CZ20012469A3 - Způsob pro extrakci prionového proteinu a souprava k jeho provádění - Google Patents
Způsob pro extrakci prionového proteinu a souprava k jeho provádění Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20012469A3 CZ20012469A3 CZ20012469A CZ20012469A CZ20012469A3 CZ 20012469 A3 CZ20012469 A3 CZ 20012469A3 CZ 20012469 A CZ20012469 A CZ 20012469A CZ 20012469 A CZ20012469 A CZ 20012469A CZ 20012469 A3 CZ20012469 A3 CZ 20012469A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- prion protein
- abnormal prion
- lyotropic
- extraction solvent
- biological material
- Prior art date
Links
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 title claims abstract description 191
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 title claims abstract description 191
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title claims abstract description 83
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 claims abstract description 110
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 65
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims abstract description 49
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 38
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 33
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims abstract description 25
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 23
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 23
- 238000002013 hydrophilic interaction chromatography Methods 0.000 claims abstract description 20
- BYEAHWXPCBROCE-UHFFFAOYSA-N 1,1,1,3,3,3-hexafluoropropan-2-ol Chemical compound FC(F)(F)C(O)C(F)(F)F BYEAHWXPCBROCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 62
- 230000002535 lyotropic effect Effects 0.000 claims description 54
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 34
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 27
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 22
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 19
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 15
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 15
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 14
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 claims description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 10
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 9
- 239000003495 polar organic solvent Substances 0.000 claims description 9
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 8
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims description 8
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 claims description 8
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 claims description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 6
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 5
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 claims description 4
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 abstract description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 22
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 abstract description 19
- 239000000284 extract Substances 0.000 abstract description 12
- 208000024777 Prion disease Diseases 0.000 abstract description 9
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 abstract description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 21
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 16
- 208000010544 human prion disease Diseases 0.000 description 15
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 11
- 208000008864 scrapie Diseases 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 8
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 8
- 201000004283 Shwachman-Diamond syndrome Diseases 0.000 description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 6
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 208000010859 Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- 208000003736 Gerstmann-Straussler-Scheinker Disease Diseases 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 208000018756 Variant Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 230000000389 anti-prion effect Effects 0.000 description 3
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 3
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 3
- 208000005881 bovine spongiform encephalopathy Diseases 0.000 description 3
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N Trifluoroethanol Chemical compound OCC(F)(F)F RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007818 agglutination assay Methods 0.000 description 2
- DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N amyloid-beta polypeptide 42 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N 0.000 description 2
- 238000012863 analytical testing Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 2
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 244000144980 herd Species 0.000 description 2
- 238000001499 laser induced fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- -1 perfluoro-t-butyl Chemical group 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M sodium bromide Chemical compound [Na+].[Br-] JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- DSLBDPPHINVUID-REOHCLBHSA-N (2s)-2-aminobutanediamide Chemical compound NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DSLBDPPHINVUID-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZVXAXABPTOPGDK-UHFFFAOYSA-N 1,1,1,3,3,4,4,4-octafluorobutan-2-ol Chemical compound FC(F)(F)C(O)C(F)(F)C(F)(F)F ZVXAXABPTOPGDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GILIYJDBJZWGBG-UHFFFAOYSA-N 1,1,1-trifluoropropan-2-ol Chemical compound CC(O)C(F)(F)F GILIYJDBJZWGBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FJQZXCPWAGYPSD-UHFFFAOYSA-N 1,3,4,6-tetrachloro-3a,6a-diphenylimidazo[4,5-d]imidazole-2,5-dione Chemical compound ClN1C(=O)N(Cl)C2(C=3C=CC=CC=3)N(Cl)C(=O)N(Cl)C12C1=CC=CC=C1 FJQZXCPWAGYPSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBUKAOOFKZFCGD-UHFFFAOYSA-N 2,2,3,3-tetrafluoropropan-1-ol Chemical compound OCC(F)(F)C(F)F NBUKAOOFKZFCGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000010624 Medicago sativa Nutrition 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000772415 Neovison vison Species 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 210000001557 animal structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000006177 biological buffer Substances 0.000 description 1
- 108091006004 biotinylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229940036811 bone meal Drugs 0.000 description 1
- 239000002374 bone meal Substances 0.000 description 1
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N butyl alcohol Substances CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000001818 capillary gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000533 capillary isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005081 chemiluminescent agent Substances 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 150000001860 citric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 201000006061 fatal familial insomnia Diseases 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- VBZWSGALLODQNC-UHFFFAOYSA-N hexafluoroacetone Chemical compound FC(F)(F)C(=O)C(F)(F)F VBZWSGALLODQNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000815 hypotonic solution Substances 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 238000003017 in situ immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000026045 iodination Effects 0.000 description 1
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 206010023497 kuru Diseases 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 108010087904 neutravidin Proteins 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N octyl beta-D-glucopyranoside Chemical compound CCCCCCCCO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000011236 particulate material Substances 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229940021222 peritoneal dialysis isotonic solution Drugs 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- HNJBEVLQSNELDL-UHFFFAOYSA-N pyrrolidin-2-one Chemical compound O=C1CCCN1 HNJBEVLQSNELDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002901 radioactive waste Substances 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 235000021067 refined food Nutrition 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M sodium perchlorate Chemical compound [Na+].[O-]Cl(=O)(=O)=O BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910001488 sodium perchlorate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000012799 strong cation exchange Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/962—Prevention or removal of interfering materials or reactants or other treatment to enhance results, e.g. determining or preventing nonspecific binding
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Způsob -a—kit pro extrakci prionového proteinu /£Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká způsobu pro extrakci prionového proteinu z biologického materiálu, jako je například zvířecí tkáň nebo biologická kapalina. Extrakce umožňuje testování přítomnosti abnormálního prionového proteinu, například za účelem diagnostiky přenosných spongiformních encefalopatií.
Dosavadní stav techniky
Prionová onemocnění neboli přenosné spongiformní encefalopatie (TSE) způsobují progresivní degenerativní onemocnění centrálního nervového systému vedoucí ke smrti (Prusiner, Med. Res. Rev. 16: 487, 1996; Weissman, FEBS Letters 289: 3, 1996). Scrapie, TSE u ovcí, byla poprvé popsána před 200 lety (Pattison, Vet. Rec., 123: 661, 1988) a je prototypem tohoto onemocněni. Není známá žádná léčba tohoto onemocnění a nejsou známé žádné testy pro diagnostiku onemocnění u zvířete ante mortem. Prionová onemocněni jsou způsobena konformačními změnami normálního prionového proteinu jedince na abnormální strukturu, která vytváří agregáty. Z důvodu nedávného výskytu hovězí spongiformní encefalopatie v Velké Británii a spojitosti této TSE a nové varianty Crezútzfeld-Jakobovi nemoci (Bruče et al., Nátuře, 389: 498, 1997), lidské TSE, existuje potřeba nových metod, které by byly sensitivní a přesné v diagnostice TSE. Ideálně by měly být tyto diagnostické testy použity pro testování zvířat před tím, než vykazují klinické příznaky a před tím, než zvířata vstoupí do lidského potravního řetězce nebo než jsou použita pro farmaceutické prostředky určené pro použití u člověka.
Většina způsobů používaných pro přípravu a přečištění agens způsobujících TSE obsahuje komplexní sekvenci zpracování enzymy a detergentními činidly a odstředění (Bolton et al., J. Virol., 53: 596, 1985). Abnormální prionový protein je špatně rozpustný v typických biologických pufrech. Jednou metodou pro získání přečištěného abnormálního prionového proteinu je hydrofilní interakční chromatografie (HILIC) (Alpert, J. Chromatogr. 499: 177, 1990), což je opak chromatografie s reverzní fází. Obvykle se zahájí s 70-85% organickým rozpouštědlem a postupně se snižuje gradient organického rozpouštědla. Eluce probíhá v pořadí od nejméně do nejvíce polárních sloučenin. Většina organických mobilních fází HILIC je kompatibilních s proteiny, které se normálně nevyskytují volně ve vodném roztoku, jako jsou membránové proteiny (Jeno et al., Anal. Biochem. 215: 292, 1993), β-amyloidový peptid (143) (Alpert et al., Eighth Symposium of the Protein Society, July 1994, San Diego, CA) a histony (Lindner et al., J. Chromatogr. A. 782: 55, 1997). Surfaktanty a jiná denaturační činidla eluují při téměř prázdném objemu, zatímco proteiny a peptidy jsou obvykle dobře zachovány.
Po HILIC přečištění může být prionový protein detekován imunotestem s kapilární elektroforesou (Schmerr and Jenny, Electrophoresis 19: 409, 1998) nebo kapilárním isoelektrickým isofokusováním (Schmerr et al., J. Chromatograph. Ά. 802: 135, 1998) .
Jak bylo uvedeno výše, současné analytické metody pro detekci abnormálního prionového proteinu se obvykle používají až posmrtně a proto existuje potřeba testu na abnormální prionový protein, který by mohl být použit za života zvířete. Dále je potřeba způsob pro izolaci abnormálního prionového proteinu bez kroků ultracentrifugace, které vyžadují zařízení, které není obvykle přítomno ve veterinárních diagnostických laboratořích. Odstředění vyžaduje přítomnost abnormálního prionového proteinu ve formě agregátů, jejichž velká velikost usnadňuje tvorbu pelet v centrifugačních trubičkách. Takové agregáty se obtížně rozpouštějí a detekují se v dalších krocích. Použití centrifugace také ohrožuje možnost detekce monomerního abnormálního prionového proteinu, což potenciálně snižuje sensitivitu testu. Existuje tedy naléhavá potřeba rychlého, spolehlivého testu, jako je kvalitativní imunotest, pro testování dobytka na infekci ΤΞΕ. Proto existuje v oboru potřeba jednoduché metody pro extrakci abnormálního prionového proteinu.
Dále, protilátky, které byly připraveny, detekují abnormální prionový protein v jeho monomerní formě, s výjimkou protilátky připravené k přirozenému abnormálnímu prionovému proteinu (Korth et al., Nátuře 390: 74, 1997). Proto musí být abnormální prionový protein deagregován silnými detergentními činidly nebo denaturujícími činidly; tato denaturační činidla musí být potom před provedením imunotestu odstraněna. Proto existuje potřeba rychlé, jednoduché metody pro extrakci prionového proteinu bez detergentních nebo denaturačních činidel za účelem analýzy v imunotestu.
Předkládaný vynález poskytuje nový způsob pro extrakci abnormálního prionového proteinu všech velikostí, včetně agregované nebo monomerní formy. Vynález umožňuje testování abnormálního prionového proteinu ve vzorcích od živého zvířete, například za použití imunotestu. Například může být diagnosa provedena ze vzorků krve, což umožňuje testování živých zvířat a usnadňuje odstranění infikovaných zvířat ze stád a brání možné kontaminaci produktů určených pro potraviny.
• · ··
Β · · · · · ···· · • · · « · ·«· •β ·· *·· ·♦· ·· ···
Podstata vynálezu
Vynález poskytuje způsob pro extrakci abnormálního prionového proteinu z biologického materiálu podezřelého z toho, že obsahuje abnormální prionový protein. Způsob zahrnuje inkubaci směsi extrakčního rozpouštědla a isotonického nebo hypotonického vodného přípravku biologického materiálu za podmínek účinných pro extrakci abnormálního prionového proteinu z biologického materiálu do extrakčního rozpouštědla. Extrakční rozpouštědlo je polární organické rozpouštědlo, ve kterém je abnormální prionový protein rozpustný, a je mísitelné s hypotonickým nebo izotonickým vodným roztokem, ale je nemísitelné s lyotropním vodným roztokem. Lyotropní aktivita směsi se zvýší tak, že dojde extrakční rozpouštědlo se separuje jako samostatní fáze od vodného přípravku biologického materiálu, za zisku extrakčního rozpouštědla obsahujícího jakýkoliv abnormální prionový protein z biologického materiálu.
Vynález se dále týká způsobu pro detekci přítomnosti abnormálního prionového proteinu u zvířete, který zahrnuje testování separovaného extrakčního rozpouštědla připraveného výše uvedeným způsobem, na přítomnost abnormálního prionového proteinu.
Vynález také poskytuje kit pro izolování abnormálního prionového proteinu z biologického vzorku. Kit obsahuje extrakční rozpouštědlo, které má charakteristiky uvedené výše, a lyotropní sůl nebo vodný roztok lyotropní soli pro přidání do vodného přípravku biologického vzorku, kde způsobí to, že organické rozpouštědlo se stane nemísitelným s vodným přípravkem, v jiném provedení vynález kit obsahuje detekční • ♦ · 0 0 0 0 · 4·0
I · »»· « · « Φφ
0 0 0 0 0 Φ Φ 0 Φ • · 0 ♦ φ φ000 ·· ·· 000 ·00 0« 000 test na prionový protein, výhodně test na abnormální prionový protein.
Proto je předmětem vynálezu rychlý způsob pro izolaci abnormálního prionového proteinu z biologického vzorku.
Předmětem vynálezu je také způsob pro časnou detekci pro organismy infikované abnormálním prionovým proteinem.
Dalším předmětem vynálezu je technika extrakce v rozpouštědlu pro izolaci abnormálního prionového proteinu z biologického vzorku.
Ještě jiným předmětem vynálezu je zjednodušení analytického testování biologického materiálu od zvířete nebo od člověka na přítomnost abnormálního prionového proteinu.
Ještě jiným předmětem vynálezu je poskytnutí extraktu obsahujícího abnormální prionový protein pro další testování nebo přečištění.
Tyto a další předměty vynálezu jsou podrobněji popsány v podrobném popisu vynálezu a připojených výkresech.
Popis obrázků na připojených výkresech
Obr. 1: Chromatogram z HILIC I- prionového proteinu, jak byl detekován podle radioaktivity (prázdná kolečka) a absorbance při 280 nm (plná čára).
Obr. 2: Vazba protilátky na I-prionový protein frakce HILIC.
♦ ♦ ·· 0 · *0 0*0 40 *0040
Φ Φ ··· 4 0 04
ΦΦ00 Φ *040
ΦΦ ·0 *0* 044 40000
Podrobný popis vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje způsoby pro extrakci abnormálního prionového proteinu z biologického materiálu. Extrahovaný produkt může být testován imunotestem na přítomnost abnormálního prionového proteinu. Tato extrakce abnormálního prionového proteinu, společně s imunotestem, může být použita pro diagnostiku infekce TSE u živých organismů a může být proto použita v celém světě pro testování TSE infekce u zvířat i u člověka. Proto se předkládaný vynález týká testování na prionový protein v klinických a veterinárních laboratořích, které nemají drahé odstředivky, a také umožňuje testování v terénu.
Vodný přípravek biologického materiálu se smísí s extrakcním rozpouštědlem za vzniku směsi. Extrakční rozpouštědlo je polární organické rozpouštědlo, ve kterém je abnormální prionový protein rozpustný, a je misitelné s nonlyotropním izotonickým vodným roztokem, ale je nemísitelné s lyotropním vodným roztokem. V konkrétním provedení je extrakcním rozpouštědlem hexafluor-2-propanol (též hexafluorisopropanol nebo HFIP). Ačkoliv v příkladech uvedených dále jsou objemy extrakčniho pufru a vodného přípravku biologickém materiálu přibližně stejné, může být použit jakýkoliv poměr, který vede k zisku dvou různých fází, jak je popsáno dále.
Ve výhodných provedeních se směs inkubuje při teplotě v rozmezí od přibližně 20 °C do přibližně 100 °C. Nicméně, může být použita jakákoliv teplota, při které jsou jak extrakční rozpouštědlo, tak vodný přípravek biologického materiálu ve vodné fázi, tj. teplota mezi teplotou tuhnutí a teplotou varu.
*9 * V ··« ♦ · · ·· ·· · ♦«« • · ··♦ · · ·φ ····· · · · · ·· • Φ · · · ·«·» ·· ·♦ «·« ··· 99···
Směs extrakční rozpouštělo-biologický materiál se inkubuje za podmínek účinných pro extrakci abnormálního prionového proteinu z biologického materiálu do extrakčního rozpouštědla. Po inkubaci se lyotropní aktivita směsi zvýší tak, že se extrakční rozpouštědlo separuje od vodného přípravku. Extrakční rozpouštědlo obsahující prionový protein se odstraní od vodného přípravku biologického materiálu.
V předkládaném vynálezu může být lyotropní aktivita směsi extrakční rozpouštědlo-vodný přípravek zvýšena přidáním lyotropní soli. S1 může být přidána ve formě pevného materiálu přímo do směsi, nebo může být přidána jako koncentrovaný vodný roztok. Výhodnými příklady lyotropních solí jsou síran sodný a síran amonný. Ve specifických provedeních, popsaných dále, se iontová síla zvýší přidáním přibližně poměru 1:1 (obj./obj.) 0,5 M síranu sodného do směsi.
Vynález je zejména výhodný proto, že nevyžaduje získání jakéhokoliv materiálu z biopsie nebo pitvy. V předkládaném vynálezu může být biologickým materiálem vzorek od živého zvířete. Způsob podle předkládaného vynálezu umožňuje extrakci abnormálního prionového proteinu z biologické kapaliny nebo orgánové biopsie pro analytické testování. Alternativně může být biologický materiál získán z biopsie nebo pitevního materiálu, například z produktu ze zvířete, který má být použit v potravě, farmacii, kosmetice nebo jiném oboru a který je určen pro použití člověkem nebo jiným zvířetem. V dalším provedení může být způsob podle předkládaného vynálezu použit pro odstranění prionového proteinu z takových materiálu pro zajištění toho, že infekční priony nebudou přeneseny.
Způsob extrakce podle předkládaného vynálezu může být
| ·· • • · | ·· • | • • * • | » M * | 9 · « fl • · | • ·· • |
| • · | • · | • | V | • · | • |
| ♦ · | ·· | ··· | • · | «·· |
použit jak pro extrakci normálního prionového proteinu, tak pro extrakci abnormálního prionového proteinu. Předběžným zpracováním biologického vzorku proteinasou-K může být normální prionový protein tráven. Proto, je-li požadován pouze abnormální prionový protein, tak může být vodný přípravek biologického materiálu předem zpracován proteinasou-K před smísením s extrakčním rozpouštědlem.
Extrakční roztok obsahující jakýkoliv prionový protein může být sušen za zisku extrakční pelety. Prionový protein v roztoku nebo extrakční peletě může být dále přečištěn, například chromatografií s hydrofilní interakcí.
Abnormální prionový protein u zvířete může být detekován testováním materiálu v separované extrakční peletě na jeho přítomnost. Výhodně je testovacím způsobem imunotest na abnormální prionový protein. Vzorek může být zpracován proteinasou-K před izolací prionového proteinu tak, že není izolován žádný normální prionový protein.
V jiném aspektu vynález poskytuje kity pro izolování abnormálního prionového proteinu z biologického vzorku. V jednom provedeni obsahuje kit extrakční rozpouštědlo, například hexafluor-2-propanol. Kit dále obsahuje lyotropní sůl nebo vodný roztok lyotropní soli, který se přidává do vodného přípravku biologického vzorku proto, aby se extrakční rozpouštědlo stalo nemísitelným s vodným přípravkem.
Vynález dále poskytuje kit pro detekci přítomnosti abnormálního prionového proteinu v biologickém vzorku. Kromě složek popsaných výše obsahuje detekční kit také detekční test pro detekci abnormálního prionového proteinu. Výhodným detekčním testem na přítomnost abnormálního prionového • · · ·« ·Φ φ a · • · · ·· φ · · * • ♦ · · · φφφ ·· ·♦ φφφ φ·· φφ φ«φ proteinu je imunotest.
Ačkoliv byly tato extrakční metoda a kit vyvinuty primárně pro diagnostiku scrapie (TSE u ovcí), jsou použitelné pro diagnostiku jiných TSE u jiných obratlovců, zejména u savců a ptáků, jako jsou lidé, skot, prasata, losi, jeleni, drůbež a hlodavci. Abnormální prionový protein může být detekován ve tkáních zvířat a člověka již dva týdny po infekci. Významnou aplikací způsobu podle předkládaného vynálezu je detekce abnormálního prionového proteinu v lidské krvi. Tato technika může být také použita pro abnormálního prionového proteinu z materiálu používanému pro výrobu farmaceutických nebo jiných výrobků určených pro použití u člověka, včetně potravinových doplňků.
Termín přibližně, jak je zde použit, znamená v rozmezí 20%, lépe v rozmezí 10% a nejlépe v rozmezí 5% od dané hodnoty nebo rozsahu.
Biologické materiály
Předkládaný vynález se týká extrakce prionového proteinu z biologického materiálu. Obecně, prionové proteiny se vyskytují u obratlovců, jak bylo popsáno výše. Proto je za většiny okolností biologický materiál od zvířete nebo od člověka. Prionový protein může být také produkován během fermentačního procesu eukaryotickými buňkami. Může být exprimován jako rekombinantní prionový protein. Velmi významná je možnost současné exprese endogenního prionového proteinu buňkami, které byly rekombinantně modifikovány tak, aby exprimovaly jiný protein. Tato možnost je pravděpodobnější tehdy, když jsou buňky neurálního původu, jako jsou PC12 buňky. V tomto případě může být biologický materiál produkt ♦ · 9# · ·Φ· • · · ·♦ ·· · ·· • Φ *·· · · ·« • · ♦ · · · φ · φ ·· ·· ΦΦΦ ♦·· ΦΦ ΦΦΦ fermentace, například rekombinantní protein.
Příklady biologických materiálů od zvířat zahrnují, například, tkáně, jako je mozek, sval (včetně srdečního svalu), játra, appendix, slinivka břišní, orgány gastrointestinálniho traktu, kůže a lymfatická tkáň, jako je thymus, slezina, mandle, lymfatické uzliny a podobně. Alternativně může být biologickým materiálem biologická kapalina. Termín biologická kapalina zahrnuje mozkomišní mok, krev, sérum, plasmu, mléko, moč, sliny, slzy, hlenové sekrety, pot, semeno a tělní kapaliny obsahující tyto složky. Také tento termín zahrnuje kultivační kapaliny (nebo kultivační media) použitá pro produkci rekombinantních proteinů nebo obsahující buňky v suspenzi před transplantací. Termín biologické materiály také zahrnuje výrobky vyrobené ze zvířecích orgánů nebo tkání, včetně sérových proteinů (jako je albumin a imunoglobulin), hormonů, potravy a zpracovaných potravinových výrobků, potravinových doplňků, kostní moučky, potravy pro zvířata, proteinů extracelulární matrice, želatiny, a jiných živočišných vedlejších produktů používaných ve výrobě nebo v konečných výrobcích.
Když je biologickým materiálem pevná tkáň nebo produkt, musí být nejprve rozpuštěn nebo suspendován ve vodném roztoku tak, aby byl vhodný pro proces extrakce. Například, mozková tkáň musí být suspendována v roztoku sacharosy (například 0,32 M sacharose) v 10% (hmot./obj.). Mezi jiné hypotonické nebo izotonické roztoky patří 5% dextrosa, fosfátem pufrovaný salinický roztok, tri-pufrovaný salinický roztok, HEPESpufrovaný salinický roztok nebo jakýkoliv z výše uvedených pufrů. Biologický materiál ve vodném roztoku může být také rozemlet, homogenizován nebo jinak rozrušen pro maximalizaci kontaktu mezi extrakčním rozpouštědlem a biologickým
| «0 | • 0 | *0 0· 0 | ||||
| • | • | 4« | • · | • 0 | 0« | |
| • | • | 0·· | 0 | « « | ||
| • | ||||||
| A | * | 0 0 | 0 | 0 | • 0 | |
| a· | 0« | • 00 | •0 | 00 |
materiálem. Nicméně, pokud je biologickou kapalinou biologický materiál, tak nemusí být přidání kapaliny nutné, pokud není nutné pro naředění iontové síly biologické kapaliny pro umožnění mísitelnosti extrakčního rozpouštědla.
Prionový protein
Termín prionový protein, jak je zde použit, označuje přirozený protein exprimovaný v nervové tkáni, zejména v mozku, a nižších koncentracích také v lymfatické tkáni a ve všech ostatních tkáních. Za některých okolností přijímá prionový protein patogenní konformaci a potom se označuje jako abnormální prionový protein. Některé mutace prionového genu u některých jedinců patrně predisponují prionový protein pro přijímání patogenní konformace. Expozice organismu přenosnému infekčnímu činidlu, prionu, může také indukovat konformační změnu vedoucí k patologii.
Abnormální prionový protein je mnohem méně citlivý na proteolýzu než normální prionový protein. Zpracování biologického materiálu proteinasou, zejména proteinasou-K, tráví normální prionový protein, ale ne abnormální prionový protein.
Ve specifických případech uvedených dále je ovčí abnormální prionový protein (PrPsc) extrahován způsobem podle předkládaného vynálezu. Nicméně, jiné prionové proteiny z jiných druhů, zejména těch, které byly uvedeny výše, mohou být také extrahovány způsobem podle předkládaného vynálezu.
Do kategorie abnormálních prionových proteinů patři lidské prionové proteiny nacházené při neurodegenerativních onemocněních jako je Kuru, Creutzfeld-Jakobova nemoc (CJD),
| 99 | 99 | 9 | 99 « | ||||
| • | 9 | 9 | 9 9 | • 9 | • | 9 | 9« |
| • | 9 | 9 99 | 9 | 9 | 9 | 9 | * |
| ♦ | |||||||
| 9 | • • 9 | « 9 99 | 9 999 | • 99« | 9 99 | 9 | • 9 9« |
Gerstmann-Strausslerův syndrom (GSS) a fatální familiární insomnie. Některé případy CJD a GSS jsou asociovány se známými mutacemi prionového genu. CJD je také asociována s expozicí TSE. Například, jak bylo uvedeno výše, je CJD asociována s hovězí spongiformní encefalopatií. Předkládaný vynález poprvé umožňuje extrakci abnormálního prionového proteinu od pacienta před pitvou. Detekce extrahovaného abnormálního prionového proteinu může být použita pro diagnostiku kteréhokoliv z těchto onemocnění.
Scrapie (u ovcí, koz) a hovězí spongiformní encefalopatie (krávy) jsou onemocnění spojená s abnormálním prionovým proteinem u zvířat. Prionové proteiny byly také izolovány u kuřat, norků, prasat, myší, křečků a morčat. Dále, u myší, křečků a morčat se může vyvinout spongiformní encefalopatie po expozici prionům od člověka nebo z jiného zdroje. Prionový protein z jakéhokoliv z těchto zdrojů může být detekován nebo extrahován způsobem podle předkládaného vynálezu.
Extrakční rozpouštědlo a podmínky
Extrakční rozpouštědlo pro použití v předkládaném vynálezu musí být separovatelné jako samostatná fáze od vody nebo vodného roztoku za lyotropních podmínek. Zároveň musi být prionový protein rozpustný v extrakčním rozpouštědle. Některá polární organická rozpouštědla splňují tato kriteria. Výhodným polárním organickým rozpouštědlem je hexafluor-2-propanol. Dalšími použitelnými rozpouštědly jsou isopropanol; 1,1,1trifluor-2-propanol (TFIP); 2,2,3,3-tetrafluor-l-propanol (tetFIP); perfluor-t-butylalkohol (PFtBA); 1,1,1,3,3,3hexafluoraceton (HFA) ; kyselina trifluoroctová (TFA); 2,2,2trifluor-l-ethanol (TFE); 2,2,3,3,4,4,4-heptafluor-2-propanol (HFB); 1,1,1,3,3,4,4,4-oktafluor-2-butanol ((OFIB); 1-methyl13 *«·4 « ·· « ···· • · · ·φ « · ·· ···· • · ♦» * • É ·· 4 »·· • · · ♦φ « · · ·» Φ
Φ Φ Φ 4Φ ··· ««· »φ ·4«
2-pyrrolidinon (ΝΜΡ); viz Wille et al., J. Mol. Biol. 259: 608, 1996. Dalšími rozpouštědly, která mohou být vyzkoušena, jsou DMSO; tetrahydrofuran a podobně. Alternativně může být použito rozpouštědlo, které není mísitelné s vodou, ale ve kterém je prionový protein rozpustný.
Ve specifických provedeních je rozpouštědlo mísitelné s vodou, například při fyziologické iontové síle (v izotonickém vodném roztoku) nebo při nižší než fyziologické iontové sile (v hypotonickém vodném roztoku). Nicméně, když pufr obsahuje lyotropní soli v koncentraci (nebo iontové síle) vyšší než je prahová hodnota, tak není extrakční rozpouštědlo rozpustné ve vodném roztoku: dvě fáze se separují do vrstvy extrakčního rozpouštědla a vodné vrstvy. Toto se zde označuje jako lyotropní podmínky. Hodnota iontové síly lyotropní soli ve vodném roztoku, která způsobuje lyotropní podmínky, se liší podle použitého extrakčního rozpouštědla a použité soli, tato hodnota může být snadno určena titraci nebo jinou systematickou změnou koncentrace lyotropní soli, za testování mísitelnosti nebo nemísitelnosti extrakčního rozpouštědla s vodným roztokem. Vodný roztok s iontovou sílou lyotropní soli, při které se extrakční rozpouštědlo separuje od vody, se označuje jako lyotropní vodný roztok. Vodné roztoky obsahující nižší koncentrace lyotropních solí nebo fyziologických soli, jako jsou izotonické pufry, se považují za non-lyotropní roztoky.
Obvykle se v procesu extrakce rozpouštědlem použiji přibližně stejné objemy extrakčního rozpouštědla a vodného přípravku biologického materiálu. Nicméně, poměr extrakčního rozpouštědla ku vodnému přípravku může být v rozmezí od přibližně 5:1 do přibližně 1:5, lépe od přibližně 3:1 do přibližně 1:3.
| 4Φ | |||
| • | ♦ | v | ·· |
| * · | ··· | ||
| • | • | « · · | |
| • | • V | ||
| 4 · |
«9 *
| * | « | ||
| • · | ·· | ||
| * | • | • | • |
| • · | • | • | |
| • | • | • | • |
| ve | IH | ·«· |
Po smísení extrakčního rozpouštědla s vodným přípravkem může být směs inkubována po určitou dobu a při určité teplotě pro zlepšení extrakce prionového proteinu do extrakčního pufru. Inkubační čas může být různý od 1 minuty do hodin a může být určen analýzou extrahovaného materiálu na přítomnost prionového proteinu. Poté, co dosáhne závislost množství prionového proteinu v extrakčním materiálu na čase fáze plató, což se určí pomocí chromatografie nebo imunotestů, nebo obou, jak je popsáno v příkladech, nemá další inkubace vliv na výtěžek prionového proteinu. Ve specifických provedeních je inkubační doba 5 minut.
Dále, teplota inkubace může být upravena pro zvýšení účinnosti extrakce, pod podmínkou, že při dané teplotě jsou jak extrakční rozpouštědlo, tak vodný roztok v kapalném stavu. Vyšší teploty, t.j. teploty vyšší než teplota místnosti, jsou výhodné, protože zvyšují rozpustnost prionového proteinu v extrakčním rozpouštědle. Zejména výhodné jsou teploty v rozmezí přibližně 50-60 °C. Stejně jako jiné proměnné, jako je iontová síla vodného přípravku a doba inkubace, může být optimální teplota určena běžnými pokusy a testováním.
Separace fází
Různé lyotropní soli mohou být použity pro zvýšení iontové síly vodného roztoku, což indukuje separaci fází. Výhodnými solemi jsou síran sodný a síran amonný, které jsou lyotropní. Obě se použijí v koncentracích nižších, než jsou koncentrace, které srážejí proteiny. Například, v konkrétním provedení se 0,5 M roztok síranu sodného přidá ke stejnému objemu směsi extrakční rozpouštědlo/vodný přípravek což vede ke konečné koncentraci síranu sodného 0,25 M. Tato koncentrace je
| • 9 « 9 9 9 | ·· 9 | 9 9 9 • | 9 9 * 9 | ·· 9 · 9 9 | • 9 |
| 9 9 | 9 9 | 9 | 9 | 9 9 | |
| ·· | 99 | ♦ •9 | f 9* | 9 9 | 9 9 |
dostatečná pro indukci separace fází HFIP a vody. Mohou být použity I jiné soli, s podmínkou, že mohou dosáhnout požadované lyotropní aktivity v koncentraci, při které jsou rozpustné. Termín lyotropní aktivita, jak je zde použit, označuje schopnost lyotropního solného roztoku vytvářet struktury.Lyotropní aktivita je dosažena dosažením koncentrace lyotropní soli dostatečné pro indukci separace fází mezi organickou a vodnou fází. Vyloučeny jsou koncentrace lyotropní soli způsobující srážení proteinů.
lyotropní nebo struktury-vytvářející soli, též známé jako kosmotropy, navozují uspořádání vodného roztoku, za vyloučení organických rozpuštěných látek. Pokud je organickou rozpuštěnou látkou extrakční rozpouštědlo, dojde k separaci fází. Pokud je organickou rozpuštěnou látkou protein, dojde k vysolení proteinu z roztoku, mezi dobré soli vytvářející struktury patří síran sodný a amonný, fosfáty, citráty atd. (Washabaugh and Collins, J. Biol. Chem. 261: 12477, 1986). (Mezi soli rozrušující strukturu, neboli chaotropy, patří guanidiniumhydrochlorid, chloristan sodný, bromid sodný atd. tyto mají opačný účinek; způsobují sloučení organických solutů s vodnými roztoky). Iontová síla vodného roztoku je funkcí celkového počtu iontů v roztoku, bez ohledu na to, zda se jedná o ionty vytvářející strukturu nebo o ionty rozrušující struktury. Termín iontová síla se týká koncentrace solí.
Jak bylo uvedeno výše, lyotropní sůl může být přidána ve formě pevné látky nebo ve formě koncentrované kapaliny, s podmínkou, že konečná koncentrace lyotropní soli je účinná pro indukci separace fází. Výhodně je konečný poměr extrakčního rozpouštědla k vodné fázi (která obsahuje vodný přípravek biologického materiálu a jakýkoliv roztok soli) po zvýšení lyotropní aktivity směsi přibližně 1:10 až přibližně 10:1 (výhodně (jak je uvedeno dále) přibližně 1:3 až přibližně 3:1, s podmínkou, že při nižším poměru extrakčního rozpouštědla k vodné fázi je konečná koncentrace soli stále ještě dosti vysoká pro indukci separace fází.
Po zvýšení lyotropní aktivity se extrakční rozpouštědlo, které nyní obsahuje jakýkoliv prionový protein, který byl přítomen v biologickém materiálu, separuje od vodného přípravku. Separace probíhá během několika minut a je dokončena tehdy, když jsou obě fáze čiré a je mezi nimi patrná diskrétní separace. Po úplné separaci dvou fázi může být extrakční rozpouštědlo, nyní obsahující jakýkoliv prionový protein, odebráno, například odsátím pipetou nebo injekční stříkačkou, nebo pomocí separační baňky.
Extrakční rozpouštědlo obsahující jakýkoliv prionový protein (zde označované jako extrakt) může být sušeno, například odpařením, lyofilizací nebo vakuovým odstředěním, za zisku vysoce koncentrovaného nebo suchého extraktu. Extrakt může obsahovat další složky, včetně buněčných lipidů, proteinů navázaných na lipidovou membránu a jiných hydrofobnějších buněčných složek. Pokud je to žádoucí, může být prionový protein izolován nebo přečištěn od těchto složek, například chromatografií s hydrofilní interakcí, jak je popsána dále, nebo jinými chromatografickými technikami (kationtovou výměnou chromatografií, gelovou chromatografií, chromatografií s reverzní fází a afinitní chromatografií, například na protilátkové koloně).
Alternativně může být koncentrovaný nebo sušený extrahovaný materiál analyzován přímo, jak je popsáno dále, na přítomnost prionového proteinu.
• · · · * · · 9 · ·· ·· ··· «·« ·♦ ·««
Detektor prionového proteinu; imunotesty
Různé detekční testy na prionové proteiny, včetně testu pro selektivní detekci abnormálních prionových proteinů, jsou známé v oboru jako účinný nástroj pro detekci prionového proteinu. Bylo ověřeno, že kapilární gelová elektroforesa je účinný analytický nástroj pro detekci abnormálního prionového proteinu (Schmerr and Jenny, Electrophoresis 19: 409, 1998). Výhodnou metodou je imunotest, například imunotest popsaný ve Schmerr and Jenny, výše. Antisérum popsané v tomto odkazu je specifické pro abnormální prionový protein, protože bylo zjistino, že reaguje ve westernovém poenosu s mozky infikovanými scrapie, ale ne s normálními mozky. Jiná antiséra reaktivní s prionovými proteiny jsou dobce známá v oboru. Výhodným ímunotestem je ELISA test (napdíklad Grathwohl et al., J. Virol. Methods, 64: 205, 1997).
Tak je v nikterých případech detekce přítomnosti prionového proteinu, zejména abnormálního prionového proteinu, založena na biofyzikálních a chemických charakteristikách prionového proteinu. Mezi tyto charakteristiky patří resistence na proteinasy (zejména na proteinasu K) a profil trávení (proteolytickými enzymy, glukolytickými enzymy, chemickými ěinidly, teplem, denaturačními činidly atd.). Mohou být hodnoceny efekty takových zpracování na zřetelnou molekulovou hmotnost a izoelektrický bod a různé vazebné testy. Resistence na proteinasy a profil trávení mohou být detekovány chromatografií, gelovou elektroforesou a jinými technikami citlivými na molekulovou hmotnost. Izoelektrický bod může být měřen pomocí kapilárního isoelektrického fokusování (IEF) nebo gelového isoelektrického fokusování, ačkoliv kapilární IEF může měřit pl prionu 3-krát lépe než všechny gely. Dále, kvalitativní stanovení celkového náboje (kyselosti nebo
| • * | « • | »·· | » a a • | • • · • | ta a • | « v | • a | |
| * | • | • · | • | • | * | • | ||
| a | • a » | • a | 4 4 |
zásaditosti) může být určeno iontovou výměnou chromatografií. Další biofyzikální techniky známé v oboru mohou být také použity pro identifikaci prionového proteinu.
Příklady testů pro detekci prionového proteinu zahrnují testy pro stanoveni zřetelné molekulové hmotnosti a izoelektrického bodu proteinu, včetně takových stanovení po zpracování teplem, štěpení bromkyanem, zpracování neuraminidasou atd. (Bolton et al., J. Virol. 53: 596, 1985); zpracováni glykosidasou a vazbou lektinu (Somerville and Ritchie, J. Gen. Virol. 71: 883, 1990); stanovení resistence na proteinasu-K (Race te al., Am. J. Vet. Res. 53: 883, 1992); a imunotesty (Farquhar et al., J. Virol. Methods, 24: 215, 1989).
Alternativně, sekvencování nebo mikrosekvencování extrahovaného - a výhodně přečištěného - prionového proteinu umožňuje jednoznačné potvrzení jeho identity.
Imunotesty na prionový protein mohou být provedeny za použití technik známých v oboru, jako je například radioimunotestr ELISA (enzymový imunosorbentní test), sandwichové imunotesty, imunoradiometrické testy, srážení a difuse v gelech, imunodifusní testy, imunotesty in šitu (za použití koloidního zlata, enzymových nebo radioizotopových značkovacích činidel), westernový přenos, srážecí reakce, aglutinační testy (například gelové aglutinační testy, hemaglutinační testy), komplement-fixační testy, imunofluorescenční testy, testy s proteinem A nebo s proteinem G, imunoelektroforetické testy, měření jejich koncentrací ve vhodných fyziologických vzorcích, atd. V jednom provedení je vazba protilátky detekována detekcí značkovacího činidla na primární protilátce. V jiném provedení je primární protilátka
| • 4 | «4 | 4 | } | 04 | ||
| • · | • | • 4 | • 4 | 4 | 0 | 44 |
| • 0 | • ·· | 4 | • | • | • | |
| ♦ 4 | 4 4 | 4 | 4 | • | 0 | |
| 4· | 44 | 4·· | «04 | ♦ * | 40 |
detekována detekcí vazby sekundární protilátky nebo činidla na primární protilátku.
Extrakční metoda podle předkládaného vynálezu poskytuje levný zdroj prionového proteinu, který může být použit pro přípravu dalších protilátek. Dále, protože se extrakční podmínky podle předkládaného vynálezu značně liší od běžných extrakčních podmínek, může mít prionový protein extrahovaný způsobem podle předkládaného vynálezu jinou konformaci a může vyvolávat tvorbu jiné populace protilátek, když je použit pro imunizaci.
Způsob podle předkládaného vynálezu zkracuje extrakční dobu na 1 až 2 hodiny. Dále, vzhledem ke své jednoduchosti může být způsob automatizován. Způsob extrahuje prionové proteiny všech molekulových velikostí, takže není omezen. Také solubilizuje abnormální prionový protein tak, že většina imunotestů může být použita pro jeho detekci. Dále, není nevýznamné, že snižuje infekčnost abnormálního prionového proteinu, což činí proces bezpečnějším.
Kity
Složky pro provedení předkládaného vynálezu mohou být výhodně dodávány ve formě křtu. V nej jednodušším provedení obsahuje kit podle předkládaného vynálezu extrakční rozpouštědlo, výhodně HFIP, a lyotropní sůl (nebo koncentrovaný roztok lyotropní soli) pro zvýšení lyotropní aktivity směsi extrakční rozpouštědlo-vodný přípravek. Množství každé složky může být předem odměřeno pro konkrétní počet testů. V dalším provedení kit obsahuje kontainer pro vzorek, výhodně z plastu nebo materiálu zpracovaného pro vyloučení nespecifické vazby prionového proteinu.
* 1·* · ··
I · · ·· • * 0· * «·Φ· 0
Termín zásobník, jak je zde použit, má nejširší význam, t.j, jedná se o jakékoliv zařízení pro uchovávání materiálu nebo činidla. Může být vyroben ze skla, plastu, keramiky, kovu nebo jiného materiálu obvykle používaného pro uchovávání činidel. Nicméně, jakýkoliv materiál nesmí být reaktivní s obsahem, který v něm má být přechováván.
Kit může také obsahovat proteinasu-K pro trávení normálního prionového proteinu v biologickém vzorku.
V dalším provedení obsahuje kit zásobník pro vzorek s ukazatelem objemu pro vodný přípravek biologického vzorku. V tomto provedení jsou polární organické rozpouštědlo a lyotropní sůl optimálně dodány v předem odměřených jednotkách určených pro použití se zásobníkem pro vzorky. Přípravek biologického vzorku může být vložen do zásobníku pro vzorky. Potom se přidá předem odměřená jednotka extrakčniho rozpouštědla a provede se smísení. Potom se přidá předem odměřená jednotka lyotropní soli pro indukci separace fází extrakčniho rozpouštědla a vody.V ještě dalším provedení kit obsahuje proteinasu-K pro zpracování vodného přípravku biologického vzorku, výhodně v předem odměřené jednotce.
Kit pro extrakci prionového proteinu ze vzorku tkáně může obsahovat ředící pufr, jako je 0,32 M roztok sacharosy nebo fosfátem pufrovaného salinického roztoku, pro homogenizaci tkáně pro přípravu vodného přípravku biologického materiálu.
V dalším provedení, ve kterém je kitem kit pro detekci přítomnosti abnormálního prionového proteinu v biologickém materiálu nebo vzorku, obsahuje kit detektor nebo test pro detekci přítomnosti abnormálního prionového proteinu, jak je «V ·* ·»« ·«» ·· * 0« · 0 _ „ 0 0 * 0· 0 00 0 »····♦··*♦
9000 0 000 • 0 00 ·· · 009 ··· popsán výše. Imunotesty, jak jsou popsány výše, jsou výhodné pro detekci abnormálního prionového proteinu extrahovaného způsobem podle předkládaného vynálezu.
V ještě dalším provedení kit obsahuje imunochromatografickou membránu nebo nosič. Extrakční rozpouštědlo obsahující jakýkoliv prionový protein může být aplikováno na nosič přímo, nebo může být aplikován sušený extrakt, například po resolubilizaci. Za vhodných podmínek může prionový protein procházet přes nosič. Může být zachycen, například imobilizovanou anti-prionovou protilátkou, a imobilizovaný prionový protein může být detekován. Mnoho metod a prostředků pro imunochromatografické testy může být použito v předkládaném vynálezu. Imunochromatografické testy jsou zejména vhodné pro použití v terénu, kde není laboratorní vybavení. Příklady takových testů jsou uvedeny v US patentech č. 5248619, 5451504, 5500375, 5624809 a 5658801.
Kit podle předkládaného vynálezu výhodně obsahuje návod pro jeho použití, například příbalový leták.
Předkládaný vynález může být lépe pochopen podle následujících příklad, které nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu.
Příklady provedeni vynálezu
Příklad 1: Analýza abnormálního prionového proteinu extrahovaného z mozků a lymfatických uzlin infikovaných ovcí
Mozky a lymfatické uzliny od dvou ovcí infikovaných scrapie se homogenizovaly v 10% sarkosylu a zpracovaly se proteinasou22
| • 0 | 0» | 0 | • | 00 | |||
| • 0 | • | · | • 0 | • | 0 | • · | |
| • | • | • 00 | 0 | Φ | • | 0 | |
| • | • | * 0 · | * | 0 | 0 0 | 0 | |
| * | • | 0 Φ | • | Φ | 0 | 0 | |
| ·· | • 0 « | • ΦΦ | 00 | « 0 |
K pro trávení normálního prionového proteinu, ale ne abnormální formy prionového proteinu. Stejné objemy (0,5 mM) homogenátu a HFIP se smísily a provedla se inkubace po dobu 5 minut při teplotě 56 °C. Do této směsi se přidalo 0,5 mM 0,5 M NazSOí a směs se inkubovala po dobu dalších 5 minut. Za těchto podmínek se HFIP vrstva separovala od vodné vrstvy. HFIP vrstva se odebrala a sušila se na odstředivce. Sušené vzorky se resuspendovaly ve 25 μΐ destilované vody a smísily se. 10 μΐ vzorku se potom smísilo s 5 μΐ 20% SDS pufru a směs se vařila po dobu 5 minut při teplotě 100 °C.
Analýza westernovým přenosem se provedla na 10%-15% gradientovém polyakrylamidovém gelu. Protein se přenesl z polyakrylamidového gelu na nitrocelulosu za standardních podmínek. Nitrocelulosa se blokovala inkubací s roztokem 5% rybí želatiny a promyla se Tris-Tween pufrem. Nitrocelulosa se inkubovala přes noc s králičím anti-prionovým proteinem (protilátka proti celému prionu naředěná 1:2500; Kascak et al., Immunol. Invest. 26: 259, 1997; viz též Miller et al., J. Vet. Diagn. Invest. 5: 309; Kascak et al., J. Virol. 59: 676, 1986). Po inkubaci s anti-prionovou protilátkou se nitrocelulosa promyla Tris-Tween a potom reagovala s konjugátem anti-králičí IgG-HRP (křenová peroxidasa) a inkubovala se po dobu 1 hodiny. Nitrocelulosa se potom důkladně promyla a reagovala s chemiluminiscentním činidlem (Pierce UltraSuperSignal®) . Peroxidasová aktivita se detekovala pomocí chemiluminiscenčního detektoru (ChemiImager-4000; Alpha, Innotech).
Extrakty od obou ovcí infikovaných scrapie obsahující 2,75 μΐ materiálu produkovaly proužky ukazující na přítomnost abnormálního prionového proteinu jak pro mozkovou tkáň, tak pro tkáň lymfatických uzlin. Extrakt mozkové tkáně obsahující
| • | • | ·· | • | ||||
| • * | * | • · | ·· | • | • | ||
| • | • | • ·* | * | * | k | ||
| • | • · · | • | • | ||||
| • · | « * | • | • | • | |||
| ·· | • ♦4 | f ·· | f · | ·· |
1,5 μΐ materiálu od jedné z ovcí infikovaných scrapie také produkoval proužek ukazující na přítomnost abnormálního prionového proteinu. Westernový přenos podobných extraktů od normální (neinfikované) ovce neprodukoval žádný proužek ukazující na přítomnost abnormálního prionového proteinu.
Příklad 2: Analýza abnormálního prionového proteinu extrahovaného a přečištěného z mozků a lymfatických uzlin infikovaných ovcí
Tento příklad ukazuje další přečištění a analýzu abnormálního (scrapie) prionového proteinu (PrPsc) za použití chromatografie s hydrofilní interakcí (HILIC). Vzorky tkáně z ovčích mozků a lymfatických uzlin byly zpracovány detergentním činidlem a proteinasou-K stejně jako v předešlém příkladu. Získané extrakty se aplikovaly na HILIC kolonu a eluovaly se klesajícím gradientem acetonitrilu v 0,1% kyselině trifluoroctové a 50 mM hexafluor-2-propanolu. Zisk z kolony byl přibližně 75%, jak bylo zjištěno pomocí radioaktivním jodem značeného prionového proteinu. Po sušení byly odebrané píkové frakce resuspendovány ve vodě a testovány pomocí protilátek specifických pro prionový protein. Způsob umožňuje účinné přečištění prionového proteinu, stejně jako testování imunotestem, protože nevyužívá interferujících detergentních činidel.
Příklad 3: Analýza abnormálního prionového proteinu extrahovaného z mozku infikovaných ovcí
Příprava materiálu ovčího mozku:
Mozky ovcí infikovaných scrapie byly získány od ovcí, které byly pozitivní na abnormální prion podle westernová přenosu
| ·· | • fc | fc | fc | ·· | |
| v · | B | • B | • fc | • · | • · |
| • · | B·· | • | B | • fc | |
| • fc | b e · | fc | fc | • fc · | |
| • fc | • · | fc | • | fc * | |
| • · | ·· | · · | • •b | ·· | « · |
(Race te al., Am. J. Vet. Res. 53: 883, 1992). Soubor byl připraven ze 3 pozitivních mozků. Stejný soubor byl použit pro všechny uvedené pokusy. Normální mozky byly od ovcí ze stád bez scrapie a byly negativní na abnormální prionový protein podle westernového přenosu. Mozky byly připraveny pro chromatografií modifikací metody podle Bolton et al·., J. Virol. 53: 596, 1985. Stručně, mozkové kmeny byly odebrány, zváženy a vloženy do 0,32 M sacharosy (10% hmot./obj.). Materiál se potom homogenizoval po dobu 60 sekund na Brinkman Polytron (Kinmatica AG, Lucerne Switzerland) za použití 0,7 cm generátoru z nerezové oceli při nejvyšší rychlosti. Homogenát se odstředil při 10000 g po dobu 20 minut pro odstranění částeček materiálu a získaný kapalný supernatant se odstředil při 230000 g po dobu 1 hodiny. Tato peleta se potom zpracovala sérií výplachů a ultracentrifugací, jak byly popsány výše. Vzorek se potom zpracoval 10 mM Tris pH 7,4 obsahujícím 10% lauryl síran sodný a proteinasu K (50 μg/ml). Po poslední ultracentrifugací se vzorek resuspendoval v 10 mM Tris, pH 7,4 (200 μg/ml počátečního vzorku mozku).
Chromatografie s hydrofilní interakcí (HILIC)
Vzorek se solubilizoval v 0,01 M Tris Hel, pH 8,0 obsahujícím 2 mM EDTA, 5% SDS a 10% hexafluor-2-propanol při 100 °C po dobu 10 minut. Po zpracování SDS se vzorek vnesl do rozpouštědla skládajícího se ze 100% acetonitrilu obsahujícího 0,1% kyselinu trifluoroctovou a 50 mM hexafluor-2-propanolu (pufr A) a aplikoval se do hydrofilní interakční kolony. Všechny použité kolony byly od PolyLC, lne. (Columbia, MD, USA) a měly rozměry 200 x 4,6 mm; 5 μιη; 300-A. Použily se tři náplně, PolyWAX LP™ (aniontový iontoměničový materiál), PolyHYDROXYETHYL A™ {neutrální materiál) a PolySULFOETHYL A™ (silný kationtový iontoměničový materiál) (všechny tři o • · ··Β· • ·*
Β ·Β«·
Β ·« • *Β ♦ *·♦·
| * | Bt | ||
| • | Β · * B | ·· | |
| B | a » B | ||
| B | B · | ||
| • a | B·· | ·· | a · |
obchodní známky jsou vlastnictvím PolyLC, lne.). Průtok byl 0,5 ml/min. Podmínky pro eluci PrPsc byly 100% A po dobu 3 minut a potom lineární gradient do 100% vody obsahující 0,1% kyselinu trifluoroctovou a 50 mM hexafluor-2-propanol {pufr B) v 15 minutách, a potom 100% B po dobu 10 minut. Píkové frakce se odebraly a sušily se ve vakuové odstředivce (Savant Instruments, lne., Farmingdale, NY, USA). Frakce se resuspendovaly v 10 μΐ deionizované H2O a frakce pozitivní v imunopřenosu na PrPsc se použily v kapilární elektroforese.
125
Značení prionového proteinu I
PrPsc se značil 125I za použití IODOGEN™ (Pierce, Rocford,
125
IL, USA). Značený protein se separoval od volného I zpracováním na náplni pro extrakci na pevné fázi obsahující PolyWAX™ (PolyLC, lne.), která byla uvedena do rovnováhy pufrem A. Značený PrP se eluoval pomocí pufru B. nenavázaný 125I zůstal zachycen v náplni a mohl být dodstraněn jako pevný sc radioaktivní odpad. Frakce obsahující značený PrP se sušily ve vakuové odstředivce, rozpustily se ve vodě, naředily se 1/10 v pufru A a vnesly se HPLC kolony.
Hybridizace na skvrnách μΐ podíly píkových frakcí z HILIC chromatografie se aplikovaly na nitrocelulosový papír, sušily se a potom se inkubovaly v 20 mM Tris, pH 7,5, obsahujícím 500 mM NaCl, 0,05% Tween 20 (TTBS) a 5% rybí želatinu po dobu 1 hodiny. Skvrny se potom prorayly 2x TTBS a potom se inkubovaly s ředěním 1/500 protilátek připravených proti peptidům prionového proteinu po dobu 3 hodin při teplotě 25 °C (králičí protilátky k peptidu 142-154). Po inkubaci se skvrny promyly 2x TTBS a potom se inkubovaly s biotinylovaným proteinem G •000 • *♦··
0 0 0·
A 00 >··
0 0« • 0 ·0 · ♦ ·
0 00
0 0 0 0 >00« «00 «·0 0*0 (Βίο-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) po dobu 1 hodiny.
Skvrny se znovu promyly stejným způsobem. Ke skvrnám se přidala křenová peroxidasa navázaná na NeutrAvidin™ (Pierce, Rocford, IL, USA) a provedla se inkubace po dobu 1 hodiny při teplotě 25 °C. Po inkubaci se skvrny promyly 6x TTBS. Po promytí se skvrny inkubvaly v SuperSignal® Substráte (Pierce) systému po dobu 10 minut a exponovaly se na Kodak X-OMAT AR (Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA) rentgenovém filmu po dobu 15 sekund.
Vazebný test pro 125IPrPsc
125
Frakce obsahující I z PolyWAX LP kolony se testovaly na vazbu na protilátku, která byla připravena k peptidu odpovídajícímu zbytkům 142-154 prionového proteinu. Zkumavky obsahující radioaktivitu se sušily v Savant cakuové odstředivce při teplotě 42 °C a resuspendovaly se v 10 μΐ H2O a potom se naředily pufrem obsahujícím sole v 0,1% BSA. PVC plotna se potáhla protilátkou v 0,1 M Na2CO3, pH 9,0. Po promytí výše uvedeným pufrem se 100 μΐ 125I-PrPsc inkubovalo na plotnách při 37 °C po dobu 2 hodin a potom přes noc při teplotě 4 °C. Plotna se promyla a nastříhala na jednotlivé jamky, které se potom analyzovaly. Cpm pozadí se odečetlo od cpm jamek.
Podmínky kapilární elektroforesy
Volná kapilární elektroforesa (Schmerr and Jenny, Electrophoresis 19: 409, 1998) se provedla na Beckman P/ACE 5500 (beckman Instruments, Fullerton, CA, USA). Detekce pomocí fluorescence indukované laserem (LIF) se provedla za použití vzduchem chlazeného argonového laseru (Beckman Instruments) s excitací při 488 nm a emisí při 520 nm. Nemodifikované kapiláry byly získány od Beckman Instruments. 20 cm (délka k
| ♦♦ | • * ·· · | |||||
| » » | • | ·· | « · | • · | ||
| • | • | ♦ ·· | • | • * | ||
| * | • · · | • | • | • · · | ||
| • · | • · | |||||
| ♦ · | «· | 9« | • 9 |
detektoru) x 201 μια I.D. kapilára se použila s 200 mM tricinu, pH 8,0. Tento pufr obsahuje 0,1% N-oktylglukosidu (Boehringer Manheim GmbH, Indianapolis, IN, USA) a 0,1% BSA (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA). Při přípravě pro separaci byla kapilára promývána po dobu 1 minuty 0,25 M NaOH, po dobu 2 minut H2O a potom po dobu 2 minut pufrem. Separačni podmínky byly 30 KV po dobu 3 minut při 20 °C. Proud byl přibližně 20 μΑ. Vzorek se injikoval po dobu 15 sekund a potom se po dobu 5 sekund injikoval pracovní pufr. Objem vzorku byl přibližně 0,95 nl. Výplachy byly provedeny za vysokého tlaku a injikování vzorku bylo provedeno za nízkého tlaku.
Vazebné testy pro imunokomplexy a priony μΐ peptidů značeného fluoresceinem obsahující přibližně 2 pmol peptidů značeného fluoresceinem se smísilo safinitně přečištěným králičím IgG pro demonstrování vazby protilátky na peptid značený fluoresceinem. 1 μΐ píkových frakcí z HILIC chromatografie se přidal do testu. Po smísení složek se vzorky inkubovaly při 25 °C po dobu 10 minut.
Výsledky
SC
Chromatogram PrP a přečištění a jodinaci je uveden na obr.
1. Radioaktivita (cpm) z prionových proteinů značených I odpovídá absorbanci při 280 nm, s výjimkou posledního píku detekovaného absorbanci. Výtěžek abnormálního proteinu, určený podle zpětného zisku I vneseneho do kolony, byl přibližně 76%. Píky cpm a Ά280 absorbance odpovídají pikům vykazujícím aktivitu s protilátkou ve vazebném testu (obr. 2). Hlavní pík ve vazebném testu v přibližně 25 minutě odpovídá pikům pro
125
IPrP a A280 absorbanci ve 25 minutě z obr. 1. Podobné výsledky byly získány pro chromatogram (není uveden) z •fc fcfc • · fc • ♦ fcfcfc • · · fc · • · · · ·· ♦·
| fc | fc | fcfc | ||
| • fc | • fc | fc | • | • fc |
| • | » | * | • | |
| fc | • | • fc | fc | |
| fc | • | fc | • | |
| ··· | ··· | • fc | • fc |
extraktu (nepřečištěného) mozků ovcí infikovaných scrapie.
(ro abnormální prionový protein bylo v literatuře popsáno široké rozpětí pí hodnot (Schmerr and Jenny, výše; Safar et al., proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 6373, 1990; Somerville et al., J. Gen. Virol. 70: 25, 1989). pí tohoto proteinu může ovlivňovat vazbu tohoto proteinu na náplň kolony, nebyly pozorovány významné odlišnosti retenčních časů pro PolyWAX LP kolonu s pozitivním nábojem a neutrální PolyHYDROXYETHYL A kolonu. Toto naznačuje, že protein může být kyselý. Vzorky abnormálního prionového proteinu obsahující SDS eluovaly z negativně nabité PolySULFOETHYL A kolony v širokém spektru. Proto byl abnormální prionový protein přečištěný na PolyWAX LP koloně znovu přečištěn na PolySULFOETHYL A koloně. Jeho eluce při nebo téměř připrázdném objemu kolony naznačuje, že je kyselý. Toto bylo potvrzeno jak gelovým isoelektrickým fokusováním, tak kapilárním elektrickým fokusováním (Schmerr et al., Chromatogr. A. 802: 135, 1998). pí hodnoty jsou v rozmezí 3-6 s většinou při 3. Tyto výsledky ukazují, že v hydrofilní interakční chromatografií je nutné použít neutrální nebo aniontový iontoměničový materiál.
V kapilární imunoelektroforese za použití HILIC přečištěných vzorků získané elektroferogramy (nejsou uvedeny) ukazují, že vzorky od infikovaných ovcí reagovaly, zatímco vzorky od normálních (neinfikovaných) ovcí neragovaly. Protože SDS inhibuje typické imunotesty včetně kapilární elektroforesy, je nutné pro provedení takových testů odstranit SDS. Kompetiční test využívající kapilární elektroforesy může být proveden na vzorcích po HILIC chromatografií, protože SDS eluuje při nebo téměř při prázdném objemu kolony (Jeno et al., Anal. Bioochem. 215: 292, 1993).
»* 9« •»9 • > 99 · • 9 99 *999
999 • 9 *9 • 99 *9
999
Příklad 4: Analýza abnormálního prionového proteinu extrahovaného od infikovaných ovcí
Frakce bohaté na leukocyty ze vzorků krve od ovcí infikovaných TSE se naředily Tris pufrovaným salinickým roztokem (10% tkáně:90% pufru). Vzorky se potom zpracovaly proteinasou K pro trávení normálních prionových proteinů, kde toto trávení neměnilo abnormální formy abnormálního prionového proteinu. Po trávení se zpracované vzorky smísily se stejným objemem hexafluor-2-propanolu (HFIP) a inkubovaly se při 56 °C po dobu 5 minut. Přidal se stejný objem 0,5 M síranu sodného a fáze se nechaly separovat. Vrstva obsahující HFIP se odstranila a vzorky se sušily ve vakuové odstředivce.
Peleta se resuspendovala ve vodě a suspenze se vnesla do organické chromatografické mobilní fáze obsahující 95% acetonitrilu, 5% vody, 0,1% kyseliny trifluoroctové a 50 mM HFIP. Mobilní fáze se aplikovala do vložky pro extrakci na pevné fázi PolyHYDROXYETHYL Aspartamideítm) (PolyLC, lne.). Abnormální prionový protein eluoval z tohoto nosiče při použití 100% vody, 0,1% kyseliny trifluoroctové a 50 mM HFIP a potom se sušil a resuspendoval se ve vodě.
Přítomnost abnormálního prionového proteinu se detekovala kapilární imunoelektroforesou. Abnormální prionový protein nebyl detekován v elektroforetogramech kontrolních vzorků krve, které nebyly infikovány TSE.
Příklad 5: Analýza abnormálního prionového proteinu extrahovaného z krve infikovaných křížených jelenů
Postup podle příkladu 4 se opakoval se vzorky krve od křížených jelenů infikovaných TSE. Přítomnost abnormálního
• » * * ♦ φ prionového proteinu se detekovala kapilární imunoelektroforesou. Abnormální prionový protein nebyl detekován v elektroforetogramech kontrolních vzorků krve, které nebyly infikovány TSE.
Příklad 6: Analýza abnormálního prionového proteinu extrahovaného z krve infikovaných losů
Postup podle příkladu 4 se opakoval se vzorky krve od losů infikovaných TSE. Přítomnost abnormálního prionového proteinu se detekovala kapilární imunoelektroforesou. Abnormální prionový protein nebyl detekován v elektroforetogramech kontrolních vzorků krve, které nebyly infikovány TSE.
Všechny patenty, patentové přihlášky, testovací protokoly a publikace citované v předkládaném vynálezu jsou zde uvedeny jako odkazy ve své úplnosti.
Předkládaný vynález není omezen specifickými popsanými provedeními. Různé modifikace vynálezu budou odborníkům v oboru jasné z uvedeného popisu a připojených výkresů. Takové modifikace spadají do rozsahu předkládaného vynálezu, jak je definován připojenými patentovými nároky.
Claims (24)
1. Způsob pro extrakci abnormálního prionového proteinu z biologického materiálu podezřelého z toho, že obsahuje abnormální prionový protein, vyznačující se tím, že zahrnuje:
(a) inkubaci směsi extrakčního rozpouštědla a izotonického nebo hypotonického vodného přípravku biologického materiálu za podmínek účinných pro extrakci abnormálního prionového proteinu z uvedeného biologického materiálu do uvedeného extrakčního rozpouštědla, kde uvedené extrakční rozpouštědlo je:
(i) polární organické rozpouštědlo, ve kterém je uvedený abnormální prionový protein rozpustný; a (ii) mísitelné s non-lyotropním vodným roztokem, ale nemísitelné s lyotropním vodným roztokem; a (b) zvýšení lyotropní aktivity směsi pro separaci uvedeného extrakčního rozpouštědla z uvedeného vodného přípravku uvedeného biologického materiálu za zisku extrakčního rozpouštědla obsahujícího jakýkoliv abnormální prionový protein z uvedeného biologického materiálu.
2. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že uvedeným extrakčním rozpouštědlem je hexafluor-2-propanol.
·· ·· • » » • * ·99
9 * · · ♦ • · · · ·· ··
5. Způsob podle nároku 3vyznačující se tím, že uvedená biologická kapalina je vybrána ze skupiny zahrnující mozkomíšní mok, krev, plasmu a sérum.
6. Způsob podle nároku 3vyznačuj ící se t í m, že uvedenou biologickou kapalinou je lidská krev.
7. Způsob podle nároku lvyznačujici se tím, že uvedená směs se inkubuje při teplotě v rozmezí od přibližně 20 °C do přibližně 100 °C.
8. Způsob podle nároku 7vyznačující se tím, že uvedená inkubace je provedena při teplotě přibližně 56 °C.
9. Způsob podle nároku lvyznačujici se tím, že uvedená lyotropní aktivita je zvýšena přidáním 0,5 M síranu sodného v poměru přibližně 1:1 (obj./obj.) k uvedené směsi.
10. Způsob podle nároku lvyznačujici se tím, že uvedený biologický materiál v uvedeném izotonickém nebo hypotonickém přípravku biologického materiálu je zpracován proteinasou K.
11. Způsob podle nároku lvyznačujici se tím, že dále zahrnuje (c) sušení extrakčního rozpouštědla obsahujícího abnormální prionový protein za zisku extrakční pelety.
12. Způsob podle nároku 11 vyznačující se tím, že dále zahrnuje (d) rozpuštění uvedené sušené extrakční pelety ve vodě a přečištění uvedeného abnormálního prionového proteinu.
13. Způsob podle nároku 12 vyznačující se tím, že uvedené přečištění zahrnuje způsob vybraný ze skupiny zahrnující hydrofilní interakční chromátografii a kapilární elektroforesu.
14. Způsob pro detekci přítomnosti abnormálního prionového proteinu u zvířete vyznačující se tím, že zahrnuje testování uvedeného separovaného extrakčního rozpouštědla připraveného způsobem podle nároku 1 na abnormální prionový protein.
15. Způsob podle nároku 14 vyznačující se tím, že uvedený test zahrnuje imunotest na abnormální prionový protein.
16. Způsob podle nároku 14 vyznačující se tím, že uvedeným biologickým materiálem je tkáň nebo biologická kapalina od obratlovce.
17. Způsob podle nároku 16 vyznačující se tím, že uvedenou tkání je mozková tkáň.
18. Způsob podle nároku 16 vyznačující se tím, že uvedená biologická kapalina je vybrána ze skupiny zahrnující mozkomíšní mok, krev, plasmu a sérum.
19. Způsob podle nároku 16 vyznačující se tím, že uvedenou biologickou kapalinou je lidská krev.
20. Způsob pro extrakci abnormálního prionového proteinu z biologického materiálu podezřelého z toho, že obsahuje abnormální prionový protein, vyznačující se tím, že zahrnuje:
• v « · · • · ··· ♦ · · · φ ♦ · φ
Φ· ··
(a) inkubaci směsi přibližně stejných množství hexafluor-2propanolu a non-lyotropního přípravku biologického materiálu za podmínek účinných pro extrakci uvedeného abnormálního prionového proteinu z uvedeného biologického materiálu do uvedeného hexafluor-2-propanolu;
(b) přidáni přibližně stejného objemu roztoku 0,5 M síranu sodného do uvedené směsi pro separaci uvedeného hexafluor-2propanolu z uvedeného vodného přípravku uvedeného biologického materiálu za zisku extrakčního rozpouštědla obsahujícího jakýkoliv abnormální prionový protein z uvedeného biologického materiálu.
21. Kit pro izolaci abnormálního prionového proteinu z biologického vzorku vyznačující se tím, že obsahuje:
(a) extrakční rozpouštědlo, kde uvedené extrakční rozpouštědlo je:
(i) polární organické rozpouštědlo, ve kterém je uvedený abnormální prionový protein rozpustný; a (ii) mísitelné s non-lyotropním vodným roztokem, ale nemísitelné s lyotropním vodným roztokem; a (b) lyotropní sůl nebo vodný roztok lyotropní soli pro přidání do vodného přípravku biologického vzorku tak, že se uvedené organické rozpouštědlo stane nemísitelným s uvedeným vodným přípravkem.
22. Kit podle nároku 21 vyznačující se tím, že dále obsahuje zásobník pro vzorky s ukazatelem objemu pro uvedený vodný přípravek biologického vzorku, kde uvedené polární organické rozpouštědlo a uvedená lyotropní sůl nebo vodný roztok lyotropní soli jsou dodány v předem odměřených jednotkách pro použití s uvedeným zásobníkem pro vzorky.
23. Kit podle nároku 21 vyznačující se tím, že dále obsahuje proteinasu-K pro zpracování uvedeného vodného přípravku biologického vzorku.
24. Kit pro detekci přítomnosti abnormálního prionového proteinu z biologického vzorku vyznačující se tím, že obsahuje:
(a) extrakční rozpouštědlo, kde uvedené extrakční rozpouštědlo je:
(i) polární organické rozpouštědlo, ve kterém je uvedený abnormální prionový protein rozpustný; a (ii) mísitelné s non-lyotropním vodným roztokem, ale nemísitelné s lyotropním vodným roztokem;
(b) lyotropní sůl nebo vodný roztok lyotropní soli pro přidání do vodného přípravku biologického vzorku tak, že se uvedené organické rozpouštědlo stane nemísitelným s uvedeným vodným přípravkem; a (c) detekční test pro abnormální prionový protein.
25. Kit podle nároku 24 vyznačující se tím, že uvedeným detekčním testem je imunotest.
26. Kit podle nároku 25 vyznačující se tím, že uvedeným imunotestem je imunochromatografický test.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US11527299P | 1999-01-08 | 1999-01-08 | |
| US09/420,850 US6150172A (en) | 1999-01-08 | 1999-10-19 | Method and kit for extracting prion protein |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20012469A3 true CZ20012469A3 (cs) | 2002-02-13 |
Family
ID=26813023
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20012469A CZ20012469A3 (cs) | 1999-01-08 | 2000-01-07 | Způsob pro extrakci prionového proteinu a souprava k jeho provádění |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6150172A (cs) |
| EP (1) | EP1147415A4 (cs) |
| JP (1) | JP2002534681A (cs) |
| KR (1) | KR20010089776A (cs) |
| CN (1) | CN1135235C (cs) |
| AU (1) | AU761319B2 (cs) |
| BR (1) | BR0007274A (cs) |
| CA (1) | CA2358285A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ20012469A3 (cs) |
| EA (1) | EA004953B1 (cs) |
| EE (1) | EE200100358A (cs) |
| GE (1) | GEP20033036B (cs) |
| HK (1) | HK1044588B (cs) |
| HU (1) | HUP0104890A3 (cs) |
| ID (1) | ID29442A (cs) |
| IL (1) | IL143974A0 (cs) |
| NO (1) | NO20013193L (cs) |
| NZ (1) | NZ513215A (cs) |
| OA (1) | OA11745A (cs) |
| PL (1) | PL349132A1 (cs) |
| SK (1) | SK9492001A3 (cs) |
| TR (1) | TR200101935T2 (cs) |
| WO (1) | WO2000040966A1 (cs) |
Families Citing this family (46)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ332132A (en) | 1996-04-03 | 2000-02-28 | Stichting Inst Voor Dierhouder | Pre-clinical detection of prion diseases such as PrPsc |
| US6720355B2 (en) | 1997-02-21 | 2004-04-13 | The Regents Of The University Of California | Sodium dodecyl sulfate compositions for inactivating prions |
| US6719988B2 (en) | 1997-02-21 | 2004-04-13 | The Regents Of The University Of California | Antiseptic compositions for inactivating prions |
| US6322802B1 (en) | 1999-06-01 | 2001-11-27 | The Regents Of The University Of California | Method of sterilizing |
| US6331296B1 (en) | 1999-06-01 | 2001-12-18 | Stanley B. Prusiner | Food additives which affect conformationally altered proteins |
| US20060008494A1 (en) * | 1997-02-21 | 2006-01-12 | The Regents Of The University Of California | Complete inactivation of infectious proteins |
| FR2774988B1 (fr) * | 1998-02-16 | 2000-05-05 | Commissariat Energie Atomique | Procede de purification de la prpres a partir d'un echantillon biologique et ses applications |
| GB9902659D0 (en) * | 1999-02-05 | 1999-03-31 | Microbiological Res Authority | Assay with reduced background |
| WO2000048003A1 (en) | 1999-02-11 | 2000-08-17 | Id-Lelystad, Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid B.V. | Prion test |
| US6605445B1 (en) * | 1999-02-22 | 2003-08-12 | Bayer Corporation | Rapid method of determining clearance of prion protein |
| US7041807B1 (en) | 1999-06-23 | 2006-05-09 | Caprion Pharmaceuticals, Inc. | Antibodies to a YYX epitope of a mammalian prion protein |
| US6437102B1 (en) * | 1999-11-24 | 2002-08-20 | Bayer Corporation | Method of separating prions from biological materials |
| US20030050276A1 (en) * | 2001-08-15 | 2003-03-13 | Cunanan Crystal M. | Treatment of tissue, instruments and work surfaces to remove infectious agents |
| IES20010042A2 (en) * | 2001-01-19 | 2002-12-11 | Enfer Technology Ltd | Test for transmissible spongiform encephalopathies |
| US20020192731A1 (en) * | 2001-04-12 | 2002-12-19 | H. Shih Jason C. | Method and composition for sterilizing surgical instruments |
| WO2009059286A1 (en) * | 2007-11-02 | 2009-05-07 | Biotrove, Inc. | Devices and methods for coupling mass spectrometry devices with chromatography systems |
| US8414774B2 (en) * | 2001-04-25 | 2013-04-09 | Agilent Technologies, Inc. | Systems and methods for high-throughput screening of fluidic samples |
| US20050123970A1 (en) * | 2001-04-25 | 2005-06-09 | Can Ozbal | High throughput autosampler |
| WO2002093168A1 (en) * | 2001-05-15 | 2002-11-21 | Gradipore Limited | Prion diagnostic test |
| FR2827047B1 (fr) * | 2001-07-03 | 2003-09-26 | Apoh Technollgies Sa | Procede de separation et/ou detection et/ou identification et/ou quantification de proteines prions |
| US6591991B2 (en) * | 2001-08-06 | 2003-07-15 | Luce Belle | Collapsible tire stand |
| US7045297B2 (en) * | 2001-11-14 | 2006-05-16 | Prion Developmental Laboratories, Inc. | Rapid prion-detection assay |
| US20030092090A1 (en) * | 2001-11-14 | 2003-05-15 | Kiamars Hajizadeh | Rapid prion-detection device, system, and test kit |
| US7659076B2 (en) † | 2002-02-28 | 2010-02-09 | Microsens Biophage Limited | Binding of pathological forms of prion proteins |
| AU2003280457A1 (en) * | 2002-06-27 | 2004-01-19 | University Of Marlyland, Baltimore | Methods for detecting and inactivating a prion |
| DE10230141B4 (de) * | 2002-07-04 | 2004-07-15 | Priontype Gmbh | Verfahren und Kit zur Anreicherung und zum Nachweis von veränderten Prion-Proteinen (PrPSc) |
| US20040018120A1 (en) * | 2002-07-29 | 2004-01-29 | Craig Rappin | Sample preparation device and method |
| US20040018575A1 (en) * | 2002-07-29 | 2004-01-29 | Craig Rappin | Sample preparation device and method |
| CH693953A5 (de) * | 2002-10-15 | 2004-05-14 | Tecan Trading Ag | Verfahren zum Anreichern von Proteinloesungen durch hydrophile Wechselwirkungschromatographie (HILIC) und Verduennungsloesung fuer proteinhaltige Fluessigkeiten. |
| US20040175775A1 (en) * | 2002-11-08 | 2004-09-09 | Neil Cashman | Method of detecting PrPsc in eye fluid |
| AU2003296953A1 (en) * | 2002-12-12 | 2004-07-09 | Strategic Diagnostics Inc. | Compositions and methods for detecting animal by product in feed |
| FR2849205B1 (fr) * | 2002-12-20 | 2005-02-11 | Afssa | Procede d'amplification de la detection de la prpsc et utilisation d'un ligand adjuvant macrocyclique pour une telle amplification |
| US20090068640A1 (en) * | 2003-06-27 | 2009-03-12 | Robert Rohwer | Methods for detecting and inactivating a prion |
| US20050054003A1 (en) * | 2003-09-10 | 2005-03-10 | Stenland Christopher J. | Prion clearance using particulate metal oxides |
| DE10354207B8 (de) * | 2003-11-20 | 2006-06-14 | Priontype Gmbh & Co.Kg | Verfahren zum Nachweis von pathologisch veränderten Prion-Proteinen (PrPSc) und Kit zur Durchführung des Verfahrens |
| JP4724816B2 (ja) * | 2005-09-06 | 2011-07-13 | シャープ株式会社 | タンパク質の測定方法 |
| DE102006044795A1 (de) * | 2006-09-13 | 2008-03-27 | Schweigert, Florian, Prof. Dr.med.vet. | Bestimmung von Inhaltsstoffen aus biologischen Materialien |
| CA2689145A1 (en) * | 2007-06-04 | 2008-12-11 | Pressure Biosciences Inc. | Pressure-enhanced extraction and partitioning of molecules |
| US20120156794A1 (en) * | 2008-03-19 | 2012-06-21 | Florian Schweigert | Method for the extraction and detection of fat-soluble components from biological materials |
| EP2288696A4 (en) * | 2008-05-07 | 2012-02-15 | Pressure Biosciences Inc | EXTRACTION OF BIOMOLECULAR COMPLEXES WITH ALTERNATIVE HYDROSTATIC PRESSURE |
| HRP20192259T1 (hr) | 2009-04-15 | 2020-03-06 | Abraxis Bioscience, Llc | Pripravci nanočestica bez priona i metode njihove proizvodnje |
| CN103255142B (zh) * | 2012-02-21 | 2017-07-25 | 上海转基因研究中心 | 一种利用RNAi调控内源性朊蛋白表达的方法及其应用 |
| CN102757493A (zh) * | 2012-07-11 | 2012-10-31 | 北京健翔和牧生物科技有限公司 | 一种制备鸡痘病毒抗体的方法 |
| US20200276518A1 (en) * | 2017-11-06 | 2020-09-03 | Shimadzu Corporation | Component separation method using supercritical fluid chromatograph |
| US11808675B2 (en) * | 2019-06-13 | 2023-11-07 | Agilent Technologies, Inc. | Room temperature methods for preparing biological analytes |
| EP4056175A4 (en) * | 2019-11-08 | 2023-12-06 | Central Glass Company, Limited | METHOD FOR SELECTIVELY KILLING CELLS CONTAINING PROTEIN AGGREGATES, RELATED KIT, THERAPEUTIC DRUG FOR PROTEIN MISFOLDING DISEASES, AND DRUG PRODUCT FOR REMOVING PROTEIN AGGREGATES FROM BLOOD PRODUCT |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6020537A (en) * | 1994-05-13 | 2000-02-01 | The Regents Of The University Of California | Prion protein standard and method of making same |
| US5998149A (en) * | 1996-04-05 | 1999-12-07 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method of detecting transmissible spongiform encephalopathies |
| US5808011A (en) * | 1996-07-01 | 1998-09-15 | Biopure Corporation | Method for chromatographic removal of prions |
-
1999
- 1999-10-19 US US09/420,850 patent/US6150172A/en not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-01-07 EP EP00904258A patent/EP1147415A4/en not_active Withdrawn
- 2000-01-07 EE EEP200100358A patent/EE200100358A/xx unknown
- 2000-01-07 KR KR1020017008560A patent/KR20010089776A/ko not_active Withdrawn
- 2000-01-07 IL IL14397400A patent/IL143974A0/xx unknown
- 2000-01-07 SK SK949-2001A patent/SK9492001A3/sk unknown
- 2000-01-07 GE GEAP20006037A patent/GEP20033036B/en unknown
- 2000-01-07 PL PL00349132A patent/PL349132A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2000-01-07 EA EA200100756A patent/EA004953B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-01-07 CA CA002358285A patent/CA2358285A1/en not_active Abandoned
- 2000-01-07 CN CNB008044058A patent/CN1135235C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-01-07 HU HU0104890A patent/HUP0104890A3/hu unknown
- 2000-01-07 NZ NZ513215A patent/NZ513215A/xx unknown
- 2000-01-07 TR TR2001/01935T patent/TR200101935T2/xx unknown
- 2000-01-07 HK HK02106255.5A patent/HK1044588B/zh not_active IP Right Cessation
- 2000-01-07 ID IDW00200101710A patent/ID29442A/id unknown
- 2000-01-07 OA OA1200100178A patent/OA11745A/en unknown
- 2000-01-07 AU AU26043/00A patent/AU761319B2/en not_active Ceased
- 2000-01-07 CZ CZ20012469A patent/CZ20012469A3/cs unknown
- 2000-01-07 BR BR0007274-5A patent/BR0007274A/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-01-07 JP JP2000592634A patent/JP2002534681A/ja active Pending
- 2000-01-07 WO PCT/US2000/000457 patent/WO2000040966A1/en not_active Ceased
-
2001
- 2001-06-25 NO NO20013193A patent/NO20013193L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| OA11745A (en) | 2005-05-13 |
| JP2002534681A (ja) | 2002-10-15 |
| HUP0104890A3 (en) | 2003-09-29 |
| CA2358285A1 (en) | 2000-07-13 |
| EA004953B1 (ru) | 2004-10-28 |
| NZ513215A (en) | 2002-12-20 |
| EP1147415A4 (en) | 2004-06-30 |
| IL143974A0 (en) | 2002-04-21 |
| HK1044588A1 (en) | 2002-10-25 |
| TR200101935T2 (tr) | 2002-01-21 |
| CN1135235C (zh) | 2004-01-21 |
| AU761319B2 (en) | 2003-06-05 |
| HK1044588B (zh) | 2004-12-03 |
| KR20010089776A (ko) | 2001-10-08 |
| NO20013193L (no) | 2001-08-15 |
| EE200100358A (et) | 2002-12-16 |
| BR0007274A (pt) | 2001-10-30 |
| WO2000040966A1 (en) | 2000-07-13 |
| CN1342266A (zh) | 2002-03-27 |
| ID29442A (id) | 2001-08-30 |
| GEP20033036B (en) | 2003-07-25 |
| HUP0104890A2 (hu) | 2002-04-29 |
| AU2604300A (en) | 2000-07-24 |
| EA200100756A1 (ru) | 2001-12-24 |
| SK9492001A3 (en) | 2002-06-04 |
| PL349132A1 (en) | 2002-07-01 |
| NO20013193D0 (no) | 2001-06-25 |
| US6150172A (en) | 2000-11-21 |
| EP1147415A1 (en) | 2001-10-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6150172A (en) | Method and kit for extracting prion protein | |
| JP4783727B2 (ja) | プリオンタンパク質結合物質と使用法 | |
| JP4842478B2 (ja) | 生物学的試料における非通常伝達因子株によって引起こされる亜急性伝達性海綿状脳症の診断方法 | |
| EP3031823B1 (en) | Method of diagnosing neurodegenerative disease | |
| CZ304365B6 (cs) | Způsob časné diagnostiky konformačních onemocnění | |
| KR20010103037A (ko) | 프리온 및 ＰｒＰＳｃ의 분리 용도로 제조되는 혈청 샘플 | |
| Grathwohl et al. | Improvement of PrPSc-detection in mouse spleen early at the preclinical stage of scrapie with collagenase-completed tissue homogenization and Sarkosyl-NaCl extraction of PrPSc | |
| PT1054897E (pt) | Processo para a purificação de prpres a partir de uma amostra biológica e suas aplicações | |
| WO2010141716A2 (en) | Methods and materials for diagnosing light chain amyloidosis | |
| Collins et al. | Regulation of neuronal PP1 and PP2A during development | |
| Schmerr et al. | Method and kit for extracting prion protein | |
| ZA200105304B (en) | Method and kit for extracting prion protein. | |
| BG64291B1 (bg) | М...'од и ки' за ...к''рахиран... на прион про'...ин | |
| EP0558747B1 (en) | Immunosorbent for diagnosis of epilepsy and group of risk | |
| EP2870481A1 (en) | Tropomyosin isoforms related to alzheimers disease and mild cognitive impairment | |
| MXPA01006875A (en) | Method and kit for extracting prion protein | |
| HUT77340A (hu) | Eljárás szivacsszerű agybetegség kimutatására | |
| KR20230148118A (ko) | 생체 시료 내 지질 연관 단백질의 질량 분석을 위한 지질 연관 단백질의 정제 및 농축 방법 | |
| US20040175775A1 (en) | Method of detecting PrPsc in eye fluid | |
| Stanly | 2.3 Isolation of uEVs by sucrose/D2o double cushion gradient ultracentrifugation | |
| KR20230148764A (ko) | 알츠하이머병 또는 경도 인지장애 진단을 위한 비응집성 용해조성물 및 이를 이용한 진단 방법 | |
| HUT77339A (hu) | Eljárás szivacsszerű agybetegség kimutatására | |
| US20030104480A1 (en) | Prion capture | |
| JP4769925B2 (ja) | 異常型プリオン蛋白質の濃縮方法、および除去方法 | |
| WO1988000343A1 (en) | Reagent kit, its use and diagnostic process for the detection of hpasp (human pancreatic specific protein) |