CZ290029B6 - Fosfolipid-proteinový přípravek - Google Patents
Fosfolipid-proteinový přípravek Download PDFInfo
- Publication number
- CZ290029B6 CZ290029B6 CZ19951438A CZ143895A CZ290029B6 CZ 290029 B6 CZ290029 B6 CZ 290029B6 CZ 19951438 A CZ19951438 A CZ 19951438A CZ 143895 A CZ143895 A CZ 143895A CZ 290029 B6 CZ290029 B6 CZ 290029B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- csf
- protein
- phospholipid
- rhg
- lipid
- Prior art date
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 93
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 91
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims abstract description 82
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims abstract description 47
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 26
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 65
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims description 65
- DSNRWDQKZIEDDB-GCMPNPAFSA-N [(2r)-3-[2,3-dihydroxypropoxy(hydroxy)phosphoryl]oxy-2-[(z)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (z)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OCC(O)CO)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC DSNRWDQKZIEDDB-GCMPNPAFSA-N 0.000 claims description 56
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 30
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims description 21
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 21
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims description 18
- BIABMEZBCHDPBV-MPQUPPDSSA-N 1,2-palmitoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-sn-glycerol) Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@@H](O)CO)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC BIABMEZBCHDPBV-MPQUPPDSSA-N 0.000 claims description 16
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 16
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 12
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 10
- KLFKZIQAIPDJCW-HTIIIDOHSA-N Dipalmitoylphosphatidylserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC KLFKZIQAIPDJCW-HTIIIDOHSA-N 0.000 claims description 9
- OZSITQMWYBNPMW-GDLZYMKVSA-N 1,2-ditetradecanoyl-sn-glycerol-3-phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC OZSITQMWYBNPMW-GDLZYMKVSA-N 0.000 claims description 7
- WKJDWDLHIOUPPL-JSOSNVBQSA-N (2s)-2-amino-3-({[(2r)-2,3-bis(tetradecanoyloxy)propoxy](hydroxy)phosphoryl}oxy)propanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC WKJDWDLHIOUPPL-JSOSNVBQSA-N 0.000 claims description 6
- PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycerol-3-phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 0.000 claims description 6
- WTBFLCSPLLEDEM-JIDRGYQWSA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC WTBFLCSPLLEDEM-JIDRGYQWSA-N 0.000 claims description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 5
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 claims description 4
- MHUWZNTUIIFHAS-CLFAGFIQSA-N dioleoyl phosphatidic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC MHUWZNTUIIFHAS-CLFAGFIQSA-N 0.000 claims description 4
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 claims description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 6
- 229960005160 dimyristoylphosphatidylglycerol Drugs 0.000 claims 2
- BPHQZTVXXXJVHI-AJQTZOPKSA-N ditetradecanoyl phosphatidylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@@H](O)CO)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC BPHQZTVXXXJVHI-AJQTZOPKSA-N 0.000 claims 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 abstract description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 abstract description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 abstract description 2
- NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M potassium iodide Chemical compound [K+].[I-] NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 12
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 12
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 12
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 12
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 12
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- PIMKEUIWMFJVNB-UHFFFAOYSA-N 10-pyren-1-yldecanoic acid Chemical compound C1=C2C(CCCCCCCCCC(=O)O)=CC=C(C=C3)C2=C2C3=CC=CC2=C1 PIMKEUIWMFJVNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 9
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 6
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 5
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 4
- 102000046157 human CSF2 Human genes 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N pyrene Chemical compound C1=CC=C2C=CC3=CC=CC4=CC=C1C2=C43 BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 4
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 4
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 3
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 3
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 3
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 239000010408 film Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 0.000 description 2
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- GZDFHIJNHHMENY-UHFFFAOYSA-N Dimethyl dicarbonate Chemical compound COC(=O)OC(=O)OC GZDFHIJNHHMENY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 2
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 2
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 2
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N [1-[2,3-dihydroxypropoxy(hydroxy)phosphoryl]oxy-3-hexadecanoyloxypropan-2-yl] (9e,12e)-octadeca-9,12-dienoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCC(O)CO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\C\C=C\CCCCC ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N 0.000 description 2
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- WFFZELZOEWLYNK-CLFAGFIQSA-N bis[(z)-octadec-9-enyl] hydrogen phosphate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOP(O)(=O)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC WFFZELZOEWLYNK-CLFAGFIQSA-N 0.000 description 2
- 238000007707 calorimetry Methods 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 2
- 238000000695 excitation spectrum Methods 0.000 description 2
- GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N fluoranthrene Natural products C1=CC(C2=CC=CC=C22)=C3C2=CC=CC3=C1 GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 229940067605 phosphatidylethanolamines Drugs 0.000 description 2
- 150000008106 phosphatidylserines Chemical class 0.000 description 2
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108010029961 Filgrastim Proteins 0.000 description 1
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102100039619 Granulocyte colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- -1 Gregoriaidis Substances 0.000 description 1
- 101100114967 Homo sapiens CSF3 gene Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 206010027905 Monocytopenia Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 description 1
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 102100032889 Sortilin Human genes 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000010441 alabaster Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000002975 chemoattractant Substances 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000001938 differential scanning calorimetry curve Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 229960004177 filgrastim Drugs 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013554 lipid monolayer Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000012792 lyophilization process Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003887 myelocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 231100000989 no adverse effect Toxicity 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 230000029983 protein stabilization Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000002691 unilamellar liposome Substances 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Fosfolipid-proteinov² p° pravek obsahuj c protein schopn² p°echodu do stavu roztaven²ch globul rn ch stic, kter² je ve styku se z porn nabit²mi liposomov²mi v ky, p°i em tento p° pravek vykazuje mol rn pom r lipidu k proteinu alespo 25 : 1 a je p° mo stabilizov n proti teplem indukovan agregaci, denaturaci, ztr t aktivity a rozvinut sekund rn struktury ste n²m vlo en m proteinu do lipidov sti liposomov ho v ku.\
Description
(57) Anotace:
Fosfolipid-proteinový přípravek obsahující protein schopný přechodu do stavu roztavených globulámích částic, který je ve styku se záporně nabitými liposomovými váčky, přičemž tento přípravek vykazuje molámí poměr lipidu k proteinu alespoň 25 :1 a je přímo stabilizován proti teplem indukované agregaci, denaturaci, ztrátě aktivity a rozvinutí sekundární struktury částečným vložením proteinu do lipidové části liposomového váčku.
CD m
O) CM σ> CM
N O
Fosfolipid-proteinový přípravek
Oblast techniky
Vynález se týká stabilního proteinového přípravku, tvořeného komplexem protein-fosfolipid, který je užitečný pro stabilizaci sekundární a terciální struktury proteinů schopných přechodu do stavu roztavených globulámích částic. Těchto komplexů je možno používat v případě nutnosti zpracování přípravků při zvýšené teplotě a jsou také užitečné jako dopravní vehikula pro G-CSF.
Dosavadní stav techniky
U několika proteinů byla zjištěna schopnost přecházet do stavu roztavených globulámích částic (MGS) [Van der Goot, F. G., Nátuře 354, 408 až 410 (1991)]. Proteiny v roztaveném globulámím stavu vykazují sekundární strukturu, která je srovnatelná se strukturou nativního proteinu, ale postrádají tuhou terciální strukturu [Pitsyn et al., FEBS Letters262: 1, 20 až 24 (1990)]. V někteiých případech je přechod do tohoto stavu doprovázen obnažením hydrofobních oblastí proteinu, které byly předtím skryty. V důsledku expozice kritických hydrofobních zbytků může být MGS meziproduktem při agregaci a precipitaci proteinů. Konformaci MGS je možno detegovat na základě srovnání cirkulámího dichroismu ve vzdálené UV oblasti spektra se spektrem aromatických postranních řetězců (cirkulámí dichroismus a fluorescence v blízké UV oblasti spektra). Roztavený globulámí stav vykazuje spektrální změny aromatických skupin za nepřítomnosti změn cirkulámího dichroismu ve vzdálené UV oblasti [Bychkova et al., FEBS Letters, 238: 231 až 234 (1988)] a může se podílet na penetraci některých proteinů do membrán [Bychkova et al., FEBS Letters, 238: 231 až 234 (1988); Van der Goot, F. G., Nátuře 354,408 až 410 (1991)].
Dvěma proteiny, o nichž je známo, že přecházejí na MGS před agregací, jsou faktor stimulující granulocytovou kolonii (G-CFS) a faktor stimulující granulocytovou makrofágovou kolonii (GM-CSF). Tyto dva proteiny je sice možno stabilizovat za určitých definovaných podmínek, ale nicméně existuje potřeba prodloužit jejich skladovatelnost stabilizací jejich sekundární a terciální struktury.
Humánní rekombinantní G-CSF selektivně stimuluje neutroflly, což je typ bílých krvinek, které se podílejí na boji s infekcí. V současné době je pro terapeutické použití k dispozici rekombinantní G-CSF, Filgrastim. Struktura G-CSF za různých podmínek byla v rozsáhlé míře studována: Lu et al., J. Biol. Chem. sv 267, str. 8 770 až 8 777 (1992). S ohledem na jeho hydrofobní vlastnosti se G-CSF obtížně zpracovává na přípravky s dlouhodobou skladovatelností. Přípravky na bázi určitých hydrofobních proteinů ztrácejí při dlouhodobém skladování svou účinnost v důsledku tvorby dimeru a agregátů vyššího řádu (makro-rozsah). Při skladování může také docházet kjiným chemickým změnám, jako je deamidace a oxidace. Kromě toho, je třeba při zpracování G-CSF na přípravky chránit G-CSF proti denaturací a zejména se snažit o zachování stability sekundární a terciální struktury tohoto proteinu.
Humánní GM-CSF je 22 kDa glykoprotein, po němž existuje stálá poptávka, poněvadž se ho používá při in vitro proliferaci makrofágových a granulocytových progenitrových buněk. Také potlačuje nevrtaný přechod těchto progenitorů na granulocyty a makrofágy. Z jeho jiných biologických účinností je možno uvést regulační schopnost na funkční aktivitu maturovaných buněk [Gough et al., Nátuře 309, 763 až 767 (1984)] a schopnost zvyšovat chemotaxi k rozpoznaným chemoatraktantům [Williams et al., Hemotology, 4. vydání (1990)]. GM-CSF také stimuluje produkci monocytů a může být proto užitečný při léčbě monocytických chorob, jako je monocytopenie.
Humánní GM-CSF je možno získat a purifikovat z řady zdrojů. Způsoby výroby rekombinantního humánního GM-CSF popsali nedávno Burgess et al., Blood 69, 43 až 51 (1987). V US patentu 5 047 504 (Boone) (tento patent je zde citován náhradou za přenesení jeho celého obsahu do popisu tohoto vynálezu) je popsán způsob výroby GM-CSF v neglykosylované formě v obchodně využitelném měřítku pomocí exprese v prokaryontních hostitelských buňkách.
Jedním ze způsobů, které byly v minulosti zkoušeny při práci s proteiny, jako je G-CSF, je způsob, při němž se používá liposomů. Liposomy jsou úplně uzavřené lipidové dvojvrstvé membrány, které jsou vytvořeny z polárních lipidů, zejména fosfolipidů, které nejsou rozpustné ve vodě. Liposomové váčky mohou mít jedinou membránovou dvojvrstvou (unilamelámí váčky) nebo mohou obsahovat několik membránových dvojvrstev (multilamelámí váčky). Dvojvrstva se skládá ze dvou lipidových monovrstev, hydrofilní (polární) „hlavové“ oblasti a hydrofobní (nepolární) „ocasové“ oblasti. Hydrofobní ocasy jsou orientovány do středu dvojvrstvy, zatímco hydrofilní hlavy jsou orientovány do vodné fáze. Stabilitu, tuhost a propustnost liposomů je možno měnit změnami složení fosfolipidů, změnami teploty, přidáváním sterolu nebo zaváděním nabitých amfifilů. Základní strukturu liposomů je možno vytvářet různými technologiemi, které jsou známé v tomto oboru.
Při své výrobě mohou liposomy zadržet látky rozpuštěné ve vodě (soluty) ve vodních kanálech a různými rychlostmi je zuvolňovat. Od objevu, že liposomy mohou zavádět do buněk enzymy a měnit jejich metabolismus [Gregoriadis, New Engl. J. Med. 295, 704 až 710, 765 až 770 (1996)] stojí liposomy v popředí zájmu, jakožto odpověď na snahu dospět k cílově orientovanému dodávání léčiv. Díky tomu se výzkum ve farmaceutickém průmyslu ve velké míře zabývá použitím liposomů jakožto depotních elementů pro pomalé uvolňování léčiv, vitaminů a proteinů, které jsou odděleny (sekvestrovány) v hydrofobních vrstvách nebo hydrofobním jádře těchto liposomů.
Úspěšné používání liposomů, jakožto nosičů léčiv je omezeno, poněvadž se výzkumní pracovníci, kteří se zabývali jejich aplikacemi, střetli s řadou problémů. Tak například o liposomech je známo, že působí jako mocné imunologické adjunkty k zachyceným antigenům a když jsou v liposomech zadrženy enzymy nebo jiné proteiny xenogenního původu, je třeba dbát opatrnosti. Také rychlost difúze léčiva je obtížně regulovatelná. To je důsledkem inherentní nestability liposomů a přítomnosti určitých krevních složek, které urychlují difúzi určitých léčiv. Kromě toho, některé látky jsou díky své povaze v liposomech špatně zadržovány, a proto rychle difundují do oběhu. Dále také vyvstal problém spočívající v cílovém zaměření na jiné buňky nebo jiný orgán, než jsou játra a slezina. Výborný přehled liposomů, látek, které byly do liposomů zavedeny a problémů, které jsou spojeny s použitím liposomů, jakožto nosičů léčiv, je uveden v publikaci „Liposomes, Gregoriaidis, Drug Carriers in Biology and Medicine, kapitola 14, str. 287 až 341 (Academie Press, New York 1979).
Existuje sice velký počet zpráv, které se týkají pokusů použít liposomů jako nosičů léčiv, ale publikací, které se zabývají používáním liposomů pro účely zvyšování skladovatelnosti terapeuticky účinných peptidů nebo proteinů stabilizací jejich struktury, je jen málo. V patentové přihlášce WO 91/04019 o názvu Therapeutic Peptides and Proteins, Hostetler et al., je popsáno použití prázdných liposomů, jako farmaceuticky vhodných ředidel pro solubilizaci polypeptidů a/nebo proteinů za účelem zabránění akumulace těchto polypeptidů a/nebo proteinů na fázovém rozhraní mezi vzduchem a vodou a pro zabránění adsorpce těchto polypeptidů a/nebo proteinů k povrchu nádoby. Hostetler et al. uvádějí, že záporně nabitý fosfolipid se může přidat v množství až do asi 50 % molámích a že přednostním liposomem je neutrální fosfolipid, fosfatidylcholin. Hostetler et al. neuvádějí, že popisované ředidlo má stabilizační účinek na strukturu polypeptidu a/nebo proteinu.
V patentové přihlášce WO 92/06995 o názvu „Preparation and Characterization of Liposomal Formulations of Tumor Necrosis Faktor“, Hung et al., je popsána molekula lipofilně
-2CZ 290029 B6 modifikovaného faktoru nekrosy nádorů (TNF), která je ve spojení s povrchem liposomu, nebo která je v něm zapouzdřena. Uvádí se zde, že liposonmem lipofilizované molekuly TNF mají zvýšenou stabilitu in vivo. Pod označením „stabilita“ se v této publikaci rozumí pokles nebo snížená tendence TNF-liposomu uvolňovat TNF do systému in vivo. Jako přednostní liposomy jsou zde uváděny neutrální lipidy. Hung et al. nepopisují přípravek na bázi TNF, v němž by měly excipienty stabilizační účinek na strukturu proteinu.
V literatuře nelze nalézt nic o kontaktování proteinu, například G-CSF, se záporně nabitým lipidovým váčkem, prostřednictvím kterého by byl protein přímo stabilizován proti tepelně indukované agregaci, denaturaci, ztrátě účinnosti a rozvinutí sekundární struktury. Existuje proto stále potřeba vyvinout přípravky, které by byly stálé při zpracování za vysokých teplot a kterých by bylo možno používat jako nových dopravních vehikul (například pro orální podávání pegylovaného G-CSF). Vynález se právě takových přípravků týká.
Podstata vynálezu
Vynález je zaměřen na přidávání hydrofobních excipientů, například lysofosfolipidů nebo jiných liposomů k proteinům za podmínek, kdy jsou tyto proteiny v roztaveném globulámím stavu, za účelem přímé stabilizace sekundární a terciální struktury těchto proteinů, a tedy za účelem ochrany proteinů proti tepelně indukované agregaci, denaturaci a ztrátě účinnosti. Vynález je zejména zaměřen na stálé přípravky G-CSF-fosfolipid. S překvapením se zjistilo, že přednostní přípravky na bázi G-CSF tohoto typuje možno podrobit několika teplotním cyklům 10 až 95 °C, přičemž po ochlazení dojde k úplné regeneraci sekundární struktury proteinu. Tyto přípravky poskytují dvojnásobný užitek: jednak jsou vhodné pro postupy zpracování, při nichž je třeba používat vysokých teplot a dále jich lze používat jako nová dopravní vehikula pro G-CSF.
Předmětem vynálezu je v souladu s tím fosfolipid-proteinový přípravek, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje protein schopný přechodu do stavu roztavených globulámích částic, který je ve styku se záporně nabitými liposomovými váčky, přičemž fosfolipid-proteinový přípravek vykazuje molámí poměr lipidu k proteinu alespoň 25 : 1 a je přímo stabilizován proti teplem indukované agregaci, denaturaci, ztrátě aktivity a rozvinutí sekundární struktury částečným vložením proteinu do lipidové části liposomového váčku.
V přednostním provedení je komplex protein-fosfolipid tvořen záporně nabitým liposomem zvoleným ze souboru zahrnujícího dioleoylfosfatidylglycerol (DOPG), dimyristoylfosfatidylglycerol (DMPG), dipalmitoylfosfatidylglycerol (DPPG), vaječný fosfatidylglycerol, dioleoyfosfatidylethanolamin (DOPE), vaječný fosfatidylethanolamin, kyselinu dioleoylfosfatidovou (DOPA), kyselinu dimyristoylfosfatidovou (DMPA), kyselinu dipalmitoylfosfatidovou (DPPA), dioleoylfosfatidylserin (DOPS), dimyristoylfosfatidylserin (DMPS), dipalmitoylfosfatidylserin (DPPS), vaječný fosfatidylserin, lysofosfatidylglycerol, lysofosfatidylethanolamin a lysofosfatidylserin.
-3CZ 290029 B6
Obzvláštní přednost se dává záporně nabitému fosfolipidu DOPG,. Dalším znakem vynálezu je udržování hodnoty pH v rozmezí od 3,0 do 7,5.
Další znaky, které jsou charakteristické pro přednostní provedení tohoto vynálezu, zahrnují použití chemicky modifikovaných proteinů v komplexu protein-fosfolipid a dále také používání jednoho nebo více činidel zvolených ze souboru zahrnujícího látky pro nastavení isotonicity, pufry a regulátory pH. Odborníkům v tomto oboru je zřejmé, že do rozsahu tohoto vynálezu spadají stálé přípravky protein-fosfolipid obsahující různé kombinace těchto přídavných znaků.
Přehled obrázků na výkresech
Na obr. 1 je znázorněno fluorescenční emisní spektrum rhG-CSF za přítomnosti (křivka 1) a za nepřítomnosti (křivka 2) váčků z DOPG. Koncentrace rhG-CSF je 0,2 mg/ml. Molámí poměr DOPG : rhG-CSF (křivka 1) je 100 :1.
Na obr. 2 je znázorněn vliv zvyšujícího se poměru lipid: protein na fluorescenci rhG-CSF. Fo představuje počáteční fluorescenci (bez lipidu) a F představuje fluorescenci po přidání lipidu do označeného molámího poměru lipid : rhG-CSF. Na obr. 2(a) je uvedena závislost poměru F/Fo (n) a maximální emisní vlnové (delta) na molámím poměru DOPG : rhG-CSF. Na obr. 2(b) je uvedena závislost poměru F/Fo (n) a maximální emisní vlnové délky (delta) na molámím poměru DOPC : rhG-CSF.
Na obr. 3 jsou uvedeny Stem-Volmerovy grafy zhášení fluorescence rhG-CSF jodidem draselným za nepřítomnosti (plné kroužky) a za přítomnosti (prázdné kroužky) váčků z DOPG. Zhášecí pokusy byly prováděny přidáváním alikvotních vzorků jodidu draselného k rhG-CSF (0,2 mg/ml) a DOPG : rhG-CSF (100 : 1 - molámě).
Na obr. 4 je znázorněno zhášení rhG-CSF tryptofanové fluorescence přídavkem pyrendekanové kyseliny. Emisní vlnová délka je v tomto případě 327 nm. Poměr DOPG : rhG-CSF je 100 : 1 (molámě).
Na obr. 5a je uveden graf ukazující porovnání změn intenzity F pro rhG-CSF za nepřítomnosti a za přítomnosti různých lipidů. V každém případě je molámí poměr lipid : protein 100 :1.
Na obr. 6 je uveden graf ukazující porovnání posunů emisních maxim v případě rhG-CSF za přítomnosti a nepřítomnosti různých lipidů. V každém případě je molámí poměr lipid: protein 100: 1.
Na obr. 7 je znázorněn vliv DMPC (křivka 2), DMPG (křivka 3) a DMPA (křivka 4) na CD rhG-CSF (křivka 1). V každém případě je molámí poměr lipid : protein ve vodě o pH 6,0 50 :1.
Na obr. 8 je znázorněn vliv zvyšující se teploty na CD rhG-CSF (křivka 1) nebo DOPG : rhGCSF (molámí poměr 140 : 1) (křivka 2). Koncentrace rhG-CSF ve vodě o pH 6,0 je 80 pg/ml. Teplota se mění v rozmezí od 10 do 90 °C rychlostí 100 °C/h.
Na obr. 9 jsou znázorněny termogramy z diferenciální kalometrie DSC pro rhG-CSF (křivka 1) a DOPG: rhG-CSF (molámí poměr 45 : 1) (křivka 2). Koncentrace rhG-CSF ve vzorcích je 1 mg/ml (voda o pH 7,0). Rychlost teplotního posunuje 90 °C.
Na obr. 10 je znázorněn vliv teplotního cyklování na CD rhG-CSF (křivka 1) nebo DOPG : rhGCSF (molámí poměr 140 : 1) (křivka 2). Vzorky se rychle»zahřejí na 95 °C a ochladí na 10 °C, jak je to znázorněno šipkami. Koncentrace rhG-CSF ve vzorcích je 80 pg/ml, pH = 6,0.
-4CZ 290029 B6
Na obr. 11 je znázorněn vliv teplotního cyklování na CD rhG-CSF (křivka 1) nebo DMPG: rhG-CSF (molámí poměr 150: 1) (křivka 2). Vzorky se rychle zahřejí na 95 °C a ochladí na 10 °C. Koncentrace rhG-CSF ve vzorcích je 80 pg/ml, pH = 6,0.
Na obr. 12 je znázorněn vliv teplotního cyklování na CD rhG-CSF (křivka 1) nebo DPPG : rhGCSF (molámí poměr 150 : 1) (křivka 2). Vzorky se rychle zahřejí na 95 °C a ochladí na 10 °C. Koncentrace rhG-CSF ve vzorcích je 80 pg/ml, pH = 6,0.
Na obr. 13 je znázorněn graf ukazující schopnost různých lipidů stabilizovat rhG-CSF během lyofilizace. Ve všech případech je molámí poměr lipid: protein 100 : 1. Stabilita se měří na základě retence aktivity in vitro při zkoušce s kostní dření. rhG-CSF samotný nepřežije lyofilizaci, takže se jako kontrolního vzorku používá neupraveného rhG-CSF za nepřítomnosti lipidu.
Na obr. 14 jsou ilustrovány účinky různých lipidů na in vivo účinnost rhG-CSF. Účinnost (na základě počtu bílých krvinek) se měří po subkutánním injekčním podání křečkům. Dávka rhGCSF je 100 pg/kg, při molámím poměru lipid : protein 100 : 1.
Na obr. 15 jsou ilustrovány účinky různých lipidů na in vivo účinnost rhG-CSF. Účinnost (měřená na základě počtu bílých krvinek) se měří po subkutánním injekčním podání křečkům. Dávka rhG-CSF je 100 pg/kg, při molámím poměru lipid : protein 50:1.
Na obr. 16 je uvéden graf ukazující srovnání změn intenzity F pro CHO-G-CSF za nepřítomnosti a za přítomnosti DOPG při měnící se hodnotě pH. V každém případě je molámí poměr lipid : protein 100 : 1.
Na obr. 17 je znázorněn graf ukazující srovnání posunů emisních maxim CHO-G-CSF za nepřítomnosti a za přítomnosti DOPG při měnící se hodnotě pH. V každém případě je molámí poměr lipid : protein 100 : 1.
Na obr. 18 je znázorněn účinek teplotního cyklování na CDPEG-G-CSF (plná čára) a DMPG : PEG-G-CSF (v molámím poměru 17 : 1) (přerušovaná čára). Vzorky se zahřívají na 90 °C a chladí na 10 °C.
Na obr. 19 (a) je znázorněn účinek teplotního cyklování na CD GM-CSF v PBS o pH 7,0. GM-CSF při 10 °C (plná čára) se srovnává s GM-CSF, který byl zahřát na 90 °C a potom ochlazen na 10 °C (přerušovaná čára). Na obr. 19(b) je znázorněn účinek teplotního cyklování na CD DPPG:PEG-G-CSF (v molámím poměru 17 : 1). DPPG:GM-CSF při 10 °C (plná čára) se srovnává s DPPG:GM-CSF, který byl zahřát na 90 °C a potom ochlazen na 10 °C (přerušovaná čára).
Příklady provedení vynálezu
Přípravky podle vynálezu jsou podrobněji popsány v následujícím popisu a ilustrovány v dále uvedených příkladech provedení. Tyto příklady ukazují různé aspekty vynálezu a zahrnují výsledky zkoušení stability a biologické účinnosti různých přípravků protein-fosfolipid. S překvapením se zjistilo, že interakce mezi proteinem a lipidovým váčkem má přímý stabilizační vliv na strukturu proteinu. Tento stabilizační účinek na protein se projevuje i za podmínek, které by v nepřítomnosti lipidu k denaturaci proteinu.
Pro použití podle tohoto vynálezu přichází v úvahu řada proteinů, které jsou schopny přejít do stavu roztavených globulámích částic. Jako příklady takových proteinů je možno uvést cytokiny, včetně různých hematopoietických faktorů, jako jsou výše uvedené G-CSF, GM-CSF, interferony (alfa, beta a gamma), interleukiny (1-11), erythropoietin (EPO), faktor růstu
-5CZ 290029 B6 finroblastů, faktor stonkových buněk (stem cell factor), faktor růstu nervů, BDNF, NT3, růstový faktor pocházející z krevních destiček a faktor růstu nádorů (alfa, beta). I jiné proteiny je možno zkoušet na schopnost přechodu do stavu roztavených globulámích částic (MGS). V případě, že je zkoušený protein schopen přejít do stavu MGS, může se potom uvést do styku s záporně nabitými liposomovými váčky a poté se může vyhodnotit dosažený stabilizační účinek.
G-CSF, kteiý je užitečný při provádění tohoto vynálezu, může být obecně v nativní formě, jaká se v čistém stavu izoluje ze savčích organismů nebo se alternativně může jednat o produkt chemických syntetických postupů nebo produkt exprese exogenních sekvencí DNA získaných klonováním genomové DNA nebo cDNA nebo genovou syntézou v prokaryontních nebo eukaryontních hostitelích. Jako vhodné prokyiyontní hostitele je možno uvést různé bakteriální buňky (například buňky E. coli). Vhodnými eukaryontními hostiteli jsou kvasinky (například S. cerevisiae) a savčí buňky, například z ovárií čínského křečka nebo opičí buňky. V závislosti na použitém hostiteli může být produkt exprese G-CSF glykosylován savčími nebo jinými eukaryontními uhlohydráty nebo může být neglykosylován. Do rozsahu tohoto vynálezu spadá použití kterékoliv z těchto forem G-CSF, přestože rekombinantním G-CSF z E. coli, se dává přednost, s ohledem na největší obchodní důležitost.
Také G-CSF, který má být chemicky modifikován pro použití při tomto vynálezu, může být bud’ přírodní humánní GCSF (nhG-CSF), nebo produkt rekombinace nukleové kyseliny, jako je produkt exprese v prokaryontních nebo eukaryontních hostitelských buňkách. Pod označením „chemická modifikace“ se v tomto kontextu obecně rozumí připojení chemické skupiny k molekule G-CSF. Modifikace proteinů a fúzované proteiny jsou přehledně popsány v článku Francis, Focus on Growth Factors 3: 4 až 10 (květen 1992) (publikace Mediscript, Mountview Court, Friem Bamet Lané, London, N20 OLD, Velká Británie). Jako příklad je možno uvést EP 0 401 384 o názvu Chemically Modified Granulocyte Colony Stimulating Factor, kde jsou popsány materiály a způsoby výroby G-CSF, k němuž jsou připojeny molekuly polyethylenglykolu. Připojení může být vazbou přímo k proteinu nebo ke skupině, která působí jako můstek k účinnému činidlu. Kovalentní vazbě se dává přednost, poněvadž představuje nejstálejší připojení. Chemická modifikace může přispívat k regulovanému, zpožděnému nebo rozšířenému účinku G-CSF. To se může projevit například regulací doby, za kterou chemicky modifikovaný G-CSF dospěje do oběhu. Jako příklad chemického modifikátoru je možno uvést polyethylglykoly, včetně jejich derivátů.
Pro použití při provádění tohoto vynálezu přichází v úvahu jakékoliv přípravky na bázi chemicky modifikovaného G-CSF, které vykazují po podání účinnost. Tuto účinnost je možno zjišťovat různými metodami, které jsou známé odborníkům v tomto obru. Přednost se dává pegylovanému G-CSF, zejména pegylovanému G-CSF pocházejícímu z E. coli a zejména pak tri- tetrapegylovanému G-CSF získanému z E. coli.
Bylo oznámeno, že G-CSF je nejstálejší za kyselých podmínek, přestože při pH v rozmezí od 2,5 do 5,0 u terciární struktury a zvýšení obsahu alfa-helixu [Narhi et al., J. Protein Chem. 10, 359 až 367 (1991)]. Tato konformační změna je charakteristická pro stav roztavených globulámích částic (MGS). Podobně jako je tomu při práci s jinými proteiny, které jsou schopny přecházet do MGS, musí se i při práci s G-CSF zajistit ochrana před tepelně indukovaným rozvinutím sekundární a terciární struktury, aby se zabránilo agregaci a denaturaci.
Podle vynálezu se může použít GM-CSF v nativní formě, která je izolována v čistém stavu ze savčích organismů nebo produktu exprese exogenních sekvencí DNA získaných klonováním genomové DNA nebo cDNA nebo genovou syntézou v prokaryontních nebo eukaryontních hostitelích. Jako vhodné prokaryontní hostitele je možno uvést různé bakteriální buňky (například buňky E. coli). Vhodnými eukaryontními hostiteli jsou kvasinky (například S. cerevisiae) a savčí buňky, například z ovárií čínského křečka nebo opičí buňky. V závislosti na použitém hostiteli může být produkt exprese GM-CSF glykosylován savčími nebo jinými eukaryontními uhlohydráty nebo může být neglykosylován. Do rozsahu tohoto vynálezu spadá použití kterékoliv
-6CZ 290029 B6 z těchto forem GM-CSF, přestože rekombinantním GM-CSF a zejména GM-CSF z E. coli, se dává přednost, s ohledem na největší obchodní důležitost.
Jako lipidové váčky, které jsou užitečné v přípravcích podle tohoto vynálezu, je možno uvést záporně nabité liposomy, které jsou schopny interakce s příslušným proteinem. Jako konkrétní liposomy, které přicházejí v úvahu je možno uvést látky zvolené ze souboru zahrnujícího dioleoylfosfatidylglycerol (DOPG), rldimyristoylfosfatidylglycerol (DMPG), dipalm itoylfosfatidylglycerol (DPPG), vaječný fosfatidylglycerol, dioleoylfosfatidylethanolamin (DOPE), vaječný fosfatidylethanolamin, kyselinu dioleoylfosfatidovou (DOPA), kyselinu dimyristoylfosfatidovou (DMPA), kyselinu dipalmitoylfosfatidovou (DPPA), dioleoylfosfatidylserin (DOPS), dimyristoylfosfatidylserin (DMPS), dipalmitoylfosfatidylserin (DPPS), vaječný fosfatidylserin, lysofosfatidylglycerol, lysofosfatidylethanolamin a lysofosfatidylserin.
V závislosti na konkrétně použitém liposomu se množství liposomu může měnit.
Přípravky protein-fosfolipid přednostně obsahují pufrovací činidlo pro udržování pH roztoku v požadovaném rozmezí. Jako přednostní pufrovací činidla je možno uvést octan sodný, fosforečnan sodný a citran sodný. Také se může použít směsi takových pufrovacích činidel. Množství pufrovacího činidla, které je vhodné v přípravcích podle vynálezu, závisí do značné míry na konkrétně použitém pufrovacím činidle a na pH roztoku. Tak například octan je účinnějším puforvacím činidlem při pH 5 než při pH 6, takže je možno použít méně octanu v roztoku o pH 5 než v roztoku o pH 6. Přednostní rozmezí pH přípravku podle tohoto vynálezu je 3,0 až 7,5.
Přípravky podle vynálezu mohou dále obsahovat isotonizační činidlo, které činí roztok isotonickým a kompatibilnějším pro injekční aplikaci. Z isotonizačních činidel se největší přednost dává chloridu sodnému v rozmezí koncentrace 0 až 150 mM.
Předmětem tohoto vynálezu jsou také farmaceutické prostředky obsahující množství polypeptidového produktu podle vynálezu spolu s farmaceuticky vhodnými ředidly, konzervačními látkami, solubilizátory, emulgátory, adjuvanty a/nebo nosiči. Takové prostředky budou ovlivňovat fyzikální stav, stabilitu a biologickou dostupnost proteinu (viz například Remingtons Pharmaceutical Sciences, 18. vydání, 1 435-1 712 (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990). Konkrétně velikost účinného množství proteinu bude v jednotlivých případech záviset na řadě faktorů, které bude brát odborník v tomto oboru v úvahu, jako je požadovaný terapeutický výsledek, závažnost léčené choroby nebo stavu, fyzický stav subjektu, atd.
V přednostním provedení, pří němž se používá rhG-CSF z E. coli, se jako liposomových váčků používá DOPG při molámím poměru DOPG : G-CSF 50:1, při hodnotě pH = 4,5 a koncentraci octanu sodného 10 mM.
V přednostním provedení, při němž se používá rhGM-CSF z E. coli, se jako liposomových váčků používá DMPG při molámím poměru DMPG : GM-CSF 17 : 1, při hodnotě pH = 7,0 v roztoku chloridu sodného pufrovaném fosforečnanem (PBS).
V přednostním provedení, při němž se používá rhG-CSF z E. coli, který byl chemicky modifikován (pegylován) za vzniku tri-tetra-pegylovaného rhG-CSF se jako liposomových váčků používá DMPG při molámím poměru DMPG : PEG-G-CSF 17 : 1, při hodnotě pH - 4,5.
Přestože je vynález popsán a ilustrován na případech specifických přípravků protein-lipid a specifických postupů zpracování, odborníkům v tomto oboru je zřejmé, že může existovat řada podobných přípravků a podobných postupů zpracování, které všechny spadají do rozsahu tohoto vynálezu.
Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Úvodní experimenty se provádějí za účelem zjištění možnosti zavést rekombinantní humánní G-CSF (rhG-CSF) do lipidového váčku. rhG-CSF se vyrobí rekombinantní DNA technologií, při níž se buňky E. coli tranfekují sekvencí DNA kódující humánní G-CSF způsobem popsaným v US patentu č. 4 810 643 (Souza). rhG-CSF se připraví ve formě roztoku ve zředěné kyselině chlorovodíkové o pH 4,0, přičemž tento roztok má koncentraci 4 mg/ml. Všechny lipidy jsou výrobky zakoupené od firmy Avanti Polar Lipids (Alabaster, Alabama, USA) a skladují se při teplotě -20 °C pod atmosférou dusíku při konečné koncentraci 100 mg/ml v chloroformu.
Příprava komplexů G-CSF-fosfolipid
Pro přípravu lipidových váčků, které mají být kombinovány s G-CSF se 30 pmol příslušného lipidu umístí do skleněné trubičky a vysuší na tenký film za použití proudu plynného dusíku. Lipidové filmy se suší přinejmenším 2 hodiny za vakua, aby se odstranily všechny stopy chloroformu. Potom se lipidové filmy hydratují v 1 ml buď desetilované deionizované vody (ddH2O), fosfátem pufrovaného roztoku chloridu sodného o pH 7,2 (Gibco/BRL „D-PBS“), nebo 150mM roztoku chloridu sodného. Potom se vzorky zpracovávají ultrazvukem vsonikátoru lázňového typu (Laboratory Supplies, Hickville, New York, USA). V sonikaci se pokračuje tak dlouho, dokud nejsou vzorky opticky čiré (obvykle asi 10 až 15 minut). Potom se vzorky skladují při teplotě 4 °C pod atmosférou dusíku až do použití. Výsledná koncentrace lipidu je 30mM. Alternativně je možno lipidové váčky vyrobit za použití 300 μπιοί lipidu, přičemž sušení pod dusíkem a další vakuové sušení se provádí výše uvedeným způsobem. Suché lipidové filmy se hydratují výše uvedeným způsobem v 10 ml příslušného vodného roztoku. Potom se vzorky mikrofluidizují vemuígátoru stolního typu (Microfludics Model 11 OS, Microfluidics lne. Cambridge, Massachusetts, USA), který pracuje za tlaku 68,7 mPa. Vzorky se cirkulují přístrojem celkem desetkrát. Mikrofluidizované vzorky se potom skladují při 4 °C, jak je to popsáno výše.
Komplexy G-CSF-fosfolipid se vyrobí smícháním G-CSF (popsaného výše) s příslušným lipidem (popsaným výše). Míšení se provádí vířením, mícháním nebo jemným třepáním. Pro vyhodnocení uložení do membrány a stabilizace proteinu se používá různých molámích poměrů lipid : G-CSF. Tak například pro výrobu 3ml vzorku ve vodě obsahujícího 0,2 mg/ml G-CSF při molámím poměru lipid: G-CSF 40:1 se smíchá 150 μΐ zásobního roztoku G-CSF s 44 μΐ roztoku lipidu (30mM zásobní roztok připravený sonikaci ve vodě), přičemž se přidá voda do konečného objemu 3 ml. Doporučená doba inkubace (která však není nutná) je 5 minut. Této doby inkubace se používá v uvedených pokusech před zkoušením vzorku.
-8CZ 290029 B6
G-CSF se také může před mikrofluidizací smíchat s hydratovaným lipidem. Při následující mikrofluidizaci vzniklé směsi, která je popsána výše, dojde k zadržení G-CSF v lipidové membráně.
Analýza komplexů G-CSF-fosfolipid
1. Tryptofanové emisní spektrum
V rhG-CSF jsou přítomny dva tryptofanové zbytky, které jsou dosti citlivé na podmínky okolí. Proto se provádí analýza za účelem stanovení fluorencence tryptofanu v rhG-CSF, když se rhG-CSF uvede do styku s liposomem. Modrý posun emisního maxima fluorescence by napovídal, že tryptofanové zbytky jsou umístěny v hydrofobnějším prostředí a že tedy rhG-CSF je uložen v lipidových membránách. Výborný přehled analýzy fluorescence tryptofanu je uveden v publikaci Principles of Fluorescence Mikroscopy, J. Lakowicz, kapitola 11 (Plenům Press, New York, 1983).
Tryptovanová fluorescence komplexů G-CSF lipid (popsaná výše) se stanovuje excitací vzorků při 280 nm, přičemž emise se zkoumá v rozmezí od 285 do 420 nm se stupňovitým posunem po jenom nm rychlostí 1 nm/s. Objem vzorkuje vždy 3 ml a konečná koncentrace G-CSF v každém vzorkuje 0,2 mg/ml. Poměr lipid-G-CSF se mění. Všechna fluorescenční měření se provádějí za použití fluorometru PTI Alphascan (South Brunswick, New Jersey, USA). Všechna měření se provádějí při 25 °C a tato teplota se udržuje pomocí duplikátorového držáku kyvety, jehož vodní plášť je připojen k cirkulující vodní lázni. Emisní spektra se zaznamenávají a analyzují za použití software od firmy PTI.
Fluorescenční spektra rhG-CSF za přítomnosti a za nepřítomnosti malých unilamelámích váčků zDOPG jsou uvedena na obr. 1. rhG-CSF vykazuje za nepřítomnosti váčků zDOPG emisní maximum při 334 nm. Za přítomnosti DOPG při poměru lipid:protein 100 : 1 dochází k mokrému posunu emisního maxima tryptofanové fluorescence na 327 nm a k silnému zvýšení intenzity fluorescence. Nízká vlnová délka fluorescenční emise za přítomnosti DOPG napovídá, že tryptofanové zbytky jsou umístěny v prostředí, které je hydrofobnější než prostředí nativního proteinu. Jak je zřejmé z obr. 2, posun fluorescence je závislý na molámím poměru DPOG:G-CSF a vložení do membrány je detegovatelné od poměru DOPG:G-CSF 10:1.
2. Jodidové zhášecí pokusy
Jodid je účinným kolisním zhášedlem tryptofanové fluorescence, ale nemůže proniknout lipidovými membránami. Účinné zhášení fluorescence tryptofanu jodidem tedy ukazuje, že jsou tryptofanové zbytky exponovány vodnému rozpouštědlu, zatímco k ochraně před jodidovým zhášením dochází při oddělení (sekvestraci) tryptofanových zbytků proteinu od vodného rozpouštědla. Při těchto pokusech se používá G-CSF a přípravku DOPG:G-CSF s poměrem lipid:protein 100: 1. Nejprve se zaznamenají počáteční hodnoty (Fo) vzorků a potom se měří intenzita fluorescence s postupně se zvyšujícím množstvím přidaného jodidu draselného (přitom se používá 5M zásobního roztoku jodidu draselného). Jak vzorek, tak roztok jodidu draselného se připraví s obsahem siřičitanu sodného lmM koncentraci (konečná koncentrace), podle publikace Lee et al., Biochem. Biophys. Acta, 984: 174—182 (1989) a Le Doan et al., Biochem. Biophys. Acta, 858 : 1-5 (1986). Přípravek siřičitanu sodného zabraňuje vzniku volného jodu, který by mohl vniknout do nepolárních oblastí proteinů a membrán. Data se analyzují pomocí StemVolmerovy rovnice
F(/F=1+Kki[KI] kde
Fq představuje intenzitu fluorescence vzorku za nepřítomnosti jodidu draselného,
-9CZ 290029 B6
F představuje intenzitu fluorescence vzorku za přítomnosti jodidu draselného o koncentraci [KI],a
Kki představuje Stem-Volmerovu zhášecí konstantu pro zhášení fluorescence tryptofanových zbytků G-CSF jodidem draselným (Lehrer, S. Biochemistry 10: 3 254 až 3 263, 1989).
Stem-Volmerovo grafické znázornění dat je uvedeno na obr. 3. Za nepřítomnosti váčků z DOPG dochází k účinnému zhášení fluorescence rhG-CSF jodidem draselným. Za přítomnosti DOPG je Stem-Volmerova křivka lineární, což ukazuje, že jodid má špatný přístup k oběma tryptofanovým zbytkům. Tato data ukazují, že tryptofanový zbytek, který je za nepřítomnosti DOPG dostupný pro jodid, se stává za přítomnosti DOPG pro jodid nedostupným. Z toho důvodu musí být část rhG-CSF obsahující tento tryptofanový zbytek uložena ve dvoj vrstvě z DOPG.
3. Měření přenosu energie
Jak bylo ukázáno výše, může docházet k přenosu energie mezi donory tryptofanu a fluorescentními akceptory rozpustnými v lipidech, jako je pyrendekanová kyselina, poněvadž se excitační spektrum této próby významně překrývá s emisním spektrem tryptofanu [Friere et al., Biochemistry 22: 1 675 až 1 680 (1983)]. Když je protein vložen do lipidových membrán, vede přenos energie z tryptofanu na pyren ke zhášení tryptofanové fluorescence. Při tomto pokusu se zaznamenává tryptofanová emisní intenzita různých komplexů G-CSF:lipid jednak před (Fo) a jednak po (F) přidání různých množství pyrendekanové kyseliny (přitom se používá zásobního roztoku této kyseliny v tetrahydrofúranu o koncentraci 30 μg/ml). Během přidávání pyrendekanové kyseliny se vzorky neustále míchají, aby se povzbudilo promísení pyrendekanové kyseliny a vzorku. Poměr F/Fo je úměrný rozsahu přenosu energie, k němuž dochází mezi tryptofanovými zbytky G-CSF a hydrofobním akceptorem energie, pyrendekanovou kyselinou.
Na obr. 4 je znázorněn zhášecí rhG-CSF za přítomnosti DOPG při poměru lipid:protein 100 : 1 v závislosti na množství přidané pyrendekanové kyseliny. Ke zhášení dochází při velmi nízké koncentraci pyrendekanové kyseliny (pod 1 % molámí), takže účinek fluorescentní próby na strukturu a chování membrány je minimální. Poněvadž se dá očekávat, že se pyrendekanová kyselina lychle rozdělí v lipidových dvojvrstvách, ukazují uvedená data, že rhG-CSF je uložen v membránách z DOPG dostatečně hluboko, aby to umožnilo účinný přenos energie z tryptofanových zbytků na pyrenový akceptor. Přenos energie se potvrdí excitačním spektrem váčků z DOPG značeného pyrendekanovou kyselinou za přítomnosti a za nepřítomnosti rhG-CSF.
Výše uvedená analýza ukazuje, že dochází k těsné interakci mezi rhG-CSF a nenasyceným fosfolipidem, jako je DOPG. Za přítomnosti váčků z DOPG jsou tryptofanové zbytky rhG-CSF chráněny před vodorozpustným zhášedlem fluorescence, ale jsou susceptibilní ke zhášení prostřednictvím přenosu energie na hydrofobní fluorescentní próbu. Dohromady tato data ukazují, že rhG-CSF se může uložit v membránách z DOPG. Vložení do membrány je detegovatelné od poměru lipidu k rhG-CSF 10:1 a tento poměr může představovat počet lipidových molekul obklopujících vloženou část proteinu.
Příklad 2
V tomto příkladu se měří schopnost interakce G-CSF s jinými fosfolipidy za použití porovnání intenzit F/Fo a emisních maxim způsobem, který je popsán výše. Ve všech případech se používá molámího poměru lipid:rhG-CSF 100 : 1.
Na obr. 5 jsou uvedena data F/Fo pro rhG-CSF za nepřítomnosti a za přítomnosti různých lipidů. Na obr. 6 jsou znázorněna data emisních maxim pro stejné přípravky. Data z obr. 5 a obr. 6
-10CZ 290029 B6 ukazují, že kromě DOPG se rhG-CSF může také uložit do DMPG a, méně účinně, do fosfatidylethanolaminů (PE) a do fosfatidylserinú (PS). Kromě toho se zjistilo, že ve srovnání s DOPE se může zlepšeného uložení rhG-CSF dosáhnout za použití G-DOPE (vzorek DOPE, v němž je hlavová skupina PE učiněna zápornější).
DOPC, DMPC a DPPC jsou neutrální lipidy a váčky z nich vyrobené mají pouze malý nebo nemají žádný vliv jak na emisní maximum, tak na intenzitu fluorescence rhG-CSF, což ukazuje, že nedochází k žádné interakci s těmito fosfolipidy (viz obr. 5 a 6 a obr. 7, křivka 2).
Výše uvedená data ukazují, že protein, který je schopen přechodu do stavu roztavených globulámích částic, může být vložen do různých lipidových váčků. Kvýše uvedené interakci rhG-CSF s lipidem však dochází pouze v tom případě, že se použije záporně nabitých lipidových váčků. Ze záporně nabitých lipidových váčků poskytují silnější interakce obecně lipidové váčky z větším zápomím nábojem.
Příklad 3
V tomto příkladu se zjišťuje účinek interakce rhG-CSF:DOPG na stabilitu proteinu. Provádějí se měření cirkulámího dichroismu za použití přístroje Jasco J-720 vybaveného termostatovým držákem kyvety Peltierova typu a magnetickým míchadlem. Cirkulámí dichroismus při 220 nm se měří za použití konečné koncentrace rhG-CSF 80 pg/ml při pH 6,0. Diferenciální kalometrická měření (DSC) se provádějí pomocí kalorimetru Microcal MC-2. Vzorky rhG-CSF (ve vodě o koncentraci 1 mg/ml) nebo DOPG:rhG-CSF (molámí poměr 45 : 1, ve vodě) se měří rychlostí 90 °C/h. Naměřená data se uloží do paměti a analyzují pomocí software Microcal.
Změny alfa-helicity G-CSF vyvolané teplotou se zjišťují měřením cirkulámího dichroismu při 220 nm v závislosti na zvyšující se teplotě. Tepelně indukované rozvinování rhG-CSF při pH 6,0 je uvedeno na obr. 8. Křivka ukazuje, že k poměrně ostrému přechodu, který vede ke ztrátě alfa-helicity dochází při teplotě od asi 60 do 70 °C. Po tomto přechodu se rhG-CSF nevratně z roztoku vysráží. Teplotní rozmezí rozvinování je podobné jako teplota tání rhG-CSF při pH 7,0 podle stanovení diferenciální kalorimetrií (DSC), jak je to znázorněno na obr. 9.
Naproti tomu, vzorky DOPG:rhG-CSF vykazují postupnou ztrátu alfa-helicity se zvyšující se teplotou a na rozdíl od samotného rhG-<SF se nezdá být teplotou indukované rozvinování struktury DOPG:rhG-CSF kooperativní (viz obr. 8). Tento závěr je též demonstrován ztrátou tavného zvratu při diferenciální kalorimetrii (DSC) viz obr. 9. Pozomhodné je, že u vzorků DOPG:rhG-CSF může po zahřívání na 95 °C dojít k regeneraci alfa-helicity, přičemž teplotu, které jsou vzorky vystaveny, je možno opakovaně cyklovat mezi 95 a 10 °C, a po ochlazení dochází k úplné regeneraci helicity (viz obr. 10). V případě samotného rhG-CSF dojde za těchto podmínek k nevratnému rozvinutí a vysrážení z roztoku.
Také se měří účinek DMPG a DPPG na cirkulámí dichroismus G-CSF. Použije se komplexu lipid:rhG-CSF vmolámím poměm 150: 1 a podobně jako v případě DOPG dojde pomocí DMPG a DPPG také ke stabilizaci sekundární struktury rhG-CSF (viz obr. 11 až 13).
Výše uvedená data ukazují, že interakce mezi rhG-CSF na jedné straně a DOPG, DMPG nebo DPPG na straně druhé, má za následek zvýšení stability proteinu za podmínek, za nichž je samotný rhG-CSF nestálý. Tato interakce přímo stabilizuje sekundární a terciární strukturu rhG-CSF.
-11 CZ 290029 B6
Příklad 4
V tomto příkladu se stanovuje účinek interakce rhG-CSF:DOPG na biologickou účinnost rhG-CSF. In vitro účinnost rhG-CSF se zkouší za použití zavádění [3H]-thymidinu do buněk murinní kostní dřeně, přičemž toto zavádění je závislé na G-CSF, způsobem popsaným v Zsebo et al., Immunobiology 172: 175 až 184 (1986). Všechna měření účinnosti se provádějí vždy třikrát. Účinnost in vivo se stanovuje tak, že se křečkům podává subkutánní injekcí rhG-CSF v dávce 100 pg/kg a měří se počet bílých krvinek.
1. Účinnost in vitro
A. Měří se specifická účinnost rhG-CSF za nepřítomnosti a za přítomnosti DOPG. Také se zkoušejí tepelně zpracované vzorky rhG-CSF a DOPG:rhG-CSF. Výsledky jsou souhrnně uvedeny v tabulce 1.
Tabulka 1
Vzorek____________________________________Specifická účinnost (U/mg proteinu)__________ rhG-CSF 0,66 ± 0,09 rhG-CSF (po zahřívání)’ nedetegovatelná
DOPG:rhG-CSFb 0,61 ± 0,11
DOPG:rhG-CSFb (po zahřívání)’0,52 ± 0,08 před měřením se vzorek 10 minut inkubuje při 85 °C ve vodné lázni b molámí poměr DOPG:rhG-CSF je 50 : 1
Jakje zřejmé z tabulky 1, vložení do dvojvrstev z DOPG nemá nepříznivý účinek na biologickou účinnost rhG-CSF. Po lOminutovém zahřívání na 85 °C má rhG-CSF nedetegovatelnou účinnost a protein se vysráží. Po podobném zpracování si komplex DOPG:rhG-CSF zachovává asi 85 % účinnosti tepelně nezpracovaného rhG-CSF a jeho sekundární struktura se po ochlazení plně regeneruje.
B. Také se studuje schopnost různých lipidů stabilizovat rhG-CSF v průběhu lyofilizace. Vzorky rhG-CSF v kombinaci s různými lipidy se lyofilizují a výše uvedeným způsobem se zkouší jejich účinnost. Smíchání rhG-CSF s DOPG, DMPG a DPPG umožňuje prakticky ze 100 % zachovat biologickou účinnost rhG-CSF po lyofilizaci (viz obr. 14). Samotný rhG-CSF lyofilizační postup nepřežije.
/
2. Účinnost in vivo
Také se měří účinnost rhG-CSF za nepřítomnosti a za přítomnosti lipidu na počet bílých krvinek. Účinnost se měří po subkutánní injekci (použitá dávka rhG-CSF je 100 pg/kg v den 0). Zkouší se 5 různých komplexů lipid:rhG-CSF a ve všech případech si komplex lipid:rhG-CSF podržuje účinnost in vivo (viz obr. 15 a 16).
Tyto studie ukazují, že uložení v záporně nabitých lipidových dvojvrstvách neovlivňuje nepříznivě biologickou účinnost rhG-CSF. Kromě toho se ukazuje, že ochranný účinek lipidu chránícího rhG-CSF se projevuje i při lyofilizaci.
-12CZ 290029 B6
Příklad 5
V tomto příkladu se zkouší schopnost interakce mezi chemicky modifikovaným G-CSF [pegylovaným G-CSF (PEG-G-CSF)] a G-CSF získaným jako produkt exprese v eukaryontních hostitelských buňkách (CHO-G-CSF) a záporně nabitých lipidovými váčky. V případě CHO-GCSF se stanovení provádějí na základě porovnání intenzit F/Fo a emisních maxim (způsobem popsaným v příkladu 1). Ve všech případech je molámí poměr lipidu k proteinu 100: 1.
V případě PEG-G-CSF je stanovení založeno na analýze cirkulámího dichroismu.
Použitý CHO-G-CSF je produktem rekombinantní DNA technologie, při níž se buňky ovárií čínského křečka (CHO) transfekují sekvencí DNA kódující humánní G-CSF způsobem popsaným v US patentu č. 4 810 643 (Souza). CHO-G-CSF se formuluje jako roztok vPBS o pH 7,0 o koncentraci 0,6 mg/ml. Ukazuje se, že CHO-G-CSF je schopen podobné interakce s DOPG, jako rhG-CSF, přičemž všechny vzorky vykazují za přítomnosti DOPG zvýšenou intenzitu fluorescence, jakož i modrý posun v emisním spektru (viz obr. 17 a 18). Interakce s DOPG není tedy důsledkem nějaké zvláštnosti rekombinantní formy G-CSF.
Jako PEG-G-CSF se při těchto pokusech používá tritetra-pegylovaného G-CSF získaného z E. coli (za použití polyethylenglykolu (PEG) 6 000). Vzorky o molámím poměru DMPG:PEGG-CSF 17 : 1 se vyrobí za použití výše popsaných postupů. Zjistí se, že u vzorků DMPG:PEGG-CSF dochází k úplné regeneraci sekundární struktury po zahřívání (obr. 19). Přes přítomnost molekul PEG je derivatizovaný protein schopen interakce s lipidem stejným způsobem jako nativní protein.
Výše uvedená data ukazují, že stabilizační účinky vyvolané interakcí mezi G-CSF a záporně nabitým lipidovým váčkem nejsou jedinečné pro rhG-CSF získaný jako produkt exprese prokaryontních hostitelských buněk. Také chemicky modifikovaný protein, v tomto případě PEG-G-CSF:DMPG, který může přejít do stavu MGS může být stabilizován, je-li uveden do styku s liposomovým váčkem.
Příklad 6
V tomto příkladu se studuje účinek DMPG a DPPG na GM-CSF. Jako GM-CSF se použije rekombinantního humánního GM-CSF popsaného v US patentu č. 5 047 504 (Boone), zpracovaného na roztok o koncentraci 1 mg/ml ve fosforečnanem pufrovaném roztoku chloridu sodného (PBS) o pH 7,0. Použije se molámího poměru lipid:GM-CSF 17:1a pomocí analýzy cirkulámího dichroismu, popsané výše, se měří jeho tepelná stálost. DMPG a DPPG mohou vést ke zlepšení tepelné stálosti GM-42SF, tj. po zahřívání se regeneruje sekundární struktura GM-CSF (viz obr. 20a a 20b).
Výše uvedený příklad představuje další příklad interakce mezi proteinem, který je schopen přejít do stavu roztavených globulámích částic a záporně nabitým lipidovým váčkem, která se projevuje zlepšením tepelné stability proteinu.
Claims (12)
1. Fosfolipid-proteinový přípravek, v y z n a č u j í c í se t í m , že obsahuje protein schopný přechodu do stavu roztavených globulámích částic, který je ve styku se záporně nabitými liposomovými váčky, přičemž fosfolipid-proteinový přípravek vykazuje molámí poměr lipidu k proteinu alespoň 25 : 1 a je přímo stabilizován proti teplem indukované agregaci, denaturaci, ztrátě aktivity do lipidové části liposomového váčku.
2. Fosfolipid-proteinový přípravek podle nároku 1,vyznačuj ící se tím, že jeho pH leží v rozmezí od 3,0 do 7,5.
3. Fosfolipid-proteinový přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že liposomové váčky jsou z látky zvolené ze souboru zahrnujícího dioleoylfosfatidylglycerol (DOPG), dimyristoylfosfatidylglycerol(DMPG), dipalmitoylfosfatidylglycerol (DPPG), vaječný fosfatidylglycerol, dioleoylfosfatidylethanolamin (DOPE), vaječný fosfatidylethanolamin, kyselinu dioleoylfosfatidovou (DOPA), kyselinu dimyristoylfosfatidovou (DMPA), kyselinu dipalmitoylfosfatidovou (DPPA), dioleoylfosfatidylserin (DOPS), dimyristoylfosfatidylserin (DMPS), dipalmitoylfosfatidylserin(DPPS), vaječný fosfatidylserin, lysofosfatidylglycerol, lysofosfatidylethanolamin a lysofosfatidylserin.
4. Fosfolipid-proteinový přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že jako protein obsahuje cytokin.
5. Fosfolipid-proteinový přípravek podle nároku 4, vyznačující se tím, že jako cytokin obsahuje hematopoietický faktor.
6. Fosfolipid-proteinový přípravek podle nároku 5, vyznačující se tím, že jako hematopoietický faktor obsahuje G-CSF nebo GM-CSF.
7. Fosfolipid-proteinový přípravek podle nároku 5, vyznačující se tím, že jako hematopoietický faktor obsahuje G-CSF.
8. Fosfolipid-proteinový přípravek podle nároku 7, vyznačující se tím, že jako G-CSF obsahuje přírodní humánní G-CSF získaný jako produkt exprese v prokaryontních nebo eukaryontních hostitelských buňkách.
9. Fosfolipid-proteinový přípravek podle nároku 7, vyznačující se tím, že jako G-CSF obsahuje chemicky modifikovaný G-CSF.
10. Fosfolipid-proteinový přípravek podle nároku 9, vyznačující se tím, že jako chemicky modifikovaný G-CSF obsahuje pegylovaný G-CSF.
-14CZ 290029 B6
11. Fosfolipid-proteinový přípravek podle nároku 1,vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky vhodný nosič.
12. Fosfolipid-proteinový přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že jako
5 protein obsahuje rhG-CSF z Escherichia coli, jako liposomové váčky obsahuje váčky z DOPG, molámí poměr DOPG:rhG-CSF je 50 : 1, pH přípravku je 4,5 a přípravek obsahuje octan sodný v lOmM koncentraci.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US13241393A | 1993-10-06 | 1993-10-06 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ143895A3 CZ143895A3 (en) | 1996-01-17 |
| CZ290029B6 true CZ290029B6 (cs) | 2002-05-15 |
Family
ID=22453938
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19951438A CZ290029B6 (cs) | 1993-10-06 | 1994-09-29 | Fosfolipid-proteinový přípravek |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0671905B1 (cs) |
| JP (1) | JP2852127B2 (cs) |
| KR (1) | KR100372006B1 (cs) |
| CN (1) | CN1206982C (cs) |
| AT (1) | ATE222752T1 (cs) |
| AU (1) | AU683698B2 (cs) |
| CA (1) | CA2150939C (cs) |
| CZ (1) | CZ290029B6 (cs) |
| DE (1) | DE69431236T2 (cs) |
| DK (1) | DK0671905T3 (cs) |
| ES (1) | ES2184768T3 (cs) |
| FI (1) | FI116271B (cs) |
| HU (1) | HUT72326A (cs) |
| IL (1) | IL111170A (cs) |
| NO (1) | NO314064B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ274705A (cs) |
| PT (1) | PT671905E (cs) |
| RU (1) | RU2119791C1 (cs) |
| WO (1) | WO1995009611A2 (cs) |
| ZA (1) | ZA947782B (cs) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5874075A (en) * | 1993-10-06 | 1999-02-23 | Amgen Inc. | Stable protein: phospholipid compositions and methods |
| SI0937456T1 (en) * | 1998-02-23 | 2004-12-31 | Cilag Ag International | Erythropoietin liposomal dispersion |
| WO1999061032A1 (en) * | 1998-05-25 | 1999-12-02 | Nippon Shinyaku Co., Ltd. | Process for producing composite preparation containing nucleic acid |
| GB0118517D0 (en) * | 2001-07-30 | 2001-09-19 | Mitsubishi Tokyo Pharm Inc | Compound |
| US7863238B2 (en) | 2004-06-10 | 2011-01-04 | Saint Louis University | Proteins with an attached short peptide of acidic amino acids |
| US7972593B2 (en) | 2004-06-10 | 2011-07-05 | Saint Louis University | Delivery of therapeutic agents to the bone |
| JP2006248978A (ja) * | 2005-03-10 | 2006-09-21 | Mebiopharm Co Ltd | 新規なリポソーム製剤 |
| EP2259768B1 (en) | 2008-04-08 | 2019-05-22 | Merck Patent GmbH | Compositions containing cyclic peptides and methods of use |
| SG10201606990TA (en) * | 2012-05-31 | 2016-10-28 | Agency Science Tech & Res | Methods for reducing levels of protein-contaminant complexes and aggregates in protein preparations by treatment with electropositive organic additives |
| US20170112861A1 (en) * | 2014-04-04 | 2017-04-27 | Osaka University | Drug delivery enhancer comprising substance for activating lysophospholipid receptors |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0457837A4 (en) * | 1989-01-26 | 1993-09-15 | Abbott Biotech, Inc. | Stabilization of aqueous-based hydrophobic protein solutions and sustained release vehicle |
| ES2086526T3 (es) * | 1989-12-13 | 1996-07-01 | Otsuka Pharma Co Ltd | Aplicacion medicinal de m-csf. |
| DE4208527A1 (de) * | 1992-03-17 | 1993-09-23 | Max Planck Gesellschaft | Liposomen mit negativer ueberschussladung |
| JPH06247842A (ja) * | 1993-02-23 | 1994-09-06 | Green Cross Corp:The | リポソーム組成物の製造方法 |
-
1994
- 1994-09-29 WO PCT/US1994/011081 patent/WO1995009611A2/en not_active Ceased
- 1994-09-29 AU AU79239/94A patent/AU683698B2/en not_active Ceased
- 1994-09-29 EP EP94929959A patent/EP0671905B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-29 DE DE69431236T patent/DE69431236T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-29 CZ CZ19951438A patent/CZ290029B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-09-29 HU HU9502053A patent/HUT72326A/hu unknown
- 1994-09-29 ES ES94929959T patent/ES2184768T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-29 AT AT94929959T patent/ATE222752T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-09-29 NZ NZ274705A patent/NZ274705A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-09-29 KR KR1019950702281A patent/KR100372006B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-29 CA CA002150939A patent/CA2150939C/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-29 CN CNB941911012A patent/CN1206982C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-29 JP JP7510908A patent/JP2852127B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-29 RU RU95117866A patent/RU2119791C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1994-09-29 PT PT94929959T patent/PT671905E/pt unknown
- 1994-09-29 DK DK94929959T patent/DK0671905T3/da active
- 1994-10-04 IL IL11117094A patent/IL111170A/xx not_active IP Right Cessation
- 1994-10-05 ZA ZA947782A patent/ZA947782B/xx unknown
-
1995
- 1995-06-02 NO NO19952210A patent/NO314064B1/no not_active IP Right Cessation
- 1995-06-05 FI FI952738A patent/FI116271B/fi active IP Right Grant
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3856471B2 (ja) | 安定なタンパク質：リン脂質の組成物および方法 | |
| JP4777873B2 (ja) | 親油性薬物送達ビヒクルおよびこれらの使用方法 | |
| JP2006517972A5 (cs) | ||
| CZ290029B6 (cs) | Fosfolipid-proteinový přípravek | |
| AU2004283078A1 (en) | Lipophilic drug delivery vehicle and methods of use thereof | |
| HK1010341B (en) | Stable protein : phospholipid compositions and methods | |
| AU688678C (en) | Stable protein:phospholipid compositions and methods | |
| MXPA97007137A (en) | Stable protein compositions: fosfolipidos ymeto | |
| HK1006079B (en) | Stable protein-phospholipid compositions and method of preparation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20090929 |