CZ183498A3 - Mikrobiální způsob transformace steroidu - Google Patents

Description

Předkládaný vynález se týká způsobu mikrobiální přeměny steroidů 11a-hydroxylací za pomoci kyslíku a vybraných mikroorganismů.

Dosavadní stav techniky

Mikrobiologická 11a-hydroxylace steroidů je dobře známý proces, in vivo stejně jako in vitro. Například 11a-hydroxylace io progesteronu bezbuněčnými preparáty Aspergillus ochraceus byla uvedena v Shibahara a další, Biochim. Biophys. Acta, 202 (1970), 172 - 179. Je také známo, že nelze úplně předpovědět průběh mikrobiálních 11a-hydroxylačních reakcí steroidů, což vede k neúplným přeměnám. Dosahuje se typických stupňů přeměny 80 až

85 %. Pro průmyslové použití je však důležité získat spolehlivě vyšší stupně přeměny, které s výhodou vedou k výtěžkům 11ahydroxylovaných steroidů větším než 95 %. Matematické modely optimalizace takových způsobů fermentace se diskutují v Deshayes a další, Bull. Soc. Chim. Fr., (1980), II 24 - 34. Například v případě 11a20 hydroxylace canrenonu se v této práci uvádí, že za optimálních podmínek mohio být dosaženo výtěžků lepších než 95 % při použití Aspergillus ochraceus v médiu obsahujícím mj. 10 g/l glukózy v matrix sladového extraktu a tryptikázy. Za těchto podmínek mohlo být transformováno až 1,5 g/l canrenonu, což bylo považováno v oboru za zlepšení, například jak se uvádí v Blunt a další, J. Chem. Soc., 6 (1971), 1136, kdy nebylo možno získat výtěžek 11a-hydroxylovaného canrenonu větší než 90 % s použitím nejvýše 0,5 g/l substrátu.

V

-2'9 9 9999 9 999

9 999 9 999

9 9 · 9 9 99 999 9 9 '9 9 9 9 9 9 9 9

99 99 99 99 99

Protože se předpokládalo, že kontaminanty budou mít nepříznivý vliv na mikrobiální proces, je možno očekávat, že zvýšením čistoty výchozích látek by mohlo být dosaženo další optimalizace. Překvapivě však bylo nyní zjištěno, že další zlepšení se získá použitím 5 substrátu, který není úplně čistý,' zvláště použitím substrátu s čistotou menší 97 %.

Podstata vynálezu

Vynález se proto týká mikrobiálního způsobu přeměny steroidu 10 in vitro na jeho odpovídající 11a-hydroxylový analog s použitím kyslíku a mikroorganismu zvoleného ze skupiny Aspergillus ochraceus, Aspergillus niger, Rhizopus stolonifer, Rhizopus nigricans, Rhizopus arrhizus a kmeny Pestelotia, který se vyznačuje tím, že se používá steroidu s čistotou méně než 97 %.

Mikroorganismem je s výhodou Aspergillus ochraceus. Čistota steroidu je s výhodou větší než 90 %. Výhodněji je čistota steroidu mezi 90 a 95 %. Předkládaný způsob využívající nečistých substrátů dovoluje mikrobiální přeměny při koncentracích substrátů, které jsou podstatně vyšší než maximální koncentrace popisované u autorů

2o Blunta nebo Deshayese.

Předkládaný mikrobiální způsob může být použit se steroidy, které mají nesubstituovanou polohu 11. Výhodnými příklady jsou estr4-en-3,17-dion a canrenon.

Překvapivý účinek nečistot na stupně přeměny je ilustrován 25 v následujících tabulkách:

• ·

Tabulka I

Přeměna estr-4en-3,17-dionu pomocí A.ochraceus
Čistota (%)-	Koncentrace substrátu ------------------(g/0 -------—	Stupeň přeměny (%)
99	15	78
99	10	83
98	25	85
94*	λ r IO	91
94*	15	91
94*	15	94
93	25	97
92	10	98

* Do čistého substrátu byly přidány různé nečistoty.

Tabulka II

Přeměna canrenonu pomocí A.ochraceus
	Čistota (%)	Koncentrace substrátu (g/i)	Stupeň přeměny (%)
	100	5	74
	100	10	78
	100	20	73
	100	35	72
	96	10	98
	94	15	96
	96	22	96
	95	22	95

• 44 ·· 44 • 4 4 · 4 4 '4 β «« e e «4

4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4

444 44 44 44

- 4 4 4*4

4 «

Vynález je dále ilustrován následujícími příklady.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Třepaná baňka obsahující minerální růstové médium s glukózou byla zaočkovaná sporami A. ochraceus a umístěna na reciproké třepačce při 28 °C 15 hod. Potom byl zaočkován 250 ml suspenze vyklíčených spor míchaný fermentor obsahující 5 I média. Použité médium obsahovalo médium glukóza/kvasničný extrakt (glukóza 40 io g/l, kvasničný extrakt 10 g/l, pH 5,0). Kultivační podmínky byly následující: otáčky míchadla 750 min'¹, průtok vzduchu 0,2 l/l/m, teplota 28 °C. Pěnění bylo měřeno elektrodou odpěňovacího přístroje a řízeno automatickým přidáváním silikonového odpěňovacího prostředku. Když kultura dosáhla koncentrace biomasy alespoň 2 g/l, byla přidána malá část estr-4-en-3,17-dionu (1 g/l) pro indukci syntézy hydroxyiačních enzymů. O 3 hod později byly přidány vyšší koncentrace steroidu do dosažení požadovaných koncentrací podle tabulky I. Přeměna steroidu byla zastavena, pokud nebylo pozorováno při opakovaném měření žádné zvýšení přeměny.

Příklad 2

V třepací baňce byla připravena stejná kultura jak bylo popsáno v příkladu 1. Když kultura dosáhla koncentrace biomasy alespoň 4 g/l, byl najednou přidán canrenon pro dosažení požadovaných koncentrací uvedených v tabulce II. Přeměna steroidu byla ukončena, jestliže při opakovaném měření nebylo pozorováno žádné zvýšení přeměny.

Claims (3)

1. Mikrobiální způsob transformace steroidu in vitro na odpovídající 11a-hydroxyanalog s použitím kyslíku a mikroorganismu zvoleného ze skupiny Aspergillus ochraceus, Aspergillus niger, Rhizopus stolonifer, Rhizopus nigricans, Rhizopus arrhizus a kmeny Pestelotia, vyznačující se tím, že čistota použitého steroidu je menší než 97 %.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e mikroorganismem je Aspergillus ochraceus.

Způsob podle některého z nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že čistota steroidu je mezi 90 a 95 %.

Z' „Z

4. Způsob podle některého z nároků 1 až 3, vyznačuj Lč í se t i m , ze použita koncentrace steroidu je vetší nez 0,5 g/l.

Způsob podle některého z nároků 1 až 4, vy z n a č u j I c í se tím, že steroid je zvolen ze skupiny estr-4-en-3,17dion a canrenon. /