CZ282676B6

CZ282676B6 - Farmatetické bakteriocinové směsi

Info

Publication number: CZ282676B6
Application number: CZ941661A
Authority: CZ
Inventors: Peter Blackburn; Steven J. Projan; Edward B. Goldberg
Original assignee: Ambi, Inc.
Priority date: 1992-01-17
Filing date: 1993-01-15
Publication date: 1997-08-13
Also published as: AU672384B2; GR3024049T3; RU94037764A; CA2127987A1; JP3719520B2; EP0623024B1; FI943261L; RU2104710C1; SK83794A3; HU9402110D0; SK282523B6; CZ166194A3; NO942644D0; KR100282166B1; FI943261A0; CA2127987C; NO314221B1; JPH07508499A; NO942644L; MX9300207A

Abstract

Přípravky zahrnující bakteriocidy obsahující lanthionin, jako je nisin, působí jako baktericidy za podmínek vyskytujících se v gastrointestinálním traktu. V přednostním provedení se těchto farmaceutických přípravků používá pro potlačování bakterií, které jsou zodpovědné za poruchy gastrointestinálního traktu.ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká použití směsi zahrnující bakteriocin obsahující lanthionin a chelatační činidlo a popřípadě také kyselé vehikulum pro výrobu léčiva.

Dosavadní stav techniky

Antimikrobiální účinnost bakteriocinu obsahujícího lanthionin, nisinu, je omezena na určité gram-pozitivní organismy a je optimální při pH 5,0. Antimikrobiální účinnost nisinu se zvýší, když se ho používá v kombinaci s chelatačním činidlem, jako je EDTA. Bylo zjištěno, že účinnost kombinací nisinu s chelatační sloučeninou je podstatně vyšší nebo optimální při pH nad 5,0. Tak například se zjistilo, že antimikrobiální účinnost kombinace nisinu a EDTA proti Staphylococcus aureus, je podstatně vyšší při pH 8,0 ve srovnání s účinností stejné kombinace proti S. aureus při pH 5,0. Také se zjistilo, že kombinace chelatační sloučeniny s nisinem je účinná proti gram-negativním bakteriím, což je účinnost, kterou samotný nisin za normálních okolností nemá.

Přítomnost patogenních mikroorganismů v gastrointestinálním traktu způsobuje různé gastrointestinální choroby, jako je diarrhea, gastritis, peptické a dvanáctníkové vředy a karcinomy žaludku. Jedná se zejména o Escherichia a Salmonella, ale také o určité druhy Clostridia, Bacillus, Bacteriodes, Campylobacter aYersinia, které mohou být zodpovědné za diarrheu, zejména u nově narozených hospodářských zvířat. (R. E. Holland, 1990, Clin. Microbiol. Rew. 3 : 345, Some infectious causes of diarrhea in young farm animals.) Helicobacter pylori je příčinou gastritis a peptických a duodenálních vředů (Peterson, W. L., 1991, New Eng. J. Med. 324: 1043, Helicobacter pylori and peptic ulcer disease) a také jsou spojovány se vznikem karcinomu žaludku. (Henderson, B. E., Ross, R. K. aPike, M. C., 1991, Science 254 : 1131, Toward the primary prevention of cancer, Nomura, A. Stemmermann, G. A., Chyou, P. H., Kato, I., Perez-Perez, G. a Blaser, M. J. (1991) New Eng. J. Med. 325 : 1132 Helicobacter pylori infection and gastric carcinoma among Japanese Americans in Hawaii.; Parsonnet, J., Friedman, G. D., Vandersteen, D. P., Chang, Y., Vogelman, J. H., Orentreich, N, a Sibley, R. K. (1991) New Eng. J. Med. 325 : 1127; Forman, D., Sitas, F., Newell, D. G., Stacey, A. R., Boreham, J., Peto, R., Campbell, T. C., Li, J. aChen, J. (1990) Int. J. Cancer 46 : 608 Geographic association of Helicobacter pylori antibody prevalence and gastric cancer mortality in rural China).

Mnohé gastrointestinální patogeny jsou gram-negativní bakterie, tedy organismy, u nichž by nebylo možno očekávat účinnost nisinu. (Hurst, A., 1981, Nisin Adv. in App. Micr, V. 27, str. 85 až 121.) Tak například Helicobacter pylori (který byl v literatuře také označován názvem Campylobacter pylori) je gram-negativní mikroaerofilní bacil, který kolonizuje žaludeční sliznici. Od roku 1983, kdy byl poprvé citován v souvislosti s histologickou gastritis, byly publikovány práce, v nichž je sledován vztah mezi potlačováním infekce H. pylori a zlepšením gastrických poruch. Přestože byla zkoušena různá antibiotika proti infekcím H. pylori, žádné z nich se až dosud neukázalo jako přijatelné, a proto nebylo proti tomuto organismu schváleno žádné činidlo ani žádný léčební režim. Dlouhodobého vyhlazení tohoto organismu bylo dosaženo jen zřídka a samotná antibiotika mohou způsobovat nepřijatelné vedlejší účinky. (Peterson, W. L. 1991, New Eng. J, Med. 324 : 1043 Helicobacter pylori and peptic ulcer disease; Warren, J. R., 1983, Lancet 1 : 1273, Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis; Morgan et al., 1988, Gastroenterology 95 : 1178, Nitrofúrans in the treatment of gastritis associated with Campylobacter pylori: Glupczynski, Y. et al., 1988, Am. J.

- 1 CZ 282676 B6

Gastroenterol. 83 : 365 Campylobacter pylori-associated gastritis: a double-blind placebo controlled trial with amoxycillin; Rauws, E. A. et al., 1988, Gastroenterology 94 : 33, Campylobacter pylori-associated chronic antral active gastritis; Glupczynski, Y. 1990, Helicobacter pylori, gastritis, and peptic ulcer; Malfertheiner, P., Ditschuneit, H., Eds. SpringerVerlag, Berlin, Germany 49-58; Rauws, E. A. a Tytgat, G. N. 1990 Lancet 335 : 1233 Cure of duodenal ulcer associated with eradication of Helicobacter pylori. O'Riordan, T. et al., 1990, Gut 31 : 999 Adjuvant antibiotic therapy in duodenal ulcers treated with colloidal bismuth subcitrate; Weil, J. et al., 1990, Aliment. Pharmacol. Ther., 4 : 651 Helicobacter pylori infection treated with a tripotassium dicitrato bismuthate and metronidazole combination; Coghlan, J. G., Gilligan, D., Humphries, H., et al., 1987, Lancet 2 : 1109 Campylobacter pylori and recurrence of duodenal ulcer a 12-month follow-up study; Marshall, B. J. Goodwin, C. S., Warren, J. R. et al., 1988, Lancet 2:1437, Prospective double-blind trial of duodenal ulcer relapse after eradication of Campylobacter pylori).

Nyní se v souvislosti s vynálezem zjistilo, směsi zahrnující bakteriocin obsahující lanthionin a chelatační činidlo se hodí pro výrobu léčiv, která jsou účinná i při nízké hodnotě pH.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je použití směsi zahrnující bakteriocin obsahující lanthionin a chelatační činidlo pro výrobu léčiva pro léčení a prevenci gastrických poruch vyvolaných patogenními mikroorganismy v žaludku. Tato směs s výhodou obsahuje také kyselé vehikulum. Léčiva vyrobená za použití směsi podle vynálezu jsou baktericidně účinná v kyselé oblasti pH pod 5,0 a vykazují významnou účinnost proti gram-negativním bakteriím. Mohou být užitečná například při léčbě nebo prevenci infekcí nebo růstu mikroorganismů v gastrointestinálním traktu lidí a zvířat. Tato antibakteriální účinnost může být užitečná při potlačování infekcí způsobených gastrointestinálními patogeny, jako jsou druhy Helicobacter, Escherichia, Salmonella, Bacillus, Clostridia, Bacteriodes, Campylobacter aYersinia. Bakteriocinová léčiva vyrobená za použití směsi podle vynálezu, budou tedy užitečná při léčbě různých chorob nebo symptomů způsobených přítomností takových patogenních bakterií. Léčiva či farmaceutické přípravky vyrobené za použití směsi podle vynálezu (dále jsou označována názvem farmaceutické přípravky podle vynálezu) působí rychle, takže když se dopraví do žaludku a gastrointestinálního traktu, neměla by být jejích účinnost omezena rychlostí vyprazdňování obsahu žaludku. Na rozdíl od antibiotik, je kromě toho možné požívat tyto přípravky bezpečně. Je možno používat samostatně, jako součásti léčebného režimu nebo v kombinaci s jinými farmaceutickými činidly nebo léčivy.

Následuje podrobnější popis tohoto vynálezu.

Účinnost přípravků podle vynálezu byla zkoušena proti bakteriím E. coli, které se vyskytují ve střevech savců a které jsou často zodpovědné za gastrointestinální poruchy. Přežití E. coli není ovlivňováno expozicí samotné EDTA nebo citrátu, ani expozicí samotnému nisinu. Kromě toho, suspenze E. coli exponované kyselině dobře přežívají v kyselém prostředí, pokud hodnota pH neklesne pod 2,5. Když se však (jak je to popsáno dále) nisin kombinuje s EDTA v kyselé oblasti pH, dosáhne se podstatného snížení života schopnosti bakterií již po jedné minutě od expozice takovým nisinovým přípravkům. Při pH 3,5 se dosáhne snížení počtu životaschopných bakterií o více než 6 desetinných řádů již po jedné minutě od začátku expozice přípravku zahrnujícímu nisin a chelatační činidlo. Při hodnotě pH nižší než 3,5 se sice projeví určité snížení účinnosti nisinových přípravků, nicméně dokonce při pH 2,5 je účinnost takového přípravku stále ještě tisíckrát vyšší než účinnost samotného nisinu (viz tabulka 1).

-2CZ 282676 B6

Nisin aktivovaný EDTA působí baktericidně proti E. coli za přítomnosti různých kyselých vehikul, jako jsou acetáty, citráty, laktáty a sukcináty (viz tabulky 2 až 5). Jak je zřejmé z výsledků dosažených při pH 3,5, rychlou baktericidní účinnost nisinových přípravků je možno ovlivnit volbou kyselého vehikula. Ve všech ilustrovaných případech je pozorován pokles baktericidní účinnosti nisinových přípravků se zvyšující se koncentrací každého kyselého aniontu. Nicméně všechna tato kyselá vehikula jsou vhodná pro zvýšení aktivity nisinu působením chelatačních činidel. Expozice bakterií takovým nisinovým přípravkům po dobu delší než je jedna minuta účinně snižuje počet bakterií i v tom případě, když přípravky obsahují méně účinné koncentrace kyselých vehikul.

Hodnocení germicidní účinnosti nisinu aktivovaného chelatačním činidlem v kyselých vehikulech proti gram-negativním bakteriím

Rychlá účinnost různých přípravků obsahujících nisin aktivovaný chelatační látkou byla hodnocena v kyselých vehikulech za použití germicidní zkoušky prováděné v suspenzi.

Buňky E. coli z noční kultury na sojovém živném agaru s tryptikasou (Trypticase soy nutrient agar (TSA) se resuspendují na hustotu odpovídající absorbanci 1,0 při 600 nm ve sterilní deionizované a destilované vodě. Reakce buněk s každým z analyzovaných baktericidních přípravků se zahájí přidáním 30 μΐ buněk k970 μΙ zkoušeného přípravku. Reakční směs se inkubuje při 30 °C po dobu alespoň 1 minuty a potom se 1 minutu odstřeďuje v mikrocentrifuze. Buněčná peleta se promyje resuspendováním v 1 ml neutralizačního pufru. (Neutralizační pufr o složení: 50 mM Tris-HCl, pH 7,0, 5 mM síran hořečnatý, 20 mM chlorid vápenatý, 0,1 M chlorid sodný a 0,1 % želatina se připraví tak, že se nejprve připraví Tris-pufr, nastaví se jeho pH a přidají se soli a želatina, načež se vzniklá směs míchá za tepla tak dlouho, dokud nevznikne čirý roztok. Tento roztok se potom 20 minut zpracovává v autoklávu. Neutralizačního pufru se používá bez ředění.) Buňky se 1 minutu odstřeďují v mikrocentrifuze po dobu 1 minuty a potom se resuspendují v 1 ml neutralizačního pufru. Počet životaschopných buněk se stanovuje tak, že se 100 μΐ bakteriální suspenze nebo sériově zředěných suspenzí, které jsou zní vyrobeny ředěním neutralizačním pufrem, rozprostře na živném agaru a po 24 hodinách inkubace při 37 °C se spočítají přežívající kolonie. Ze zjištěných hodnot se vypočítá poměr přežití v procentech, vztažený na neošetřený kontrolní vzorek.

Zjistí se účinnost nisinu aktivovaného EDTA při nízké hodnotě pH. Při pH pod 3,5 je stupeň aktivace nižší, což je zřejmě důsledkem titrace karboxylových skupin chelatačního činidla. Nicméně dokonce při pH 2,5 se stále ještě dosahuje tisícinásobného zvýšení účinnosti nisinu pomocí EDTA (viz výsledky uvedené v tabulce 1). V tabulkách 1, 2, 4 a 8 až 13 znamenají hodnoty, kterým předchozí symbol <, hodnoty procenta přežití, vztažené na počáteční koncentraci životaschopných bakterií (vyjádřenou počtem jednotek vytvářejících kolonie (cfu)/l ml) ve zkoušené bakteriální suspenzi a alikvotním objemu této suspenze odebrané na zkoušení, které odpovídají nulové detekci přežívajících kolonií.

-3 CZ 282676 B6

Tabulka 1

Aktivace nisinu EDTA proti Escherichia coli Závislost na kyselé hodnotě pH

EDTA	Nisin			Hodnota pH
mM	ua/ml	7,0	2,0	2,5	3,0	3,5	4,0
				% přežití po 1 minutě³
0	0	100^b	-		100
0	100	-	0,28	3,37	4,43	100	100
1,0	0	-	0,07	5,41	-	-
1,0	100	-	0,01	0,005	0,0007	<10^	<10

a Inkubace se provádí při 37 °C ve 20 mM pufru s octanem sodným s přizpůsobenou hodnotou pH.

b Počáteční počet životaschopných bakterií - 4 x 10⁷ cfu/ml

Tabulka 2

Aktivace nisin-acetátu chelatačním činidlem proti Escherichia coli Závislost na koncentraci acetátu

EDTA mM

Nisin ug/ml

Koncentrace acetátu (g/1) při pH 3,5

1_____________3_____________10____________30 % přežití po 1 minutě³

0	0	100^b	55	80	90	10,1
0	100	-	9,6	70	100	100
1,0	0	-	40	25	25	10,7
1,0	100	-	0,0005	<10^	0,02	0,4

a Inkubace se provádí při 37 °C.

b Počáteční počet životaschopných bakterií - 2 x 10⁷ cfu/ml

Tabulka 3

Aktivace nisin-citrátu chelatačním činidlem proti Escherichia coli Závislost na koncentraci citrátu

EDTA mM	Nisin us/ml	Koncentrace citrátu (e/F) při pH 3,5
0	1	3	10	30
			% přežití po 1 minutě	a
0	0	100^b	100	56,3	72,9	100
0	100	-	0,003	0,0007	0,56	14,6
1,0	0	-	100	50,0	47,9	100
1,0	100	-	0,0006	0,0002	0,69	20,8

-4CZ 282676 B6 a Inkubace se provádí při 37 °C.

b Počáteční počet životaschopných bakterií - 5 x 10⁷ cfu/ml.

Tabulka 4

Aktivace nisin-laktátu chelatačním činidlem proti Escherichia coli Závislost na koncentraci laktátu

EDTA mM	Nisin Pg/ml	Koncentrace laktátu (g/1) oři pH 3,5
0	1	3	10	30
				% přežití po 1 minutě	a
0	0	100^b	22,2	46,7	35,6	4,2
0	100	-	4,4	0,24	17,8	26,7
1,0	0	-	5,1	0,46	0,91	1,58
1,0	100	-	C10·⁴	0,02	0,20	2,84

a Inkubace se provádí při 37 °C.

b Počáteční počet životaschopných bakterií - 5 x 10⁷ cfu/ml.

Tabulka 5

Aktivace nisin-sukcinátu chelatačním činidlem proti Escherichia coli Závislost na koncentraci sukcinátu

EDTA mM	Nisin pg/ml	Koncentrace sukcinátu ís/1) při pH 3,5
0	1	3	10	30
				% přežití po 1 minutě“	i
0	0	100^b	85,5	29,9	36,7	13,9
0	100	-	18,3	66,6	83,4	28,4
1,0	0	-	56,8	63,6	46,2	43,2
1,0	100	-	0,02	6,21	14,2	4,73

a Inkubace se provádí při 37 °C.

b Počáteční počet životaschopných bakterií - 3,4 x 10⁶ cfu/ml

Účinnost nisinu aktivovaného EDTA při pH 3,5 byla sledována za přítomnosti všech zkoušených aniontů kyselin (viz tabulky 2 až 5). Při pH 3,5 působila koncentrace laktátu 3 g/litr poněkud inhibičně na účinnost nisinu aktivovaného EDTA. Nicméně je tato účinnost stále ještě tisíckrát vyšší než je účinnost koncentrace samotného laktátu 3 g/litr. Koncentrace laktátu 1 g/litr nepůsobí inhibičně na nisin aktivovaný EDTA.

Při pH 3,5 se koncentrace acetátu do 3 g/litr a koncentrace citrátu do 3 g/litr zdá být kompatibilní s germicidní účinností nisinu aktivovaného chelatační látkou proti suspenzím E. coli. Tyto anionty se zdají být nej slibnějšími kyselými vehikuly pro přípravky obsahující nisin aktivovaný EDTA. Citrát je nejvhodnějším kyselým vehikulem pro přípravky obsahující nisin aktivovaný EDTA. Citrát je látka, která se vyskytuje v přirozené stravě a která je intermediálním metabolitem, přičemž je zároveň účinným aktivátorem baktericidní účinnosti nisinu (viz

-5CZ 282676 B6 tabulka 3). Nisin-citrátové přípravky lze považovat za bezpečné přípravky, které jsou účinné při potlačování nebo odstraňování růstu nežádoucích mikroorganismů v gastrointestinálním traktu člověka nebo zvířat.

Citrát je metabolit, který neinhibuje růst bakterií. Bakterie dobře rostou na živném agaru doplněném citrátem. Nisin za přítomnosti citrátu je však účinný proti gram-negativním bakteriím. Je tedy možno demonstrovat účinnosti nisinu proti gram-negativním bakteriím za použití zkoušky inhibice růstu na živném agaru doplněném různými koncentracemi citrátu. Tato nisin-citrátová zkouška na agaru je mnohem obecněji použitelná. Její možno použít pro zkoušení 10 potenciálních činidel, jiných než je citrát, v kombinaci s nisinem na možné aktivační vlastnosti v souvislosti s baktericidní účinností nisinu. Jako příklady jiných organických kyselin, kterých se používá v kombinaci s nisinem, je možno uvést acetát, propionát, laktát, sukcinát, fumarát, malonát, adipát, sorbát, fosfát a askorbát.

Z jiných činidel, které zvyšují účinnost nisinu, je možno uvést neiontové a amfotemí povrchově aktivní látky a emulgátory, kvatemí sloučeniny, monoglyceridy a mastné kyseliny.

Nisin-citrátová zkouška na agaru se provádí následujícím způsobem:

Buňky E. coli se resuspendují na optickou hustotu 1,0 při A_6Oo· 100 μΐ vzorek této bakteriální suspenze se rovnoměrně rozprostře na sojovém živném agaru s tryptikasou (Trypticase soy nutrient agar (TSA)), doplněném různými koncentracemi citrátu (například 1, 3, 10 a 30 g/litr). Inkubace se provádí 1 hodinu při 37 °C. Vyrobí se zásobní roztok nisinu a z něho pak sériově zředěné vzorky v 0,1 % hovězím sérovém albuminu (BSA). Ze zásobního roztoku a příslušně 25 zředěných vzorků se odebere vždy objem 5 μΐ a přenese se na rostoucí bakterie. Misky s TSA se 24 hodin inkubují při 37 °C. Po 24 hodinách při 37 °C vytvoří E. coli rostoucí v TSA, doplněném citrátem, konfluentní nárůst. Účinnost nisinu proti bakteriím rostoucím za přítomnosti citrátu prokazují čisté zóny v bakteriálním nárůstu, kam byly přeneseny sériově zředěné vzorky nisinu. Účinnost nisinu proti gram-negativním bakteriím je možno vyjádřit na základě stanovení 30 minimálního množství nisinu, kterého je zapotřebí pro vytvoření čisté zóny s inhibovaným růstem. Se zvyšující se koncentrací citrátu v živném agaru je pro inhibici růstu E. coli zapotřebí snižujícího se množství nisinu. Tuto skutečnost dokládají data uvedená v tabulce 6.

Tabulka 6

Účinnost nisinu proti bakteriím E. coli pěstovaným na živném agaru za přítomnosti citrátu

Koncentrace citrátu (g/litr)	Nisin NIC¹ (pg/ml)
0	3 333
1	370
3	123
10	13,7
30	0,06

¹ NIC = nominální inhibiční koncentrace, tj. minimální koncentrace nisinu, které je zapotřebí pro zabránění růstu E. coli kmene ATCC 8739 na sojovém agaru s tiyptikasou, doplněném různými koncentracemi citrátu, uvedenými výše.

Také byla demonstrována účinnost nisinu aktivovaného EDTA nebo jinými chelatačními činidly 45 za přítomnosti citrátu proti různým kmenům Helicobacter pylori a podobným druhům, zejména Campylobacter jejuni za použití germicidní zkoušky v suspenzi. Příklady jsou uvedeny

-6CZ 282676 B6 v tabulkách 7 až 13. Čerstvě narostlé buňky H. pylori, pěstované v misce se živným agarem (Trypticase Soy Agar, BBL 11043, doplněný 5 % ovčí krve zbavené fibrinu) se sklidí a nechají růst při 37 °C po dobu 72 až 96 hodin v komůrce BBL Gaspak^(R) Systém s obalem BBL Campy Pak^(R) Microaerophilic systém za použití Campylobacter mikroaerofilního plynového generátoru 5 (BBL71034). Potom se buňky resuspendují ve sterilní deionizované a destilované vodě na hustotu buněk 1,0 A_6Oo· Tím se získá vhodná zásobní suspenze. Zkouška se zahájí přídavkem 50 μΐ bakteriální suspenze k 950 μΐ zkušebního roztoku, po němž se směs 5 minut inkubuje při 37 °C a potom 1 minutu odstřeďuje v mikrocentrifuze. Buněčná peleta se promyje resuspendováním v 1 ml sterilního neutralizačního pufru popsaného výše a potom se vzniklá 10 suspenze 1 minutu odstřeďuje v mikrocentrifuze. Buňky se resuspendují v médiu BrucellaAlbimi (BBL) a suspenze se sériově zředí ve stejném médiu a potom se jednotlivé suspenze přenesou na živný agar. Počet životaschopných bakterií se stanoví tak, že se 100 μΐ suspenze bakterií (nebo příslušně zředěných vzorků) přenese na živný agar popsaný výše a spočítají se přežívající kolonie po 72 až 96 hodinách inkubace při 37 °C v modifikované atmosféře popsané 15 výše. Z naměřených hodnot se vypočítá poměr přežití v procentech, vzhledem k neošetřeným kontrolním vzorkům.

Závislost účinnosti nisinu proti Helicobacter pylori na jeho koncentraci za přítomnosti nebo nepřítomnosti citrátu o koncentraci 1 g/litr při pH 5,0 je ilustrována daty uvedenými v tabulce 7.

Přestože H. pylori je gram-negativní bakterie, vykazuje nisin, který byl považován za látku účinnou pouze proti gram-pozitivním bakteriím, překvapivě určitou baktericidní účinnost proti tomuto organismu. Účinnost nisinu proti H. pylori se však podstatně zvýší za přítomnosti citrátu.

Závislost účinnosti nisinu proti H. pylori na koncentraci citrátu při pH 5,0 a 7,0 je ilustrována 25 daty uvedenými v tabulce 8. Obecně má samotný citrát malý účinek na životaschopnost těchto bakteriálních druhů při pH 5,0, přestože při pH 7,0 se za použití vyšších koncentrací citrátu životaschopnost organismů poněkud sníží. Účinky samotného citrátu jsou překvapující, poněvadž citrát je metabolit. Zvýšená účinnost nisinu za přítomnosti citrátu postačuje k úplnému usmrcení suspenze H. pylori (10⁵ cfu/ml) za 5 minut při 37 °C.

Data uvedená v tabulce 9 ilustrují skutečnost, že účinnost nisinu proti H. pylori při pH 5,0 a 7,0 se také podstatně zvýší za přítomnosti chelatačně účinné EDTA. Samotná chelatační látka má malý vliv na životaschopnost těchto organismů, s výjimkou vyšších koncentrací. Účinnost nisinu aktivovaného EDTA však postačuje pro úplné usmrcení suspenze H. pylori (10³ cfu/ml) 35 v průběhu 5 minut při 37 °C.

Bakteriální účinnost nisinu proti H. pylori za přítomnosti nebo nepřítomnosti citrátu nebo EDTA v určitém rozmezí hodnot pH je ilustrována daty uvedenými v tabulce 10 a 11. Přestože je H. pylori izolován z žaludku, jehož lumen je kyselý, životaschopnost tohoto organismu je 40 překvapivě špatná při expozici nízkým hodnotám pH. H. pylori kolonizuje epithel žaludeční sliznice, což je méně kyselé mikroprostředí ve srovnání s lumenem žaludku. Přes omezenou životaschopnost H. pylori při nízkých hodnotách pH při těchto pokusech, ukazují zjištěná data, že u nisinu s citrátem nebo EDTA máje možno očekávat baktericidní účinnost proti H. pylori za podmínek, které se podobají podmínkám převládajícím v žaludku a jeho epithelu sliznice, kde je 45 H. pylori schopen prosperovat.

Campylobacter jejuni je gram-negativní bakterie, která kolonizuje střeva ptáků a savců a spojuje se s otravami potravou. Baktericidní účinnost nisinu za přítomnosti a nepřítomnosti citrátu nebo EDTA proti C. jejuni je ilustrována daty uvedenými v tabulce 12 a 13. Samotný nisin je vysoce 50 účinný proti této gram-negativní bakterii. Ukázalo se také, že při pH 5,0 jsou vyšší koncentrace citrátu toxické vůči této bakterii. Je tedy možno očekávat, že kombinace nisinu s citrátem nebo EDTA bude účinná proti C. jejuni, jak to ilustrují data uvedená v tabulkách 12 a 13.

-7CZ 282676 B6

Tabulka 7

Baktericidní účinnost nisinu proti Helicobacter pylori Závislost účinnosti na koncentraci nisinu

kmen ATCC#	Citrát pH 5,0	Nisin (us/ml)
0	10	30	100	300
			% přežití po 5 minutách³
ATCC	0	100^b	1,41	0,39	0,085	0,0056
43579	0,1%	86,2	0,21	0,008	0,001	1,89x10’⁵

a inkubace se provádí při 37 °C b počáteční počet životaschopných bakterií je 3,19 x 10⁷ cfu/ml

Tabulka 8

Baktericidní účinnost nisinu proti Helicobacter pylori Závislost účinnosti na koncentraci citrátu při pH 5,0 a 7,0

kmen ATCC#	PH	Nisin pg/ml	0	Koncentrace citrátu (g/1)
1	3	10
				% přežití po 5 minutách³
ATCC 43579	5,0	0	100^b	100	100	100
		100	9,62	<0,01	<0,01	<0,01
ATCC 43504	5,0	0	100^c	83,6	42,9	22,1
		0	100^d	25,8	4,39	50,9
		100	n. a.	0,033	0,066	0,14
		100	0,043	<31xl0'³	0,92	2,44
ATCC 43579	7,0	0	100^e	12,1	0,26	0,02
		100	0,78	<8, lxl O'³	<8, lxl 0'³	<8, lxl 0'³
ATCC 43504	7,0	0	100^f	17,7	8,94	0,82
		100	2,08	<0,01	<0,01	<0,01

a inkubace se provádí při 37 °C po dobu 5 minut b počáteční počet životaschopných bakterií je 1,04 x 10⁴ cfú/ml c počáteční počet životaschopných bakterií je 1,40 x 10⁵ cfu/ml d počáteční počet životaschopných bakterií je 3,26 x 10⁵ cfu/ml e počáteční počet životaschopných bakterií je 1,24 x 10⁵ cfú/ml f počáteční počet životaschopných bakterií je 9,62 x 10⁴ cfu/ml

Tabulka 9

Baktericidní účinnost nisinu proti Helicobacter pylori Závislost účinnosti na koncentraci EDTA při pH 5,0 a 7,0

-8CZ 282676 B6

kmen ATCC#	pH	Nisin Pg/ml	ímM) EDTA
0	1,0	10	100
				% přežití po 5 minutách³
ATCC	5,0	0	100^b	13,63	8,82	0,43
43579		100	4,7	<5,0x10'³	<5,0x10’³	<5,0x10
ATCC	7,0	0	100^c	94,1	21,0	1,62
43526		100	5,88	<0,03	<0,03	<0,03

a inkubace se provádí při 37 °C po dobu 5 minut b počáteční počet životaschopných bakterií je 2,04 x 10⁵ cfu/ml c počáteční počet životaschopných bakterií je 3,40 x 10⁴ cfu/ml

Tabulka 10

Baktericidní účinnost nisinu proti Helicobacter pylori

Závislost účinnosti na koncentraci citrátu při pH v rozmezí od 2,5 do 5,0

kmen ATTC#	Citrát %	Nisin pg/ml	Hodnota pH
2,5	3,0	3,5	4,0	5,0
ATCC	0	0		% přežití po 5 minutách³	100^b
43579	0	100	-	-	-	-	8,6x10'^{3 e}
	0	100	-	-	-	-	0,3 0^c
	0,1	0	<5,0xl0’⁴	1,1x10’³	0,18	9,56	97,2^b
ATCC	0,1	100	<5,0xl0‘⁴	1,1x10’³	Ι,ΙχΙΟ'³	2,0x10'³	2,7x10'^{3 b}
43504	0	0	-	-	-	-	100^d
	0	0	-	-	-	-	100^e
	0	100	-	-	-	-	0,69^d
	0	100	-	-	-	-	4,86^e
	0,1	0	0,14	<0,004	<0,004	0,36	68,5^d
	0,1	100	<0,004	<0,004	<0,004	<0,004	0,022^d
	0,3	0	0,027	<0,027	29,7	17,6	100^e
	0,3	100	<0,027	<0,027	2,7	0,32	0,18^e

a inkubace se provádí při 37 °C po dobu 5 minut v v prostředí s pH nastaveným citrátem nebo za použití 20 mM acetátu, pH 5,0 b počáteční počet životaschopných bakterií je 1,85 x 10⁶ cfú/ml c průměr z pěti experimentů d počáteční počet životaschopných bakterií je 2,7 x 10⁵ cfu/ml e počáteční počet životaschopných bakterií je 3,7 x 10⁶ cfu/ml

-9CZ 282676 B6

Tabulka 11

Baktericidní účinnost nisinu proti Helicobacter pylori

Závislost účinnosti na koncentraci EDTA při pH v rozmezí přežití po 5 minutách

kmen ATCC#	EDTA mM	Nisin ue/ml %	Hodnota pH
2,5	3,0	3,5	4,0	5,0
ATCC	0	0		% přežití po 5 minutách	100^b
43504	0	0	-	-	-	-	100^c
	0	100	-	-	-	-	0,02 l^d
	0	100	-	-	-	-	7,03^e
	1,0	0	0,023	<0,021	94,2	11,6	10,0^b
	1,0	0	0,013	0,001	0,015	16,5	100^c
	1,0	100	<0,021	<0,021	0,012	<0,021	0,53^b
	1,0	100	<0,001	<0,001	0,005	0,54	0,32^c

a inkubace se provádí při 37 °C po dobu 5 minut v v prostředí s pH nastaveným citrátem nebo za použití 20 mM acetátu, pH 5,0 b počáteční počet životaschopných bakterií je 8,6 x 10⁴ cfu/ml c počáteční počet životaschopných bakterií je 9,82 x 10⁵ cfu/ml d inkubace za přítomnosti citrátu o koncentraci 1 g/litr e inkubace za přítomnosti 20 mM acetátu

Tabulka 12

Baktericidní účinnost nisinu proti Campylobacter jejuni ATCC 29 428 Závislost účinnosti na koncentraci citrátu při pH 5,0 (kmen ATCC 29 428)

Nisin us/ml	Koncentrace citrátu (a/l) při pH 5,0
0	1	3	10
		% přežití po 5 minutách
0	100^b	2,9	<6,4x10’³	<6,4x10'³
100	<6,4x10'³	<6,4xl0'³	<6,4x10’³	<6,4x10'³

a inkubace se provádí při 37 °C po dobu 5 minut b počáteční počet životaschopných bakterií je 1,57 x 10⁵ cfu/ml

- 10CZ 282676 B6

Tabulka 13

Baktericidní účinnost nisinu proti Campylobacter jejuni ATCC 29 428 Závislost účinnosti na koncentraci EDTA při pH 5,0 (kmen ATCC 29 428)

Nisin ua/ml	mM EDTA dH 5,0
0	1,0	10	100
		% přežití po 5 minutách³
0	100^b	56,5	76,1	76,1
100	<5,0x1 θ'⁴	<5,0xl0’⁴	<5,0x10^-4	<5,0xl0'⁴

a inkubace se provádí při 37 °C po dobu 5 minut b počáteční počet životaschopných bakterií je 1,84 x 10⁶ cfú/ml ío Účinnost nisinu aktivovaného EDTA, citrátem nebo jinými chelatačními činidly je také možno demonstrovat za použiti germicidních suspenzních zkoušek proti druhu Salmonella. Čerstvě vypěstované buňky S. typhimurium se odeberou z misky z živným agarem (Trypticase Soy Agar, BBL11043), kde byly pěstovány 24 hodin při 37 °C. Buňky se resuspendují na hustotu 1,0 A₆oo, a tak se získá vhodná zásobní suspenze. Zkouška se zahájí přídavkem 30 μΐ bakteriální suspenze 15 k970 μΐ zkušebního roztoku. Následuje inkubace alespoň po dobu 1 minuty a potom jednominutové odstřeďování v mikrocentrifuze. Buněčná peleta se promyje resuspendováním v 1 ml sterilního neutralizačního pufru, peleta se znovu suspenduje a potom se vzniklá suspenze sériově zředí neutralizačním pufrem. Počet živých buněk se stanoví tak, že se bakteriální suspenze a sériově zředěné vzorky (vždy 100 μΐ) rozprostřou na živném agaru a po 24 hodinách 20 inkubace při 37 °C se spočítají přežívající kolonie.

Bakteriocinové přípravky, účinné při nízké hodnotě pH, podle vynálezu se přednostně podávají orálně ve formě farmaceutických přípravků, které obsahují účinné množství bakteriocinu obsahujícího lanthionin a farmaceuticky vhodný nosič. Nosič může též zahrnovat účinné 25 množství chelatačního činidla a/nebo kyselého vehikula a/nebo povrchově aktivní látky nebo emulgátoru, monoglyceridu nebo mastné kyseliny. Bakteriocin obsahující lanthionin může být zvolen ze souboru zahrnujícího nisin, subtilin, epidermin, Pep 5, ankovenin, gallidermin, duromycin nebo cinnamicyn. Jako vhodná chelatační činidla, na něž se však vynález neomezuje, je možno uvést EDTA, vápenatou sůl EDTA (CaEDTA), sodnovápenatou sůl EDTA 30 (CaNa₂EDTA) a jiné alkyldiamintetraacetáty a dále též citrát. V některých případech může být chelatační činidlo totožné s kyselým vehikulem, jako je tomu v případě, kdy je jak kyselým vehikulem, tak chelatačním činidlem citrát. Vhodnými kyselými vehikuly pro použití v přípravcích podle vynálezu jsou acetát, propionát, citrát, laktát, sukcinát, fúmarát, malonát, adipát, sorbát, fosfát a askorbát.

Přípravky podle vynálezu jsou také účinné při mírně kyselé hodnotě pH (například 5,0) a dokonce i při vyšších hodnotách pH (například 8,0) proti patogenním bakteriím, které mohou obývat gastrointestinální trakt, jako je E. coli a S. typhimurium, jak je to popsáno v US patentu č. 5 135 910. Výše uvedená citace US patentu č. 5 135 910 představuje náhradu za přenesení 40 obsahu celého tohoto patentu do popisu tohoto vynálezu.

Farmaceutické přípravky podle vynálezu je tedy možno také vyrábět jako antacidové přípravky neboje možno je podávat v kombinaci s antacidovým přípravkem, přičemž důsledkem takového podávání může být například vyšší hodnota pH v žaludku než je hodnota před podáním. I za 45 těchto podmínek jsou přípravky na bázi nisinu a chelatačního činidla účinné proti patogenním bakteriím.

- 11 CZ 282676 B6

Jako farmaceuticky vhodné nosiče přicházejí v úvahu pevná, polopevná nebo kapalná ředidla nebo též kapsle. V některých provedeních vynálezu může být kyselé vehikulum totožné s farmaceutickým nosičem. Jako jiné farmaceuticky vhodné nosiče je možno uvést deriváty celulosy, želatinu, laktosu, škrob atd.

Farmaceutické přípravky mohou mít podobu roztoků, koloidů nebo emulzí, prášků, tablet, kapslí nebo gelů.

Suché formy přípravků, účinných pří nízké hodnotě pH, je možno zpracovávat lisováním na tablety a vzniklé tablety je možno potahovat koncentrovanými cukernými roztoky. Potahovací roztoky mohou obsahovat též jiné farmaceuticky vhodné látky, jako je arabská guma, želatina, mastek nebo oxid titaničitý a různá barviva. Přípravky podle vynálezu mohou mít též podobu tvrdých želatinových kapslí, které obsahují granule bakteriocinu, kyselého vehikula a chelatačního činidla v kombinaci s pevným nosičem, jako je laktosa, bramborový škrob, kukuřičný škrob, deriváty celulosy nebo želatina.

Kapalné přípravky pro orální podávání mohou mít podobu sirupů nebo suspenzí obsahujících peptid bakteriocin, chelatační činidlo, kyselé vehikulum, cukr, vodu, glycerol nebo propylenglykol. Takové kapalné přípravky mohou popřípadě obsahovat též barvicí činidla, aromatizační látky, sladidla, jako je sacharin a zahušťovadla, jako jsou deriváty celulosy.

Aplikační vlastnosti přípravku je přirozeně možno modifikovat, tak například k jednoduchým vodným přípravkům je možno přidávat zahušťovadla, emulgátory nebo částicové látky, za účelem přípravy koloidní suspenze. Alternativně je možno vytvářet osmoticky vyvážené roztoky obsahující vhodnou dávku, které lze podávat v objemech tak malých, jako například 10 ml, nebo tak velkých, jako jsou například 4 litry. Jako osmoticky vyvážené roztoky je možno uvést například roztoky, kterých se obvykle požívá pro proplachování gastrointestinálního traktu (Di Palma, J. A. a Brady 74 C. E., 1989, Am. J. Gastroenterol. 84 : 1008, Colon Cleansing for Diagnostic and Surgical Procedures: Polyethylene glycol Lavage Solution. Di Palma, J. A. aMarshal, J. B., 1990, Gastrointestinal Endoscopy 1990, 36 : 285, Comparison of anew Sulfate-free Polyethylene glycol Electrolyte Lavage Solution versus a Standard Solution for Colonoscopy Cleansing; Fordtran, J. S., et al., 1990, Gastroenterol. 98 : 11, A low-Sodium Solution for Gastrointestinal Lavage).

Je možno očekávat, že účinnost gastrointestinálních proplachovacích roztoků, používaných pro pročišťování gastrointestinálního traktu, se přídavkem germicidních přípravků podle vynálezu zlepší.

Typická denní dávka přípravků podle vynálezu se může měnit v závislosti na druhu patogenního mikroorganismu vyvolávajícího léčenou infekci, na místě infekce a symptomech léčené choroby. Obvykle se očekává, že orální dávka bude ležet v rozmezí od 0,1 mg/dávka do 300 mg/dávka, vztaženo na bakteriocinovou látku obsahující lanthionin a v rozmezí od 0,1 g/dávka do 30 g/dávka, vztaženo na chelatační činidlo. Tak například, vzhledem k tomu, že se objem obsahu žaludku mění v závislosti na době, která uplynula od posledního jídla, jednoduché vodné přípravky pro gastrointestinální použití je možno připravit takto:

Má-li se zajistit výsledná koncentrace v žaludku 0,1 % citrát + 0,001 % nisin (10 přičemž objem dávky má být 10 ml a předpokládá-li se, že objem obsahu žaludku je 100 ml:

Dávka 1 : 1,0 mg nisinu a 0,1 g citrátu

	CZ 282676 B6
citran sodný nisin sacharin polysorbát 20 glycerol voda	1,0% 0,01 % 0,005 % 1,0% 10,0 % 87,985 %

Má-li se zajistit výsledná koncentrace v žaludku 3,0 % citrát + 0,03 % nisin (300 pg/ml), přičemž objem dávky má být 10 ml a předpokládá-li se, že objem obsahu žaludku je přibližně 100 ml:

Dávka 2 : 30 mg nisinu a 3,0 g citrátu

citran sodný nisin sacharin polysorbát 20 glycerol voda

30,0 % 0,3 % 0,005 % 1,0 % 0,0 % 58,695 %

Má-li se zajistit výsledná koncentrace v žaludku 0,1 % citrát + 0,001 % nisin (10 pg/ml), přičemž objem dávky má být 10 ml a předpokládá-li se, že objem obsahu žaludku je přibližně 1 000 ml:

Dávka 3:10 mg nisinu a 1,0 g citrátu

citran sodný nisin sacharin polysorbát 20 glycerol voda

10,0% 0,1 % 0,005 % 1,0% 10,0% 78,895 %

Má-li se zajistit výsledná koncentrace v žaludku 3,0 % citrát + 0,03 % nisin (300 pg/ml), přičemž objem dávky má být 100 ml a předpokládá-li se, že objem obsahu žaludku je přibližně 1 000 ml:

Dávka 4 : 300 mg nisinu a 30,0 g citrát

citran sodný nisin sacharin polysorbát 20 glycerol voda

30,0 % 0,3 % 0,005 % 1,0 % 10,0% 58,695 %

Má-li se zajistit výsledná koncentrace v žaludku 3,0 % citrát + 0,03 % nisin (300 . _f úsl), přičemž objem dávky má být 100 ml a předpokládá-li se, že objem obsahu žaludku je ;

100 ml:

Dávka 5 : 60 mg nisinu a 6,0 g citrátu

citran sodný nisin sacharin polysorbát 20 glycerol voda

6,0 %

0,06 %

0,005 %

1,0%

10,0 %

82,935 %

V závislosti na typu patogenního mikroorganismu a druhu léčené choroby, může léčebný režim zahrnovat také podávání jiných léčiv a farmaceutických přípravků. Tato léčiva mohou být součástí farmaceutického přípravku podle vynálezu nebo se mohou podávat v rámci kombinovaného léčebného režimu zahrnujícího podávání bakteriocinového přípravku, účinného při nízké hodnotě pH a jiného léčiva, které je užitečné pro léčbu gastrointestinálního traktu. Tak například při léčbě diarrhey, která může být způsobena infekcí patogenního mikroorganismu, například druhu Salmonella, se může bakteriocinový přípravek, účinný při nízké hodnotě pH, podávat v podobě farmaceutického přípravku, který také obsahuje kaolin, pektin nebo jiné pojivo. Takové symptomy je také možno léčit souběžným podáváním bakteriocinového přípravku, účinného při nízké hodnotě pH a pojivá. Při takových léčebných režimech se tak může používat antacidových přípravků a neočekává se, že by mohl antacid ovlivnit účinnost přípravku na bázi nisinu a chelatačního činidla.

Při léčbě infekcí způsobených patogenním mikroorganismem Helicobacter pylori se může bakteriocinový přípravek, účinný při nízké hodnota pH, podávat ve spojení s jinou farmaceuticky účinnou látkou proti H. pylori, jako je sůl vismutu, například subcitrát vizmutu nebo subsalicylát vizmutu. Přípravky podle vynálezu se mohou podávat ve spojení sjinými činidly, jako je cimetidin, ranitidin, omeprazol, antacidy, inhibitory ureasy nebo jejich kombinace, která slouží pro léčbu některých chorob a symptomů spojených s přítomností H. pylori v gastrointestinálním traktu. Při těchto léčebných režimech se účinná farmaceutická činidla mohou podávat souběžně nebo střídavě s farmaceutickými přípravky podle vynálezu, přičemž způsob podávání se může v průběhu léčby podle potřeby měnit.

H. pylori byl izolován zdentálního plaku, který může představovat zásobník opakujících se infencí žaludku. (Desa; H. G., Gill, Η. H., Shankaran, K.., Mehta, P. R., and Prabha, S. R. (1991) Dental Plaque: a permanent reservoir of Helicobacter pylori? Scand. J. Gastroenterol. 26: 1205 a Shames, B., Krajden, S., Fukasa, M., Babida, C. a Penner, J. L. (1989) Evidence for the Occurrence of the Same Strain of Campylobacter pylori in the Stomach and Dental Plague. J, Clin. Microbiol. 27: 2849.)

Bakteriocinových přípravků, které jsou vhodné pro použití proti H. pylori v dentálním plaku, se tedy může používat v kombinaci s bakteriocinovými přípravky, účinnými při nízké hodnotě pH, proti H. pylori v gastrointestinálním traktu.

Claims

1. Použití směsi zahrnující bakteriocin, obsahující lanthionin a chelatační činidlo pro výrobu léčiva pro léčení a prevenci gastrických poruch vyvolaných patogenními mikroorganismy v žaludku.

2. Použití podle nároku 1, kde směs obsahuje navíc kyselé vehikulum.

3. Použití podle nároků 1 nebo 2, kde chelatační činidlo obsahuje citrát.

4. Použití podle nároků 1 nebo 2, kde chelatační činidlo obsahuje EDTA.

5. Použití podle nároků 1 nebo 2, kde chelatační činidlo obsahuje citrát a EDTA.

6. Použití podle nároků 1 nebo 2, kde bakteriocin je zvolen ze souboru zahrnujícího nisin, subtilin, epidermin, Pep 5, ankovenin, gallidermin, duromycin a cinnamycin.

7. Použití podle nároků 1 nebo 2, kde bakteriocinem je nisin.

8. Použití podle nároků 1 nebo 2, kde bakteriocinem je nisin chelatační činidlo obsahuje citrát nebo EDTA.

9. Použití podle nároku 2, kde kyselé vehikulum je zvoleno ze souboru zahrnujícího acetát, propionát, citrát, laktát, sukcinát, fumarát, malonát, adipát, sorbát, fosfát a askorbát.

10. Použití podle nároku 1 nebo 2, kde patogenními organismy jsou gram-negativní bakterie.

11. Použití podle nároků 1 nebo 2, kde patogenní mikroorganismy spadají do druhu Helicobacter, Salmonella, Escherichia, Clostridia, Bacillus, Bacteriodes, Campylobacter nebo Yersinia.

12. Použití podle nároků 1 nebo 2, kde patogenním mikroorganismem je Helicobacter pylori nebo Campylobacter jejuni.