CZ232698A3 - Způsob získávání integrantů kmene Bacillus thuringiensis - Google Patents

Description

Způsob získávání integrantů kmene Bacillus thuringiensis

Tato patentová přihláška je částečnou pokračovací přihláškou přihlášky pořadového čísla 08/274,608, podané 13. července 1994, která je částečnou pokračovací přihláškou přihlášky pořadového čísla 08/092,338 podané 15. července 1993, nyní vzaté zpět. Tato přihláška je rovněž částečnou pokračovací přihláškou přihlášky 07/835,701, podané 26. května 1992.

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu získávání integrantů(ů) kmene Bacillus thuringiensis. Vynález se dále týká takového(ých) integrantů(ů) nebo jeho spor, komposic obsahujících takový integrant(y), stejně jako způsobů pro potírání škůdce(ů), které těchto kompozic používaj í.

Dosavadní stav techniky

Škůdci mohou být potíráni buď chemickými pesticidy nebo biopesticidy. Avšak vzhledem k širokému spektru účinku mohou chemické pesticidy ničit organismy, které cílem nejsou, jako je užitečný hmyz a parasiti i dravci proti ničivým škůdcům. Mimo to jsou chemické pesticidy obvykle toxické pro zvířata i lidi. Dále pak, jsou-li vybraní škůdci opakovaně vystavováni takovým látkám, může se u nich vyvinout resistence.

Biopesticidy využívají ke zvládání zamoření plodin hmyzem, fungálními škůdci a plevelem, přirozeně se vyskytující pathogeny. Jako příklad biopesticidu je bakterie, která produkuje substanci, toxickou pro zamořujícího škůdce. Obecně je biopesticid méně škodlivý pro organismy, na které není zaměřen, a pro životní prostředí v celku, než chemické • · · · · ·

Bačillus pohyblivá, je je přírodě široce pesticidy.

Nejvíce rozšířeným biopesticidem thuringiensis. Bacillus thuringiensis tyčinkovitá, gram-positivní bakterie, v rozšířená, zejména v půdě a prostředích bohatých na škůdce. Během sporulace produkuje Bacillus thuringiensis parasporální krystalickou inklusi(e), která(é) je (jsou) po požití toxická(é) pro citlivé larvy. Inkluse se může (mohou) lišit co do tvaru, počtu a složení. Jsou tvořeny z jednoho nebo více proteinů, nazývaných delta-endotoxiny, které z hlediska velikosti mohou být v rozmezí 27-140 kDa. Delta-endotoxiny j sou ve vnitřnostech larev proteázami obvykle konvertovány na menší (zkrácené) toxické polypeptidy působící destrukci zažívacího traktu a na konec uhynutí škůdce (Hófte a Vhiteley, 1989, Microbiol. Rev. 53:242-255).

Delta-endotoxiny jsou kódovány cry (krystalický protein) geny. Cry geny se rozdělují na šest tříd a několik podtříd založených na homologii aminokyselin a pesticidní specificitě. Šest hlavních tříd představují Lepidopteraspecifické (cryl), Lepidoptera- a Diptera-specifické (cryll), Coleoptera-specifické (crylll), Diptera-specifické (crylV) (Hófte a Vhiteley, 1989, Microbiol. Rev. 53:242-255), Coleoptera- a Lepidoptera-specifické (označované Tailorem a spol., 1992, Mol. Microbiol. 6:1211-1217, jako cryV geny); a Nematoda-specifické (označované Feitelsonem a spol., 1992, Bio/Technology 10:271-275, jako cryV a cryVI geny). Některé krystalické delta-endotoxiny Bacillu thuringiens jsou také podle publikací pesticidní pro Acari, Hymenoptera, Phthiraptera, Platyhelminthes, Homoptera, Blattodea a Protozoa.

Delta-endotoxiny byly připraveny pomocí metod rekombinatní DNA. Delta-endotoxiny připravené metodami rekombinantní DNA mohou anebo nemusí být v krystalické formě.

Různé cry geny byly klonovány, sekvencovány a exprimovány v různých hostitelích, jako je např. E. coli.(Schnepf

a spol., 1987,	J. Bacteriol.	169:4110-4118) a	Bačillus
subtilis (Shivakumar a	spol	1986, J.	Bacteriol.
166:194-204). Amplifikace	cry genů	bylo	dosaženo pomocí	Bačillus

subtilis. Gen delta-endotoxinu Bacillu thuringiensis subsp. kurstaki HD73 byl klonován do Bacillus subtilis za použití integrativního plasmidu a zmnožen (Calogero a spol., 1989, Appl. Environ. Microbiol., 55:446-453). Avšak, jak bylo bylo zjištěno srovnáním s Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD73, nebyl pozorován vzrůst velikosti krystalů. Kromě toho nebyl popsán rozdíl v pesticidní aktivitě.

Úroveň exprese genů delta-endotoxinů se zdá být závislá na použitých hostitelských buňkách (Skivakumar a spol., 1989, Gene 79:21-23). Skivakumar a spol. nalezli na příklad výrazné diference při expresi crylA a crylIA genů delta-endotoxinů Bacillu thuringiensis subsp. kurstaki v Bacillus subtilis a Bacillus megaterium. CrylA gen byl exprimován, když byl vícekopiový vektor přítomen v Bacillus megaterium, v Bacillus subtilis však nikoliv. CryIIA byl exprimovám v obou hostitelích, ale v Bacillus megaterium ve větší míře. Elektronovou mikroskopií byly zkoumány sekce buněk Bacillus megaterium, které tyto geny delta-endotoxinů exprimují a v těchto buňkách byla zj ištěna přítomnost velkých bipyramidálních krystalů. Není však žádná indikace, že tyto krystaly jsou nějak větší než krystaly nalézané v Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, které normálně tyto geny obsahují. Výsledky bioessayů buněk Bacillus megaterium, exprimující tyto geny delta-endotoxinů, naznačují, že zde nebyl žádný vzrůst pesticidální aktivity ve srovnání s Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. A vskutku, pro dosažení stejného efektu v zahubeni hmyzu bylo zapotřebí ·· ····

91·· pětinásobné koncentrace Bacillu thuringiensis subsp. kurstaki.

Při dřívějších způsobech transformovala sekvenci DNA, megaterium než Bacillu se hostuj ící buňka pomocí vektoru rekombinantní DNA, nesoucí která kóduje delta-endotoxin a replikační sekvence

DNA.

Exprese delta-endotoxinu je závislá na replikaci vektoru rekombinantní DNA v hostiteli. Jestliže se, za účelem produkování žádaného polypeptidu procedurami rekombinantní DNA, bakteriální buňky transformují vektorem rekombinantního plasmidu, který nese vloženou genetickou informaci s kódem pro delta-endotoxin, často se pozorovalo, že se takové plasmidy stávají nestálé, i když samy o sobě mohou být stabilní součástí buňky. Tato nestabilita může nabýt buď formy nestálého trvání plasmidu v buňkách tak, že se plasmid případně vytratí z buněčné populace, anebo tak, že DNA kódující příslušný protein může být plasmidem vymazána. Tradiční způsob řešení předešlého problému bylo pěstování transformovaných buněk za zvoleného omezení, což znamená, typicky v přítomnosti antibiotika, vůči kterému příslušné buňky se staly resistentní díky přítomnosti genu kódujícího produkt zprostředkující resistenci vůči onomu antibiotiku, na plasmidu transformovaném do buněk. Avšak tento přístup není ani ekonomicky vhodný pro produkci ve velkém měřítku vzhledem k vysokým nákladům antibiotik přicházejících v úvahu, ani žádoucí z důvodů ochrany životního prostředí. Použití antibiotik v kultivačních prostředích také více znesnadňuje získání produktu, který by schválily zdravotní a jim podobné úřady.

Dříve bylo navrženo, že by plasmidy mohly být stabilizovány tím, že se do nich vloží sekvence DNA kódující partiční funkci, která zajišťuje stejnou distribuci plasmidu do dalších pokolení buněk při buněčném dělení. Alternativní metodou dosažení stabilní dědičnosti klonovaných sekvencí DNA je provedení opatření pro genomu hostující bakterie, u plasmidových vektorů překřížovacím postupem, integraci takových DNA sekvencí do Integrace DNA sekvencí přítomných se může provést tak zvaným jak je popisován např. A.

Campbellem, Advances Genet. 11, 1962, str. 101-145. Podle tohoto postupu je plasmidový vektor opatřen DNA sekvencí, která je homologická k oblasti bakteriálního genomu, anebo alternativně má dvě homologické sekvence na obou stranách heterologické DNA sekvence, která má být integrována. V následujícím rekombinačním případu jsou homologická sekvence i přilehlé sekvence na vektoru integrovány do hostitelského genomu v oblasti homologie.

V některých případech však bylo zjištěno, že integrované sekvence DNA jsou vymazány z buněk bez voleného omezení, na příklad podobným typem homologického rekombinantního případu jako toho, který je zodpovědný za integraci DNA. Dříve bylo zejména pozorováno, že rekombinace mezi homologickými sekvencemi DNA je stimulována v blízkosti replikační DNA přítomné nebo blízké DNA integrované do genomu hostitelské buňky; viz Ph. Noirot a spol., J. Mol. Biol. 196, 1987, str. 39-48 a M. Young a S.D. Ehrlich, J. Bacteriol. 171(5), květen 1989, str. 2653-2656.

Předmětem předkládaného vynálezu je proto poskytnout stabilní integraci DNA sekvencí do genomické DNA, např. chromosomu bakteriálních hostitelských buněk, zejména Bacillu thuringiensis. Předmětem vynálezu je také vytvořit integranty kmene Bacillu thuringiensis, které produkují dostatečná množství delta-endotoxinů. Takové integranty mohou být užitečné pro rozšíření rozsahu hostování Bacillu thuringiensis a získání efektivnějších formulací Bacillu thuringiensis.

Podstata vynálezu získávání integrantu Bacillu nejméně jeden heterologický

Vynález se týká způsobů thuringiensis, který produkuje krystalický endotoxin. Integrant se získává

a) tím, že se do buňky hostitelského kmene Bacillus thuringiensis (i) zavede první DNA vektor, obsahující první počátek replikace a nejméně jeden funkční gen kódující nejméně jeden faktor, potřebný pro replikaci plasmidu z řečeného prvního počátku replikace, a s ním (ii) druhý DNA vektor, obsahující druhý počátek replikace, avšak postrádaj ící funkční gen kóduj ící faktor, potřebný pro replikaci plasmidu z druhého počátku replikace, stejně jako sekvenci DNA kódující delta-endotoxin Bacillu thuringiensis, sekvenci DNA, která je homologická s oblastí genomu řečeného hostitelského kmene a volitelný signální znak a (b) kultivací buňky z kroku (a) za selektivních podmínek vedoucích ke ztrátě prvního DNA vektoru a k integraci řečeného druhého DNA vektoru do genomu řečené hostitelské buňky homologickou rekombinací.

V charakteristickém provedení je hostitelským kmenem Bacillu thuringiensis cry- kmen.

Předložený vynález se dále týká řečeného integrantu. Sekvence DNA, která kóduje delta-endotoxin Bacillu thuringiensis, může být heterologickou DNA sekvencí. V jednom z provedení může integrant kromě obsahu heterologického krystalického delta-endotoxinu obsahovat také homologický krystalický delta-endotoxin, delta-endoxin, který je endogenně produkován hostitelským kmenem Bacillu thuringiensis. V jiném provedení může integrant produkovat více než jeden heterologický delta-endotoxin Bacillu thuringiensis. N dalším provedeni, ve srovnání s odpovídajícím mateřským kmenem, je jako výsledek • · · · amplifikace genu či hyperexprese produkováno veliké množství krystalického delta-endotoxinu s větší pesticidní účinností a případně větší velikostí krystalů. Vynález se také týká pesticidní komposice obsahující takový integrant a pesticidně přijatelný nosič právě tak jako způsobů pro potírání škůdce(ů) při užití takové komposice.

Definice

Integrant, jak se zde definuje, je kmen Bacillu thuringiensis, který obsahuje dodatečný segment DNA (obvykle cry gen, gen antibiotické resistence a s plasmidem sdružené DNA) vložený homologickou rekombinací do genomu řečeného kmene.

Heterologická sekvence DNA, jak se zde definuje, je

sekvence DNA,	která	se	v hostitelské buňce	Bačillu
thuringiensis přirozeně	nevyskytuj e.
Genom,	j ak se	zde	def inuj e, je veškerá	DNA, j ak
chromosomální	tak i	plasmid, uvnitř buňky	Bačillu
thuringiensis.
Mateřský	kmen, jak se	zde definuje, je kmen,	který je

zdrojem heterologické sekvence DNA kódující delta-endotoxin Bacillu thuringiensis.

Větší pesticidní účinností, jak se zde definuje, se míní nejméně 1,25-krát větší účinnost proti škůdci, ve smyslu zahubení nebo zakrnění škůdce, než odpovídá mateřskému kmeni. V preferovaném provedení je pesticidní účinnost integrantu mezi kolem 1,5 až kolem 10 násobku pesticidní účinnosti odpovídajícího mateřského kmene Bacillus thuringiensis.

Větším množstvím, jak se zde definuje, je míněno, že integrant produkuje nejméně 1,25-násobné množství krystalického delta-endotoxinu než mateřský kmen.

Větší velikostí krystalu, jak se zde definuje, se rozumí, že největší plocha krystalu integrantu má nejméně

1111

1,2-násobnou plochu povrchu nebo objem krystalu mateřského kmene.

Způsoby získávání integrantů

Integrant podle předloženého vynálezu může být získán systémem dvouplasmidové integrace. Tento systém spočívá na prvním čili pomocném plasmidu, který obsahuje původ replikace a nejméně jeden funkční gen kódující nejméně jeden faktor nezbytný pro replikaci plasmidu, např. na teplotu citlivý replikační protein, který působí in trans, a druhý vektor čili integrativní plasmid, který v nepřítomnosti pomocného plasmidu nemůže replikovat. Integrativní plasmid podle předloženého vynálezu obsahuje (i) cry gen, (ii) oblast homologickou s hostitelským genomem (na příklad 16S rRNA gen nebo gen fosfolipázy C nebo samotný cry gen) a (iii) a volitelný signální znak. První plasmid může také obsahovat sekvenci DNA, jež kóduje volitený signální znak, např. znak antibiotické resistence, který se liší od onoho, který je kódován pomocným plasmidem. Pomocný plasmid může být přidáván před anebo současně s integrativním plasmidem.

Při typickém provedení je pomocný plasmid zaveden elektroporací do požadovaného hostitele zahrnujícího, ale neomezujícího se na Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, Bacillus thuringiensis subsp. aizawai, Bacillus thuringiensis subsp. galleriae, Bacillus thuringiensis subsp. entomocidus, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis, Bacillus thuringiensis subsp. alesti, Bacillus thuringiensis subsp. canadiensis, Bacillus thuringiensis subsp. darmstadiensis, Bacillus thuringiensis subsp. dendrolimus, Bacillus thuringiensis subsp. finitimus, Bacillus thuringiensis subsp. kenyae, Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni, Bacillus thuringiensis subsp. subtoxicus, Bacillus thuringiensis

subsp. toumanoffi, Bacillus thuringiensis subsp. toumanoffi, Bacillus thuringiensis subsp. pondicheriensis, Bacillus thuringiensis subsp. shandogiensis, Bacillus thuringiensis subsp. sotto, Bacillus thuringiensis subsp. nigeriae, Bacillus thuringiensis subsp. yunnanensis, Bacillus thuringiensis subsp. dakota, Bacillus thuringiensis subsp. indiana, Bacillus thuringiensis subsp. tohokuensis, Bacillus thuringiensis subsp. kumamotoensis, Bacillus thuringiensis subsp. tochigiensis, Bacillus thuringiensis subsp. thompsoni, Bacillus thuringiensis subsp. wuhanensis, Bacillus thuringiensis subsp. kyushuensis, Bacillus thuringiensis subsp. ostriniae, Bacillus thuringiensis subsp. tolworthi, Bacillus thuringiensis subsp. pakistani, Bacillus thuringiensis subsp. japonensis, Bacillus thuringiensis subsp. colmeri, Bacillus thuringiensis subsp. pondicheriensis, Bacillus thuringiensis subsp. shandongiensis, Bacillus thuringiensis subsp. neoleonensis, Bacillus thuringiensis subsp. coreanensis, Bacillus thuringiensis subsp. silo, Bacillus thuringiensis subsp. mexicanensis a Bacillus thuringiensis subsp. israelensis a udržován přidáváním zvoleného činidla, na příklad antibiotika jako erythromycinu při teplotě, která dovoluje vlastní fungování Rep proteinu citlivého na teplotu (např. 30 °C). Potom se do téhož hostitelského kmene zavede integrativní plasmid postrádaj ící funkční replikační protein (např. Rep protein) a udržuje se výběrem zvoleného činidla, např. chloramfenikolu. Selekce samotným chloramfenikolem je dostatečná, aby byly udržovány oba plasmidy, protože integrativní plasmid nemůže existovat bez pomocného plasmidů. Růst při vyšší teplotě např. 37 °C nedovoluje replikaci pomocného plasmidů. Za nepřítomnosti pomocného plasmidů nemůže také replikovat integrativní plasmid kóduj ící resistenci chloramfenikolu. Jedinou cestou aby hostitelská • ·

buňka mohla udržet resistenci na chloramfenikol, je tedy integrace integrativního plasmidu Campbellovým způsobem rekombinace v oblasti homologie, kterou sdílí s genomem Bacillu thuringiensis. Následkem toho je DNA integrována do genomu hostitelského kmene. V určitém případě je hostitelským kmenem cry-kmen. V nejcharakterističtějším případě je hostitelským kmenem kmen Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki.

DNA sekvence kódující delta-endotoxin může být volena ze skupiny obsahující cryl, cryll, crylll, crylV, cryV, nebo cryVI geny, avšak neomezuje se to jen na ně. Při jednom z provedení obsahuje delta-endotoxin kódující sekvence DNA gen crylC. CrylC gen kóduje delta-endotoxin specifický pro lepidopterové škůdce. Sekvence DNA obsahující crylC gen se dá získat z kmene Bacillus thuringiensis subsp. aizawai. N nejtypičtějším případě se crylC DNA sekvence získává z Bacillus thuringiensis subsp. aizawai kmene EMCC0087.

Plasmidy mohou být vneseny do hostitelského kmene Bacillu thuringiensis postupy, které jsou v oboru běžně známy, např. elektroporací, protoplastisací buněk, transdukcí, chemickou transformací a regenerací (Macaluso a Mettus, 1991, J. Bacteriol. 173:1353-1356; Crawford a spol., 1987, J. Bacteriol. 169:5423-5428; a Battisti a spol., 1985, J. Bacteriol. 162:543-550). Simultánní růst při vhodné teplotě, např. při 37 ’C nebo vyšší, a vliv antibiotika dává výběr pro integraci plasmidu do genomu hostitelské buňky rekombinaci s homologickou oblastí genomu hostitelské buňky. Buňka, která ve svém genomu nese útvar integrované DNA, se pěstuje v prostředí se vzrůstajícími množstvími činidla, které udává vyber volitelného signálního znaku, např. prostředí obsahující antibiotikum, čímž znásobuje volitelný signální znak a nutně také cry gen (Albertini a Galizzi, 1985, J. Bacteriol. 162:1203-1211).

• · · · ·· ···· • · ·· ··

Invertebrate

Invertebrate

N preferovaném provedení je DNA kódující delta-endotoxin amplifikována v integrantu. V typickém případě probíhá takové zmnožování přenosem integrantu do media obsahujícího větší množství činidla udávaj ícího výběr volitelného signálního znaku. Tento krok může být opakován několikrát se vzrůstajícím množstvím činidla udávajícího výběr volitelného signálního znaku.

Integrant podle předkládaného vynálezu může být kultivován za použití medií a fermentačních technik v oboru běžných (viz na příklad Rogoff a spol., 1969, J.

Path. 14:122-129; Dulmage a spol., 1971, J. Path. 18:353-358; Dulmage a spol. v Microblal

Control of Pests and Plant Diseases, H.D. Burges (vydavatel), Academie Press, New York, 1980). Po skončení fermentačního cyklu se krystaly delta-endotoxinu(ů) Bacillu thuringiensis a spory z fermentační směsi shromáždí způsoby v oboru běžně známými, např. centrifugací.

Čistění spor nebo delta-endotoxinů produkovaných kmenem integrantu podle předkládaného vynálezu může být provedeno různými, v oboru známými způsoby, které zahrnuj ί, aniž by se jen na ně omezovaly, ultrafiltraci, diferenční extrakci, centrifugací podle gradientu hustoty, chromatografií nebo jiné techniky pro čistění proteinů a/nebo částic.

Účinnost krystalického delta-endotoxinu nebo spor kmene integrantu podle předkládaného vynálezu proti různým škůdcům může být stanovena pomocí biotestů s použitím v oboru známých postupů jako je přidávání umělé diety, potahování umělou dietou, natírání listů, namáčení listů, sprej ování olistění a vodního testu.

Komposice

Kmeny integrantu Bacillu thuringiensis, krystalické endo-toxiny a/nebo spory podle vynálezu mohou být formulovány • · · · • · do pesticidní(ch) komposice(ic), to je na příklad suspense, disperse, vodná emulse, zásypový pudr, práškovací moučka, emulsifikovatelný koncentrát, aerosol nebo opouzdřené mikro či makro granule anebo jakékoliv jiné formulace, které kontrolované uvolňují Bacillus thuringiensis. Takové komposice lze připravovat přidáním povrchově aktivního činidla, např. dispergačního činidla, emulsifikačniho činidla nebo zvlhčovacího činidla nebo inertního nosiče či dalších komponent, které usnadňují manipulaci a aplikaci proti jednotlivým škůdcům, na které jsou zacíleny.

Vhodná povrchově aktivní činidla zahrnují aniontové sloučeniny jako karboxylát, na příklad karboxylát kovu od mastné kyseliny s dlouhým řetězcem; N-acylsarkosinát; mononebo diestery fosforečné kyseliny s ethoxyláty mastných alkoholů nebo soli takových esterů; sulfáty mastných alkoholů jako dodecylsulfát sodný, oktadecylsulfát sodný nebo cetylsulfát sodný; sulfáty ethoxylovaných mastných alkoholů; sulfáty ethoxylovaných alkylfenolů; ligninsulfonáty; ropné sulfonáty; alkylarensulfonáty jako alkylbenzensulfonáty nebo nižší alkylnaftalensulfonáty, např. butylnaftalensulfonát; soli sulfonovaných kondenzátů naftalenu a formaldehydu nebo soli polyakrylové kyseliny; soli sulfonovaných kondenzátů fenolu a formaldehydu; nebo složitější sulfonáty jako amidsulfonáty, např. sulfonované kondenzační produkty kyseliny olejové a N-methyltaurinu nebo dialkyl sulfojantarany např. dioktyl sulfojantaran sodný. Neionogenní činidla zahrnuj i kondenzační produkty esterů mastných kyselin, mastných alkoholů, amidů mastných kyselin nebo fenolů substituovaných alkyly masných alkoholů nebo alkenyly s ethylenoxidem a/nebo propylenoxidem, esterů mastných kyselin s ethery polyhydroxyalkoholů, např. estery mastných kyselin a sorbitolu, kondenzační produkty takových esterů s ethylenoxidem, např. esterů mastných kyselin * · · · · · s polyoxyethylensorbitolem, blokových kopolymerů ethylenoxidu a propylenoxidu, acetylenických glykolů jako 2,4,7,9tetraethyl-5-decin-4,7-diolu nebo ethoxylovaných acetylenických glykolů. Příklady kationaktivních povrchově aktivních činidel představuj i na příklad acetát, naftenát nebo oleát alifatického mono-, di- nebo polyaminu; kyslík obsahující amin jako aminoxid polyethylenalkylaminu; aminy spojené amidovými skupinami získávané kondenzaci karboxylových kyselin s di- nebo polyaminy anebo kvarterní amoniové soli.

Příklady inertních materiálů zahrnují anorganické minerály jako fylosilikáty, uhličitany, sírany, fosfáty; organické materiály jako cukry, škroby nebo cyklodextriny; nebo rostlinné materiály jako vřetena kukuřičných palic, slupky rýže, skořápky ořechů, kukuřičná mouka, peletisované zrní a celulozová vlákna.

Komposice podle předkládaného vynálezu mohou být ve vhodné formě k přímé aplikaci nebo jako koncentrát či primární komposice, která před aplikací vyžaduje zředění vhodným množstvím vody nebo jiného rozpouštědla. Pesticidní koncentrace se bude měnit podle povahy jednotlivé formulace, zvláště jde-li o koncentrát nebo o přímé užití. Komposice obsahuje 0,1 % až 99 %, přednostně 0,1 % až 95 % integrantů, mutantu nebo variantu podle předkládaného vynálezu, 1 % až 98 % pevného nebo kapalného inertního nosiče a 0 % až 50 %, přednostně pak 0,1 % až 50 % povrchově aktivního činidla. Tyto komposice se používají v množství kolem 0,01 libry až 5 liber na akr (= 0,0121 kg/ha až 5,605 kg/ha) jsou-li v suché formě a kolem 0,01 pinty až 10 pint na akr (= 0,017 1/ha až 11 1/ha) jsou-li v kapalné formě.

Podle dalšího způsobu provedení mohou být intergranty podle předkládaného vynálezu před formulací ošetřeny tak, aby se prodloužila pesticidní účinnost při jeho aplikaci • · 4 ·

4 4 « »44 4 4 v prostředí ničeného škůdce. Takové ošetření může být uskutečněno chemickými a/nebo fysikálními prostředky, pokud toto ošetření zhoubně neovliní vlastnosti směsi/í. Mezi příklady chemických činidel patří, ale neomezují se jen na halogenační činidla, aldehydy jako formaldehyd a glutaraldehyd, činidla proti infekci jako zephiran chlorid, alkoholy jako isopropanol a ethanol a histologické fixativy jako Bouin-ův fixativ a Helly-ho fixativ (viz na příklad Humason, Animal Tissue Techniqes, V.H. Freeman and Co., 1967), konservační prostředky, ochranné UV filtry, sprejové adjuvanty (zvlhčovadla), prostředky proti pěnění a adhesiva.

Kompozice podle vynálezu lze aplikovat přímo na rostlinu na příklad postřikem nebo poprášením v době, kdy se na rostlině začal objevovat škůdce nebo jako ochranné opatření před jeho výskytem. Mezi rostliny, které lze chránit v rozsahu tohoto vynálezu patří, ale nejsou omezeny jen na ně: obiloviny (pšenice, ječmen, žito, oves, rýže, čirok a příbuzné plodiny), řepy (cukrová řepa, krmná řepa), peckoviny, jádroviny a měkké ovoce (jablka, hrušky, švestky, broskve, mandle, třešně, jahody, maliny, borůvky), luskoviny (fazole, čočka, hrách, sója), olejniny (řepka, hořčice, mák, olivy, slunečnice, kokos, skočce poskytující ricinový olej, kakaové boby, podzemnice olejná), okurkovité rostliny (okurky, dýně, melouny), vláknité rostliny (bavlna, len, konopí, juta), citrusové ovoce grapefruity, mandarinky), zelenina zelí a jiné košfáloviny, mrkve, cibule, rajčata, brambory, paprika), vavřínovité rostliny (avokado, skořice, kafr), opadavé listnaté stromy i jehličnany (lípy, tisy, duby, olše, topoly, břízy, jedle, modřiny, borovice), nebo rostliny jako jsou kukuřice, tabák, ořechy, káva, třtina cukrová, vinná réva, chmel, banánovníky, kaučukovníky stejně tak jako rostliny okrasné. Preferovaným způsobem aplikace je (pomeranče, citrony, (špenát, salát, chřest, sprej ování listí. Zpravidla je důležité získat kontrolu nad škůdcem v ranných stadiích vývoje rostliny, protože to je doba, kdy může být poškozena nejvážněji. Pokud se má za to, že je to nutné, může postřik nebo poprašek obsahovat výhodně i jiný insekticid nebo pesticid, jako např. fungicid, herbicid nebo hnojivo k ošetření trávníku. V preferovaném provedení se kompozice podle vynálezu aplikuje přímo na rostlinu.

Kompozice podle předkládaného vynálezu může být účinná proti škůdcům řádu Lepidoptera na příklad Achroia grísella, Acleris gloverana, Acleris variana, Adoxophyes orana, Agrotis ipsilon, Alabama argillacea, Alsophila pometaria, Amyelois transitella, Anagasta kuehniella, Anarsia lineatella, Anisota senatoria, Antheraea pernyi, Anticarsia gemmatalis, Archips sp., Argyrotaenia sp., Athetis mindara, Bombyx moři, Bucculatrix thurberiella, Cadra cautella, Choristoneura sp., Cochylis hospes, Colias eurytheme, Corcyra cephalonica, Cydia latiferreanus, Cydia pomonella, Datana integerrima, Dendrolimus sibericus, Desmia funeralis, Diaphania hyalinata, Diaphania nitidalis, Diatraea grandiosella, Diatraea saccharalis, Ennomos subsignaria, Eoreuma loftini, Ephestia elutella, Erannis tiliaria, Estigmene acrea, Eulia salubricola, Eupocoellia ambiguella, Eupoecilia ambiguella, Euproctis chrysorrhoea, Euxoa messoria, Galleria mellonella, Grapholita molesta, Harrisina americana, Helicoverpa subflexa, Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Hemileuca oliviae, Homoeosoma electellum, Hyphantria cunea, Keiferia lycopersicella, Lambdina fiscellaria fiscelaria, Lambdina fiscellaria lugubrosa, Leucoma salicis, Lobesia botrana, Loxostege sticticalis, Lymantria dispar, Macalla thyrsisalis, Malacosoma sp. , Mamestra brassicae, Mamestra configurata, Manduca quinquemaculata, Manduca sexta, Maruca testulalis, Melanchra pieta, Operoptera brumata, Orgyia sp., Ostrinia

I 4 4 » · ·« • · · 4 cresphontes, californica, Pieris ηαρί, Pieris rapae, flouendana, Platynota sultana, nubilalis, Paleacrita vernata, Papilio Pectinophora gossypiella, Phryganidia

Phyllonorycter blancardella,

Plathypena scabra, Platynota

Schizura ocel lana, Tineola Xylomyges

Spilonota pityocampa,

Platyptilia carduidactyla, Plodia interpunctella, Plutella xylostella, Pontia protodice, Pseudaletia unipuncta, Pseudoplusia includens, Sabulodes aegrotata, concinna, Sitotroga cerealella,

Spodoptera sp., Thaurnstopoea bisselliella, Trichoplusia ni, Udea rubigalis, curialis, Yponomeuta padella. Kompozice podle vynálezu mohou být také účinné proti hmyzím škůdcům řádu Coleoptera, na příklad Leptinotarsa sp., Acanthoscelides obtectus, Callosobruchus chinensis, Epilachna varivestis, Pyrrhalta luteola, Cylas formicarius elegantulus, Listronotus oregonensis, Sitophilus sp., Cyclocephala borealis, Cyclocephala immaculata, Makrodactylus subspinosus, Popillia japonica, Rhizotrogus majalis, Alphitobius diaperinus, Palorus ratzeburgi, Tenebrio molitor, Tenebrio obscurus, Tribolium castaneum, Tríbolium confusum, Tribolius destructor; Dále řádu Diptera na příklad Aedes sp., Andes vittatus, Anastrepha ludens, Anastrepha suspensa, Anopheles quadrimaculatus, Armigeres subalbatus, Calliphora stygian, Calliphora vidná, Ceratitis capitata, Chironomus tentans, Chrysomya rufifacies, Cochliomyia macellaria, Culex sp., Culiseta inornata, Dacus oleae, Delia antiqua, Delía platura, Delia radicum, Drosophila melanogaster, Eupeodes corollae, Glossina austeni, Glossina brevipalpis, Glossina fuscipes, Glossina morsitans centralis, Glossina morsitans morsitans, Glossina morsitans submorsitans, Glossina pallidipes,

Glossina palpalis gambiensis, Glossina palpalis palpalis, Glossina tachinoides, Haemagogus equinus, Haematobia irritans, Hypoderma bovis, Hypoderma lineatum, Leucopis • Φ φφφφ φφ φφφφ • ΦΦΦ • *

ΦΦ 1 ninae, Lucilia čupřina, Lucilia sericata, Lutzomyia longlpaipis, Lutzomyia shannoni, Lycoriella mali, Mayetiola destructor, Musea autumnalis, Musea domestica, Neobellieria sp., Nephrotoma suturalis, Ophyra aenescens, Phaenicia sericata, Phlebotomus sp., Phormia regina, Sabethes cyaneus, Sarcophaga bullata, Scatophaga stercoraria, Stomaxys calcitrans, Toxorhynchites amboinensis, Tripteroides bambusa. Dále řádu Acari na příklad Oligonychus pratensis, Panonychus ulmi, Tetranychus urticae; nebo řádu Hymenoptera na příklad Iridomyrmex humilis, Solenopsis invicta; či řádu Isoptera na příklad Reticulitermes hesperus, Reticulitermes flavipes, Coptotermes formosanus, Zootermopsis angusticollis, Neotermes connexus, Incisitermes minor, Incisitermes immigrans; nebo řádu Siphonaptera na příklad Ceratophyllus gallinae, Ceratophyllus niger, Nosopsyllus segnis, Ctenocephalides canis,

Echicnophaga gallinacea, Pulex irritans, Xenopsylla cheopis, Xenopsylla vexabilis, Tunga penetrans; a řádu Tylenchida na příklad Melodidogyne ineognita, Pratylenchus penetrans.

fasciatus, Leptopsylla Ctenocephalides felis,

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 ukazuje mapu plasmidů pDN3000. Obrázek 2 ukazuje mapu plasmidů pE194^ts. Obrázek 3 ukazuje mapu plasmidů pPL1975. Obrázek 4 ukazuje mapu plasmidů pET235. Obrázek 5 ukazuje mapu plasmidů pCP115.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady jsou uváděny pro ilustraci, nikoliv však aby omezovaly.

4444

4··· • 4

4

4 · · • 4 4 4 4 • 4 4 4 · •444 44 ··

44

4 4 4 » 4 44

4 4 4

4 4

44

Příklad 1

Bakteriální kmeny a plasmidy

Bacillus thuringiensis subsp. aizawai EMCC0087 byl uložen v NRRL pod přírůstkovým číslem NRRL B-21147. Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki 4D7 a 4D9 (cry- HD-1) byl získán z Bacillus Genetic Stock Center na Ohio State University. Escherichia coli GM48 dam- dcm- byl popsán Yanish-Perronem a spol., 1985, Gene 33:103-119 a E. coli GM272 (Raleigh a spol., 1988, Nucl. Acids Res. 16:1563-1575; dam- dcm- hsd-) byl získán od New England Biolabs. Plasmid pBR322 vpůže být získán z komerčních zdrojů. Plasmid pMIHOlD byl popsán Youngmannem a spol., 1984, v Plasmid 12:1-9. Plasmid pE194^ts je ukázán na obrázku 2 a byl rovněž popsán Villafanem a spol., 1987, v J. Bact. 169:4822-4829. Plasmid pCP115 popsali Price a Doi, 1985, Mol. Gen. Genet. 201:88-95 a j e uveden na obrázku 5.

Plasmid pPL1975 je uveden na obrázku 3. K vytvoření pPL1975 byl použit následující postup. Plasmid pDN3000 byl vytvořen restriktováním pUC19 (Yanish-Perron a spol., 1985, Gene 33:103-119) s EcoRI a vložením následující sekvence oligonukleotidu (SEQ ID NOS:1 a 2),

5' -AATTGATCAAGCTTTAAATGCATGCTAGCAACGCGGCCGCCAACCTCGAGATCTCATG- 3 * 3' - CTAGTTCGAAATTTACGTACGATCGTTGCGCCGGCGGTTGGAGCTCTAGAGTACTTAA - 5' připravené na automatickém DNA syntetizéru fosfoamiditovou metodou, kterou popsali Beaucage a Caruthers, 1981, Tetrahedron Let. 22:1859-1869, do linearisovaného pUC19 a následovanou ligací. Ligovaná směs se potom použije k transformování kompetentních buněk E. coli SJ6 a tranformanty se třídí na LB destičkách obsahujících 100 pg/ml ampicilinu. Orientace vloženého článku v pDN3000 je, ·· φφφφ φφ φφφφ • · · • φ • · • · · •••Φ φφ φ φ φ φ • φ φ • φ • Φ φφ φφ • φ φ · φ φ φφ φ φφφ φ φ φ φ φ φφ φφ jak je na obrázku 1 naznačeno orientací restrikčních míst.

Plasmid pPL1975 se vytvoří vložením DNA obsahujícího

Mbol fragmentu restriktovaného z pE195 z posice 1 do 1585 v Bg/I místě pDN3000. Ligovaná směs se potom použije k transformování kompetentních buněk E. coli SJ6 a tranformanty se třídí na LB destičkách obsahujících 100 μg/ml ampicilinu. Orientace těchto dvou fragmentů je ukázána na obrázku 3. Pak tedy pPL1975 obsahuje funkční počátek replikace E. coli a pE194^^s DNA fragment obsahující intaktní plus počátek (+ ori PE194^{1 5}) a zkrácený repF gen (repl·’) (Villafane a spol., 1987, J. Bact. 169:4822-4829).

Příklad 2

Příprava genomické DNA

Genomická DNA z kmene Bacillus thuringiensis subsp. aizawai EMCC0087 byla připravena inokulací 2 ml LB (kultura Luria-Bertáni) kolonie Bacillus thuringiensis ve zkumavce opatřené šroubovacím uzávěrem. Po inkubaci při 37 °C přes noc bez třepání byl veškerý obsah zkumavky přenesen do 1 1 baňky obsahující 250 ml LB a kultivován za třepání 6 hodin při 37 C a při 300 otáčkách za minutu. Obsah baňky byl shromážděn při 8000 otáčkách za minutu do GSA rotoru a vzniklý sbalek byl znovu suspendován ve 20 ml TE pufru (10 mM Tris, pH 7,9, 1 mM EDTA) v 25 ml centrifugační zkumavce Corex. Přidalo se přibližně 20 mg pevného lysozymu a obsah zkumavky byl promísen mírným obracením. Po 10-ti minutové inkubaci při 37 °C byl přidán 1 ml 0,5 M EDTA a 0,5 ml 2M Tris, pH 7,9. Obsah zkumavky byl znovu promísen mírným obracením a ponechán inkubaci po dalších 15 minut. Potom bylo přidáno 200 μΐ RNase A (10 mg/ml), pak následovala 15-ti minutová inkubace při 37 °C a přidalo se 2,3 ml 10 %-ního SDS. Byla přidána proteinaza (2 mg), obsah zkumavky byl podroben 2. hodiny inkubaci při 50 ’C, rozdělen do dvou Corex zkumavek a nejméně dvakrát extrahován fenolem a dvakrát fenol/chloroformem. Genomická DNA byla vysrážena 1/10 objemu octanu sodného a 2,5 objemy 95% ethanolu a znovu suspendována v přibližně 5 ml TE pufru.

Příklad 3

Vytvoření plasmidu pET235

Serie DNA fragmentů kmene Bacillus thuringiensis subsp. aizawai EMCC0087 vybrané velikosti byla vytvořena štěpením genomické DNA EcoRI, gelovou elektroforesou, vybráním řezů fragmentů 6 kb a větších a uvolněním z agarosy elektroelucí. Po ligaci fragmentů do EcóS.1 místa pBR322 a tranformaci do E. coli kmen XL-1 Blue MRF* (Stratagene Clonig Systems; Jerpseth a spol., 1992, Strategies 5[3]:81), fragment 8-kb ZscoRI nesoucí cryC gen se klonuje, jak bylo dříve popsáno (Sambrook a spol., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY), skupinovou hybridisací kolonií, prozkoumávaj ící, aby se pomocí fragmentu DNA odpovídaj íciho nukleotidům 869 až 1175 crylC genu (Honée a spol.,1988, Nucleic Acids Research 16:6240) s přidáním čtyř nukleotidů (CGGG) ke 5* konci, vytvořilo funkční JSamHI místo. Tato sonda vzniká PCR amplifikaci genomické DNA kmene Bacillus thuringiensis subsp. aizawai EMCC0087 a je níže uvedena jako SEQ ID NO:3:

’ - CGGGATCCACAGTTACAGTCTGTAGCTCAATTACCTACTTTTAACGTTATGGAGAGCA GCCGAATTAGAAATCCTCATTTGATATATTGAATAATCTTACAATCTTTACGGATTGGTTT AGTGTTGGACGCAATTTTTATTGGGGAGGACATCGAGTAATATCTAGCCTTATAGGAGGTG GTAACATAACATCTCCTATATATGGAAGAGAGGCGAACCAGGAGCCTCCAAGATCCTTTAC TTTTAATGGACCGGTATTTAGGACTTTATCAAATCCTACTTTACGATTATTACAGCAACCT TGGCC-3’ .

• ·

Gen C(pZc) fosfolipázy kmene Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki 4D7 byl podroben PCR amplifikací za použití primérů obsahujících BamHI nísta. Primery jsou níže uvedeny: 5' -TTGGATCCAGGGAAATATTATTTATACGTCTATAAATAT- 3' (SEQ ID NO: 4 ) 5' -TTGGATCCGAATAAAAAATCATGTGGAAACTTCATAG-3' (SEQ ID NO: 5). Amplifikovaný fragment byl štěpen RíztoHI a vložen do BamHI místa u pCP115. 850 bp fragment EcoUl-BamHI obsahující 3^} polovinu pel genu se potom vkládá mezi EcoRI a BamHI místa u PL1975. Plasmid pET231 se vytvoří insercí fragmentu 8-kb EcoRI nesoucího cryC gen do EcoRI místa u pNNB 11. Plasmid pET235 (viz obrázek 1) se vytvoří insercí cat nesoucího

1,5-kb BamHI fragmentu pMIllOlD do BamHI místa u pET231.

Příklad 4

Integrace a amplifikace plasmidu pET235

Buňky E. coli byly podrobeny elektroporací pomocí Bio-Rad Gene Pulseru, jak je výrobcem popsáno. Buňky kmene Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki 4D9 byly pro elektroporací připraveny metodou, kterou popsal Macaluso a Mettus (1991, J. Bacteriol. 173:1353-1356). Avšak na rozdíl od j ej ich postupu nebyly na Gene Pulseru činěny žádné elektrické modifikace. Namísto toho byly buňky umístěny do 0,2 cm kyvety a podrobeny elektroporací při 800 ohmech, 25 gF a 1600 voltech (8000 voltů na cm). Plasmid DNA pro elektroporací byl připraven v E. coli GM272 (dam- dem- hsd-), která obvykle dává vyšší výtěžky transformace Bacillu thuringiensis než dává plasmid DNA připravený z GM48 (damdem-). Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki 4D9 byl transformován s pE194^ts a kolonie byly vybírány na LB destičkách obsahujících 5 gg erythromycinu na ml. Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki 4D9 nesoucí pomocný plasmid pE194ts byl transformován pomocí pET235 a kolonie byly • · · ·

• · · · • · ·· • · · · · · vybírány na LB destičkách obsahujících 10 μg chloramfenicolu na ml. Integrant EMCC0122 se vybírá na základě velikosti krystalu zjišťované fázovou kontrastní mikroskopií jak je popsáno svrchu.

Příklad 5

Stanovení velikosti krystalu crylC integrantů EMCC0122 kmene Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki 4D9

Měření krystalů byla prováděna fotografováním přípravy spory/krystalu pomocí Zeiss-ova Axioscopu a potom kopírováním zvětšeni. Měření pravítkem a potom každém snímku, aby negativů do konečného 2000-násobného krystalů v milimetrech bylo provedeno normalizováno na průměrnou délku spor na se srovnaly jakékoliv rozdíly při zvětšování snímku. Za předpokladu, že dospělá endospora má přibližně 1 gm délky ve svém nej delším průměru, mají krystaly rozměry uvedené v Tabulce 1.

Výsledky jsou uvedeny níže v Tabulce 1.

TABULKA 1

Rozměry krystalu cryC integrantů EMCC0122

Vzorek	Délka kryst. (μιη)	Rozsah (μ®)	Šířka kryst. (μιη)	Rozsah (μ®™)	Ob j em kryst. (μιη3)	Počet
EMCC0122	l,0± ±0,17	0,74± ±1,4	0,60± ±0,083	0,45± ±0,76	0,12± ±0,055	20

Příklad 6

Kultivace crylC integrantů EMCC0122 kmene Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki 4D9

Subkultura crylC integrantů EMCC0122 kmene Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki 4D9, udržovaná při -80 °C jako 40%-ní zásobní roztok v glycerolu byla ve 250 ml uzavřených třepacích baňkách použita k naočkování 50 ml P/Y media, které mělo následující složení:

Kyselina citrónová kh₂po₄

CaCl₂.H₂0

MgSO₄.7H₂O

Maltrin-100

Extrakt kvasnic

Pepton

Stopové kovy

1,0 g/1 1,3 g/1 0,33 g/1 0,67 g/1 g/1 10 g/1 15,3 g/1

0,3 ml/1 pH media bylo za použití 10 N NaOH adjustováno na 7,0.

Po naočkování byly třepací baňky inkubovány při 30 °C 72 hodin na rotační třepačce o 250 ot/min. Všechny kultury byly stabilizovány přídavkem 10 mg sorbátu draselného, 3 mg benzoanu sodného a 0,5 mg parabenu na ml kultury, 30%-ní ΗβΡΟ₄ adjustovány na pH 4,5 a uchovávány při 5 °C.

Příklad 7

Bioessay krystalického delta-endotoxinu z crylC integrantu EMCC0122 kmene Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki 4D9 proti Spodoptera exigua

Účinnost crylC integrantu EMCC0122 kmene Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki 4D9 byla stanovena bioessayem s přidáváním výživy pro larvy třetího mezistadia vývoje Spodoptera exigua.

Veškerá kultura crylC integrantu EMCC0122 kmene Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki 4D9 z příkladu 6 se naředila po sériích, aby se zjistil rozsah účinnosti. Jako referenční standard se rovněž analyzoval Bacillus thuringiensis subsp.

aizawai EMCC0087 kultivovaný jak popsáno v příkladu 6.

alikvotních podílů, g roztavené potravy.

Standardní umělá potrava složená z vody, agaru, cukru, kaseinu, pšeničných klíčků, methylparabenu (= methyl 4-hydroxybenzoát), sorbové kyseliny, oleje z lněných semen, celulosy, solí a vitaminů byly připravena ve 20 1 kotli. To poskytuje dostatek potravy pro testování 10 až 12 vzorků se sedmi různými koncentracemi testované substance. Veškerá kultura z přípravy integrantu EMCC0122 kmene Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki se naředila po sériích na 16 Každý alikvot se přidal ke 184 Potom se směs homogenisovala a poté nalila na plastový tác, který měl 40 jednotlivých jímek. Pro každou dávku potravy byly připraveny tři kontrolní tácy. Jakmile byla potrava ochlazena a ztuhla, byla do každé jímky přidána jedna larva Spodoptera exigua třetího stadia vývoje a tácy byly pokryty perforovanou folií průhledného plastu. Tácy byly umístěny do polic a po čtyři dny byly podrobeny inkubaci při 28 °C a 65%-ní vlhkosti.

Po čtyřech dnech byla spočítána mortalita hmyzu. Na vršek každého tácu bylo zamířeno prudké fouknutí a larvy, které se nehýbaly byly počítány jako mrtvé. Byla vypočtena procenta mortality a data byla analyzována pomocí paralelních kontrolních analýz. Byly stanoveny LC50, LC90, směrnice regresních přímek, koeficient odchylek (CV) a potence ve Spodoptera jednotkách (SU). Stanovení se provádělo nejméně třikrát nebo pokud tři účinnosti nebyly do 20 % průměru vypočteného pro každý vzorek.

Výsledky jsou udány níže v Tabulce 2. Účinnost EMCC0122 je přibližně dvakrát taková jako u Bacillus thuringiensis subsp. aizawai EMCC0087.

• · · · • · «· ·· ► · · «

I · ·· • · · · « • · « • · · ·

Tabulka 2

Účinnost crylC integrantu EMCC0122 na Spodoptera exigua

Vzorek	LC50	LC90	Směrnice	CV	SU
EMCC0087	3127	16922	2,1	10,2	750
EMCC0122	2074	8021	2,2	9,7	1671

Uložení mikroorganismů

Následující kmeny Bacillus thuringiensis byly uloženy v Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory (NRRL), 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604, USA.

Kmen_Přírůstkové číslo_Datum uložení

EMCC0087

EMCC0122

NRRL B-21147 NRRL B-21386

6. října 1993 19. ledna 1995

Kmeny byly deponovány za podmínek, které zaručuj i, že přístup ke kultuře bude patentové přihlášce tomu, and Trademarks (předseda dosažitelný během řízení o této koho určí Commisioner of Patents úřadu pro patenty a ochranné známky), který je pro to zmocněn podle 37 C.F.R. 1,14 a 35 U.S.C. 122. Uložený vzorek představuje v podstatě čistou kulturu každého deponovaného kmene. Uložený vzorek je dostupný, jak vyžadují cizí patentová práva v zemích, v nichž jsou zaregistrovány protějšky nebo příbuzné přihlášky subjektu. Je však třeba pochopit, že dostupnost uloženého vzorku nezakládá volnost provozovat předložený vynález za narušení patentových práv udělovaných státním aktem.

Přemětný deposit kultury bude dále uchováván a pro veřejnost přístupný v souhlase s ustanoveními Budapešťské dohody o depositu mikroorganismů, tj. bude uchováván se vší • ·

·· · · · • · · • · · · životnosti a pěti let po péčí nezbytnou pro udržení jejich zabránění kontaminace v období nejméně nejposledněší žádosti o poskytnutí vzorku depositu a v každém případě po dobu nejméně 30 (třiceti) let po datu uložení nebo vymahatelné platnosti každého patentu, který může být vydán o objevu kultury. Ukladatel uznává povinnost vyměnit deposit pokud by depositní místo nemohlo poskytnout žádaný vzorek vzhledem k podmínkám depositu. Všechna omezení veřejné přístupnosti předmětného depositu kultury budou neodvolatelně odstraněna po udělení patentu, který jej popisuje.

Zde popsaný a nárokovaný vynález není ommezován v rozsahu zde popisovanými typickými příklady, protože tyto příklady jsou zamýšleny jako ilustrace různých aspektů vynálezu. Každé ekvivalentní případy jsou považovány, že spadají do rozsahu tohoto vynálezu. Různé modifikace vynálezu kromě těch, které jsou zde ukázány a popsány, se ovšem z předcházejícího popisu stanou zřejmými pro zkušené odborníky. Takové modifikace je třeba rovněž považovat, že spadaj i do rozsahu připoj ených patentových nároků.

Citují se různé odkazy a na jejich obsah se v jejich celistvosti odkazuje.

Claims (31)

1. PATENTOVÉ NÁRO

   1. Způsob získávání integrantů thuringiensis vyznačující se

   a) do buňky hostitelského kmene Bacillus thuringiensis (i) zavede první DNA vektor, obsahující první počátek replikace a nejméně jeden funkční gen kódující nejméně jeden faktor, potřebný pro replikaci plasmidu z řečeného prvního počátku replikace, a s ním (ii) druhý DNA vektor, obsahující druhý počátek replikace, avšak postrádající funkční gen nebo jeho část kódující faktor, potřebný pro replikaci plasmidu z druhého počátku replikace, stejně jako heterologickou sekvenci DNA kódující delta-endotoxin Bacillu thuringiensis a sekvenci DNA, která je homologická s oblastí genomu řečeného mateřského kmene a (b) buňka z kroku (a) kultivuje za vybraných podmínek vedoucích k integraci řečeného druhého DNA vektoru do genomu řečené mateřské buňky homologickou rekombinací a ztrátě prvního DNA vektoru.
2. 2. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že hostitelským kmenem Bacillu thuringiensis je cry kmen.
3. 3. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že se hostitelský kmen Bačillu thuringiensis volí ze skupiny kmenů Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, Bacillus thuringiensis subsp. aízawai, Bacillus thuringiensis subsp. galleriae, Bacillus thuringiensis subsp. entomocidus, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis, Bacillus thuringiensis subsp. alesti, Bacillus thuringiensis subsp. canadiensis, Bacillus thuringiensis subsp.. darmstadiensis, Bacillus • · · · • · thuringiensis subsp. dendrolimus, Bacillus thuringiensis subsp. finitimus, Bacillus thuringiensis subsp. kenyae, Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni, Bacillus thuringiensis subsp. subtoxicus, Bacillus thuringiensis subsp. toumanoffi, Bcillus thuringiensis subsp. toumanoffi, Bacillus thuringiensis subsp. pondicheriensis, Bacillus thuringiensis subsp. shandogiensis, Bacillus thuringiensis subsp. sotto, Bacillus thuringiensis subsp. nigeriae, Bacillus thuringiensis subsp. yunnanensis, Bacillus thuringiensis subsp. dakota, Bacillus thuringiensis subsp. indiana, Bacillus thuringiensis subsp. tohokuensis, Bacillus thuringiensis subsp. kumamotoensis, Bacillus thuringiensis subsp. tochigiensis, Bacillus thuringiensis subsp. thompsoni, Bacillus thuringiensis subsp. wuhanensis, Bacillus thuringiensis subsp. kyushuensis, Bacillus thuringiensis subsp. ostriniae, Bacillus thuringiensis subsp. tolworthi, Bacillus thuringiensis subsp. pakistani, Bacillus thuringiensis subsp. japonensis, Bacillus thuringiensis subsp. colmeri, Bacillus thuringiensis subsp. pondicheriensis, Bacillus thuringiensis subsp. shandongiensis, Bacillus thuringiensis subsp. neoleonensis, Bacillus thuringiensis subsp. coreanensis, Bacillus thuringiensis subsp. silo, Bacillus thuringiensis subsp. mexicanensis a Bacillus thuringiensis subsp. israelensis.
4. 4. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že hostitelským kmenem je Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki.
5. 5. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že sekvence DNA kódující delta-endotoxin je crylC gen.

   • ·
6. 6. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že se sekvence DNA kódující delta-endotoxin získá z kmene Bacillus thuringiensis vybraného ze skupiny zahrnující Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, Bacillus thuringiensis subsp. aizawai, Bacillus thuringiensis subsp. galleriae, Bacillus thuringiensis subsp. entomocidus,

   Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis, Bacillus thuringiensis subsp. alesti, Bacillus thuringiensis subsp. canadiensis, Bacillus thuringiensis subsp. darmstadiensis, Bacillus thuringiensis subsp. dendrolimus, Bacillus thuringiensis subsp. finitimus, Bacillus thuringiensis subsp. kenyae, Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni, Bacillus thuringiensis subsp. subtoxicus, Bacillus thuringiensis subsp. toumanoffi, Bacillus thuringiensis subsp. toumanoffi, Bacillus thuringiensis subsp. pondicheriensis, Bacillus thuringiensis subsp. shandogiensis, Bacillus thuringiensis subsp. sotto, Bacillus thuringiensis subsp. nigeriae, Bacillus thuringiensis subsp. yunnanensis, Bacillus thuringiensis subsp. dakota, Bacillus thuringiensis subsp. indiana, Bacillus thuringiensis subsp. tohokuensis, Bacillus thuringiensis subsp. kumamotoensis, Bacillus thuringiensis subsp. tochigiensis, Bacillus thuringiensis subsp. thompsoni, Bacillus thuringiensis subsp. wuhanensis, Bacillus thuringiensis subsp. kyushuensis, Bacillus thuringiensis subsp. ostriniae, Bacillus thuringiensis subsp. tolworthi, Bacillus thuringiensis subsp. pakistani, Bacillus thuringiensis subsp. japonensis, Bacillus thuringiensis subsp. colmeri, Bacillus thuringiensis subsp.

   pondicheriensis, Bacillus thuringiensis subsp.

   shandongiensis, Bacillus thuringiensis subsp. neoleonensis, Bacillus thuringiensis subsp. coreanensis, Bacillus thuringiensis subsp. sílo, Bacillus thuringiensis subsp.

   mexicanensis a Bacillus thuringiensis subsp. israelensis.
7. 7. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že se sekvence DNA kódující delta-endotoxin získává z kmene Bacillus thuringiensis subsp. aizawai.
8. 8. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že volitelný signální znak z druhého DNA vektoru je sekvence DNA kódující antibiotickou resistenci.
9. 9. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že první DNA vektor obsahuje dále volitelný signální znak, přičemž se tento signální znak liší od volitelného signálního znaku ve druhém DNA vektoru.
10. 10. Způsob podle nároku 1 vyznačující se t i m, že první DNA vektor obsahuje první počátek replikace z jednovláknového DNA plasmidu a funkční rep gen a druhý DNA vektor obsahuje druhý počátek replikace z jednovláknového DNA plasmidu, avšak postrádá funkční rep gen, DNA sekvenci kódující delta-endotoxin kmene Bacillus thuringiensis a DNA sekvenci, která je homologická s oblastí genomu řečeného hostitelského kmene.
11. 11. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, ž e se buňka v kroku (b) podrobí inkubaci při kolem 37 °C.
12. 12. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že řečený způsob dále zahrnuje amplifikaci integrované DNA sekvence kultivací integrantu z kroku (b) za přítomnosti vzrůstajících množství selektujícího činidla.

    ···· ··
13. 13. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že integrant má všechny identifikační charakteristiky kmene EMCC0122, uloženého v NRRL a majícího přírůstkové číslo NRRL B-21386.
14. 14. Integrant Bacillu thuringiensis nebo jeho spora, který produkuje nejméně jeden heterologický krystalický delta-endotoxin.
15. 15.

    integrant

    Integrant podle nároku 1, kde integrantem Bacillu thuringiensis subsp. kurstaki.

    je
16. 16.

    integrant

    Integrant podle cry- kmene.

    nároku

    1, kde integrantem j e
17. 17. Integrant delta-endotoxinem je podle nároku CrylC protein.

    1, kde heterologickým
18. 18. Integrant podle nároku 1, kde identifikační charakteristiky kmene v NRRL a maj ícího přírůstkové číslo NRRL integrant má všechny EMCC0122, uloženého B-21386.
19. 19. Integrant podle nároku 1, kde integrant produkuje větší množství krystalického delta-endotoxinu s větší pesticidní účinností ve srovnání s krystalickým delta-endotoxinem produkovaným mateřským kmenem.
20. 20. Integrant podle nároku 1, kde produkovaný delta-endotoxin je účinný proti hmyzímu škůdci.
21. 21. Integrant podle nároku 1, kde produkovaný delta-endotoxin je účinný proti hmyzímu škůdci řádu Lepidoptera.

    ·· • · • · • · · · ·· ···· ·· ····
22. 22. Pesticidní komposice vyznačující se t i m, ž e obsahuje (a) integrant podle nároku 1 a (b) pesticidně přijatelný nosič.
23. 23. Konstrukt DNA, obsahující (a) druhý počátek replikace, avšak postrádající funkční gen nebo jeho část kóduj ící faktor nutný pro replikaci plasmidu z druhého počátku replikace; (b) DNA sekvenci kódující delta-endotoxin Bacillu thuringiensis·, (c) sekvenci DNA, která je homologická s oblastí genomu Bacillu thuringiensis·, a (d) volitelný signální znak.

    10.

    DNA vektor, obsahuj ící konstrukt

    DNA podle nároku
24. 25. Způsob potírání škůdce vyznačující se t í m, ž e se škůdce vystaví efektivnímu množství škůdce potírající pesticidní komposice, obsahující (a) integrant kmene Bacillus thuringiensis nebo jeho spory, produkující nejméně jeden heterologický krystalický delta-endotoxin, a (b) pesticidně přijatelný nosič.
25. 26. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že integrantem je integrant kmene Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki.
26. 27. Způsob podle nároku 1 tím, že integrantem je vyznačuj ící integrant kmene cry-.
27. 28.

    t í m, ž

    Způsob podle nároku 1 vyznačující se e heterologickým delta-endotoxinem je CrylC protein.

    ·· • · • · · ·
28. 29. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že integrant má všechny identifikační charakteristiky kmene EMCC0122, uloženého v NRRL a majícího přírůstkové číslo NRRL B-21386.
29. 30. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že integrant produkuje větší množství krystalického delta-endotoxinu s větší pesticidní účinností ve srovnání s krystalickým delta-endotoxinem produkovaným odpovídajícím mateřským kmenem.
30. 31. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, ž e produkovaný delta-endotoxin je účinný proti hmyzímu škůdci.
31. 32. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, ž e produkovaný delta-endotoxin je účinný proti hmyzímu škůdci řádu Lepidoptera.