DD257646A5 - Verfahren zur Herstellung von Streptokinase - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von StreptokinaseInfo
- Publication number
- DD257646A5 DD257646A5 DD257646A5 DD 257646 A5 DD257646 A5 DD 257646A5 DD 257646 A5 DD257646 A5 DD 257646A5
- Authority
- DD
- German Democratic Republic
- Prior art keywords
- streptokinase
- gat
- aaa
- dna
- yeast
- Prior art date
Links
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 title claims abstract description 116
- 229960005202 streptokinase Drugs 0.000 title claims abstract description 101
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 70
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 62
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 48
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 40
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 40
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 24
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 20
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 15
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 11
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims abstract description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000000470 constituent Substances 0.000 claims abstract description 4
- 241000235648 Pichia Species 0.000 claims description 32
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 10
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 claims description 8
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 6
- 101710194180 Alcohol oxidase 1 Proteins 0.000 claims description 5
- 241000264435 Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis Species 0.000 claims description 5
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 claims description 5
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 3
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 3
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 3
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims 4
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims 2
- 101710093617 Dihydroxyacetone synthase Proteins 0.000 claims 1
- PVFDPMYXCZLHKY-MLLWLMKGSA-M sodium [(1R,2R,4aR,8aS)-2-hydroxy-5-[(2E)-2-[(4S)-4-hydroxy-2-oxooxolan-3-ylidene]ethyl]-1,4a,6-trimethyl-2,3,4,7,8,8a-hexahydronaphthalen-1-yl]methyl sulfate Chemical compound [Na+].C([C@@H]1[C@](C)(COS([O-])(=O)=O)[C@H](O)CC[C@]11C)CC(C)=C1C\C=C1/[C@H](O)COC1=O PVFDPMYXCZLHKY-MLLWLMKGSA-M 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 10
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 44
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 39
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 34
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 24
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 22
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 19
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 19
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 11
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 8
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 8
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 8
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 8
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 8
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 8
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 8
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 8
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 7
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 7
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 7
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 7
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 6
- 241000364057 Peoria Species 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- YQDHCCVUYCIGSW-LBPRGKRZSA-N ethyl (2s)-2-benzamido-5-(diaminomethylideneamino)pentanoate Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(=O)OCC)NC(=O)C1=CC=CC=C1 YQDHCCVUYCIGSW-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 6
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 5
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 5
- 108010067193 Formaldehyde transketolase Proteins 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 5
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101150069554 HIS4 gene Proteins 0.000 description 4
- 101001113483 Homo sapiens Poly [ADP-ribose] polymerase 1 Proteins 0.000 description 4
- 101000630284 Homo sapiens Proline-tRNA ligase Proteins 0.000 description 4
- 102100023712 Poly [ADP-ribose] polymerase 1 Human genes 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 244000309466 calf Species 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 4
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 3
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 3
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 3
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 3
- 101000605403 Homo sapiens Plasminogen Proteins 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 150000003138 primary alcohols Chemical class 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710101803 DNA-binding protein J Proteins 0.000 description 2
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 2
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 2
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001149669 Hanseniaspora Species 0.000 description 2
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 241000223252 Rhodotorula Species 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 2
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001718 repressive effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- 101150006240 AOX2 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 206010002660 Anoxia Diseases 0.000 description 1
- 241000976983 Anoxia Species 0.000 description 1
- 101100238763 Bacillus subtilis hsdRM gene Proteins 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220489870 Cofilin-1_H46A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 206010011703 Cyanosis Diseases 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010033128 Glucan Endo-1,3-beta-D-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108091036060 Linker DNA Proteins 0.000 description 1
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000007953 anoxia Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- KDZOASGQNOPSCU-UHFFFAOYSA-N argininosuccinate Chemical compound OC(=O)C(N)CCCN=C(N)NC(C(O)=O)CC(O)=O KDZOASGQNOPSCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000000963 caseinolytic effect Effects 0.000 description 1
- 229940021722 caseins Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 101150102883 hsdM gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000006286 nutrient intake Nutrition 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000033885 plasminogen activation Effects 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- 238000010583 slow cooling Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000003466 welding Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Streptokinase, gekennzeichnet dadurch, dass man einen Hefestamm der mit einem Plasmid mit folgenden Bestandteilen: ein DNA-Fragment, enthaltenda) einen Heferegulationsbereich, der zur Kontrolle der Transkription von Messenger-RNA in Hefe bei Positionierung am 5-Ende des Polypeptid-Kodierungsbereichs in der Lage ist, und(b)einen Polypeptid-Kodierungsbereich, wobei dieser Kodierungsbereich fuer Streptokinase oder Teile davon kodiert und frei von bakteriellen Signalsequenzen ist,bakterielle Plasmid-DNA, ein selektierbares Hefemarkergen und eine autonome Hefereplikationssequenz, transformiert worden ist, unter Bedingungen zuechtet, unter denen der Regulationsbereich die Expression des fuer Streptokinase kodierenden Polypeptid-Kodierungsbereiches induziert.
Description
Hierzu 4 Seiten Zeichnungen
Die Anwendung der vorliegenden Erfindung erfolgt auf dem Gebiet der rekombinanten DNA-Technik zur Herstellung von Streptokinase, einem Arzneistoff zur Bekämpfung von Thrombosen.
Mit der Entwicklung der rekombinanten DNA-Technik in den letzten Jahren wurde die kontrollierte Bildung einer großen Anzahl von wertvollen Polypeptiden durch Mikroorganismen möglich. Viele eukaryontische Polypeptide, ζ. Β. menschliches Wachstumshormon, Leukozyteninterferone, Humaninsulin und Humanproinsulin werden bereits durch Mikroorganismen gebildet. Die weitere Anwendung der bereits zur Verfügung stehenden Technik läßt für die Zukunft erwarten, daß eine Reihe von weiteren wertvollen Polypeptidprodukten durch Mikroorganismen gebildet werden können. Ein derartiges wertvolles Polypeptidprodukt ist Streptokinase.
Die Streptokinasen sind eine gut definierte Gruppe von Proteinen, die von vielen Stämmen von hämolytischen Streptokokken an das Wachstumsmedium abgegeben werden. Vor einiger Zeit wurde festgestellt, daß Streptokinasen eine Rolle bei der Auflösung von Blutgerinnseln und insbesondere von Exsudaten spielt, die reich an Fibrinbestandteilen sind. Je nach der Art und Größe dieser Gerinnsei, beeinflußt Streptokinase in Gegenwart von Humanplasminogen die Auflösung derartiger Gerinnsel. Die Auflösung der Gerinnsel erfolgt aufgrund der Tatsache, daß die Streptokinasen eine stöchiometrische Wechselwirkung mit dem
enzymatisch inerten Plasma-plasminogen unter Bildung des aktiven Enzyms Plasmin eingehen. Das auf diese Weise gebildete Plasmin baut sodann das Fibrin-Netzwerk durch begrenzte Proteolyse unter Bildung von löslichen Produkten ab. Bevor gemäß der vorliegenden Erfindung die Aufgabe in Angriff genommen worden ist, die rekombinante DNA-Technik für die großtechnische Hersteilung von Streptokinase einzusetzen, wurde Streptokinase als Fermentationsprodukt von hämolytischen Streptokokken erhalten. Bisher war die Verwendung von Streptokinase dadurch begrenzt, daß das aus Streptokokken, die natürlicherweise Streptokinase bilden, isolierte Streptokinaseprodukt mit fremden Streptokokken-Proteinnebenprodukten verunreinigt war, die zu toxischen Reaktionen beim Menschen führen. Diese Reaktionen machen sich durch eine Erhöhung der Körpertemperatur, einen Abfall des Blutdrucks, Schüttelfrost, Anoxie, Cyanose und dergi. bemerkbar. Somit ist es bisher nicht möglich gewesen, ausreichende Mengen an Streptokinase von ausreichender Reinheit für die Behandlung von Blutgerinnseln bereitzustellen.
Ziel der Erfindung ist es, ein neues Verfahren zur Herstellung von Streptokinase bereitzustellen. Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues Verfahren zur Herstellung von Streptokinase bereitzustellen, wobei die Nachteile des Standes der Technik überwunden werden sollen und insbesondere Streptokinase, die frei von Nebenprodukten ist, in erheblichen Mengen und zu geringen Kosten liefern soll. Außerdem sollen erfindungsgemäß DNA-Bausteine hergestellt werden, die zur Expression von Streptokinase in Hefe in hohen Ausbeuten fähig sein sollen.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Streptokinase, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Hefestamm, der mit Plasmid mit folgenden Bestandteilen:
ein DNA-Fragment, enthaltend
a) einen Heferegulationsbereich, der zur Kontrolle der Transkription von Messenger-RNAin Hefe bei Positionierung am 5'-Ende des Polypeptid-Kodierungsbereichs in der Lage ist, und
b) einen Polypeptid-Kodierungsbereich, wobei dieser Kodierungsbereich für Streptokinase oder Teile davon kodiert und frei von bakteriellen Signalsequenzen ist,
bakterielle Plasmid-DNA,
ein selektierbares Hefemarkergen und
eine autonome Hefereplikationssequenz,
transformiert worden ist, unter Bedingungen züchtet, unter denen der Regulationsbereich die Expression des für Streptokinase kodierenden Polypeptid-Kodierungsbereiches induziert.
Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß Streptokinase in Hefe in hohen Ausbeuten gebildet werden kann, indem man mit DNA-Bausteinen mit einem Gehalt an Streptokinase-Kodierungsbereichen unter der Kontrolle von Heferegulationsbereichen transformierte Hefezellen züchtet, wobei die Streptokinase-Kodierungsbereiche frei von bakteriellen Signalsequenzen sind.
Fig. 1: ist eine Restriktionskarte des 5'-Bereichs des primären Dihydroxyaceton-synthase-Gens von Pichia (DAS1).
Fig. 2: ist eine Restriktionskarte des 5'-Bereichs des primären Alkohol-oxidase-Gens von Pichia (AOX 1).
Fig.3: ist eine Restriktionskarte des 5'-Bereiches des p40-Gens von Pichia.
Fig.4: ist eine Restriktionskarte der autonomen Replikationssequenz PARS 1.
Fig. 5: ist eine Restriktionskarte der autonomen Replikationssequenz PARS 2.
Fig.6: ist eine Restriktionskarte des Plasmids pMF5, einschließlich des Details über den Streptokinase-Kodierungsbereich für
die Modifikation und Insertion in den Pichia-Expressionsvektor pTHBS3V. Fig.7: ist eine Restriktionskarte des Plasmids pTHBS3V
Fig. 8: ist eine Restriktionskarte des Plasmids pHTskc25
Die folgenden Abkürzungen werden in den Figuren für die Restriktionsenzyme verwendet:
| Abkürzung | Restriktionsenzym |
| A | AIuI |
| Ah | Aha III |
| Av | Aval |
| B | BamHI |
| B2 | BgIII |
| Bc | Belli |
| C | CIaI |
| H2 | Hindi |
| H3 | Hind III |
| K | Kpnl |
| Mb | Mbo Il |
| Nd1 | Ndel |
| Nr | NmI |
| Ps | Pst I |
| Pv1 | Pvul |
| R1 | EcoRI |
| R5 | EcoRV |
Rs ' Rsal
S Sal I
Sm Smal
Ss Sstl
T Taql
Xh Xhol
Erfindungsgemäß werden neue DNA-Fragmente bereitgestellt, die einen Heferegulationsbereich und einen Polypeptid-Kodierungsbereich enthalten, wobei der Polypeptid-Kodierungsbereich für Streptokinase oder Teile davoh kodiert, wobei aber der Kodierungsbereich für Streptokinase frei von bakteriellen Signalsequenzen ist und wobei der Heferegulationsbereich dazu in der Lage ist, die Transkription von Messenger-RNA bei Positionierung am 5'-Ende des Streptokinase-Kodierungsbereiches zu kontrollieren. Ggf. können die erfindungsgemäßen DNA-Fragmente auch eine 3'-Sequenz von DNA stromabwärts zum Polypeptid-Kodierungsbereich umfassen, wobei die 3'-Sequenz von DNA zur Kontrolle der Polyadenylierung und Termination der Transkription von Messenger-RNA, die durch den Polypeptid-Kodierungsbereich kodiert ist, in der Lage ist. Die Kombination von Regulationsbereich, Streptokinasegen und transkriptionalem Terminatorfragment wird nachstehend als Expressionskassette oder Expressionseinheit bezeichnet.
Ferner werden erfindungsgemäß neue lineare und kreisförmige Plasmide mit einem Gehaltan den vorerwähnten Expressionskassetten bereitgestellt.
Außerdem werden erfindungsgemäß im wesentlichen reine Kulturen von Hefestämmen, die mit den vorerwähnten linearen oder kreisförmigen Plasmiden transformiert sind, bereitgestellt.
Streptokinase werden durch verschiedene Mitglieder der Bakterienfamilie Streptococcus gebildet. Das Streptokinasegen aus Streptococcus equisimilis wurde von Malkeund Ferretti (PNAS USA, Bd.81 (1984], S.3557-3561) und Malke, Roe und Ferretti (Gene, Bd.34 [1985], S. 357-362) geklont und charakterisiert. Die vorerwähnten Druckschriften beschreiben die Nucleotidsequenzfürdas isolierte Streptokinasegen unter Einschluß von bakteriellen, nicht-kodierenden Sequenzen am 5'-und 3'-Ende des Streptokinasekodierungsbereiches.
Das von Malke et ai. beschriebene Streptokinasegen wurde durch Spaltung mit dem Restriktionsenzym Ava Il modifiziert. Durch diese Verdauung wurden die nativen 5'-Signalsequenzen, die ersten zehn Nucleotide, die für die reife Form von Streptokinase kodieren, sowie einige 3'-Sequenzen des Streptokinasekodierungsbereiches entfernt. Diese gestutzte Streptokinasekodierungssequenz wurde sodann mit dem in nachstehender Sequenz A gezeigten, synthetischen Ava ll-BamH I-Linker verknüpft.
Sequenz A
14-1 .J-
5'-GAT CCC GGG rAAT TCC ATG ATT GCT G-3' GG CCC TTA AGG TAC TAA CGA CCT
1 t 1 t
BamRl
ScoRl
Avail
Smal
Bei Verknüpfung des in Sequenz A gezeigten synthetischen Linkers mit dem mit Avall-behandelten Streptokinasekodierungsfragment wurden die ersten zehn Nucleotide, die aus dem Streptokinasekodierungsbereich deletiert worden waren, ersetzt, wodurch vier Codons, die für die gleichen Aminosäuren wie die nativen Sequenzen kodieren, bereitgestellt wurden. Ferner wurde ein ATG-Initiationscodon bereitgestellt. Die DNA wurde anschließend mit EcoR I verdaut, um kompatible kohäsive Enden zur Ligation in die einzige EcoRI-Stelle des Hefeexpressionsvektors pTHBS3V (vgl. Fig.7) bereitzustellen. Die erhaltene Streptokinasekodierungssequenz weist die nachstehend in Sequenz B angegebenen 5'-Endnucleotidsequenzen und aminoterminalen, translatierten Aminosäuresequenzen auf:
Sequenz B
Nucleotid- 5'-ATG ATT GCT GGA CCT...native Streptosequenz 3'-TAC TAA CGA CCT GGA ... kinasesecHien-
zen
Avail
Restriktionsendonuclease- Erkennungsstellen
translatierte Met He. AIa2 GIy,, Pro.. Sequenz
Die Nucleotidsequenzen (und translatierten Aminosäuresequenzen), die als Ergebnis der Verknüpfung der Sequenz A (nachstehend in Kursivschrift angegeben) an das 3'-Ende des gestutzten Streptokinasekodierungsfragmentes erhalten worden sind, sind in nachstehender Sequenz C angegeben.
Sequenz C
| Nucleotid - sequenz | 5'-GAC AAA 3·-CTG TTT | TAA CCACGGTCTT ATT C-GTGCCAGAA | GCAAGCAACA CGTTCGTTGT |
| ASp413 LyS4 | X4 Stop | CCTCTTAGTT GGAGAATCAA | |
| CTAAAACGAT GATTTTGCTA | GAGATTAACT CTCTAATTGA | GACAAAAAAA CTGTTTTTTT | TAATCGTAAC ATTAGCATTG |
| TGCTATCAAC ACGATAGTTG | AGTTGCTTGC TCAACGAACG | TTTTTTCTAA AAAAAAGATT | |
| GTAGAGACTA CATCTCTGAT | GTGACATTTC CACTGTAAAG | GTGTCTAAAA CACAGATTTT | |
| TGGTCCAGCA KCCAGGTCGT | ATCATGGAAT TAGTACCTTA | TCCCGG AGGGCCCGAT | |
Der für die Expressionsarbeit verwendete, vollständige Streptokinasekodierungsbereich, der nachstehend näher beschrieben ist, weist etwa 1 245 Nucleotide auf. Die Restriktionskarte davon ist in Fig. 6 gezeigt (vgl. das Ava Il-Fragment, das den Großteil des Streptokinasestrukturgens und einige 3'-Sequenzen und Strecken von Position 907 bis 2274 umfaßt). Dieses 1 245-Basenpaarfragment wurde vollständig sequenziert. Die Sequenz ist nachstehend als Sequenz D angegeben.
Sequenz D . .
5'-AATTCC ATG ATT GCT GGA CCT GAG TGG CTG CTA GAC CGT CCA
TCT GTC AAC AAC AGC CAA TTA GTT GTT AGC GTT GCT GGT ACT —
GTT 'GAG GGG ACG AAT CAA GAC ATT AGT CTT AAA TTT TTT GAA ATC GAT CTA ACA TCA CGA CCT GCT CAT GGA GGA AAG ACA GAG CAA GGC TTA AGT CCA AAA1 TCA AAA CCA TTT GCT ACT GAT AGT GGC GCG ATG TCA CAT AAA CTT GAG AAA GCT GAC TTA CTA AAG GCT ATT CAA GAA CAA TTG ATC GCT AAC GTC CAC AGT AAC GAC GAC TAC TTT GAG GTC ATT GAT TTT GCA AGC GAT GCA ACC ATT ACT GAT CGA AAC GGC AAG GTC TAC TTT GCT GAC AAA GAT GGT TCG GTA ACC TTG CCG ACC CAA CCT GTC CAA GAA TTT TTG CTA AGC GGA CAT GTG CGC GTT AGA CCA TAT AAA GAA AAA CCA ATA CAA AAC CAA GCG AAA TCT GTT GAT GTG GAA TAT ACT GTA CAG TTT ACT CCC TTA AAC CCT GAT GAC GAT TTC AGA CCA GGT CTC AAA GAT ACT AAG CTA TTG AAA ACA CTA GCT ATC GGT GAC ACC ATC ACA TCT CAA GAA TTA CTA GCT CAA GCA CAA AGC ATT TTA AAC AAA AAC CAC CCA GGC TAT ACG ÄTT TAT GAA CGT GAC TCC TCA ATC GTC ACT CAT GAC AAT GAC ATT TTC CGT ACG ATT TTA CCA ATG GAT CAA GAG TTT ACT TAC CGT GTT AAA AAT CGG GAA CAA GCT TAT AGG ATC AAT AAA AAA TCT GGT CTG AAT GAA GAA ATA AAC AAC ACT GAC CTG ATC TCT GAG AAA TAT TAC GTC CTT AAA AAA GGG GAA AAG CCG TAT GAT CCC TTT GAT CGC AGT CAC TTG AAA CTG TTC ACC ATC AAA TAC GTT GAT GTC GAT ACC AAC GAA TTG CTA AAA AGT GAG CAG CTC TTA ACA GCT AGC GAA CGT
- / - CSiI OHO
AAC TTA GAC TTC AGA GAT TTA TAC GAT CCT CGT GAT AAG GTC AAA CTA CTC TAC AAC AAT CTC GAT GCT TTT GGT ATT ATG GAC TAT ACC TTA ACT GGA AAA GTA GAG GAT AAT CAC GAT GAC ACC AAC CGT ATC ATA ACC GTT TAT ATG GGC AAG CGA CCC GAA GGA GAG AAT GTC AGC TAT CAT TTA GCC TAT GAT AAA GAT CGT TAT ACC GAA GAA GAA CGA GAA GTT TAC AGC TAC CTG CGT TAT ACA GGG ACA CCT ATA CCT GAT AAC CCT AAC GAC AAA TAA CCACGGT CTTCTAAAAC GATGAGATTA ACTGACAAAA AAAGCAAGCA ACATGCTATC AACAGTTGCT TGCTTTTTTC TAACCTCTTA GTTGTAGAGA CTAGTGACAT TTCGTGTCTA AAATAATCGT AACTGGTCCA GCAATCATGG-3'
Beliebige Heferegulationsbereiche sind für die Anwendung in der erfindungsgemäßen Praxis geeignet. Der Ausdruck „Regulationsbereich", wie er in dieser Beschreibung verwendet wird, soll die verschiedenen Funktionen umfassen, die für die kontrollierte Genexpression erforderlich sind, z. B. Promotorbereiche, stromaufwärts gelegene Aktivatorsequenzen, catabolitempfindliche Bereiche und dergl. Dem Fachmann sind zahlreiche Regulationsbereiche bekannt, die charakterisiert worden sind und in Verbindung mit dem vorstehend beschriebenen modifizierten Streptokinase-Kodierungsbereich verwendet werden können.
Beispiele für Heferegulationsbereiche sind die aus Saccharomyces cerevisiae isolierten Regulationsbereiche für saure Phosphatase, ß-Passfaktorund Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehyxdrogenase; die aus Pichia pastoris isolierten Regulationsbereiche für primäre Alkohol-oxidase (AOX 1) und Dihydroxyaceton-synthase (DAS1) und p40; der Pichia HIS 4-Regulationsbereich; und dergl.
Die zur Zeit in der erfindungsgemäßen Praxis bevorzugten Regulationsbereiche sind durch ihre Fähigkeit gekennzeichnet, gegenüber Medien mit einem Gehalt an folgenden Bestandteilen anzusprechen:
(1) Methanol,
(2) Nichtcatabolit-Repressionskohlenstoffquellen, z. B. Glycerin, Galactose, Acetat und dergl.,
(3) Catabolit-Repressonskohlenstoffquellen, z. B. Glucose, Äthanol, Fructose und dergl., unter anschließenden Kohlenstoffquellen-Mangelbedingungen.
Beispiele für derzeit bevorzugte Regulationsbereiche sind durch die Restrikationskarten in Fig. 1,2 und 3 dargestellt. Der in Fig. 1 dargestellte Regulationsbereich leitet sich vom primären Dihydroxyaceton-synthase (DAS 1 )-Gen von Pichia pastoris ab. Der in Fig. 2 dargestellte Regulationsbereich ist vom primären Alkohol-oxidase (AOX 1 )-Gen von Pichia pastoris abgeleitet (Pichia weist zwei Alkohol-oxidase-Gene auf, die nachstehend als AOX1 und AOX2 bezeichnet werden). Der in Fig. 3 dargestellte Regulationsbereich ist vom p40-Gen von Pichia pastoris abgeleitet. Für den Fachmann ist es ersichtlich, daß andere Regulationsbereiche mit den vorerwähnten Eigenschaften aus methylotrophen Hefen, z. B. Pichia pastoris, isoliert werden können. Derartige weiteren Regulationsbereiche, deren Regulationseigenschaften ähnlich denen der vorerwähnten Regulationsbereiche sind, kommen erfindungsgemäß ebenfalls in Betracht.
Die Verknüpfung von beliebigen der vorerwähnten Regulationsbereiche mit dem gestutzen Streptokinasegen läßt sich vom Fachmann durch Anwendung bekannter Techniken leicht erreichen. Es ist darauf hinzuweisen, daß die Kombination von Regulationsbereich-Linker (vgl. z.B. Sequenz A) — gestutzte Kodierungssequenz für den erhaltenen Baustein das notwendige ATG-Startcodon, das zur Proteinexpression erforderlich ist, bereitstellt, sowie die zehn Nucleotide, die beim Stutzen des „vollständigen" Streptokinasegens entfernt wurden, wie vorstehend beschrieben.
Die Regulationsbereich-Strukturgen-Bausteine der Erfindung können den Organismen zur Amplifikation, Reproduktion und Expression auf einer Reihe von Wegen zugeführt werden. Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß das anfängliche Ligationsprodukt direkt in einen Hefewirt zur Amplifikation und Selektion transformiert werden kann. Somit bevorzugen wir anstelle einer vorherigen Transformation des anfänglichen Ligationsgemisches in einen E.coli-Wirt zur Amplifikation und Selektion die direkte Transformation in einen Hefewirt.
Hefetransformanten, die die gewünschten, für Streptokinase kodierenden Bausteine enthalten, können durch Anwendung des geeigneten Selektionsdruckes auf das Gemisch der Hefekultur, das sich bei der anfänglichen Hefetransformation ergibt, ausgewählt werden. Plasmid-DNA kann sodann aus den ausgewählten Hefetransformanten gewonnen und zur Transformation von E. coli verwendet werden, worauf geeignete Tests durchgeführt werden, um die Anwesenheit von für Streptokinase kodierenden Sequenzen in den ausgewählten Transformanten nachzuweisen. (Die angewandten Tests sind in Beispiel X beschrieben).
Für die autonome Replikation der Genbausteine in Hefe ist es wertvoll, ein autonomes Replikationssequenz (ARS)-Element als Teil der transformierenden DNA zu verwenden. Beispiele hierfür sind PARS 1 und PARS 2, die aus Pichia pastoris abgeleitet sind, wie in Fig.4 bzw. 5 gezeigt.
Sofern statt dessen eine integrative Transformation des Wirtes erwünscht ist, wird kein ARS-Element verwendet. Eine bevorzugte Methode zur Erzielung der integrativen Transformation umfaßt die Anwendung eines stellengerichteten Ingetrationsvektors, der folgende Bestandteile enthält:
Ein erstes insertierbares DNA-Fragment,
einen für Streptokinase kodierenden Bereich, der frei von bakteriellen Signalsequenzen ist, wie vorstehend beschrieben, ein selektierbares Markergen und
ein zweites insertierbares DNA-Fragment. j
Das erste und das zweite insertierbare DNA-Fragment weisen jeweils eine Länge von mindestens etwa 200 Nucleotiden auf und besitzen Nucleotidsequenzen, die mit Teilen der Genom-DNA von Spezies der Gattung Pichia homolog sind. Die verschiedenen
Komponenten des integrativen Vektors werden seriell unter Bildung eines linearen Fragments von DNA angeordnet, so daß die Expressionskassette und das selektierbare Markergen sich zwischen dem 3'-Ende des ersten insertierbaren DNA-Fragmentes und dem 5'-Ende des zweiten insertierbaren DNA-Fragmentes befinden. Das erste und das zweite insertierbare DNA-Fragment sind in bezug zueinander im seriell angeordneten linearen Fragment so orientiert, wie sie im Genom von Pichia orientiert sind. Es ist notwendig, mindestens ein selektierbares Markergen in die DNA, die zur Transformation des Hefewirtes verwendet wird, einzubeziehen. Dies erleichtert die Selektion und Isolation von den Organismen, denen die transformierende DNA einverleibt worden ist. Das Markergen verleiht dem transformierten Organismus ein phänotypisches Merkmal, das der Wirt nicht aufwies, ζ. B. die wiedergewonnene Fähigkeit zur Bildung einer spezifischen Aminosäure, wenn der nichttransformierte Wirtstamm einen Defekt im Biosyntheseweg der speziellen Aminosäure aufwies.
Für den Fachmann ist es ersichtlich, daß weitere DNA-Sequenzen ebenfalls den in der erfindungsgemäßen Praxis verwendeten Vektoren einverleibt werden können, z. B. bakterielle Plasmid-DNA, Bakteriophagen-DNA und dergl. Diese Sequenzen ermöglichen die Amplifikation und Aufrechterhaltung dieser Vektoren in bakteriellen Wirten. Expression in transformierter Hefe
Die vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Plasmide finden Anwendung in Hefestämmen, die transformiert werden können. Die Regulation der Streptokinaseexpression in Hefe durch die neuen erfindungsgemäßen DNA-Bausteine kann durch Wachstum der transformierten Stämme unter geeigneten induzierenden oder nicht-induzierenden Bedingungen erreicht werden. Beispielsweise kann die Genexpression unter Verwendung der gegenwärtig bevorzugten Regulationsbereiche, die in Fig. 1, 2 und 3 dargestellt sind, erreicht werden, indem man die transformierten Organismen Kohlenstoffquellen-Mangelbedingungen unterwirft. Kohlenstoffquellen-Mangelbedingungen nach Wachstum auf verschiedenen Catabolit-Repressions- und Nichtcatabolit-Repressions-Kohlenstoffquellen induzieren die Expression des unter der Kontrolle der gegenwärtig bevorzugten erfindungsgemäßen Regulationsbereiche gehaltenen Genprodukts. Eine weitere Maßnahme, die Expression des gewünschten Genprodukts in einer geeigneten Spezies von transformierter Hefe zu erzielen, besteht in der Züchtung von transformierten Hefen auf Methanol. Eine weitere Maßnahme zur Induktion der Expression des gewünschten Genprodukts besteht in der Züchtung von transformierter Hefe auf Medien, die Nichtcatabolit-Repressions-Kohlenstoffquellen enthalten.
Die derzeit bevorzugten Regulationsbereiche der Erfindung eignen sich zur Expression in sämtlichen Hefestämmen, da es sich gezeigt hat, daß diese Regulationsbereiche unter verschiedenen Bedingungen induziert werden. Somit können die zum Wachstum auf Methanol oder Nichtcatabolit-Repressions-Kohlenstoffquellen fähigen Hefen zur direkten Bildung von Streptokinase veranlaßt werden, während zum Wachstum auf Catabolit-Repressions-Kohlenstoffquellen fähige Hefen zur Bildung von Spretokinase veranlaßt werden können, indem man die so gezüchteten Hefezellen Kohlenstoffquellen-Mangelbedingungen unterwirft.
Zu den transformierten Hefestämmen, die zur Anwendung im erfindungsgemäßen Verfahren unter Einsatz verschiedener Regulationsbereich-Kodierungssequenzen-Bausteinen bevorzugt werden, gehören Mitglieder der Gattungen Candida, Kloeckera, Saccharmomyces, Schizosaccharomyces, Rhodotorula, Hansenula, Torulopsis, Pichia und Kluyveromyces. Hefen dieser Gattungen.werden bevorzugt, da ihre sichere Handhabung, die geeigneten Wachstumsbedingungen und dergl. festgestellt worden sind und dem Fachmann geläufig sind.
Besonders bevorzugte Hefestämme zum Einsatz bei der Herstellung von Streptokinase gemäß einer Ausführungsform der Erfindung sind die Hefestämme, die zum Wachstum auf Methanol als Kohlenstoff- und Energiequelle in der Lage sind, da derartige Wirte die gegenwärtig bevorzugten, auf Methanol ansprechenden Regulationsbereiche, die vorstehend beschrieben worden sind, gut ausnützen. Zu den Hefen, deren Fähigkeit zum Wachstum auf Methanol bekannt ist, gehören Mitglieder der Gattungen Candida, Kloeckera, Saccharomyces, Rhodotorula, Hansenula, Torulopsis und Pichia. Da die gegenwärtig bevorzugten erfindungsgemäßen Regulationsbereiche auch durch Wachstum auf Nichtcatabolit-Repressions-Kohlenstoffquellen sowie durch Kohlenstoffquellen-Mangelbedingungen induziert werden, können in der erfindungsgemäßen Praxis auch Hefestämme, die zum Wachstum auf Nichtmethanoi-Substraten, wie Glucose, Acetat, Glycerin, Äthanol, Lactose, Galactose, Fructose, Saccharose und dergl. sowie Gemische aus zwei oder mehr dieser Bestandteile, fähig sind, verwendet werden. Durch Züchtung des Wirtsorganismus auf einer geeigenten Nichtcatabolit-reprimierbaren Nichtmethanoi-Kohlenstoffquelle, z. B. Glycerin oder Galactose, oder durch Züchtung des Wirtsorganismus auf einer geeigneten, Catabolit-reprimierbaren Kohlenstoffquelle, z. B. Äthanol, Glucose und Fructose und anschließendes Einhalten von Kohlenstoffquellen-Mangelbedingungen für den Wirtsorganismus kann die Expression von Streptokinase unter der Kontrolle der gegenwärtig erfindungsgemäß bevorzugten Regulationsbereiche erreicht werden.
Ein besonders bevorzugter Hefewirtsstamm ist die Mutante Pichia pastoris GS115, bei der es sich um eine Mangelmutante in bezug auf die Fähigkeit zur Bildung von Histidin handelt. GS115 wird aufgrund des Mangels im Histidin-Stoffwechsel, der das für Histidinol-dehydrogenase kodierende Gen betrifft, als Mutante vom Genotyp his4 bezeichnet. GS115 ist von Pichia pastoris NRRL Y-11430 abgeleitet und wurde beim Northern Regional Research Center des United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, unter der Nummer NRRL Y-15851 hinterlegt. Dieser spezielle Wirt ist geeignet, da es sich um eine auxotrophe Mutante mit einem Mangel im Histidin-Stoffwechsel handelt. Die Transformation dieses Wirts mit einem Vektor, der neben anderen DNA-Sequenzen auch für die HIS4-Genfunktion kodierende Sequenzen enthält, ermöglicht die einfache Selektion der transformierten Wirte.
Ein weiterer bevorzugter Hefestamm zur Anwendung in der erfindungsgemäßen Praxis ist die Mutante Pichia pastoris GS190, bei der es sich um eine Mutante mit einem Mangel im Arginin-Stoffwechsel, der das für Argininosuccinat-Iyase kodierende Gen betrifft, handelt. GS190 ist von Pichia pastoris NRRL Y-11430 abgeleitet und wurde beim Northern Regional Research Center der United States Department of Agriculture, Peoria, llliniois, unter der Nummer NRRL Y-18014 hinterlegt.
Ein weiterer bevorzugter Wirtshefestamm ist die doppelt auxotrophe Mutante PPF1, bei der es sich um eine Mutante handelt, die einen Mangel sowohl im Histidin-als auch im Arginin-Stoffwechsel aufweist. PPF1 zeigt einen Mangel sowohl im Histidin-Stoffwechsel, der das für Histidinol-dehydrogenase kodierende Gen betrifft, als auch im Arginin-Stoffwechsel, der das für Argininosuccinat-Iyase kodierende Gen betrifft. PPF1 wurde beim Northern Regional Research Center des United States Department of Agriculture, Peoria, llliniois, unter der Nummer NRRL Y-18017 hinterlegt.
Escherichiacoli ist ebenfalls ein geeigneter Wirt für die erfindungsgemäßen Plasmide. Der Fachmann erkennt, daß zahlreiche Stämme von E.coli zur Verfügung stehen und geeignete Wirte darstellen.
Die experimentellen Verfahren zur Transformation von Pichia pastoris wurden früher beschrieben und werden nachstehend näher erläutert (Beispiel I).
Pichia pastoris kann durch enzymatische Verdauung der Zellwände unter Bildung von Sphäroplasten transformiert werden. Die Sphäroplasten werden sodann mit der transformierenden DNA vermischt und in Gegenwart von Calciumionen und Polyäthylenglykol inkubiert und anschließend im selektiven Wachstumsmedium mit Histidinmangel regeneriert. Die transformierende DNA umfaßt das HIS4-Gen, an dem es dem Wirtsstamm mangelt, so daß nur transformierte Zellen auf dem eingesetzten selektiven Wachstumsmedium überleben.
Das gewünschte Produkt, nämlich Streptokinase, wird durch Züchtung dertransformierten Zellen unter Bedingungen, bei denen der Regulationsbereich die Expression des für Streptokinase kodierenden Polypeptid-Kodierungsbereiches induziert, gebildet.
Der Fachmann ist in der Läge, auf einfache Weise die entsprechenden Züchtungsbedingungen festzulegen, ohne daß unangemessene experimentelle Tätigkeit erforderlich ist.
Nachdem das Zellwachstum und die Expression von Streptokinase in ausreichendem Maße durchgeführt worden ist, kann das Produkt gewonnen werden, indem man verschiedene, dem Fachmann geläufige Maßnahmen zur Proteingewinnung ergreift.
Ein Beispiel für entsprechende Verfahren ist das Aufbrechen der Zellen durch heftiges Vermischen mit Glasperlen unter anschließender Zentrifugation zur Bildung eines löslichen Proteinextraktes. Die isolierte, proteinhaltige Fraktion kann nach verschiedenen Methoden getestet werden, z. B. durch Plasminogen-Aktivierungstests, durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese der zellulären Proteine und durch Immunoreaktion mit Streptokinase-Antikörper. Diese Tests werden in den Beispielen näher beschrieben.
Zunächst werden allgemeine Informationen, die die gesamten Beispiele betreffen, gegeben.
Stämme
In den Beispielen wurde als Wirtshefestamm Pichia pastoris GTS115 (his 4) (NRRL Y15851 (verwendet.
Die Stämme E.coli K-12848 (F[-] metthi galtonAhsdR hsdM) und E.coli GM119 (dam dem) wurden zur Vermehrung der Plasmid-DNAs verwendet.
Plasmide
DasPlasmid pMF5istin Fig.6 dargestellt (vgl. Malkeund Ferretti, PNAS USA, Bd.81 [1984], S.3557-3561; und Malke, Roe und
Ferretti, Gene, Bd.34 [1985], S. 357-362).
Das Plasmid pTHBS3V ist in Fig.7 dargestellt. DasPlasmid pTHBS3V enthält die Sequenzen Pichia HIS4, PARS1 und 5'-AOX1, die aus dem Plasmid pSAOH 5 (das in einem E. coli-Wirt beim Northern Regional Research Center des United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-15862 erhältlich ist) erhalten werden können. Die 3'-AOX1-Sequenzen können aus dem Plasmid pPG4.0 (das in einem E. coli-Wirt beim USDA unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-15868 erhältlich ist) erhalten werden. Eine andere Möglichkeit besteht darin, pTHBS3Vaus pHTskc25 (erhältlich beim USDA in einem E. coli-Wirt unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-18069) durch EcoRI-Verdauung, anschließende Religation des geöffneten Vektorsohne die Streptoknasesequenzen (die in pHTskc25 als ein EcoRI-lnsert vorliegen), herzustellen.
Plasmide wurden aus E.coli unter Anwendung des Verfahrens von Birnboim und Dolby (Nucl. Acids Res., Bd. 7 [1979], S. 1513 bis
1523) isoliert. Plasmid-DNAaus Pichia pastoris wurde gemäß den Angaben von Cregg (Mol. Cell. Biol., Bd. 5 [1985], S. 3376) isoliert.
Streptokinase der Fa. Boehringer Mannheim Biochemicals wurde als Standard verwendet. Humanserum-Plasminogen wurde von Calbiochem. erhalten. Restriktionsendonucleasen stammten von New England Biolabs. Acrylamid, Bisacrylamid, TEMED und Ammoniumpersulfat wurden von BioRad erhalten. T4-DNA-Ligase stammte von Promega und Polynucleotid-kinase und Kalbsdarm-Phosphatase wurden von Boehringer Mannheim Biochemicals bezogen. 125J-Protein A wurde von Amersham und Agamma-Kalbsserum von Gibco erhalten.
Kaninchen-Antiseren gegen gereinigtes S. equisimilis H46A-Streptokinase wurden freundlicherweise von Dr. J. J. Ferretti und Dr. M. L. Dau (University of Oklahoma) zur Verfügung gestellt.
Medien *
E.coli wurde in LB-Medium mit 1C^g/ml Tetracyclin oder 50pg/ml Ampicillin gezüchtet.
Pichia pastoris-Schüttelkolbenkulturen wurdenin IM3-Medien mit YTM4-Spurenmineralien gezüchtet. Als Kohlenstoffquellen dienten 2,0% Glucose, 1,0% Glycerin oder 0,5% Methanol.
Die in den Beispielen verwendeten Puffer und Lösungen haben die nachstehend angegebenen Zusammensetzungen:
\ 1 m Tris-Puffer: 121,1 g Tris-Base in 800 ml H2O; Einstellen des pH-Werts auf den gewünschten Wert durch Zugabe von konzentrierter (35%) wäßriger HCI; Abkühlen der Lösung auf Raumtemperatur vor der endgültigen Einstellung
des pH-Werts und Verdünnen auf ein Endvolumen von 1 Liter. TE-Puffer: 1,0 millimolar EDTA in 0,01 m (pH-Wert 7,4) Tris-Puffer.
PBS (phoshatgepufferte Kochsalzlösung): 10 millimolar Natriumphosphat (pH-Wert 7,0), 0,15mNaCI. SDS-Gel-Beschickungspuffer: 62,5 millimolar Tris-HCKpH-Wert 6,8), 2% SDS, 10% Glycerin, 100 millimolar Dithiothreit, 0,001 Prozent Bromphenolblau.
YPD-Medium: 1 % Bacto-Hefeextrakt, 2% Bacto-Pepton, 2% Dextrose.
SD-Medium: 6,75g Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren (DIFCO), 2 Prozent Dextrose in 1 Liter Wasser. SED: 1 m Sorbit, 25 millimolar EDTA, 50 millimolar DTT.
SCE-Puffer: 9,1 g Sorbit, 1,47g Natriumeitrat, 0,168g EDTA, 50ml H2O, pH-Wert mit HCI auf 5,8 eingestellt. CaS: 1 m Sorbit, 10 millimolar CaCI2, steril filtriert.
-10- Zb/ Ö4ö
PEG-Lösung: 20% Polyäthylenglykol-3350,10 millimolar CaCI2,10 millimolarTris-HCI (pH-Wert 7,4), steril filtriert.
SOS: 1 m Sorbit, 0,3 χ YPD-Medium, 10 millimolar CaCI2.
FM-21-Salz-Medium:
H3PO4 (85%) 3,5 ml
CaSO4-2 H2O 0,15 g
K2SO4 , 2,38 g
MgSO4-7 H2O 1,95 g
KOH 0,65 g
FeSO4-7H2O 0,065 g
CuSO4-OH2O ' 0,006 g
ZnSO4-7 H2O 0,020 g
MnSO4-H2O 0,003 g
Biotin 0,000041 g
1 Liter Wasser IM3-Salz-Medium:
KH2PO4 15,0 g
K2HPO4 1,0 g
MgSO4-7 H2O 0,50 g
CaSO4-2 H2O 0,04 g
(NH4J2SO4 3,00 g
Biotin 0,00005 g
pH-Wert 5,4 1 Liter Wasser
YTM-4-Spurenmineralien-Konzentrat:
FeSO4-7 H2O 65,0 g '
CuSO4-5H2O 6,0 g
ZnSO4-7 H2O 20,0 g
MnSO4-H2O 3,0 g
1 LiterWasser
Zugabe von 250^l/Liter Medium Beispiel 1 Pichia pastoris-TransformationsverfaHren
1. Inokulieren einer Kolonie von Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) auf etwa 10ml YPD-Medium und 12 bis20stündige Durchführung einer Schüttelkultur bei 30°C.
2. Nach etwa 12 bis 20 Stunden Verdünnen der Zellen auf einen OD60o-Wert von etwa 0,01 bis 0,1 und etwa 6- bis8stündiges Belassen der Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase in YPD-Medium bei30°C.
3. Nach etwa 6 bis 8 Stunden Inokulieren von 100 ml YPD-Medium mit 0,5 ml der Anzuchtkultur mit einem OD60o-Wert von etwa 0,1 (oder eine äquivalente Menge). Etwa 12 bis 20 Stunden schütteln bei 300C.
4. Ernten der Kultur, wenn der OD60o-Wert etwa 0,2 bis 0,3 beträgt (nach etwa 16 bis 20 Stunden) durch 5-minütiges Zentrifugieren bei 1 500g.
B. Herstellung von Sphäroplasten
1. Einmaliges Waschen der Zellen in 10ml sterilem Wasser. (Sämtliche Zentrifugationsvorgänge in den Stufen 1 bis 5 werden Minuten bei 1 500g durchgeführt).
2. Einmaliges Waschen der Zellen in TOmlfrisch hergestelltem SED.
3. Einmaliges Waschen der Zellen in 10ml sterilem 1 m Sorbit.
4. Resuspendieren der Zellen in 10 ml SCE-Puffer.
5. Zugabe von 10μΙ 3 mg/ml Zymolase 60000 (Miles Laboratories). Etwa lOminütiges Inkubieren der Zellen bei 3O0C.
6. Einmaliges Waschen der Sphäroplasten in 10ml sterilem 1 m Sorbit durch 5- bis lOminütiges Zentrifugieren bei 1000g. (Die Zeit und Geschwindigkeit der Zentrifugation können variieren. Das Zentrifugieren reicht zur Pelletisierung der Sphäroplasten aus, führt jedoch nicht zum Aufbrechen derselben).
7. Einmaliges Waschen der Zellen in 10ml sterilem CaS.
8. Resuspendieren der Zellen in insgesamt 3,5 ml CaS.
C. Transformation
1. Zugeben der DNA-Proben (bis zu 20μΙ Volumen) zu 12 x 75mm sterilen Polypropylenröhrchen. (Die DNA soll sich in Wasser oder TE-Puffer befinden. Für maximale Transformationsfrequenzen mit geringen Mengen an DNA ist es ratsam, etwa 1 μΙ an 5 mg/ml mit Ultraschall behandelter E. coli-DNA zu jeder Probe zu geben).
2. Zugeben von 100μΙ Sphäroplasten zu jeder DNA-Probe und etwa 20minütiges Inkubieren bei Raumtemperatur.
3. Zugeben von 1 ml PEG-Lösung zu jeder Probe und etwa 15minütiges Inkubieren bei Raumtemperatur.
D. Regeneration von Sphäroplasten
1. Ansatz des Regenerationsagarmediums
a) Agar-KCI-9g Bacto-Agar, 13,4g KCI, 240 ml H2O, Autoklavisieren.
b) 10x Glucose, 20g Dextrose, 100ml H2O, Autoklavisieren.
c) 10x SC-6,75g Hefe-Stickstöffbase ohne Aminosäuren, 100 ml H2O, Autoklavisieren. (Zugeben von beliebigen gewünschten Aminosäuren oder Nucleinsäuren bis zu einer Konzentration von 200μg/ml vor oder nach dem Autoklavisieren).
sd) Zugeben von 30ml 10x Glucose und 30 ml 10x SC zu 300 ml geschmolzener Agar-KCI-Lösung. Zugeben von 0,6ml 0,2mg/ml Biotin und beliebigen gewünschten Aminosäuren oder Nucleinsäuren bis zu einer Konzentration von 20^g/ ml. Belassen des geschmolzenen Regenerationsagars bei 55 bis 600C.
2. Ausstreichen von Transformationsproben
Gießen einer Bodenagarschicht von 10mi Regenerationsagar pro Platte, mindestens 30 Minuten vor Fertigstellung der Transformationsproben. Verteilen von 10 ml Aliquotanteilen Regenerationsargar auf Röhrchen in einem Wasserbad von 45 bis 500C während der Zeit, in der sich die Transformationsproben in SOS befinden. Zugeben von 50,250 oder 700 ml-Aliquotanteilen der transformierten Probe zu 10 ml Aliquotanteilen desauf 45 bis 500C gehaltenen geschmolzenen Regenerationsagars und Gießen auf die Platten mit einem Gehaltan 10ml Bodenagarschicht aus Regenerationsagar.
3. 3- bis 5tägiges Inkubieren der Platten bei 300C.
Beispiel Il Transformation von E.coli
Das Verfahren von Hanahan (J. Mol. Biol., Bd. 166 [1983], S. 557) wurde zur Transformation von sämtlichen E.coli-Stämmen angewandt.
Beispiel III Synthetischer Linker
Ein synthetischer Linker wurde zum Insertieren eines Streptokinasestrukturgens — ohne dessen Signalpeptidsequenz — in eine Reihe von Expressionsvektoren konstruiert. Der Linker wurde in Form von zwei komplementären Strängen synthetisiert, für die die Sequenzen in Sequenz A gezeigt sind. Die lyophilisierten Oligomeren wurden in sterilem 10 millimolarem Tris mit einem Gehalt an 1 millimolar EDTA suspendiert. Gleiche molare Volumina wurden vermischt und auf 900C erwärmt, wonach sich ein langsames Abkühlen auf Raumtemperatur zum Verschweißen der komplementären Stränge anschloßs. Der doppelsträngige Linker weist eine BMamHI-Stelle an seinem 5'-Ende und eine Avall-Stelle an seinem 3'-Ende auf.
Die zur Insertion des Streptokinasestrukturgens minus den Signalpeptid-Kodierungsbereich in die EcoR I-Stelle des Expressionsvektors pTHBS3 V sind in diesem Beispiel beschrieben. Plasid pMF5 (vgl. Fig. 6) wurde in E. coli-GM 119 vermehrt, so daß die gereinigte Plasmid DNA mit Avail, das gegenüber Methylierung empfindlich ist, verdaut wurde. Das 1370 bp-Avall-Fragment aus pMF5 wurde durch präparative Gelelektrophorese und Elektroelution in Dialyseschläuchen gewonnen. Dieses Ava Il-Fragment enthält die Kodierungssequenz für sämtliche Aminosäuren — ausgenommen die ersten vier Aminosäuren — des reifen Streptokinaseproteins und des Signalpeptids (26 Aminosäuren). Ein ATG-Initiationscodon und die kodierende Sequenz für die deletierten ersten vier Aminosäuren des reifen Proteins wurden durch den synthetischen Linker ersetzt. Das Ava Il-Fragment wurde mit überschüssiger Linker-DNA verknüpft, mit Phenol/Chloroform extrahiert und mitÄthanol gefällt. Die verknüpfte DNA wurde in Restriktionspuffer resuspendiert und mit EcoR I für die anschließende Insertion in die EcoR I-Stelle von pTHBS 3 V verdaut. Der Vektor war vorher an seiner einzigen EcoR I-Stelle für die anschließende Ligation mit dem EcoR I-gespaltenen Ava Il-Linker (Sequenz A)-Fragment gespalten worden. Der Vektor wurde nach Verdauung mit EcoR I mit Kälberdarm-Phospatase (CIP) behandelt, um die Frequenz der Selbstligation zu verringern. Das verknüpfte DNA-Gemisch wurde zur direkten Transformation von Pichia pastoris Stamm GTS115 verwendet.
Pichia pastoris GTS115-Zellen, die mit dem gemäß Beispiel IV hergestellten Streptokinase-pTHBS3V-Ligationsgemisch transformiert worden waren, wurden dem Screening auf Histidin-Prototrophie unterworfen. 50 His+-Transformanten wurden willkürlich für die Plasmidisolierung ausgewählt. Einer der Clone enthielt ein Plasmid der erwarteten Größe (9,6kb) (Fig. 8), während ein weiterer Clon, der das selbstverknüpfte pTHBS3 V-Plasmid enthielt, in den anschließenden Versuchen als Kontrolle mitgeführt wurde. Dieser Clon, nämlich Pichia pastoris GTS115 (pHTskc25) wurde beim Northern Regional Research Center des Unites States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, hinterlegt, um die öffentliche Zugänglichkeit nach der Patenterteilung des entsprechenden US-Patents zu gewährleisten. Dieser Stamm erhielt die Hinterlegungsnummer NRRL Y-18070. Um die Natur dieser beiden Clone zu bestätigen, wurde Plasmid-DNA aus den vorstehend beschriebenen Clonen zur Transformation von E.coli 848 verwendet.
Da heterologe Gene unter der Kontrolle des AOX1 -Promotors in gewissem Umfang in E. coli exprimiert werden, unterwarfen wir die E.coli 848-Transformanten dem Screening auf Streptokinase-Bildung. Die E.coli848 (pHTskc25)-Transformanten zeigten eine.Clearingzone beim Casein-Uberschichtungstest (vgl. Beispiel X), was die Bildung von Streptokinase durch diese Zellen anzeigt, während E.coli-Transformanten mit einem Gehaltan dem Vektor pTHBS3V nicht die Clearingzone beiderCasein-Überschichtung aufwiesen. E.coli mit einem Gehaltan dem Plasmid pHTskc25 wurde beim Northern Regional Research Center des United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, hinterlegt, um die öffentliche Zugänglichkeit nach Erteilung des entsprechenden US-Patents zu gewährleisten. Dieser Stamm erhielt die Laboratoriumsbezeichnung 848 (pHTskc25) und die Hinterlegungsnummer NRRL B-18069.
Plasmid-DNA aus E.coli848(pHTskc25) wurde durch Restriktionsendonuclease-Verdauung mit EcoR I, Pst I, Sail und Hindill untersucht. Die durch die Restriktion erhaltenen DNA-Fragmentgrößen bestätigten, daß pHTskc25 den Baustein mit der gewünschten Streptokinase darstellt, wobei das Ava Il-Fragment die synthetischen Linker in der richtigen Orientierung in bezug zum AOX 1-Promotor umfaßt.
Die Expression von Streptokinase durch GTS115 (pHTskc25) wurde in 20-ml-Schüttelkolben unter Wachstumsbedingungen untersucht, wobei dasStreptokinasegen sowohl reprimiert als auch dereprimiert wurde. GTS115(pTHBS3V) wurde bei diesen Untersuchungen als Kontrolle mitgeführt. Bei Züchtung auf Glycerin oder Glucose, wurde der AOX1 -Promotor reprimiert, während bei Kohlenstoffbeschränkung oder Wachstum auf Methanol der Alkohol-oxidase-Promotor aktiv ist. Die Wachstumsgeschwindigkeiten für beide Stämme waren im wesentlichen für alle Kohlenstoffquellen gleich, was zeigt, daß die Anwesenheit und die Expression des Streptokinasegens keinen nachweisbaren schädlichen oder hemmenden Einfluß auf das Zellwachstum besitzt. Die Menge der gebildeten Streptokinase wurde gemäß dem BAEE-Test (vgl. Beispiel X) bestimmt. Wie
erwartet, wurde bei Wachstum auf Glycerin oder Glycose keine Streptokinase gebildet. Die auf Methanol gezüchtete Kultur · bildete signifikante Konzentrationen an Streptokinase, die bei einem OD-Wert von 8,9 145 U/ml erreichten. Die Bildung pro Zelle erschien während des gesamten Zellwachstums bei einer Menge von etwa 16U/OD Zellen konstant.
Die Bildung von Streptokinase wurde in zwei kontinuierlichen Züchtungsdurchgängen untersucht. Jeder Durchgang wurde unter Verwendung eines 5 Liter-New Brunswick Scientific-Fermenters, der mit Anzeige- und Steuervorrichtufngen für die pH-Wert, gelösten Sauerstoff (DO), Rührgeschwindigkeit, Temperatur, Luftstrom und Sauerstoffstrom ausgerüstet war,
durchgeführt.
Die einzelnen kontinuierlichen Züchtungen wurden durch Zugabe von NH3-GaS zum Luftstrom bei einem pH-Wert von 5,0 gehalten. Die Temperatur wurde auf 300C eingestellt. Das Fermentervolumen betrug 2,4 bis 1,8 Liter. Die Zellausbeuten wurden
aus den Zelltrockengewichten nach dem Waschen bestimmt.
Impfansätze für die Fermenterdurchgänge wurden in 250ml-Erlenmeyerkolben mit einem Gehaltan 100 ml IM-3-Salzen und 2% (Gew./Vol.) Glycerin als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle gezüchtet. Die Fermenterkulturen wurden absatzweise mit 2% (Gew./Vol.) Glycerin-IM-3-Medien gezüchtet, bis das zur Verfügung stehende Glycerin verbraucht war. Kontinuierliche Züchtungen wurden unter Verwendung einer Zufuhr von 10% (Gew./Vol.) Glycerin-FM 21-Salzen als Nährstoffquelle durchgeführt, bis ein stationärer Zustand erreicht war. Einmal wurden Basislinien-Kontrollproben entnommen. Bei der Nährstoffzufuhr ging man von Glycerin auf 15% (Vol./Vol.) Methanol-FM 21-Salze ohne dazwischenliegende Mangelperiode über. Die einzelnen kontinuierlichen Züchtungen wurden unabhängig von der Kohlenstoffquelle in Form eines Chemostats durchgeführt, wobei die Wachstumsrate der Population durch die Verfügbarkeit der Kohlenstoffquelle begrenzt war.
Der erste Fermenterdurchlauf wurde 15,5 Stunden auf limitierendem Methanol als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle durchgeführt. 5 Proben (A bis E) wurden aus dem von der Kultur ablaufendem Produkt während der Fermentation zu
Analysenzwecken entnommen.
Die Bildung von Streptokinase bei konstantem Zellwachstum im Fermenter von 19,4g/Liter Trockengewicht der Zellen ist in
Tabelle 1 angegeben.
Beim Fermenterdurchgang von GTS115 (pHTskc25) gebildete Streptokinase
Zeit (Std.) Relativ zum MeOH-Chemostat
OD 600
Tests*
| A | -1 (Glycerin-Chemostat) |
| B, | O(MeOH-Zufuhr) |
| C | 9,5 |
| D | 14,0 (Trockengew. = 25 g/l) |
| E | 15,5 (Ende des Durchlaufs) |
| ^g Einheiten | skc/ml | |
| skc/ml | 208 | |
| 103 | 1,94 | 139 |
| 107 | 1,30 | 413 |
| 114 | 3,86 | 3 381 |
| 112 | 31,6 | 6420 |
| 104 | 60,0 | |
* Die Zellen wurden 2 Minuten in einem Aufbrechpuffer aufgebrochen (kein Triton X-100)
Die BAEE-Tests wurden an Zellen, die durch 2minütiges Bewegen der Lysis unterworfen worden waren (kein Triton X-100) durchgeführt. Beim Züchtungsendewaren nach 15,5stündiger Züchtung auf Methanol 6400 U/ml (60,0/jg/ml) Streptokinase im Kulturlysat vorhanden. Dies entspricht etwa 61 U/OD Zellen. Während der letzten 1,5stündigen Züchtungsdauer verdoppelte sich die Menge an Streptokinase pro ml, während die Zelldichte konstant blieb. Dies zeigt, daß die Züchtung zu diesem Zeitpunkt nicht vollständig induziert war und die Produktionsmengen noch nicht den stationären Zustand erreicht hatten.
Die Plasmidstabilität wurde auf der Basis der Erhaltung des His+-Phänotyps bestimmt. Zellen aus den Proben A bis E wurden mit sterilem Wasser gewaschen, verdünnt und auf IM3-Glucoseplatten entweder mit oder ohne Histidin ausgestrichen. Ferner wurden Kolonien, die in Gegenwart von Histidin gezüchtet worden waren, der Replikaplattierung auf His~-Stellen unterworfen.
Mehr als 98% der Kolonien waren Histidin-prototroph unter Beibehaltung des His4-Gens und vermutlich auch des
Streptokinasegens.
Der zweite Fermenterdurchgang wurde 255 Stunden mit limitierendem Methanol als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle durchgeführt. 11 Proben (Abis M) wurden periodisch für Analysezwecke entnommen.
Während der zweiten Züchtung von GTS115 (pHTskc25) wurde die Kultur auf 46g/Liter Trockengewicht gebracht und 10 Tage im stationären Zustand (konstante Verdünnungsgeschwindigkeit) gehalten. Für BAEE-Tests der Proben A bis M wurden die Zellen durch 2minütiges Bewegen (kein Triton X-100) aufgebrochen. Die Streptokinasebildung in /jg/ml und U/ml-Äquivalenten
während der Züchtungsdauer ist in Tabelle 2 zusammengestellt.
Probe
Zeit (Std.) im Methanol-Chemostaten
Streptokinase
| A | _o |
| B | 0 |
| C | 14 |
| D | 18 |
| E | 22 |
| H | 86,5 |
| K | 158,5 |
| M | 254,5 |
| Mg/ml | U/ml |
| 2,4 | 260 |
| 3,4 | 370 |
| 85 | 9100 |
| 110 | 11800 |
| 122 | 13100 |
| 125 | 13400 |
| 122 | 13100 |
| 142 | 15200 |
| Endkonzentration an | Streptokinase | U/ml |
| Triton X-100,% | 15200 | |
| 0 | 142 | 29300 |
| 0 | 274 | 27800 |
| 0 | 260 | 27400 |
| 0,005 | 256 | 29300 |
| 0,005 · | 274 | 26300 |
| 0,005 | 246 | 25700 |
| 0,01 | 240 | 26322 |
| 0,01 | 246 | 22700 |
| 0,02 | 212 | 21000 |
| 0,02 | 192 | |
-13- έΰ/ 040
Die Streptokinaseausbeute erhöhte sich leicht von etwa 12000 U/ml (1^g/ml) auf etwa 15000 U/ml (ΜΟμς/ιηΙ) infolge der verlängerten Züchtungszeit.
Untersuchungen wurden durchgeführt, um die Wirkung einer längeren Bewegungszeit und den Zusatz von Triton X-100 in den Lysismedien auf die Streptokinaseausbeute zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengestellt.
Bewegungszeit, min
Die Ausbeute verdoppelte sich nahezu auf etwa 29300 U/ml (274μg/ml),wenn die Zellen in Gegenwart von 0,005% Triton X-100 aufgebrochen wurden oder wenn die Bewegungsdauer auf 3 Minuten verlängert wurde. Ferner führen Steigerungen der Zeilbewegungsdauer und der Triton-Konzentration zu einer Abnahme der Streptokinaseausbeute.
Die Plasmidstabilität wurde auf die vorstehend für die Probe M beschriebene Weise bestimmt. Mehr als 98% der Zellen von Probe M waren Histidin-prototroph, was ein hohes Maß an Stabilität während der langen Züchtungsdauer anzeigt.
Pichia-Zellen wurden durch Bewegen in Gegenwart von Glasperlen unter Verwendung eines Minibead-Beaters (Biospec Products, Bartlesville, Oklahoma) aufgebrochen. Die Pichia-Zellen wurden in sterilem Wasser gewaschen und in einem gleichen Volumen an sterilem 0,2 m Tris-HCI, 0,1 % BSA, resuspendiert. Röhrchen (1,5 ml) wurden zur Hälfte mit gewaschenen Glasperlen von 0,5mm Durchmesser gefüllt und mit 1,0 ml Zellen versetzt. Die Röhrchen wurden 2 bis 4 Minuten bewegt. In einigen Fällen wurde der Aufbrechpuffer mit Triton X-100 (0,005, 0,01 oder 0,02%) versetzt.
Proteine aus den GTS115 (pHTskc25)-Fermenterdurchgang-Proben A und M wurden durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese getrennt. GTS115 (pTHBS3V)-Proteine und authentische Streptokinase wurden als Kontrollen mitgeführt. Die Ergebnisse sind nachstehend zusammengestellt. Beim nicht-eingeengten Lysatvon Probe M trat eine neue47kD-Proteinbande auf, die im Lysat aus der Pichia-Kontrollkultur, GTS115 (pTHBs3V), nicht beobachtet wurde. Dieses Protein besaß die richtige Größe für Streptokinase.
Die durch die Polyacrylamidgel-Elektrophorese abgetrennten Proteine wurden auf ihre Reaktion mit Streptokinase-Antikörper gemäß der Western Blot-Analyse untersucht. Bei der radioaktiven Abbildung ergab sich eine einzige radioaktive Bande, entsprechend einem 47 kD-Protein in der GTS115 (pHTskc25)-Proteinbahn. Es gibt keine Antikörperreaktion mit GTS115 (pTHBS3V)-Proteinen. Pichia-Streptokinase wurde von dem Antikörper gegen S. equisimilis-Streptokinase erkannt, was zeigt, daß die in diesen unterschiedlichen Wirtsorganismen gebildeten Proteine antigenmäßig ähnlich sind. Ferner gibt es keine Kreuzreaktion auf andere Pichia-Proteine mit dem Antikörper und keinen Hinweis auf abgebaute Formen von Streptokinase.
Die caseinolytische Aktivität von Plasmin, die durch Aktivierung von Plasminogen durch Streptokinase hervorgerufen wird, ermöglichte es, die einzelnen Kolonien von E.coli auf ihre Streptokinasebildung zu testen (6). Auf Kulturplatten gezüchteteZellen wurden mit etwa 10ml 1,0% Agarose in 50 miilimolar Tris-HCI, pH-Wert 8,0,150 millimolar NaCI, 0,02g/ml Milchpulver und 0,05U/ml Humanplasminogen überschichtet. Die Platten wurden bei 37°C inkubiert. Nach mindestens 2stündiger Inkubationsdauer traten bei Streptokinase bildenden Kolonien Clearingzonen aufgrund derCaseinlysisauf. Um zu zeigen, daß keine andere Proteasen das Casein verbauten, wurden Caseinüberschichtungen von E.coli 848 (pHTskc25) ohne Plasminogen in der Überschichtung durchgeführt. Eine aktive Protease würde in beiden Fällen zum Entstehen von Clearingzonen führen, während Streptokinase eine Caseinverdauung nur in Gegenwart von Plasminogen durchführen kann. Wir beobachteten in Abwesenheit von Plasminogen keinen Caseinabbau, was bestätigt, daß'die beobachteten Clearingzonen ein Ergebnis der Einwirkung von Streptokinase auf Plasminogen waren.
B. Benzoyl-L-arginin-äthylester (BAEE)-Test auf Streptokinase
Ein Test zum Nachweis von ng-Mengen an Streptokinase wurde entwickelt, bei dem die auf ihre Streptokinaseaktivitätzu analysierenden Proben mit einer vorbestimmten Menge an Humanplasminogen versetzt und anschließend 15 Minuten bei ,Raumtemperatur inkubiert wurden. Während dieser Inkubationsdauer kommt es zur Assoziation von Streptokinase mit Plasminogen unter Aktivierung zum Enzym Plasmin. Eine gegebene Mmenge an BAEE-Substrat wurde sodann zugesetzt. Dieses Substrat wird durch Plasmin hydrolysiert und führt zu einer proportionalen Zunahme der Absorption bei 253 nm. Ein Doppelstrahl-Spektrophotometer mit einem Schreiber (Perkin-Elmer Modell 559A) wurde zum Auftragen der Absorptionszunahme in bezug zum Leerwert (Probe ohne Streptokinase) verwendet. Die Änderung der optischen Dichte
pro Minute wurde gegen die Streptokinasemenge in ng (über einem Bereich von 0 bis 260 ng) unter Verwendung von Streptokinase-Standard aufgetragen. In diesem Bereich ergab sich eine lineare Beziehung. Unbekannte Proben wurden je nach Bedarf verdünnt, um OD/min-Werte zu erhalten, die innerhalb diesen linearen Bereich der Eichkurve fielen.
C. SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese
Pichia-Zellen wurden auf die vorstehend beschriebene Weise aufgebrochen. Die Zellysate wurden bis zum Aufsetzen auf Eis belassen. Trenngele (10% Acrylamid) wurden zusammen mit Stapelgelen (6% Acrylamid) zur Trennung der Proteine gemäß üblichen Verfahren angewandt. Die Gele wurden mit Coomassie-Briliantblau zur Sichtbarmachung der Proteinbanden gefärbt.
D. Westem-Blot zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von Streptokinase-Protein
Proteinextrakte wurden gemäß den vorstehenden Angaben der Elektrophorese unterworfen und unter Verwendung einer Transblot-Vorrichtung (Bio Rad-Laboratories) gemäß den Angaben dieser Firma auf Nitrocellulose übertragen. Das Westem-Blot-Verfahre η wurde folgendermaßen durchgeführt: Der Blot wurde 2 Stunden in blockierenden Puffer (20% Agamma- Kalbsserum in Puffer A, der aus 0,15 m NaCI, 50 millimolarTris bestand und den pH-Wert 7,6 aufweist) eingeweicht. Streptokinase-Antikörper wurde in 25ml Inkubationspüffer (5% Agamma-Kalbsserum in Puffer A) verdünnt, in einen frischen, verschließbaren Beutel mit dem Nitrocellulose-Blot gebracht und 2 Stunden unter mäßigem Schütteln bei 250C inkubiert. Der Blot wurde sodann in Puffer A, zweimal in Puffer A mit 0,05% Triton X-100 und wiederum einmal in Puffer A gewaschen, wobei für den Waschvorgang jeweils 200 ml verwendet wurden und die Vorgänge jeweils 10 Minuten dauerten. Der Blot wurde in einen frischen Beutel zusammen mit 20 ml Inkubationspuffer, der mit 2OpCi 125J-Protein A versetzt wurde, gebracht. Der verschlossene Beutel wurde 1,5 Stunden bei Raumtemperatur unter mehrfachem Umdrehen des Beutels zur Gewährleistung einer gleichmäßigen Bedeckung geschwenkt. Anschließend wurde auf die vorstehend beschriebene Weise gewaschen. Der Blot wurde getrocknet, in Saran eingeschlagen und mindestens 2 Stunden bei -80°C Kodak XAR-5-Film mit zwei Verstärkungsfiltern ausgesetzt. Die Nachweisgrenze betrug etwa 10ng Streptokinase-Protein.
E. Spezifische Aktivität von Streptokinase-Protein
Die tatsächliche spezifische Aktivität von Streptokinase ist ein schlecht definierter Wert, was teilweise auf die Schwierigkeiten bei der Standardisierung eines geeigneten Substrats für die enzymatische Aktivität zurückzuführen ist. Mehrere unterschiedliche Methoden werden angewandt, um die Aktivitätseinheitzu definieren. Wir haben uns für den höchsten Wert für die spezifische Aktivität, von dem in der Literatur berichtet wird, entschieden. Dieser Wert beträgt etwa 107 000 U/mg Protein (Mol. Gen. Genet., Bd.196[1984],S.36O).
Claims (19)
- - 1 - £.Ό Ι OtOErfindungsanspruch:1. Verfahren zur Herstellung von Streptokinase, gekennzeichnet dadurch, daß man einen Hefestamm der mit einem Plasmid mit folgenden Bestandteilen:ein DNA-Fragment, enthaltenda) einen Heferegulationsbereich, der zur Kontrolle der Transkription von Messenger-RNA in Hefe bei Positionierung am 5'-Ende des Polypeptid-Kodierungsbereichs in der Lage ist, undb) einen Polypeptid-Kodierungsbereich, wobei dieser Kodierungsbereich für Streptokinase oder Teile davon kodiert und frei von bakteriellen Signalsequenzen ist,bakterielle Plasmid-DNA,ein selektierbares Hefemarkergen undeine autonome Hefereplikationssequenz,transformiert worden ist, unter Bedingungen züchtet, unter denen der Regulationsbereich die Expression des für Streptokinase kodierenden Polypeptid-Kodierungsbereiches induziert.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Heferegulationsbereich aus folgender Gruppe ausgewählt ist:Pichia AOXI-Regulationsbereich,Pichia DAS 1-Regulationsbereich,Pichia-Glycerinaldehyd-S-phosphat-dehydrogenase-Regulationsbereich, Saccharomyces-saure-Phosphatase-Reguiationsbereich, Saccharomyces-a-Paßfaktor-Regulationsbereich, Saccharomyces-Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase-Regulationsbereich und Pichia p40-Regulationsbereich.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß der für Streptokinase kodierende Bereich eine Länge von etwa 1 250 Basenpaaren aufweist und durch das Ava Il-Fragment mit einem Gehaltan den Nucleotiden 907 bis 2274 in der in Fig. 6 gezeigten Restriktionskarte charakterisiert ist.
- 4. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß der für Streptokinase kodierende Bereich folgende Nucleotidsequenz aufweist:'5'-GAATTCC ATG ATT GCT GGA CCT GAG TGG CTG CTA GAC CGT CCA. TCT GTC AAC AAC AGC CAA TTA GTT GTT AGC GTT GCT GGT ACT , GTT GAG GGG ACG AAT CAA GAC ATT AGT CTT AAA TTT TTT GAA ATC GAT CTA ACA TCA CGA CCT GCT CAT GGA GGA AAG ACA GAG CAA GGC TTA AGT CCA AAA TCA AAA CCA TTT GCT ACT GAT AGT GGC GCG ATG TCA CAT AAA CTT GAG AAA GCT GAC TTA CTA AAG GTC ATT CAA GAA CAA TTG ATC GCT AAC GTC CAC AGT AAC GAC r GAC TAC TTT GAG GTC ATT GAT TTT GCA AGC GAT GCA ACC ATT ATC GAT CGA AAC GGC AAG GTC TAC TTT GTC GAC AAA GAT GGT TCG GTA ACC TTG CCG ACC CAA CCT GTC CAA GAA TTT TTG CTA AGC GGA CAT GTG CGC GTT AGA CCA TAT AAA GAA AAA CCA ATA CAA AAC CAA GCG AAA TCT GTT GAT GTG GAA TAT ACT GTA CAG TTT ACT CCC TTA AAC CCT GAT GAC GAT TTC AGA CCA GGT CTC AAA GAT ACT AAG CTA TTG AAA ACA CTA GCT ATC GGT GAC ACC ATC ACA TCT CAA GAA TTA CTA GCT CAA GCA CAA AGC ATT TTA AAC AAA AAC CAC CCA GGC TAT ACG ATT TAT GAA CGT GAC TCC TCA ATC GTC ACT CAT GAC AAT GAC ATT TTC CGT ACG ATT TTA CCA ATG GAT CAA GAG TTT ACT TAC CGT GTT AAA AAT CGG GGA CAA GCT TAT AGG ATC AAT AAA AAA TCT GGT CTG AAT GAA GAA ATA AAC AAC ACT GAC CTG ATC TCT GAG AAA TAT TAC GTC CTT AAA AAA GGG GAA AAG CCG TAT GAT CCC TTT GAT CGC AGT CACTTG AAA CTG TTC ACC ATC AAA TAC GTT GAT GTC GAT ACC AAC GAA TTG CTA AAA AGT GAG CAG CTC TTA ACA GCT AGC GAA CGT AAC TTA GAC TTC AGA GAT TTA TAC GAT CCT CGT GAT AAG GTC AAA CTA CTC TAC AAC AAT CTC GAT GTC TTT GGT ATT ATG GAC TAT ACC TAT ATC GGA AAA GTA GAG GAT AAT CAC GAT GAC ACCAAC CGT ATC ATA ACC GTT TAT ATG GGC AAG CGA CCC GAA GGA GAG AAT GTC AGC TAT CAT TTA GCC TAT GAT AAA GAT CGT TAT ACC GAA GAA GAA CGA GAA GTT TAC AGC TAC CTG CGT TAT ACA GGG ACA CCT AAT CCT GAT AAC CCT AAC GAC AAA TAA CCACGGT CTTCTAAAAC GATGAGATTA ACTGACAAAA AAAGCAAGCA ACATGCTATC AACAGTTGCT TGCTTTTTTC TAACCTCTTA GTTGTAGAGA CTAGTGACAT TTCGTGTCTA AAATAATCGT AACTGGTCCA GCAATCATGG AATTC-3'a) Entfernen der Signalpeptide aus dem aus S. equisimilis erhaltenen Streptokinase-Kodierungsbereich zur Bildung einer gestutzten Streptokinase-Kodierungssequenz,b) Verknüpfen der gestutzten Streptokinase-Kodierungssequenz mit einer synthetischen Linkersequenz, die ein ATG-Codon enthält und die die vollständige Streptokinase-Kodierungssequenz wieder herstellt, und
- 5. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das DNA-Fragment zusätzlich eine 3'-Sequenzvon DNA stromabwärts zum Polypeptid-Kodierungsbereich aufweist, wobei die 3'-Sequenz von DNA zur Kontrolle der Polyadenylierung und Termination der Transkription der Messenger-RNA, die durch den Polypeptid-Kodierungsbereich kodiert wird, in der Lage ist.
- 6. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das DNA-Fragment zusätzlich einen oder mehrere weitere DNA-Sequenzen aufweist, die sich von einem Bestandteil aus folgender Gruppe ableiten:Bakterielle Plasmid-DNA,
Bakteriophagen-DNA,
Hefeplasmid-DNA und
Hefechromosomen-DNA. - 7. Verfahren nach Anspruch 4, gekennzeichnet dadurch, daß die Hefechromosomen-DNA eine autonom replizierende DNA-Sequenz und ein Markergen aufweist.
- 8. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß das DNA-Fragment zusätzlich eine oder mehrere weitere DNA-Sequenzen aufweist, die sich von einem Bestandteil aus folgender Gruppe ableiten: ,Bakterielle Plasmid-DNA,Bakteriophagen-DNA,Hefeplasmid-DNA und ^ ·Hefechromosomen-DNA.
- 9. Verfahren nach Anspruch 6, gekennzeichnet dadurch, daß die Hefechromosomen-DNA eine autonom replizierende DNA-Sequenz und ein Markergen aufweist.
- 10. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das DNA-Fragment zusätzlich seriell angeordnete DNA aufweist, die folgende Bestandteile umfaßt:Ein erstes insertierbares DNA-Fragment,
ein selektierbares Markergen und
ein zweites insertierbares DNA-Fragment,wobei das erste und das zweite insertierbare DNA-Fragment jeweils eine Länge von mindestens etwa 200 Nucleotiden aufweisen und Nucleotidsequenzen besitzen, die mit Teilen der Genom-ONA von Spezies der Gattung Pichia homolog sind, wobei das DNA-Fragment, das Markergen und das DNA-Fragment von Anspruch 1 sich zwischen dem 3'-Ende des ersten insertierbaren DNA-Fragmentes und dem 5'-Ende des zweiten insertierbaren DNA-Fragmentes befinden und wobei das erste und das zweite insertierbare DNA-Fragment zueinander so orientiert sind, wie es im Genom von Pichia der Fall ist. - 11. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß es sich beim Plasmid um das Plasmid pHTskc25 handelt. '— O — CJ I
- 12. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß eine im wesentlichen reine Kultur eines Stammes der Gattung Pichia, der mit dem DNA-Fragment von Anspruch 5 transformiert ist, verwendet wird.
- 13. Verfahren nach Anspruch !,gekennzeichnet dadurch, daß eine im wesentlichen reine Kultur eines Stammes der Gattung Pichia, der mit dem DNA-Fragment nach Anspruch 8 transformiert ist, verwendet wird.
- 14. Verfahren nach Anspruch ^gekennzeichnet dadurch, daß eine im wesentlichen reine Kultur eines Stammes der Gattung Pichia, der mit dem Plasmid pHTskc25 transformiert ist, verwendet wird.
- 15. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Streptokinase isoliert und gereinigt wird.
- 16. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die zur Expression von Streptokinase in Hefe geeigneten Regulationsbereich-Streptokinase-Kodierungsbereich-Bausteine hergestellt werden durchc) Verknüpfen des Streptokinase-Kodierungsbereiches, der gemäß Stufe (b) hergestellt worden ist, mit einem Heferegulationsbereich.
- 17. Verfahren nach.Anspruch 16, gekennzeichnet dadurch, daß die Signalpeptide vom aus S. equisimilis erhaltenen Streptokinasekodierungsbereich durch Verdauung mit Ava Il entfernt werden.
- 18. Verfahren nach Anspruch 17, gekennzeichnet dadurch, daß die ATG-Startstelle für den Streptokina.se-Kodierungsbereich durch einen synthetischen Polylinker der nachstehend angegebenen Nucleotidsequenz bereitgestellt wird:1-4-4- 1 ·5'-GAT CCC GGG AAT TCC ATG ATT GCT G-31-GG CCC TTA AGG TAC TAA CGA CCT GT t T . 1BamHl | £coRI AvailSmal
- 19. Verfahren nach Anspruch 17, gekennzeichnet dadurch, daß der Heferegulationsbereich aus folgender Gruppe ausgewählt ist:Pichia AOX 1-Regulationsbereich,Pichia DHAS-Regulationsbereich,Pichia-Glycerinaldehyd-S-phosphat-dehydrogenase-Regulationsbereich, Saccharomyces-saure-Phosphatase-Regulationsbereich, Saccharomyces-a-Paßfaktor-Regulationsbereich,Saccharomyces-Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase-Regulationsbereich und Pichia p40-Regulationsbereich.
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE3688831T2 (de) | Herstellung von Hepatitis-B-Oberflächen-Antigen-(HBsAg) mittels Hefe. | |
| DE69132812T2 (de) | Pichia pastoris Säure-Phosphatase-Gen | |
| DE68929115T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von menschlichem Serumalbumin in Hefe | |
| DE69232666T2 (de) | Gene, die die proteolytische aktivitaet von pichia beeinflussen und deren verwendung | |
| DE3689411T2 (de) | Methode zur erhöten Expression von Polypeptiden in Hefe des Gattung Pichia. | |
| DE3885668T2 (de) | Kluyveromyces als Wirtsstamm. | |
| US5002876A (en) | Yeast production of human tumor necrosis factor | |
| DE69228497T2 (de) | Expression von menschlichen Serum-Albuminen in Pichia Pastoris | |
| DE69033633T2 (de) | Verfahren zur Herstellung eines Proteins mittels eines durch Mehrfachkopie-Integrierung eines Expressionsvektors tranformierten Pilzes | |
| DE69224768T2 (de) | Expression von menschlichen Serum-Albuminen in Pichia pastoris | |
| DE69325794T2 (de) | Humanes serum albumin, herstellung und verwendung | |
| DD218118A5 (de) | Verfahren zur herstellung eines hefe- oder nichthefepolypeptids | |
| DE68923123T2 (de) | Herstellung von Proteinen. | |
| DD254211A5 (de) | Verfahren zur herstellung von plypeptiden | |
| DD284047A5 (de) | Verfahren zur herstellung einer dna-sequenz, die fuer einen alkohol-oxidose-ii-regulationsbereich einer methylotrophen hefe kodiert | |
| DD276886A5 (de) | Expressin und Sekretion heterologer Proteine durch transformierte Spezies von Yarrowia Lipolytica | |
| DE69005959T2 (de) | Verfahren zur Reinigung von menschlichem Serum-Albumin. | |
| DE3854947T2 (de) | Neues Expressionssystem | |
| DE69333249T2 (de) | Neue Schimmel-Protease | |
| DE69233031T2 (de) | Hefepromotor und seine verwendung | |
| DE69034051T2 (de) | Stabil transformierte Hefezellen und ihre Verwendung zur Herstellung von Albumin | |
| DE69226028T2 (de) | Mutanter AOX2 Promotor, Mikroorganismen es enthaltend, Verfahren zur Herstellung und Produktion von heterologem Protein, das solche Mikroorganismen benutz | |
| DE68907166T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von menschlichem Lysozym. | |
| DE3878410T2 (de) | Verfahren zur erhoehung von gen-expression. | |
| DE69331434T2 (de) | Mutanter AOX2 Promotor, diesen enthaltender Vektor, transformierte Zellen und Herstellung von heterologen Proteinen |