak štěpen na dvě komponenty proteolytickým působením fak-toru D sera, označených ^b a Ba. Komplex CoF-Bb, kdeCoF představuje faktor jedu kobry, je vysoce aktivníjá G3a C5- štěpící enzym nebo kovertáza. Nicméně na rozdíl odnormálních G3- a C5 konvertáz je CoF-Bb rezistentní knormálním systémům regulace komplementu. Jeho působenípokračuje, dokud nebyl všechen C3 převeden, což účinně vy-čerpá individuální aktivitu komplementu. Štěpení C5 uvol-ňuje G5a, která působí anafyloidně; ne všechny faktoryjedu kobry Naja vykazují G5 konvertézovou aktivitu, aletoto není pro účely vynálezu důležité. Inhibice komplementunení omezena na jedy rodu Naja. Eggertsen a spol. (Toxicon18 87-96 (1980)) studovali jedy z hadů z rodů Elapidae,Viperidae a Grotalidae. Ze 26 jedů, které byly studovány,mělo 22 schopnost inhibovat normální lidský komplement.Analýza struktury faktoru jedu kobry potvrzuje, že jeekvivalentní kobra C3 nebo jeho částečně degradovanému pro-duktu. ne

Faktor jedu kobry a faktory jiných hadích jedů se/budouobecně podle předloženého vynálezu podávat ve své nativníformě, protože jsou zřejmé problémy s toxicitou. Jelikožchybí jiná opatření při potlačování problémů s toxicitou,je obecně potřebné čistit alespoň částečně aktivní faktorze surového jedu.Není nutné u faktoru jedu kobry nebo ji-ného hadího jedu, aby byl čištěn do homogenity podle před-loženého vynálezu, ale dochází k problémům v regulaci,jestliže je zamýšleno předepsání užiti v podstatě čištěné-ho faktoru, ^'aktor jedu kobry jako semi-čištěný přípravek,může být získán od dodavatelů chemikálií jako je Sigma(Sigma Chemicals Limited, Poole, Dorset), kteří také dodá- -Ί- vají surový jed kobry pro další čištění. Příklad přípravyfaktoru jedu kobry ze surového jedu kobry je uveden v přík-ladech.

Je třeba zvážit, že dále při použití faktoru přírod-ního jedu kobry a faktorů jiných hadích jedů, mohou býtpoužity v tomto vynálezu analogy takových faktorů(obsahu-jící aktivní fragmenty), jako jsou syntetické faktory, zahrnující faktory připravené technologií rekombinantní DNA.Charakteristikou CoF, která jej činí vhodným pro použitív předloženém vynálezu je jeho schopnost tvořit stabilníkomplex s faktorem Bb, který je rezistentní k běžnému me-chanismu vypuzení, Jiné molekuly mající tuto vlastnostjsou také výhodné pro použití podle vynálezu.

Druhou složkou farmaceutického přípravku v souladu spředloženým vynálezem, je imunosupresant s aktivitou podob-nou cyklosporinu A. lakové sloučeniny jsou odborníkům zná-mé a zahrnují jiné cyklosporiny než cyklosporin A jako jecyklosporin C a cyklosporin G. Eikosanoidy také mají akti-vitu podobnou cyklosporinu A a zahrnují PGI2 (prostacýklin)PGE2, PGD2 , rapamycin a FK 506 (Fujisawa). Sloučenina FK506 je sloučenina, která je v předloženém vynálezu prefero-vána, ale nejvýhodnější je samotný cyklosporin A. Cyklo-sporin A je dostupný od firmy Sandoz pod značkou SANDIMUN.

Zvláště výhodné provedení předloženého vynálezu setýká farmaceutického přípravku, který obsahuje faktor jedukobry a cyklosporin A, dvě nejvýhodnější výše uvedené slou-čeniny. Předpokládá se, že v souladu s vynálezem mohou býtve farmaceutických přípravcích přítomny další složky. Bu-dou obvykle přidávány přísady a přítomnost dalších aktiv- -8- ních složek není vyloučena. Může být přítomno více než jed-na aktivní složka z každé kategorie.

Aktivní složky nutné nemusí být podány spolu v jed-nom přípravku, -^odle druhého aspektu předloženého vynálezuje poskytnut produkt, obsahující inhibitor komplementu aimunosupresant s aktivitou podobnou cyklosporinu A propoužití jako kombinovaný přípravek pro současné, oddělenénebo postupné použití při podpoře přežití alotransplantátunebo souhlasného xenotransplantátu nebo ochraně před vypu-zením. V souladu s třetím apektem je podle vynálezu poskytnutkit, obsahující farmaceutický přípravek imunosupresantu s ak-tivitou podobnou cyklosporinu A.

Gyklosporin A a další imunosupresanty s aktivitou po-dobnou cyklosporinu A budou obvykle podávány v praktickémprovedení vynálezu parenterálně. V takových případech musíbýt přípravek, obsahující imunosupresant sterilní, ^icméněsamotný cyklosporiri A a některé další imunosupresanty mo-hou být podány orálně, v takovém případě není sterilitapodstatná. Gyklosporin A samotný je jen nepatrně rozpustnýve vodě a pro praktickéúúčely. je výhodné jej rozpustit voleji, jako v oleji rostlinném. Přijatelný je v praxi olejolivivý. Disoluce v oleji je nezbytná, když se jedná oimunosupresant, který není rozpustný ve vodě a obecně můžebýt imunosupresant rozpuštěn v jakémkoliv fyziologicky při-jatelném nosiči. V některých případech ani není disolucenutná, koncentrace, ve které se připraví imunosupresant, bu-de samozřejmě záviset na charakteru samotného imunosupre-santu a zamýšlené dávce, která se obecně bude řídit návodemlékaře. Obecně bylo zjištěno, že je vhodné připravit pří-pravky o koncentraci cyklosporinu od 1 do Í00 mg/ml, na-příklad od 1 do 10 mg/ml, typicky asi 5 mg/ml pro parente-rální učela nebo 25 až 100 mg/ml, například od 50 do 100 mg/ml, -9- typicky asi 100 mg/ml pro orální podání. inhibitory komplementu jako je faktor jedu kobry seobecně podávají parenterálně a pro tento účel by měly býtsterilní. °amotný faktor jedu kobry může být formulován vefosfátem fufrovaném salinickém roztoku (bez azidu) nebov jakémkoliv vhodném rozpouštědle nebo nosiči, koncentraceinhibitoru komplementu ve farmaceutickém přípravku budeopět záviset na konečné zamýšlené dávce, která by mělabýt pod kontrolou lékaře. Přípravek faktoru jedu kobry v PDSmůže mít koncentraci v rozmezí od 0,05 mg/ml až do mezerozpustnosti, která závisí na jeho čistotě. V praxi lzeužít kompozic o koncentraci až do 5 mg/ml, např. od 0,1do 2 mg/ml, například asi 0,5 mg/ml.

Protože cyklosporin A je prakticky ve vodném mediunerozpustný, zatímco faktor jedu kobry je, měly by obecnětyto dvě preferované aktivní složky být formulovány oddě-leně a podány odděleně. i’ato skutečnost není zásadní, nic-méně je možné formulovat vhodnou emulzi dvou aktivníchsložek a různé kombinace aktivních složek mohou být roz-puštěny v běžném rozpouštědle nebo alespoň suspendoványv běžném nosiči.

Pokud se jedná o parenterální injekce, je výhodnýmmístem pro injekci sval, protože depotní účinek vzniká zintramuskulární injekce. Intravenozní injekce nicméně můžebýt za některých okolností vhodná a subkutánní injekcemůže mít některé, i když ne všechny výhody injekce intra-muskulární. Intraperitoneální injekce by mohla být použi-ta podle okolností.

Podle čtvrtého aspektu předloženého vynálezu je poskyt- nuto použití inhibitoru komplementu a imunosupresantu s aktivitou podobnou cyklosporinu A. V přípravku činidla pro -10- podporu přežití aiotransplantátu nebo souhlasného xeno-transplantátu nebo zábranu před vypuzením, ^roto má vyná-lez užití ve způsobu podpory přežití aiotransplantátunebo souhlasného xenotransplantátu, nebo zábraně před vypu-zením u hostitele, způsob zahrnuje podání inhibitoru kom-plementu a imunosupresantu s aktivitou podobnou cyklospo-rinu A příjemci transplantátu nebo zamýšlenému příjemcitransplantátu. Může být výhodné za různých okolností podat před usku-tečněním transplantace některé nebo všechny aktivní složkypodle vynálezu. Je také třeba poznamenat, že hlavní výhodoupředloženého vynálezu, je, že kombinace aktivních složekby měla být vhodná pro prevenci chronického vypuzení nebovznik chronického vypuzeni (tj. zábranu před vypuzením) pojeho nástupu; k tomu obvykle dochází mnoho let po trans-plantaci. U příjemců aiotransplantátu, trpících chronickým vypu-zováním transplantátu, nebo rizikem chronického vypuzovánítransplantátu je možno dosáhnou imunosuprese cyklospori-nem A nebo jiným imunosupresantem, majícím aktivitu podob-nou cyklosporinu A. ťro účely tohoto vynálezu s cílem lé-čit nebo zabraňovat chronickému vypuzení transplantátu utakových pacientů je nutné pouze přidat terapii inhibitoremkomplementu. V souladu s pátým aspektem vynálezu je poskyt-nuto použití inhibitoru komplementu při přípravě činidlapro podporu přežití aiotransplantátu nebo souhlasného xeno-transplantátu, nebo zabránění vypuzení transplantátu pří-jemcem, který je ošetřen imunosupresantem s aktivitou po-dobnou cyklosporinu A. Vynález je tak možno použít přizpůsobu podpory přežití aiotransplantátu nebo souhlasného 'xenotransplantátu a/nebo zabránění vypuzení transplantátuu hostitele. Způsob zahrnuje podání příjemci transplantátunebo zamýšlenému příjemci transplantátu, který je ošetřen -11- imunosupresantem s aktivitou podobnou cyklosporinu A, in-hibitoru komplementu. xmunosupresant s aktivitou podobnou cyklosporinu Amůže být podán v jakékoliv vhodné účinné, ale netoxickéhladině, s přihlédnutím k ošetřovaným druhům a orgánu, kte-rý bude transplantován. Xiorní hranice tolerance cyklospo-rinu A u člověka je dána jeho nefrotoxicitou a stářím pří-jemce. 20 mg/kg na den může být bezpečná horní hranice proošetření lidí v mnoha případech, ačkoliv jiné druhy mohoumít vyšší tolerance. Gyklosporin A je účinný v nižšíchdávkách a tak nejnižší množství, které může být podánobude ..jednoduše nejnižší množství, které dává účinnou odez-vu. Množství 1 nebo 2 mg/kg na den byly v některých pří-padech shledány účinnými. Obecně může být podáváno mezi5 a 10 mg/kg na den. Jestliže je podání parenterální, můžebýt cyklosporin A podáván ob den, v takovém případě, v tako-vém případě by dávka byla dvojitá. Pro výhodnou orální ces-tu denní dávka nicméně bude řízena podle příjemce, výhod-něji může být cyklosporin A podáván dvakrát nebo častějiza den pro získání celkové denní dávky 5 až 10 mg/kg. Jinéimunosupresanty s aktivitou podobnou cyklosporinu A budoupodávány v účinných, ale netoxických dávkách, jak stanovílékař. inhibitor komplementu, jako je faktor jedu kobry budepodáván v takovém množství, které účinně inhibuje aktivi-tu komplementu, jak se stanoví hemolysou^Q (ΟΗ^θ) komple-mentu. Bezpečná horní hranice po podání faktoru jedu kobrynebyla stanovena, ale dávka 2 mg/kg se nejeví být toxická.Minimální dávka faktoru jedu kobry je závislá na druhu amůže být snadno stanovena zkouškou. Denní dávky mezi 0,01 a °,1 nebo 0,2 mg/kg byly zjištěny jako účinné pro fak- tor jedu kobry, účinné a netoxické dávky jiných inhibitorů komplementu mohou být také snadno stanoveny odborníky, na- -1 2- příklad použitím zkoušky.

Faktor jedu kobry působí asi 6 hodin po počátku akti-vity po intramuskulárním podání. °akmile je pozorována po-čáteční aktivita, může trvat více než jeden den, například2 dny a tak nemusí být nezbytné denní podávání faktoru jedukobry. Je výhodné podávat faktor jedu kobry ob den, v tako-vém případě výhodné denní dávky uvedené výše budou v denpodání zdvojeny. V praxi bylo zjištěno, že zvláště výhod-ný režim zahrnuje podání 0,4 mg/kg intramuskulárně ob den.

Cyklosporin A nebo jiné imunosupresanty mohou býtpodávány kontinuálně. Faktor jedu kobry nebo jiný inhibitorkomplementu obecně nebude podáván kontinuálně, ale můžebýt prolongován; i když to není pro praktické provedenípodstatné, krátkodobou terapií mohou být všechny, kde jenutné ošetření před nebo zabránění vypuzení, souhlasnýchxenotransplantátů. Výhodné rysy druhého až pátého aspektu vynálezu jsoujakou prvního apektu, mutatis mutandis.

Vynález bude nyní ilustrován následujícími příkladya přípravami. Příklady souvisejí s připojenými obrázky, kte-ré představují:

Obr.1 - je graf přežití xenotransplanétů křeččí' ho srdce u krysy, procenta přežití jsou vynesena proti dnůmpo transplantaci a obr.2 - je graf přežití xenotransplantétu křeččího srdceu krys ošetřených cyklofosfamidem; graf jinakodpovídá obr.1. -13- Příklady provedení vynálezu Příprava

Tato příprava uvádí protokol pro přípravu faktorujedu kobry ze surového jedu kobry. 1 g jedu Naja naja kaouthia (Sigma, produkt č. V-9125,Lots č. 116F-0398 a 58F-0565) byl rozpuštěn v 60 ml odply-něného fosfátového pufru (0,01M) při pH 7,5 a načerpánna 90 cm x 26 mm (vnitřní průměr) kolonu DEAE celulózy(DE52, Whatman) a ekvilibrované stejným pufrem. Kolona pakbyla eluována 43,0 ml za hodinu s výchozím pufrem dokud^280 abs^bance eluentu se nevrátí na 0. Lineární 3 lit- -ry: 3 litrům gradient výchozího pufru a limitního pufru(0,01M fosfát sodný, pH 7,5, obsahující 0,5M chloridusodného) pak byl čerpán rychlostí 40,0 ml za hodinu a by-ly odebírány frakce 7,0 ml. Frakce byly testovány na anti-komplementaritu a pozitivní frakce byly spojeny a zahuš-těny na CX-10 ultrafiltrech.

Celý pool faktoru jedu kobry byl čerpán na 90 cm x26 mm (vnitřní průměr) kolonu Sephadexu G200 (jemný) (Phar-macia GB Limited, londýn), ekvilibrovaný PBS (bez azidu)a eluován PBS rychlostí 36 ml za hodinu. 6 ml frakce bylyshromážděny a zkoušeny na antikomplementérní aktivitu. Frak-ce faktoru jedu kobry (tj. aktivní frakce) byly spojeny,zvláště na sestupné větvi píku, zahuštěny na CX-10 ultra-filtrech, rozděleny do částí a tyto byly zmrazený na -20 °Ca připraveny pro použití.

Antikomplementérní aktivita faktoru jedu kobry uvede- ná výše může být měřena následujícím způsobem. 20 ^ul frakce se inkubují se 20 ^ul čerstvého lidského sera 20 minut při 37 °C. Do jamek testovací destičky se přidají 5 /Ul podíly. Destička je vyrobena z: -14- 5,0 ml 2% vodné agarozy, 4,5 ml dvakrát zesíleného PBS obsahujícího 20 mM EDTA, 0,5 ml 10% promytých erythrocytů morčete a0,5 ml čerstvého normálního lidského sera. Pěstička pak byla inkubována přes noc při +4 °G. Pozi-tivní se projevují jasnými zónami lýzí po inkubaci. Příklad 1 (Srovnávací příklad) V tomto příkladu jsou krysy krysami DA od ^anting akingdom a křečci jsou syrští křečci tako od ^anting a^ingdom. ^etodou podle Herona (Acta Pathol. Microbiol·Scand. 79 366-372(1971)) byla srdce křečků transplantovánado brků krys. Aorta byla připojena ke karotidš za použitítechniky popsané Heronem. Podobně pulmonární arterie bylapřipojena k jugulární véně. Všechny další srdeční cévy bylypodvázány. Srdce začala bít několik minut po odstraněnísvorek. Kůže byla nad implantovaným srdcem uzavřena a srd-ce bylo denně sledováno externální palpací.

Hodnoty přežití srdečních transplantátů jsou uvedenyna obr. 1 a jsou představovány křivkou 1. Je zřetelné, žeprůměrná doba přežití transplantátů byla 3 dny. Příklad 2 (Srovnávací příklad)

Opakuje se postup z příkladu 1 s tím rozdílem, že bylpodán cyklosporin A v dávce 20 mg/kg obden. Sy^iosporin Abyl podán jako přípravek 20 mg/ml v olivovém oleji a bylinjikován intramuskulárně, první dávka byla podána v dobětransplantace. Injekce pak byly podávány obden. Hodnoty přežití transplantátu jsou opět uvedeny na obr. 2: křivka 2představuje výsledky z tohoto příkladu. Střední hodnota přežití je 3 dny. -15- “^říklad 3 (Srovnávací příklad)

Opakuje se postup z příkladu 1 s tím rozdílem, že bylobden podáván faktor jedu kobry v dávce 0,4 mg/kg. Faktorjedu kobry byl podáván jako Soztok o koncentraci 0,5 mg/mlv PBS prostém azidu. První injekce byla.podána intramus-tulárně v době transplantace a následující intrámuskulár-ní injekce byly podávány potom obden. Hodnoty vypuzenítransplantátu jsou opět uvedeny na obr. 1. Výsledky jsouznázorněny křivkou 3, které udává, že střední hodnota pře-žití pro transplantáty je 6 dnů. Příklad 4

Opakuje se postup z příkladu 1 s tím rozdílem, že pří-jemci byl podán jak cyklosporin A tak faktor jedu kobry. Cyk'losporin A byl podán v dávce 20 mg/kg obden, takže podmínkypodávání cyklosporinu jsou stejné jako v příkladu 2. Fak-tor jedu kobry bal podáván za stejných podmínek jak jepopsáno v přikladu 3. uak cyklosporin A tak faktor jedukobry byly poprvé podány v době transplantace. Hodnoty pře-žití jsou,opět uvedeny na obrázku. V tomto příkladu nebylepozorováno žádné vypuzení transplantátu, jak je zřejmé zekřivky 4 na obr. 1. Přežití transplantátu je v průměruvyšší než 50 dnů. Příklad 5

Opakuje se postup z příkladu 4 s tím rozdílem, že po-dávání faktoru jedu kobry bylo přerušeno po 28 dnech potransplantaci. Průměrné přežití transplantátu bylo většínež 100 dnů. Dvě zvířata byla usmrcena 103. a 105* dena" histologické vyšetření transplantátu prokázalo normálnísrdeční stavbu, ^bylékrysy přežívaljr s tlukoucím křeččímsrdcem více než 5 měsíců. -16- Příklad 6 (Srovnávací příklad) 20 krys obdrželo křeččí srdce postupem podle pří-kladu 1. Byly ošetřeny cyklosporinem A jak je popsáno vpříkladu 2 a dále obdržely ENDOXAN cyklofosfamid i.p. (20mg/kg) jeden den před transplantací (den-1) a den 2 potransplantaci. (Výraz ENDOXAN je ochranná známka pro cyklo-fosfamid, který je inhibitorem produkce protilátek.) Srdcekřečků byla vypuzena jak je zřejmé ze křivky 5 na obr. 2.Pozorované odložené vypuzení, ve kterém je zpoždění výsled-kem krátké cyklofosfamidové terapie, simuluje zpožděnívypuzení transplantátu odpovídající neadekvátním imuno-supresivním protokolům. Příklad 7 Pět krys bylo ošetřeno jako v příkladu 6, ale navícbyly ošetřeny jako v příkladu 4 faktorem jedu kobry. Ošet-ření bylo prováděno od 7.dne, trvalo 14 dnů. Všechna zví-řata byla ochráněna před vypuzením jak je zřejmé ze křiv-ky 6 obr.2.

Claims (10)

1. .'.ií.·?·;··-·'· -· »·** vArtfčka ¢/,ŠX 5 -17-

   PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Farmaceutický přípravek,v y z n a Suj í c í setím, že obsahuje inhibitor komplementu a imunosupre-sant s aktivitou podobnou cyklosporinu A.
2. 2. Farmaceutický přípravek podle nároku 1, vyzna-čující se tím,že inhibitor komplementu inhi- buje jak klasické tak alternativní způsoby aktivace faom-plementu. 3”. Farmaceu-tický přípravek podle nároku 1 nebo 2,vyznačující se tím, že inhibitor komple-mentu obsahuje MCP, DAF nebo protilátku proti C3, 4. farmaceutický přípravek podle nároku ^vyznaču-jící se tím, že inhibitor komplementu obsahujemolekuly, které tvoří stabilní komplex s faktorem Bb, při-čemž je komplex rezistentní k normálnímu mechanismu poruchy,
3. 5. Farmaceutický přípravek podle nároku 1 nebo 2, vy-značující se tím, že inhibitor komplementuobsahuje faktor jedu kobry.
4. 6. Farmaceu-t,ícký přípravek podle kteréhokoliv z náro-ků 1 až 5, vyznačující se tím,že imuno-supresantem s aktivitou podobnou cyklosporinu A je cyklo-sporin nebo eikosanoid. 7. farmaceutický přípravek podle nároku 6,v y z n a č u -jící se tím, že imunosupresantem je cyklospo- rin A.

   ;γν:. '/ák -18-
5. 8. Farmaceutický přípravek podle nároku 6,v y z n a -dující se tím, že imunosupresantem je FK 506.
6. 9. Produkt, obsahující inhibitor komplementu a imu-nosupresant s aktivitou podobnou cyklosporinu A pro použi-tí jako kombinovaný přípravek pro současné, oddělené nebopostupné použití při podpoře přežití alotransplantétů ne-bo souhlasných xenotransplantátů nebo při zabránění vypu-zení transplantátů. 10. ^it, obsahující farmaceutický přípravek inhibitorukomplementu a farmaceutický přípravek imunosupresantu saktivitou podobnou cykho^pBĚ*íhu A.
7. 11 . Použití inhibitoru komplementu a imunosupresantu s aktivitou podobnou cyklosporinu A pro přípravu činidla propodporu přežiti alotransplantátu nebo souhlasného xeno-transplantátu nebo pro zabránění vypuzení transplantátů.
8. 12. Způsob podpory přežití alotransplantétů nebo souhlas-ných xenotransplantátů u hostitele, nebo zabránění odhoje- ní takových transplantátů, který se vyznačuje tím,že zahrnuje podání příjemci nebo zamýšlenému příjemcitransplantátu, inhibitoru komplementu a imunosupresantu saktivitou podobnou cyklosporinu A.
9. 13. Použití inhibitoru komplementu při přípravě činidla pro podporu přežití alotransplantétů nebo souhlasných xeno-transplantátů, nebo zabránění odhojení, u příjemce trans-plantátu, který je Ošetřen imunosupresantem s aktivitoupodobnou cyklosporinu A. -
10. 14. Způsob podpory přežití alotransplantátů nebo souhlas- ných xenotransplantátů v hostiteli, nebo zabránění odhoje-ní takových transplantátů,vy značujíci setím, že zahrnuje podání inhibitoru komplementu příjem-ci transplantátu nebo zamýšlenému příjemci transplantátu,který je ošetřen imunosupresantem, majícím aktivitu po-dobnou cyklosporinu A.