CZ315594A3

CZ315594A3 - Peptide of glucagon type, insulinotropic derivatives, process of their preparation, pharmaceutical composition containing such compounds and use

Info

Publication number: CZ315594A3
Application number: CZ943155A
Authority: CZ
Inventors: Glenn C Andrews; Gaston O Daumy; Michael L Francoeur; Eric R Larson
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1992-06-15
Filing date: 1993-04-14
Publication date: 1995-07-12
Also published as: MX9303554A; HRP930993A2; BR9306551A; IL105928A0; CN1085913A; KR0154880B1; EP0646128A1; YU41493A; HUT64367A; JP2575298B2; CA2138161A1; FI932722A0; AU4027593A; WO1993025579A1; RU2128663C1; SK155694A3; AU671117B2; JPH07504679A; HU211498A9; KR950701937A

Description

Peptid glukagonového typu, insulinotropní děFivaty', “způsob* jejich přípravy, farmaceutický prostředek obsahující tyto látky a použití.

Oblast techniky

Vynález se týká derivátů peptidů glukagonového typu 1 (neboli peptidů GLP-1), zkrácených peptidů glukagonového typu 1 (zkrácených peptidů GLP-1), inzulinotropinu a zkráceného inzulinotropinu. Konkrétně je možno uvést, že se uvedený vynález týká derivátů GLP-1, zkrácených GLP-1 inzulinotropinu a zkráceného inzulinotropinu a farmaceuticky přijatelných solí odvozených od těchto solí, které mají hodnotu pí asi 4,0 nebo menší nebo je jejich hodnota pí asi 7,0 nebo větší. Tyto deriváty GLP-1, zkráceného GLP-1, inzulinotropinu a zkráceného inzulinotropinu. které náleží do rozsahu uvedeného vynálezu, jsou zejména vhodné pro aplikaci savcům, která se provádí iontoforézou. Deriváty podle uvedeného vynálezu mají inzulinotropní účinnost a jsou vhodné pro posílení účinku inzulínu u savců. Tyto uvedené látky podle vynálezu je možno použít pro léčení savců, které zahrnuje podávání účinného množství tohoto derivátu GLP-1, zkráceného GLP-1, inzulinotropinu nebo zkráceného inzulinotropinu. Dále se uvedený vynálezu týká farmaceutických prostředků, které obsahují jako účinnou složku uvedené deriváty GLP-1, zkráceného GLP-1, inzulinotropinu a zkráceného inzulinotropinu. Kromě toho se uvedený vynález dále týká nového použití určitých známých derivátů inzulinotropinu a zkráceného inzulinotropinu k posílení účinku inzulínu u savců, při kterém se uvedené deriváty aplikují iontoforetickou metodou. Do rozsahu uvedeného vynálezu patří rovněž postup přípravy uvedených 2 derivátů peptidů glukagonového typu (GLP-1), zkrácených GLP-1, inzulinotropinu a zkráceného inzulinotropinu.

Dosavadní stav techniky Z dosavadního stavu techniky je známa aminokyselinová sekvence GLP-1, přičemž tato sekvence je známa v následující formě :

His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-I le-AI a-Trp- Leu-Val - Ly s - Gly-Arg-Gly (id. č. sekvence : 1)

Tato sekvence GLP-1 je známa z literatury podle dosavadního stavu techniky, viz. Lopez, L.C., a kol., P.N.A.S., USA 80, 5485-5489 (1963), Bell, C.I., a kol., Nátuře 302, 716-718 (1983), Heinrich, G. a kol., Endocrinol. 115, 2176-2181 (1984) a Ghiglione, M. a kol., Diabetologia 27, 599-600 (1984).

Rovněž je z dosavadního stavu techniky známo, že je GLP-1 v přírodních podmínkách zpracováván konverzí na peptid tvořený 31 aminokyselinami, který obsahuje aminokyseliny 7-37 peptidu GLP-1 (peptid 7-37). V publikacích podle dosavadního stavu techniky se uvádí, že toto zpracovávání se vyskytuje ve slinivce a ve střevě. Tento peptid 7-37, který se v textu uvedeného vynálezu označuje alternativním způsobem jako inzulinotropin, představuje hormon, který má inzulinotropní účinnost.

Tento inzulinotropin má následující aminokyselinovou sekvenci : 3

Hi s-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gin-Ala-Ala-Lys-Gl u-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (id. č. sekvence : 2)

Inzulinotropin, určité deriváty této látky a použiti této látky k léčení diabetes mellitus u savců, je podrobněji uváděno v mezinárodní patentové přihlášce PCT/US87/01005 (VO87/06941) , která byla publikovaná 19,listopadu 1987. Tato publikace je zde uvedena jako odkazový materiál. Mezi deriváty inzulinotropinu, které jsou uváděny v této mezinárodní patentové přihlášce PCT/US87/01005, patří polypeptidy, které obsahují jednu nebo více aminokyselin, nebo je naopak neobsahují, které nemusí být přítomny v této sekvenci nalézající se v přírodě. Mezi další deriváty inzulinotropinu, uváděné v této mezinárodní patentové přihlášce PCT/US87/01005 patří určité C-koncové soli, estery a amidy, přičemž tyto soli a estery jsou definovány jako OM, kde M je farmaceuticky přijatelný kation nebo nižší alkylová skupiny s rozvětveným nebo nerozvětveným řetězcem obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, a amidy jsou definovány jako -NR R , kde R a R jsou stejné nebo různé substituenty, zvolené ze skupiny zahrnující vodík a nižší alkylové skupiny s nerozvětveným nebo rozvětveným řetězcem obsahujícím 1 až 6 atomů uhlíku. Některé další polypeptidy, označované v tomto textu jako zkrácený inzulinotropin, které mají inzulinotropní účinnost, a jejich deriváty jsou popsány v mezinárodní patentové přihlášce PCT/US89/01121 (VO 90/11296) , Tyto polypeptidy, zde označované jako GLP-l(7-36), GLP-l(7-35) a GLP-l(7-34), mají následující sekvence aminokyselin: 4

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val- Ser - Se r-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-1le-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg (id. č. sekvence: 3)

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tvr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly (id. č. sekvence: 4)

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Tle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys (id. č, sekvence: 5)

Mezi deriváty polypeptidů, popsané v PCT/US89/01121, je možno zařadit polypeptidy s nevýznamnými aminokyselinovými substitucemi nebo s přidanými aminokyselinami k usnadněni kondenzace s nosičovým proteinem nebo posílení inzulinotropního účinku. Mezi další deriváty inzulinotropinu, popsané v PCT/US89/01121, patří určité C-koncové soli, estery a amidy, přičemž tyto soli a estery jsou definovány jako OM, kde M je farmaceuticky přijatelný kation nebo nižší rozvětvená nebo nerozvětvená alkylová 2 “i 2 3 skupina, a amidy jsou definovány jako -NR R , kde R a R jsou stejné nebo různé substituenty, zvolené ze skupiny zahrnující vodík a nižší rozvětvenou nebo nerozvětvenou alkylovou skupinu. Při podávání terapeuticky účinných polypeptidů savcům dochází k určitým problémům, které jsou odborníkům pracujícím v daném oboru běžně známé. Perorální podávání 5 polypeptidů je bez použití určité formy uvolňovacího prostředku obvykle neúspěšné vzhledem k malé vrozené permeabilitě střeva a vzhledem k jiným probíhajícím procesům, jako je chemická degradace v žaludku a ve střevě. Jako vhodná aplikační metoda podáváni terapeuticky účinného množství polypeptidů savcům, při které nedochází k rozkladu těchto polypeptidů ve střevě, se nabízí transdermální aplikace polypeptidů. Odborníkům pracujícím v daném oboru je známa celá řada způsobů transdermální aplikace farmaceuticky účinných sloučenin. Jedním z těchto způsobů transdermální aplikace je metoda známá z dosavadního stavu techniky jako iontoforéza. Při této iontoforéze se aplikace provádí za pomoci napěťového elektrického gradientu vytvořeného na kůži v kombinaci se současnou povrchovou aplikací terapeutických činidel. K provedení této aplikace jsou tedy kromě zásobníku léčiva a zdroje proudu nutné dvě elektrody. Z dosavadního stavu techniky jsou známy různé typy iontoforetických přístrojů, které jsou popsány například v publikaci Tyle, P , Pharmaceutical Research 3: 318-326 (1986). K provedení této iontoforézy je možno například použít elektrod, které jsou uvedeny v patentu Spojených států amerických ě. 4 950 229, který je zde uveden pouze jako odkazový materiál. Výsledkem této iontoforézy je převod terapeutických činidel kůží buďto do daného místa nebo do systemického oběhu. Kromě toho jsou známé druhy iontoforézy, které pracují s různými napěťovými režimy, včetně takových metod jako je elektroporace nebo pulzní proudová metoda. K transdermálnímu podávání leuprolidu, což je syntetický 9-aminokyselinový leutinizační hormon uvolňující hormonový analog, bylo použito metody s nízkou úrovní použitého proudu, viz. Meyer, B.R. a kol. Clin. Pharmacol. Ther. 4_4: 607-612 (1988). Výsledky výzkumů týkajících se iontoforetického uvolňování insulinu u krys jsou uvedeny v publikaci Siddiqui, 0. a kol., J. Pharmaceutical Sciences 76: 341-345 (1987). Výsledky výzkumů týkajících se rransdermální iontoforézy hormonu uvolňujícího gonadotropin a hormonu uvolňujícího thyrotropin jsou uvedeny v publikaci Miller, L.L. a kol. , J. Pharmaceutical Sciences 79_: 490-493 (1990) a Burnette, R.R. a kol., J. Pharmaceutical Sciences 75: 738-743 (1986). V dosavadním stavu techniky je rovněž uváděn ethanol jako látka podporující iontoforetické transdermální aplikování leuprolidu a CCK-8 (cholecystokinin-8) analogu, viz. Srínivasan V. a kol., J. Pharmaceutical Sciences Z2: 588-591 (1990).

Podstata vynálezu

Uvedený vynález se týká polypeptidových derivátů, peptidu 1 glukagonového typu (GLP-1) a zkráceného peptidu glukagonového typu (GLP-1) obsahující následující primární strukturu ;

H2N—V—COOH ve kterém znamená : V aminokyselinovou sekvenci, zvolenou ze souboru zahrnujícího : Hís-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala- Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (id. č. sekvence : 1) 7 a

His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-GIy-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-$er-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gl.n-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg (id. č. sekvence: 6), a farmaceuticky přijatelných solí odvozených od těchto látek, přičemž tento derivát má hodnotu pí asi 4,0 nebo nižší, nebo má hodnotu pí asi 7,0 nebo vyšší, a při zpracování při aplikaci savcům vznikne polypeptidový derivát, který má insulinotropní účinnost.

Uvedený vynález se dále týká polypeptidových derivátů GLP-1 a zkrácených GLP-1, popisovaných výše, které obsahují následující primární strukturu :

H2N-V-(X)I,-(Y)n-Z a farmaceuticky přijatelných solí odvozených od těchto sloučenin, ve kterých : V má stejný význam jako bylo uvedeno shora, m znamená nulu nebo jedna, n je nula nebo jedna, X představuje bazický nebo neutrální L-aminokyselinový zbytek, Y představuje bazický nebo neutrální L-aminokyselinový zbytek, a Z znamená skupinu C02R* nebo CONTR^R·5, 1 kde R znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu s rozvětveným nebo nerozvětveným řetězcem obsahujícím 1 až 6 atomů uhlíku : v případě, že m je jedna, n je nula a X představuje bazický L-aminokyselinový zbytek, nebo HL je nula, n je jedna a Y představuje bazický L-aminokyselinový zbytek, nebo man jsou oba jedna a jeden nebo oba substituenty X a Y představují bazický L-aminokyselinový zbytek, R1 představuje alkylovou skupinu s rozvětveným nebo nerozvětveným řetězcem obsahujícím 1 až 6 atomů uhlíku : v případě, že m a n jsou oba nula, nebo m je jedna a n je nula a X představuje neutrální L-aminokyselinový zbytek, nebo m je nula, n je jedna a Y představuje neutrální L-aminokyselinový zbytek, nebo man jsou oba jedna a oba substituenty X a Y představují neutrální L-aminokyselinový zbytek, a 2 a R a R každý nezávisle znamenají atom vodíku nebo rozvětvenou nebo nerozvěxvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 atomů uhlíku.

Kromě toho se uvedený vynález týká derivátů polypeptidů obsahujících následující primární strukturu :

H-,N—R—COOH ve kterém znamená : R aminokyselinovou sekvenci vybranou ze souboru zahrnujícího :

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-

Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (id. č. sekvence : 2) - 9 - H i s-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AI a-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg (id. č. sekvence: 3)

Hi s-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val - Ser-Ser -Tyr - Leu-Glu-Gly-Gin-AIa-Ala-Lys-Glu-Phe-1le-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly (id. č. sekvence: 4)

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys (id. č. sekvence: 5) a farmaceuticky přijatelných solí odvozených od těchto derivátů, přičemž tento derivát má hodnotu pí asi 4,0 nebo nižší, nebo má hodnotu pí asi 7,0 nebo vyšší, a dále projevuje insulinotropní účinnost, s tou podmínkou, že tento derivát nepředstavuje C-koncový alkylový ester s rozvětveným nebo nerozvětveným řetězcem obsahujícím 1 až 6 atomů uhlíku a dále s tou podmínkou, že tento derivát nepředstavuje C-koncový karboxamid obecného vzorce : CONR2R3 2 3 ve kterém R a R každý nezávisle představují atom vodíku nebo rozvětvenou nebo nerozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 atomů uhlíku.

Uvedený vynález se rovněž týká derivátů polypeptidů, popsaných výše a obsahujících následující primární strukturu :

H 2 N R X— (Y) n—Z a farmaceuticky přijatelných solí odvozených od těchto derivátů, ve kterém : R má stejný význam jako bylo uvedeno shora, n je nula nebo jedna, X představuje bazický nebo neutrální L-aminokyselinový zbytek, Y představuje bazický nebo neutrální L-aminokyselinový zbytek, a Z znamená CC^R1 nebo CONR^R·^, kde R^ představuje atom vodíku nebo rozvětvenou nebo nerozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 atomů uhlíku : v případě, že n je nula a X představuje bazický L-aminokyselinový zbytek, nebo n je jedna a jeden nebo oba substituenty X a Y představují bazický L-aminokyselinový zbytek, R1 představuje rozvětvenou nebo nerozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 atomů uhlíku : v případě, že n je nula a X představuje neutrální L-aminokyselinový zbytek, nebo n je jedna a oba substituenty X a Y představují neutrální L-aminokyselinový zbytek, a 2 3 R a R představuji každý nezávisle atom vodíku nebo rozvětvenou nebo nerozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 atomů uhlíku.

Ve výhodném provedení podle vynálezu jsou uvedenými deriváty takové látky, které mají hodnotu pí asi 8,5 nebo větší. Dalšími výhodnými deriváty jsou takové polypeptidy, ve kterých R představuje : 1 1

Hi s- Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp- Val -Ser-Ser-Ty r- Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (id. č. sekvence : 2)

Ještě výhodnějšími jsou takové deriváty, ve kterých R představuje :

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val- Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Gl u-Phe- Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (id. č. sekvence : 2), n je nula a X znamená Arg, nebo n je jedna a X a Y jsou každý Arg. Ještě výhodnějšími deriváty podle vynálezu jsou taková deriváty, ve kterých Z představuje CC^R^ kde R^

O O O představuje atom vodíku, nebo Z představuje CONR R kde R a R^ představují každý atom vodíku.

Uvedený vynález se rovněž týká způsobu posílení účinku inzulínu u savců, přičemž podstata tohoto postupu spočívá v tom, že se savci podává účinné množství derivátu podle vynálezu. Ve výhodném provedení podle vynálezu se tohoto posílení účinku inzulínu podle uvedeného vynálezu dosahuje v souvislosti s léčením diabetes typu II. Výhodnou metodou aplikace uvedených derivátů podle uvedeného vynálezu je iontoforetický transdermální způsob podávání.

Do rozsahu uvedeného vynálezu rovněž náleží způsob posílení účinku inzulínu u savců, jehož podstata spočívá v tom, že se uvedenému savci iontoforeticky aplikuje účinné množství derivátu polypeptidu obsahující následující primární strukturu :

h2n—R—(X)m—(Y)n—Z ve kterém znamená. : R aminokyselinovou sekvenci vybranou ze souboru zahrnujícího :

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tvr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lvs-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (id. č. sekvence : 2)

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg (id. č. sekvence: 3)

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Tle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly (id. č. sekvence: 4)

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys (id. č. sekvence: 5) nebo farmaceuticky přijatelná sůl odvozená od této látky, ve které znamená : m je nula nebo jedna, n je nula nebo jedna, X představuje bazický nebo neutrální L-aminokyselinový zbytek. J- */ Y představuje bazický nebo neutrální L-arninokyselinový zbytek, a Z znamená skupinu CC^R^ nebo CONR^R^, kde znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu s rozvětveným nebo nerozvětveným řetězcem obsahujícím 1 až 6 atomů uhlíku : v případě, že m je jedna, n je nula a X představuje bazický L-aminokyselinový zbytek, nebo m je nula, n je jedna a Y představuje bazický L-aminokyselinový zbytek, nebo man jsou oba jedna a jeden nebo oba substituenty X a Y představují bazický L-aminokyselinový zbytek, představuje alkylovou skupinu s rozvětveným nebo nerozvětveným řetězcem obsahujícím 1 až 6 atomů uhlíku : v případě, že m a n jsou oba nula, nebo m je jedna a n je nula a X představuje neutrální L-aminokyselinový zbytek, nebo m je nula, n je jedna a Y představuje neutrální L-aminokyselinový zbytek, nebo man jsou oba jedna a oba substituenty X a Y představují neutrální L-aminokyselinový zbytek, a 9 a R a R každý nezávisle znamenají atom vodíku nebo rozvětvenou nebo nerozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 atomů uhlíku.

Uvedené deriváty jsou rovněž použitelné v souvislostí s jinými druhy terapie, jako například s jinými anti-diabetickými činidly (jako jsou například sulfonylmočoviny) . Výhodnou metodou iontoforetické aplikace derivátu polypeptidu podle uvedeného vynálezu, který byl uveden bezprostředně výše, zahrnuje iontoforetickou aplikaci uvedeného derivátu, ve kterém R znamená :

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tvr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Glv (id. č. sekvence : 2) m znamená nulu a n znamená nulu, přičemž podle ještě výhodnějšího způsobu podle uvedeného vynálezu se aplikuje bezprostředně výše uvedený derivát, ve 9 -1 9 9 kterém Z znamená CONR R kde R a R představují každý atom vodíku.

Do rozsahu uvedeného vynálezu rovněž náleží farmaceutické prostředky, které obsahují deriváty polypeptidů podle uvedeného vynálezu. Tyto farmaceutické prostředky jsou vhodné pro posílení účinku inzulínu u savců. Vzhledem k výše uvedenému jsou tyto farmaceutické prostředky podle uvedeného vynálezu zejména vhodné pro léčení určitých diabetických stavů, jako je například diabetes typu II.

Termínem "derivát" se v textu uvedeného vynálezu a v připojených patentových nárocích míní polypeptidy obsahující primární strukturu znázorněnou ve shora uvedeném textu, kde na C-konci je přítomna jedna nebo více L-aminokyselin; dále kde C-koncová karboxylová skupina tvoří ester s rozvětvenou nebo rozvětvenou alkylovou skupinou obsahující 1 až 6 atomů uhlíku; dále kde C-koncová karboxylová skupina tvoří karboxamid nebo substituovaný karboxamid; dále kde kyselé aminokyselinové zbytky (Asp a/nebo Glu) tvoří ester nebo karboxamid; a jejich kombinace všech těchto uvedených forem, přičemž ovšem rozsah vynálezu není touto specifikací nijak omezen. 15

Termínem "bazické L-aminokyselinové zbytky'' , který je použit v tomto textu a v připojených patentových nárocích, se míní běžně známé aminokyseliny Lys, Arg a His, přičemž ovšem touto specifikací není rozsah uvedeného vynálezu nijak omezen.

Termínem "neutrální L-aminokyselinové zbytky", který je použit v tomto textu a v připojených patentových nárocích, se míní Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn a Glu, přičemž ovšem touto specifikací není rozsah uvedeného vynálezu nijak omezen. I když Gly technicky vzato nepředstavuje skutečný L-aminokyselinový zbytek vzhledem k přítomnosti pouze vodíku na a-uhlíku kromě karboxylové skupiny a aminoskupiny, je v tomto textu označován pro jednoduchost tento zbytek jako L-aminokyselina. Výše uvedená klasifikace L-aminokyselinových zbytků jako bazických nebo neutrálních zbytků je založena na výsledném náboji odpovídající aminokyseliny při hodnotě pH 7. V textu uvedeného vynálezu a v připojených patentových nárocích se termínem pí míní teoretická hodnota pí, kterou je možno vypočítat pomocí běžně komerčně dostupného software, známého pod označením PCGENE (IntelliGenetics, lne. , 700 East El Cami.no Reál, Mountain Víew, CA 94040) .

Do rozsahu uvedeného vynálezu náleží polypeptidy, které mají homologické uspořádání polypeptidů uvedených výše, přičemž toto homologické uspořádání je dostatečné k tomu, aby těmto polypeptidům byla udělena inzulinotropní účinnost. Rovněž do rozsahu uvedeného vynálezu náleží různé varianty těchto polypeptidů uvedených výše, přičemž do rozsahu těchto variant náleží formy uvedených polypeptidů, které mají nepodstatné aminokyselinové substituce a projevují inzulinotropní účinnost. Výše uvedeným termínem "posiluje účinek inzulínu" nebo "zvyšuje účinek inzulínu", který je použit v textu předmětného vynálezu a v připojených patentových nárocích, se míní jeden nebo více následujících účinků : zvýšení syntézy inzulínu, zvýšení sekrece inzulínu, zvýšení vychytávání glukózy ve svalstvu a tuku a snížení produkce glukózy v játrech, přičemž ovšem touto specifikací není tento termín nijak omezen.

Polypeptidy podle vynálezu je možno připravit různými metodami běžně známými z dosavadního stavu techniky. Například je možno pro syntézu těchto peptidů podle vynálezu použít automatických peptidových syntetizérů, jako je syntetizér peptidů pracující s pevnou fází Applied Biosystems (ABI) 430A. Kromě toho je možno pro přípravu polypeptidů podle uvedeného vynálezu, ve kterých Z znamená CO2H, použít rekombinantní DNA-metody, při které se sekvence DNA, kódující polypeptid, operativně naváže na expresní vektor a použije se k transformaci vhodné hostitelské buňky. Transformovaná hostitelská buňka se pak kultivuje za podmínek, za nichž dochází k expresi polypeptidů. Polypeptid se pak z kultury izoluje. Dále je možno použít kombinací syntézy a metody rekombinace DNA k výrobě amidických a esterových derivátů podle vynálezu a/nebo k produkci fragmentů požadovaného polypeptidů, které se pak spojují metodami, které jsou odborníkům pracujícím v daném oboru běžně známé.

Deriváty polypeptidů podle uvedeného vynálezu se připravují metodami, které jsou pro odborníky pracující v daném oboru běžně známé. Například C-koncové alkylesterové deriváty polypeptidů podle vynálezu se připravují reakcí požadovaného alkanolu obsahujícího 1 až 6 atomů uhlíku s požadovaným polypeptidem v přítomnosti katalyticky působící kyseliny, jako je například kyseliny chlorovodíková HC1. Vhodné reakční podmínky pro přípravu tohoto alkylesteru zahrnují reakční teplotu asi 50 ‘C a reakční dobu v rozmezí od asi 1 hodiny do asi 3 hodin. Podobným způsobem je možno připravit deriváty polypeptidů podle vynálezu zahrnující alkylestery obsahující 1 až 6 atomů uhlíku odvozené od zbytků Asp a/nebo Glu uvnitř polypeptidů.

Karboxamidové deriváty polypeptidů podle uvedeného vynálezu je možno připravit rovněž metodami syntézy peptidů v pevné fázi, které jsou odborníkům pracujícím v daném oboru běžně známé, viz například "Solid Phase Peptide Synthesis", Stewart, J.M, a kol., Pierce Chem. Co. Press, 1984. V případě, že je zapotřebí připravit deriváty polypeptidů podle uvedeného vynálezu, jejichž hodnota pí je asi 4,0 nebo menší, potom je možno tuto přípravu rovněž provést metodami běžně známými z dosavadního stavu techniky. Například je možno uvést, že pro přípravu derivátů, které mají nižší hodnoty pí, je možno použít metody deamidace glutaminového zbytku, čímž se získá zbytek glutamové kyseliny, dále alkylace nebo amidace volné aminové skupiny na N-konci a/nebo na epsilon aminové skupině lysinového zbytku, nebo je možno použít kombinace těchto metod. Ke snížení hodnoty pí derivátu insulinotropinu na méně než asi 3,89 je nutno použít modifikace libovolných dvou aminových skupin, které jsou k tomu k dispozici. Deamidace glutaminových zbytků se snadno provede suspendováním požadovaného polypeptidu podle uvedeného vynálezu ve vodě při hodnotě pH vyšší než 8, což se provádí po dobu několika hodin.

Například je možno uvést, že podle hodnoty pH uvedené reakce je možno acetvlací insulinotropinu, provedenou za bazických podmínek, získat derivát, u kterého dojde jak k amidaci N-koncové aminoskupiny tak obou epsilon aminových skupin. Výsledkem je derivát, jehož teoretická hodnota pí je 3,61. V alternativním provedení se při N-koncové acetylaci kombinované s deamidací jednoho glutaminového zbytku insulinotropinu na zbytek glutamové kyseliny získá derivát o teoretické hodnotě pí 4,11,

Jako alternativní metody snížení hodnoty pí je možno použít postupu, při kterém se polypeptid uvede do reakce s cyklickým anhydridem za účelem blokování bazického zbytku a zavedení kyselého zbytku. Jako příklad, který ovšem nijak neomezuje rozsah daného vynálezu, je možno uvést postup, při kterém se z roztoku insulinotropinu (sekvence id č. : 2) v dimethylformamidu (DMF) v přítomnosti 8 ekvivalentů triethylaminu a 8 ekvivalentů anhydridu kyseliny jantarové získá N-sukcinátový derivát inzulinotropinu na N-konci a jeho Lys2Q a Lys2g zbytky.

Alternativně nebo v kombinaci s výše uvedenými metodami je možno deriváty polypeptidů podle vynálezu připravovat modifikací sekvence DNA, kódující takový polypeptid, přičemž se zbytek bazické aminokyseliny nahradí acidickým nebo neutrálním zbytkem aminokyseliny nebo se neutrální aminokyselinový zbytek nahradí acidickým aminokyselinovým zbytkem. Takové změny primární sekvence polypeptidu je možno provést také přímou syntézou derivátu. 19

Tyto metody jsou odborníkům pracujícím v daném oboru běžné známé. Je ovšem samozřejmé, že takto připravené deriváty, aby mohly být použity k provádění postupu podle vynálezu, musejí mít inzulinotropní účinek.

Inzulinotropní účinnost polypeptidového derivátu podle vynálezu, přičemž uvedený polypeptid nezahrnuje aminokyseliny 1-6 GLP-1, je možno zjistit následujícím způsobem: Z pankreatické tkáně normálních krys se izolují pankreatické ostrůvky modifikací metody podle Lacyho, P.E. a kol-, Diabetes 16, 35-39 (1967), přičemž se kolagenázový výluh pankreatické tkáně oddělí na Ficollově gradientu (27 %, 23 %, 20,5 % a 11 % v Hankově rovnovážném solném roztoku, pH 7,4). Ostrůvky se odebírají z rozhraní 20,5 %/ll %, promyjí se a pod stereomikroskopem ručně sesbírají tak, aby neobsahovaly exokrinní a jinou tkáň. Tyto ostrůvky se potom inkubují přes noc v médiu RPMI 1640, doplněném 10 % fetálního bovinního séra a obsahujícím 11 mM glukózy, při 37 °C a za použití směsi 95 % vzduch/5 % COj Pak se ostrůvky přemístí do média RPMI 1640, doplněného 10 % fetálního bovinního séra a obsahujícího 5,6 mM glukózy, a inkubují se po dobu 60 minut při teplotě 37 "C v atmosféře 95 % vzduch/5 % CO2* Testovaný derivát polypeptidu se připraví v koncentracích 1 nli a 10 níl v médiu RPMI, obsahujícím 10 % fetálního bovinního séra a 16,7 mM glukózy. Asi 8 až 10 izolovaných ostrůvků se pak přenese pipetou do celkového objemu 250 μΐ média, obsahujícího derivát polypeptidu, na 96-jímkových mikrotitračních plotnách. Ostrůvky se inkubují v přítomnosti derivátu polypeptidu po dobu 90 min při teplotě 37 "C a v atmosféře 95 % vzduch/5 % CO2. Pak se odeberou alikvotní díly média bez ostrůvků a v objemu 100 μΐ se radioimunoanalýzou pomocí přístroje Equate Insulin RIA (Binax, lne., Portland. ME) zjišťuje množství přítomného insulinu.

Farmaceutické prostředky obsahující polvpeptidové deriváty podle uvedeného vynálezu je možno připravit obvyklými metodami, které jsou odborníkům pracujícím v daném oboru běžně známé. Například je možno uvést, že tyto polypeptidové deriváty se kombinují s farmaceuticky přijatelným ředidlem nebo s nosičovou látkou. V případě, že se tyto polypeptidové deriváty podle uvedeného vynálezu podávají intravenózně, intramuskulárně nebo subkutánně, potom se použije vhodného sterilního ředidla běžně používaného podle dosavadního stavu techniky. Tyto farmaceutické prostředky podle vynálezu obsahují dostatečné množství polypeptidového derivátu odpovídající vhodné dávce, podrobněji popisované v dalším textu, podávané ve vhodném časovém intervalu. V případě iontoforetické aplikace polypeptidového derivátu podle uvedeného vynálezu je možno použít různých prostředků. Polypeptidový derivát podle vynálezu je možno vpravit do roztoku nebo může tvořit součást gelu nebo pěny. Ovšem je samozřejmě výhodné, jestliže má tento polypeptidový derivát v uvedeném prostředku stejný nebo přibližně stejný náboj jako elektroda v zásobníku léčiva použité iontoforetické jednotky. Tento náboj uvedeného derivátu je možno samozřejmě kontrolovat například použitím vhodného pufru. V případě použití tohoto pufru je výhodné použít lakového pufru, jehož náboj je opačný než je náboj konkrétního aplikovaného polypeptidového derivátu. V alternativním provedení může daný polypeptidový derivát fungovat jako svůj vlastní "pufr", jestliže se použije 21 vhodná forma soli tohoto derivátu. Mezi proměnné veličiny tohoto prostředku je možno zařadit koncentraci polypeptidového derivátu, koncentraci pufru, v případech, kdy je použit, iontovou sílu tohoto prostředku a nevodná ko-rozpouštědla. Obecně je možno uvést, áe k dosažení nejvyšší přenosové účinnosti touto iontoforézou za použití těchto prostředků je výhodné minimalizovat v těchto prostředích koncentraci veškerých přítomných iontových částic s výjimkou daného polypeptidového derivátu. Z dosavadního stavu techniky je známa celá rada iontoforetických přístrojů. Známá a dostupná je rovněž celá řada různých elektrodových materiálů, které se používají v těchto přístrojích. Mezi tyto elektrodové materiály je možno zařadit například platinu nebo systém střibro-chlorid stříbra. Jednotlivé rozdíly mezi těmito elektrodovými materiály jsou rovněž běžné známy, přičemž tyto odlišnosti jsou spojeny s určitými provozními nuancemi. Například je možno uvést, že při použití platinových elektrod dojde k hydrolýze, která vede k uvolňování vodíkových iontů a k následným změnám hodnoty pH. Tyto změny hodnot pH zase ovlivňují ionizační stav tohoto polypeptidového derivátu a tím výsledný iontoforetický přenos tohoto derivátu. Při použití elektrodového systému stříbro-chlorid stříbra v iontoforetických přístrojích zase naopak nedochází k hydrolýze vody. Tyto elektrodové systémy stříbro-chlorid stříbra ale vyžadují přítomnost chloridových iontů, které mohou konkurovat transportu přes kůži dosahovanému účinkem proudu. Výběr vhodných elektrod, kterých je třeba použít při iontoforetické aplikaci polypeptidových derivátů podle vynálezu, může provést každý odborník pracující v daném oboru na základě znalostí uvedených v tomto popisu.

Kromě toho je možno k vyhodnocení iontoforetické aplikace polypeptidových derivátů a prostředků obsahujících tyto polypeptidové deriváty podle uvedeného vynálezu použít prasečího neštépeného transplantátu a metody podle Rivieře, J.E. a kol., J. Toxicol.-Cut & Ocular Toxicol. 8 :493-504 (1989-1990). Dávka účinná pro léčení diabetů v náběhové fázi se u dospělých pohybuje v rozmezí od asi 1 pg/kg do 1000 pg/kg za den, což platí pro případy, kdy se podává polypeptid podle vynálezu například intravenózně, intramuskulárně nebo subkutánně. Výhodná dávka pro intravenózní infuse aplikované během jídel a mezi jídly se pohybuje v rozmezí od asi 4 do asi 10 ng/kg/minutu nebo od asi 0,6 asi 1,4 pg/den, vztaženo na pacienta o hmotnosti 100 kilogramů. Je však nutno zdůraznit, že je možno rovněž použít dávek, které leží mimo tato rozmezí, přičemž i tyto dávkové formy náleží do rozsahu uvedeného vynálezu. Odpovídající dávka, jejíž určení je v kompetenci ošetřujícího lékaře, závisí na intenzitě onemocnění a dále na odezvě organismu na konkrétní podávaný derivát, na věku, hmotnosti, pohlaví a na předchozím léčení pacienta. V případě iontoforetické aplikace polypeptidových derivátů podle uvedeného vynálezu se dávka pohybuje v rozmezí od asi 500 pg/den do asi 1000 pg/den. Rovněž i v tomto případě je možno použít dávek, které leží mimo uvedené rozmezí, přičemž i tyto dávky náleží do rozsahu uvedeného vynálezu. Příklady provedení vynálezu

Peptidové deriváty glukagonového typu podle uvedeného vynálezu, insulinotropní deriváty, způsob jejich přípravy a použití a další detaily budou v dalším ilustrovány pomocí konkrétních příkladů provedení, které ovšem nijak rozsah vynálezu neomezují, pouze tento vynálezu blíže ilustrují. Příklad 1

Postup přípravy polypeptidového derivátu obecného vzorce :

H2N—R—X— ( Y) n—Z ve kterém znamená : n nulu, X je Arg, Z je CONR^R^, kde R^ a R^ jsou atom vodíku, a R představuje :

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (id. č. sekvence : 2).

Podle tohoto příkladu byl výše uvedený peptid připraven tak, že se vycházelo z p-methylbenzhydrylaminové pryskyřice (použita ve formě hydrochloridové soli) a k syntéze bylo použito peptidového syntetizéru Applied Biosystems (ABI) 430 A pracujícího s pevnou fází za použití ABI Version 1.40 N-methylpyrrolidon/hydroxybenzotriazol t-BOC cyklů. Konečný cyklus byl zvolen tak, aby byla odstraněna poslední t-BOC chránící skupina po dokončení syntézy. Při provádění této syntézy bylo použito následujících chránících skupin bočních aminokyselinových řetězců : Arg (Tos) , Lys (CI-Z), Trp (CHO), Glu (OcyHex),

Tyr (Br-Z) , Ser (Bzl) , THr (Bzl) , Asp (OCyHex) a His (BOM) . Jednotlivé svntézní cykly odpovídaly použité metodě a výše uvedenému zařízení ABI s následujícími modifikacemi interval uvolňování hydroxvbenzotriazolu do měřícího obvodu byl zvýšen ze 6 sekund na 10 sekund za účelem zajištění reprodukovatelnosti a vhodného způsobu dodávání této složky; a uvolňovací interval hydroxybenzotriazolu do aktivační nádoby byl zvýšen ze 12 sekund na 18 sekund za účelem zabránění ucpávání přístroje způsobeného parami vytvořenými v reakční nádobě pro anhydrid kyseliny octové, přičemž cyklus v reakční nádobě byl modifikován tak, že po každém uvolnění anhydridu kyseliny octové byl připojený ventilový blok natlakován. K aktivování Glu byl použit ABOC11 aktivační cyklus místo normálně používaného AB0C12 aktivačního cyklu. Po závěrečném odstranění N-koncové t-BOC skupiny bylo získáno celkem 2,65 gramu peptidové pryskyřice. V další fázi postupu byla formylová chránící skupina odstraněna od zbytku Trp zpracováváním této peptidové pryskyřice jemným protřepáváním v roztoku obsahujícím 2 mililitry vody, 2 mililitry 70 %-ního ethanolaminu v methanolu a 16 mililitrů dimethylformamidu, což bylo prováděno po dobu 1 hodiny. Potom byla takto získaná pryskyřice zfiltrována, promyta postupné dimethylformamidem (ve formě třech podílů po 10 mililitrech), methanolem (ve formě třech podílů po 10 mililitrech) a dichlormethanem (ve formě třech podílů po 10 mililitrech) . Takto promytá pryskyřice byla potom sušena za použití vakua, čímž bylo získáno 2,48 gramu pryskyřice, K oddělení peptidu od této pryskyřice bylo 997 miligramů této vysušené pryskyřice zpracováváno s kapalným fluorovodíkem obsahujícím 10 % m-kresolu při teplotě 0 °C po dobu 1 hodiny. Potom byl použitý fluorovodík odstraněn odpařováním a získaný peptid byl zachycen v kyselině trifluoroctové. Tento peptid byl potom vysrážen za použiti ethyletheru, přičemž tímto shora uvedeným postupem bylo získáno 403 miligramů peptidu ve formě bílé pevné látky. Z analytických hodnot HPLC (vysokoúčinná kapalinová chromatografie) bylo zjištěno nekompletní odstranění formylové chránící skupiny zbytku Trp v tomto peptidu. K odstranění zbývajících formylových chránících skupin bylo 40 miligramů tohoto peptidu rozpuštěno ve směsi obsahující 3,6 mililitru vody a 0,4 mililitru 70 %-ního ethanolaminu v methanolu. Takto získaný výsledný roztok byl potom ponechán usazovat po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Potom bylo přidáno 0,35 mililitru kyseliny trifluoroctové a vzniklá sraženina byla oddělena odstřeďováním (14 000 otáček za minutu, prováděno po dobu 5 minut). Oddělená sraženina byla potom rozpuštěna ve 4 mililitrech 6 M roztoku hydrochloridu guanidinu a potom bylo provedeno chromatografické zpracování preparativní HPLC metodou s reverzními fázemi v koloně VYDAC Cl8 (2,54 centimetru) za použití následujícího gradientového systému : 100 % -—-> 40 % A, 0 % -> 60 % B, což bylo provedeno během intervalu 60 minut při průtokovém množství 10 mililitrů/minutu (A je 0,1 % kyseliny trifluoroctové/95 % vody/5 % CHjCN a B je CH^CN). Postupem podle tohoto příkladu bylo připraveno 10,5 miligramu požadovaného peptidu uvedeného v záhlaví. FAB MS : 3511,4 Da (základ + H předpokládáno : 3511 Da) 26 Příklad 2

Postup přípravy polypeptidového derivátu obecného vzorce h2n—r—x— (Y)n—z ve kterém znamená : n nulu, X je Arg, Z je COjR^, kde R^ je atom vodíku, a R představuje :

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (id. č. sekvence : 2). Při provádění postupu podle tohoto příkladu bylo použito stejné metody jako v příkladu 1, která byla ovsem modifikována pro přípravu tohoto titulního peptidu, a tímto postupem byly získány celkem 2,0 gramy peptidové pryskyřice. Zpracováním 900 miligramů této peptidové pryskyřice fluorovodíkem, což bylo prováděno stejným způsobem jako v příkladu 1 bylo získáno po vysrážení roztokem kyseliny trifluoroctové z ethyletheru celkem 340 miligramů peptidu. Potom bylo stejným způsobem jako je uvedeno v příkladu 1 zpracováváno 40 miligramů tohoto peptidu ve vodném roztoku ethanolaminu, který byl okyselen, vysrážen a produkt byl chromatograficky zpracován, čímž bylo získáno 10 miligramů požadovaného titulního peptidu. FAB MS 3511,9 Da (základ + H předpokládáno ; 3512 Da) . 27 Přiklad 3

Postup přípravy polypeptidového derivátu obecného vzorce :

H2N—R—X—(Y) n—Z ve kterém znamená : n jedna, X je Arg, Y je Arg, Z je CONR^R^, kde R^ a jsou atom vodíku, a R představuje :

His- Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr- Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe- I le-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-GIy (id. č. sekvence : 2). Při provádění postupu podle tohoto příkladu bylo použito stejné metody jako v příkladu 1, která byla ovšem modifikována pro přípravu tohoto titulního peptidu, a tímto postupem bylo získáno celkem 1,3 gramu peptidové pryskyřice. Zpracováním 1,3 gramu této peptidové pryskyřice fluorovodíkem, což bylo prováděno stejným způsobem jako v příkladu 1, bylo získáno po vysrážení roztokem kyseliny trifluoroctové z ethyletheru celkem 671 miligramů peptidu. Potom bylo stejným způsoben jako je uvedeno v příkladu 1 zpracováváno 7 miligramů tohoto peptidu ve vodném roztoku ethanolaroinu, který byl okyselen, vysrážen a produkt byl chromatografíčky zpracován, čímž bylo získáno 4,2 miligramu požadovaného titulního peptidu. FAB MS : 3667,8 Da (základ + H předpokládáno : 3667,81 Da) . 28 Příklad 4

Postup přípravy polypepxidového derivátu obecného vzorce :

H2N—R—X—(Y) n—Z ve kterém znamená ; n jedna, X je Arg, Y je Arg, Z je C02R^ . kde R^ je atom vodíku, a R představuje :

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser -Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (íd. č. sekvence : 2). Při provádění postupu podle tohoto příkladu bylo použito stejné metody jako v příkladu 1, která byla ovšem modifikována pro přípravu tohoto titulního peptidu, a tímto postupem bylo získáno celkem 2,66 gramu peptidové pryskyřice. Zpracováním 1,1 gramu této peptidové pryskyřice fluorovodíkem, což bylo prováděno stejným způsobem jako v příkladu 1, bylo získáno po vysrážení roztokem kyseliny trifluoroctové z ethyletheru celkem 490 miligramů peptidu. Potom bylo stejným způsobem jako je uvedeno v příkladu 1 zpracováváno 10 miligramů tohoto peptidu ve vodném roztoku ethanolaminu, který byl okyselen, vysrážen a produkt byl chromátograficky zpracován, čímž bylo získáno 3,8 miligramu požadovaného titulního peptidu. FAB MS : 3669,1 Da (základ + H předpokládáno : 3668.83 Da) . 29 Příklad 5

Postup přípravy polypeptidového derivátu obecného vzorce : H2N—R—X—(Y)n_z ve kterém znamená : n nulu, X Je Arg, Z je CC^R1, kde R"*· je atom vodíku, a R představuje derivát :

Hi s-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (id. č. sekvence : 2), přičemž tímto derivátem je N-koncový (N-alfa) sukcinoylovaný derivát, kde epsilon aminová skupina obou Lys zbytků je sukcinoylována.

Podle tohoto příkladu bylo k roztoku, který obsahoval 800 μg (což představuje 0,24 groolů) inzulinotropinu (sekvence id. č. 2) v 800 μΐ dimethylformamidu (DMF) , přidáno postupně 200 pg (což představuje 2,0 pmoly) anhydridu kyseliny jantarové ve 20 μΐ dimethylformamidu DMF a 200 pg (což představuje 2,0 pmoly) triethylaminu v 10 μΐ dimethylformamidu DMF. Takto připravený čirý roztok byl potom promícháván po dobu tří hodin při teplotě okolí, čímž byl získán po analytickém zpracování metodou HPLC v reverzními fázemi jeden hlavní produkt, přičemž bylo postupováno stejným způsobem jako v příkladu 1, ve výtěžku přibližně 90 % (zjištěno na základě HPLC plochy píků). Takto získaný produkt byl potom přidán do 10 mililitrů vody, potom byl roztok okyselen kyselinou trífluoroctovou na hodnotu pH 2 a nakonec byl lyofilizován do sucha. Tento suchý lvofilizát byl přidán do HPLC mobilní fáze a vyčištěn preparativní HPLC metodou s reverzními fázemi, přičemž bylo postupováno stejným způsobem jako v příkladu 1, a tímto způsobem byl získán homogenní produkt analyzovaný plasmovou desorpční hmotovou spektrální analýzou jako tri-sukcinoy1 substituovaný insulinotropin. Předpokládaná hmotnost (Μ + H) : 3656,68 Da, nalezeno : 3658,2 Da. Příklad 6

Postup přípravy polypeptidového derivátu obecného vzorce :

H2N—R—X—(Y) n—Z ve kterém znamená : n nulu, X je Arg, Z je CC^R1, kde je atom vodíku, a R představuje derivát :

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (id. č. sekvence : 2), přičemž tímto derivátem je hexa- nebo hepta- sukcinoylovaný derivát. 31 31

Při provádění postupu podle tohoto příkladu se postupovalo stejným způsobem jako v příkladu 5, přičemž místo 800 pg (což představuje 0,24 pmolů) insulinotropinu bylo použito 100 pg (což představuje 0,03 pmolů) insulinotropinu a k provedení tohoto postupu byly použity stejné složky ve stejných množstvích uvedených v tomto příkladu 5. Po promíchání reakční směsi, které bylo prováděno po dobu 16 hodin při teplotě okolí, byl získán požadovaný nový produkt (potvrzeno HPLC analýzou), Tento produkt, který byl oddělen stejným způsobem jako je uvedeno v příkladu 5, byl analyzován ES-MS hmotovou spektrální analýzou jako směs hexa- a hepta- sukcinoylovaný insulinotropin. Předpokládaná hmotnost pro hexa-sukcinoylovaný insulinotropin : 3955,68 Da, nalezeno : 3955,9 Da. Předpokládaná hmotnost pro hepta-sukcinoylovaný insulinotropin : 4055,68 Da, nalezeno : 4055,9 Da. Příklad 7

Postup přípravy polypeptidového derivátu obecného vzorce : H2N—R—X— ( Y) n—z ve kterém znamená : n nulu, X je Arg, Z je C02R*, kde R1 je atom vodíku, a R představuje : 32

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr- ieu-Glu-Gl.y-Gln-AI a-Ala- Lys-Gl u- Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (id. č. sekvence : 2).

Podle tohoto příkladu bylo 100 mikrogramů (100 pg) inzulinotropinu (sekvence id. č. 2) rozpuštěno v roztoku obsahujícím 50 μΐ dimethylformamidu DMF obsahujícího 20 μΐ vodného tricinového pufru (pH 8,75) a tato reakční směs byla promíchávána při teplotě 37 ’C po dobu přes noc. Metodou HPLC, provedenou stejným způsobem jako v příkladu 1, byla potvrzena přítomnost nového píku, pro který bylo zjištěno, že se současně eluuje s produktem získaným úplnou syntézou postupem podle přikladu 2. 33 Přehled o sekvencích (1) Obecné informace ; (I) Přihlašovatel : Andrews, Glenn C.

Daumy, Gaston 0.

Francoeur, Michael L.

Larson, Eric R.

Pfizer lne, (ne-US) (II) Název vynálezu : Deriváty peptidu a insulínotropinu glukagonového typu (III) Počet sekvencí : 6 (IV) Adresa pro korespondenci : (A) Adresa : Gregg C. Benson, Pfizer lne (B) Ulice : Eastern Point Road (C) Město : Groton

(D) Stát : CT

(E) Země : USA (F) ZIP : 06340 (V) Počítačové čitelná forma : (A) Typ média : Floppy disk (B) Počítač : IBM PC kompatibilní

(C) Operační systém : PC-DOS/MS-DOS (D) Software : Patentln Release #1.0, Version #1.25 (EPO) (VI) Současná data o přihlášce : (A) Číslo přihlášky (B) Datum podání (C) Klasifikace (VII) Prioritní data o přihlášce vynálezu : (A) Číslo přihlášky : US 07/899,083 (B) Den podání : 15. červen 1992 - J4 - (VIII) Zástupce/Informace o patentovém zástupci (A) Jméno : Benson, Gregg C. (B) Registrační číslo : 30,997

(C) Referenční óíslo/značka : PC8156AGCB (IX) Informace o telekomunikačním spojení : (A) Telefon : (203) 441-4901 (B) Telefax : (203) 441 - 5221 (2) Informace pro sekvenci ID č. SEQ : 1 (I) Charakteristika sekvence : (A) Délka : 37 aminokyselin (B) Typ : aminokyselina (D) Topologie : lineární (II) Molekulový typ : peptid (XI) Popis sekvence : ID č. SEQ 1 :

Hi s-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe -15 10

Thr-Ser -Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-15 20

Ala-Lys-Glu-Phe-IIe-AIa-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly 25 30 35 (2) Informace pro sekvenci ID č. SEQ : 2 (I) Charakteristika sekvence : (A) Délka : 31 aminokyselin (B) Typ : aminokyselina (D) Topologie : lineární (II) Molekulový typ : peptid 35 (XI) Popis sekvence : ID č. SEQ 2 :

Hi s-Ala-Glu-Gly-Thr - Phe-Thr - Ser-A sp-Val - Ser-Ser-15 10

Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-15 20

Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly 25 30 (2) Informace pro sekvenci ID č. SEQ : 3 (I) Charakteristika sekvence : (A) Délka : 30 aminokyselin (B) Typ : aminokyselina (D) Topologie : lineární (II) Molekulový typ : peptid (XI) Popis sekvence ; ID č. SEQ 3 :

His-Ala-Glu-Gly-Thr - Phe-Thr - Ser-Asp-Val - Ser-Ser -15 10

Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-1 le- Ala-15 20

Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg 25 30 ^ Lř (2) Informace pro sekvenci ID č. SEQ : 4 (I) Charakteristika sekvence : (A) Délka : 29 aminokyselin (B) Typ : aminokyselina (D) Topologie : lineární (II) Molekulový typ : peptid (XI) Popis sekvence : ID č. SEQ 4 :

His-Ala-Glu-Glv-Thr-Phe-Thr-Ser -Asp-Val-Ser-Ser 1 5 10

Tyr- Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala 15 20

Trp-Leu-Val-Lys-Gly 25 (2) Informace pro sekvenci ID č. SEQ : 5 (I) Charakteristika sekvence : (A) Délka : 28 aminokyselin (B) Typ : aminokyselina (D) Topologie : lineární (II) Molekulový typ : peptid (XI) Popis sekvence : ID č. SEQ 5 :

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser - Ser 15 10

Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala 15 20

Trp-Leu-Val-Lys 25 - J / - (2) Informace pro sekvenci ID č. SEQ : 6 (I) Charakteristika sekvence : (A) Délka : 36 aminokyselin (B) Typ : aminokyselina (D) Topologie : lineární (II) Molekulový typ : peptid (XI) Popis sekvence : ID č. SEQ 6

Hi s - Asp-Glu- Phe-Glu- Arg-Hi s -Ala-GI u-Gly -Thr - Phe -15 10

Thr- Ser-Asp-Val - Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala" 15 20

Ala -Lys-Glu-Phe- Ile-Ala-Trp -Leu-Val-Lys-Gly-Arg 25 30 35

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY 1. Derivát polypeptidu obsahující primární strukturu : i H2N—v—COOH i 5 E ve kterém znamená : .---— V aminokyselinovou sekvenci, zvolenou ze souboru zahrnujícího : ; His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (id. č. sekvence : 1) a His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-A1a-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg (id. č. sekvence: 6), a farmaceuticky přijatelné soli odvozené od těchto látek, přičemž tento derivát má hodnotu pí asi 4,0 nebo nižší, nebo má hodnotu pí asi 7,0 nebo vyšší, přičemž se jedná o esterifikovaný derivát, amidovaný derivát, deamidovaný derivát, alkylovaný derivát, acetylovaný derivát, reakční derivát s cyklickým anhydridem, derivát s přidanou C-koncovou bazickou a/nebo neutrální aminokyselinou nebo přidanými bazickými a/nebo neutrálními aminokyselinami, nebo o derivát s dvěma nebo více uvedenými kombinacemi, které jsou odvozeny od uvedené primární struktury, a při zpracování při aplikaci savcům vznikne polypeptidový derivát, který má inzulinotropní účinnost. 39
2. Derivát polypeptidu podle nároku 1, který má obecný vzorec : h2n V— (X) m— (Y) n z a farmaceuticky přijatelné soli odvozené od těchto sloučenin, ve kterých : m znamená nulu nebo jedna, n je nula nebo jedna, X představuje bazický nebo neutrální L-aminokyselinový zbytek, Y představuje bazický nebo neutrální L-aminokyselinový zbytek, a Z znamená skupinu CC^R^ nebo CONR^R^, kde R·^ znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu s rozvětveným nebo nerozvětveným řetězcem obsahujícím 1 až 6 atomů uhlíku, v případě, že : (a) m je jedna, n je nula a X představuje bazický L-aminokyselinový zbytek, nebo (b) m je nula, n je jedna a Y představuje bazický L-aminokyselinový zbytek, nebo (c) m a n jsou oba jedna a jeden nebo oba substituenty X a Y představují bazický L-aroinokyselinový zbytek, R* představuje alkylovou skupinu s rozvětveným nebo nerozvětveným řetězcem obsahujícím 1 až 6 atomů uhlíku, v případě, že : (a) man jsou oba nula, nebo (b) m je jedna a n je nula a X představuje neutrální L-aminokyselinový zbytek, nebo (c) m je nula, n je jedna a Y představuje neutrální i L-aminokyselinový zbytek, nebo (d) man jsou oba jedna a oba substituenty X a Y představují neutrální L-aminokyselinový zbytek, a R a R každý nezávisle znamenají atom vodíku nebo rozvětvenou nebo nerozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 atomů uhlíku.
3. Derivát polypeptidu obsahující primární strukturu H2N—R—COOH ve kterém znamená ; R aminokyselinovou sekvenci vybranou ze souboru zahrnuj ícího : His-AÍa-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ara-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (id, č. sekvence : 2) His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg (id. č. sekvence: 3) His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly (id. č. sekvence: 4) - ·* 1 - His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys (id. č. sekvence; 5) a farmaceuticky přijatelné soli odvozené od téchto derivátů, přičemž tento derivát má hodnotu pí asi 4,0 nebo nižší, nebo má hodnotu pí asi 7,0 nebo vyšší, a projevuje inzulinotropní Účinnost, přičemž se jedná o esterifikovaný derivát, amidovaný derivát, deamidovaný derivát, alkylovaný derivát, acetylovaný derivát, reakční .derivát s-cyklickým aňhydridem, derivát s přidanou C-koncovou bazickou a/nebo neutrální aminokyselinou nebo přidanými bazickými a/nebo neutrálními aminokyselinami, nebo o derivát s dvěma nebo více uvedenými kombinacemi, které jsou odvozeny od uvedené primární struktury, s tou podmínkou, že tento derivát nepředstavuje C-koncový alkylový ester uvedené primární struktury jako takové s rozvětveným nebo nerozvětveným alkylovým řetězcem obsahujícím 1 až 6 atomů uhlíku, a dále s tou podmínkou, že „tento.derivát nepředstavuje G-koncový-karboxamid^obecného' * vzorce : C0NR2R3 uvedené primární struktury jako takové nebo derivát sekvence id. č. 4, která má dodatečně Lys nebo Lys-Gly na C-konci, kde R a RJ každý nezávisle představují atom vodíku nebo rozvětvenou nebo nerozvétvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 atomů uhlíku.
4. Derivát polypeptidu podle nároku 3 obecného vzorce : H2N—R—X— (Y> n—2 a farmaceuticky přijatelných soli odvozených od těchto derivátů, ve kterém : N n je nula nebo jedna, X představuje bazický nebo neutrální L-aminokyselinový zbytek, Y představuje bazický nebo neutrální L-aminokyselinový zbytek, a Z znamená CC^R^ nebo CONR^R^, kde R1 představuje atom vodíku nebo rozvětvenou nebo nerozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, v případě, že : (a) n je nula a X představuje bazický L-aminokyselinový zbytek, nebo (b) n je jedna a jeden nebo oba substituenty X a Y představují bazický L-aminokyselinový zbytek, i R představuje rozvětvenou nebo nerozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, v případě, že ; (a) n je nula -a X představuje neutrální L-aminokyselinový zbytek, nebo (b) D je jedna a oba substituenty X a Y představují neutrální L-aminokyselinový zbytek, a Λ -3 R a R představují každý nezávisle atom vodíku nebo rozvětvenou nebo nerozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 atomů uhlíku.
5. Polypeptidový derivát podle nároku 4 a farmaceuticky přijatelné soli odvozené od tohoto derivátu, ve kterém R znamená : 43 ·/ His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (id. č. sekvence : 2).
6. Polypeptidový derivát podle nároku 5 a farmaceuticky přijatelné soli odvozené od tohoto derivátu, ve kterém n je nula a X znamená Arg.
7. Polypeptidový derivát podle nároku 6 a farmaceuticky přijatelné soli odvozené od tohoto derivátu, ve kterém Z je C02R* kde R* je atom vodíku.
8. Polypeptidový derivát podle nároku 6 a farmaceuticky přijatelné soli odvozené· od tohoto derivátu., ve kterém Z znamená CONR^R^ kde R^’a R^ znamenají každý atom vodíku.
9. Polypeptidový derivát podle nároku 5 a farmaceuticky přijatelné.soli odvozené od tohoto derivátu, ve kterém n je jedna, a X a Y každý znamenají Arg.
10. Polypeptidový derivát podle nároku 9 a farmaceuticky přijatelné soli odvozené od tohoto derivátu, 11 ve kterém Z je CC^R kde R je atom vodíku.
11. Polypeptidový derivát podle nároku 9 a farmaceuticky přijatelné soli odvozené od tohoto derivátu, 2 3 2, 3 ve kterém Z znamená CONR R kde R a R znamenají každý atom vodíku.
12. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje polypeptidový derivát podle nároku 1. 44
13. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje polypeptidový derivát podle nároku 2.
14. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje polypeptidový derivát podle nároku 3. *
15. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje polypeptidový derivát podle nároku 4.
16. Polypeptid podle některého z nároků 1, 2, 3 nebo 4 pro přípravu léčiva k posílení účinku inzulínu u savců.
17. Polypeptid podle některého z nároků 1, 2, 3 nebo 4 pro přípravu léčiva k iontoforetické transdermální aplikaci k posílení účinku inzulínu u savců.
18. Polypeptid podle některého z nároků 1, 2, 3 nebo 4 pro přípravu léčiva k léčení diabetes typu II.
19. Použití polypeptidového derivátu nebo farmaceuticky přijatelné soli odvozené od tohoto derivátu obsahujícího primární strukturu : < H2N—R— (X)m— (Y)n—Z < pro přípravu léčiva pro posílení účinku inzulínu u savců při iontoforetickém podání, ve které : R znamená aminokyselinovou sekvenci vybranou ze souboru zahrnujícího 45 His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (id. č. sekvence : 2) His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser- , Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala- Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg » (id. č. sekvence: 3) His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gin-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly (id. č. sekvence: 4) His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val- Ser-Ser-Tyr - Leu-Glu-Gly-Gin-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys (id. č. sekvence: 5), m znamená nulu nebo jedna, n je nula nebo jedna, X představuje bazický nebo neutrální L-aminokyselinový zbytek, Y představuje bazický nebo neutrální t L-aminokyselinový zbytek, a Z znamená skupinu CC^R1 nebo C0NR2R^ , ^ kde R1 znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu s rozvětveným nebo nerozvětveným řetězcem obsahujícím 1 až 6 atomů uhlíku, v případě, že : (a) m je jedna, n je nula a X představuje bazický L-aminokyselinový zbytek, nebo (b) m je nula, n je jedna a Y představuje bazický 46 L-aminokyselinový zbytek, nebo (c) man jsou oba jedna a jeden nebo oba substituenty X a Y představují bazický L-aminokyselinový zbytek, R* představuje alkylovou skupinu s rozvětveným nebo nerozvétveným řetězcem obsahujícím 1 až 6 atomů uhlíku, v případě, že : (a) man jsou oba nula, nebo (b) m je jedna a n je nula a X představuje neutrální L-aminokyselinový zbytek, nebo (c) m je nula, n je jedna a Y představuje neutrální L-aminokyselinový zbytek, nebo (d) man jsou oba jedna a oba substituenty X a Y představují neutrální L-aminokyselinový zbytek, a 2 3 R a R každý nezávisle znamenají atom vodíku nebo rozvětvenou nebo nerozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 atomů uhlíku.
20. Použití podle nároku 19, kde R představuje His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (id. č. sekvence : 2) m je nula a n je nula.
21. Použití podle nároku 20, kde Z znamená CONR^R^ kde 2 3 R a R představují každý atom vodíku.
22. Způsob přípravy polypeptidového derivátu obsahujícího primární strukturu H2N—V—COOii 47 ve kterém znamená : V aminokyselinovou sekvenci, zvolenou ze souboru zahrnujícího : His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tvr-Leu-Glu-Glv-Gin -Ala- * Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (id. č. sekvence : i) » a His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-Hi s-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Clu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg (id. č. sekvence: 6), a farmaceuticky přijatelných solí odvozených od těchto látek, přičemž tento derivát má hodnotu pí asi 4,0 nebo nižší, nebo má hodnotu pí asi 7,0 nebo vyšší, přičemž se jedná o esterifikovaný derivát, amidovaný derivát, deamidovaný derivát, alkylovaný derivát, acetylovaný derivát, reakční derivát s cyklickým anhydridem, derivát s přidanou C-koncovou bazickou a/nebo neutrální aminokyselinou nebo přidanými bazickými a/nebo neutrálními aminokyselinami, nebo o derivát s dvěma nebo více uvedenými kombinacemi, které jsou odvozeny od uvedené primární struktury a při zpracování tohoto derivátu při aplikaci * savcům vznikne polypeptidový derivát, který má insulinotropní účinnost, 1 vyznačující se tím, že zahrnuje přípravu derivátu s uvedenou primární strukturou metodami jako takovými známými, případné potom následuje převedení uvedeného derivátu na farmaceuticky přijatelnou sůl odvozenou od tohoto derivátu metodami jako takovými známými. 48
23. Způsob přípravy polypeptidového derivátu podle nároku 22, který má obecný vzorec . H2N-V-(X)n,-(Y)n-Z a. farmaceuticky přijatelných solí odvozených od těchto sloučenin, 4 ve kterých : m znamená nulu nebo jedna, n je nula nebo jedna, X představuje bazický nebo neutrální L-aminokyselinový zbytek, Y představuje bazický nebo neutrální L-aminokyselinový zbytek, a Z znamená skupinu CC^R nebo CONR R , kde R1 znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu s rozvětveným nebo nerozvětveným řetězcem obsahujícím 1 až 6 atomů uhlíku, v případě, že : (a) m je jedna, n je nula a X představuje bazický L-aminokyselinový zbytek, nebo (b) m je nula, n je jedna a Y představuje bazický L-aminokvselinový zbytek, nebo (c) man jsou oba jedna a jeden nebo oba substituenty X a Y představuji bazický L-aminokyselinový zbytek, » R^· představuje alkylovou skupinu s rozvětveným nebo nerozvětveným řetězcem obsahujícím 1 až 6 atomů uhlíku, 1 v případě, že : (a) man jsou oba nula, nebo (b) m je jedna a n je nula a X představuje neutrální L-aminokyselinový zbytek, nebo (c) m je nula, n je jedna a Y představuje neutrální L-aminokyselinový zbytek, nebo (d) m a n jsou oba jedna a oba substituenty - η y X a Υ představuji neutrální L-aminokyselinový zbytek, a 2 3 R a R každý nezávisle znamenají atom vodíku nebo rozvětvenou nebo nerozvétvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, vyznačující se tím, že zahrnuje přípravu derivátu s uvedenou primární strukturou metodami jako takovými známými, případně potom následuje převedení uvedeného derivátu na * farmaceuticky přijatelnou sůl odvozenou od tohoto derivátu metodami jako takovými známými. K
24. Způsob přípravy polypeptidového derivátu obsahujícího primární strukturu H2N—R—COOH ve kterém znamená : R aminokyselinovou sekvenci vybranou ze souboru zahrnujícího : His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (id. č. sekvence : 2) His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp^Leu-Val-Lys-Gly-Arg (id. č. sekvence: 3) His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly (id. č. sekvence: 4) His-Ala-Glu-Gly-Tbr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys (id. č. sekvence: 5) 9 a farmaceuticky přijatelné soli odvozené od těchto derivátů, přičemž tento derivát má hodnotu pí asi 4,0 nebo nižší, nebo 4 má hodnotu pí asi 7,0 nebo vyšší, a projevuje insulinotropní účinnost, přičemž se jedná o esterifi kovaný derivát, amidovaný derivát, deamidovaný derivát, alkyl ováný derivát, acetvlovaný derivát, reakční derivát s cyklickým anhydridem, derivát s přidanou C-koncovou bazickou a/nebo neutrální aminokyselinou nebo přidanými bazickými a/nebo neutrálními aminokyselinami, nebo o derivát s dvěma nebo více uvedenými kombinacemi, které jsou odvozeny od uvedené primární struktury, s tou podmínkou, že tento derivát nepředstavuje C-koncový alkylový ester uvedené primární struktury jako takové s rozvětveným nebo nerozvětveným alkylovým řetězcem obsahujícím 1 až 6 atomů uhlíku, a dále s tou podmínkou, že tento derivát nepředstavuje C-koncový karboxamid obecného vzorce : CONR2R3 uvedené primární struktury jako takové nebo derivát sekvence i id. č. 4, která má dodatečně Lys nebo Lys-Gly na C-konci, 2 i kde R a každý nezávisle představuji atom vodíku nebo rozvětvenou nebo nerozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, vyznačující se tím, že zahrnuje přípravu derivátu s uvedenou primární strukturou metodami jako takovými známými, případně potom následuje převedení uvedeného derivátu na farmaceuticky přijatelnou sůl odvozenou od tohoto derivátu 51 metodami jako takovými známými.
25. Způsob připravy polypeptidového derivátu pódiu nároku 24, který má obecný vzorec : h2n—r—X— (Y)n—z a farmaceuticky přijatelných soli odvozených od těchto derivátů, ve kterém ; n je nula nebo jedna, X představuje bazický nebo neutrální L-aminokyselinový zbytek, Y představuje bazický nebo neutrální L-aminokyselinový zbytek, a Z znamená C02R^ nebo CONR^R^, kde R^ představuje atom vodíku nebo rozvětvenou nebo nerozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, v případě, že : (a) Π je nula a X představuje bazický L-aminokyselinový zbytek, nebo (b) n je jedna a jeden nebo oba substituenty X a Y představují bazický L-aminokyselinový zbytek, R·*· představuje rozvětvenou nebo nerozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, v případě, že : (a) Π je nula a X představuje neutrální L-aminokyselinový zbytek, nebo (b) n je jedna a oba substituenty X a Y představují neutrální L-aminokyselinový zbytek, a a představují každý nezávisle atom vodíku nebo rozvětvenou nebo nerozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 atomů uhlíku. vyznačující se tím, že zahrnuje přípravu derivátu s uvedenou primární strukturou metodami jako takovými známými, případně potom následuje převedení uvedeného derivátu na farmaceuticky přijatelnou sůl odvozenou od tohoto derivátu metodami jako takovými známými. ¥ i
26. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, že R představuje His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-AIa-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (id. č. sekvence : 2).
27. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že n je nula a X představuje Arg.
28. Způsob podle nároku 27, vyznačující se tím, že Z znamená CC^R·*- kde představuje atom vodíku, nebo *2 "X 2 "i Z představuje CONR R kde R a R představuji každý atom vodíku.
29. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že n je jedna a X a Y představují každý Arg.
30. Způsob podle nároku 29, vyznačující se tím, že Z představuje CC^R^ kde R^ představuje atom vodíku, nebo Z představuje CONR R kde R a R·3 představují každý atom vodíku.
31. Způsob podle nároků 22 nebo 24, vyznačující se tím, že uvedený derivát se připraví pomocí jednoho nebo více následujících kroků : (a) reakcí primární struktury s alkanolem obsahujícím 1 až 6 atomů uhlíku v přítomnosti katalytické kyseliny za vzniku C-koncového alkylesteru obsahujícího v alkylové části 1 až 6 atomů uhlíku, (b) reakcí primární struktury s alkanolem obsahujícím 1 až 6 atomů uhlíku v přítomnosti katalytické kyseliny za vzniku alkylesteru Asp a/nebo Glu zbvtku obsahujícího 1 až 6 atomů uhlíku v alkylové části, (c) syntézou karboxamidového derivátu primární struktury peptidovou syntézou v pevné fázi, (d) deamidací Gin zbytku této látky, (e) alkylací nebo amidací volné aminové skupiny na N-konci a/nebo na epsilon skupině jednoho nebo vice Lys zbytků primární struktury, nebo kombinací těchto postupů, (f) reakcí primární struktury s cyklickým anhydridem, (g) adicí jedné nebo více bazických a/nebo neutrálních aminokyselin k C-konci uvedené primární struktury. Zastupuje : Dr. Pavel Zelený