DD263074A5 - Verfahren zur Bindung von Stickstoff in Nichtleguminosen - Google Patents
Verfahren zur Bindung von Stickstoff in NichtleguminosenInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft einen Rhizobium-Transformanten, der symbiotisch Stockstoff in Nichtleguminosen bindet und zusaetzlich einen Transkonjuganten umfasst. Der neuartige Rhizobium-Transformant kann beispielsweise symbiotisch Stickstoff in zur Familie Poaeceae gehoerenden Nichtleguminosen binden, wie Weizen, Gerste, Sorghum, Reis, Raps. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Material zur Behandlung von Samen einer Nichtleguminosenpflanze, das einen Rhizobium-Transformanten enthaelt, der symbiotisch Stickstoff in der Nichtleguminosenpflanze bindet. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Rhizobia-F2-Transkonjuganten, die symbiotisch Stickstoff in Nichtleguminosen binden.
Description
Verfahren zur Bindung von Stickstoff in !Tichtleguminosen Anwendungsgebiet- der Erfindung
Die Erfindung betrifft Rhizobia-Transformanten, die tlichtleguminosenpflanzen, deren Samen mit einem für den Rhizobia-Transformanten spezifischen Material überzogen wurden, infizieren, bei ihnen Wurzelknöllchenbildung bewirken und Stickstoff in ihnen binden. Die Nichtleguminosen mit ausgebildeten Wurzelknöllchen (noduliert) können ohne Einsatz von Stickstoffdüngemitteln gezogen v/erden. Die Pflanzen und das nach der Ernte verbleibende Stroh haben einen höheren Protein-, Trockensubstanz- und Stickstoffgehalt als ihre Gegenstücke ohne ausgebildete Wurzelknöllchen (nichtnoduliert).
Die Erfindung wird anhand spezifischer Beispiele, bei denen Rhizobia-Transkonjuganten zur WürzeIknöllchenbildung bei Gräsern (Familie Poaceas) einschließlich Weizen, Gerste, Sorghum, Reis und Brassicaceae (Familie Cruceforae) wie Raps eingesetzt werden, näher veranschaulicht. Rhizobia-Transkonjuganten, die Stickstoff in Eucalyptus (Familie Liyrtaceae) binden, werden in den Beispielen ebenfalls behandelt.
Ein wesentlicher Aspekt des Pflanzenstoffwechsels ist die nutzung von Hitraten und anderen anorganischen Stickstoffverbindungen bei der Synthese von organischen Verbindungen wie Aminosäuren, Proteinen, Chlorophyllen, Vitaminen, Hormonen und Alkaloiden, die für Wachstum und Entwicklung
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der Pflanze wichtig sind. Obgleich Pflanzen Nitrate und andere Stickstoffverbindungen aus der Erde aufnehmen, ist die Haüptstickstoffquelle der freie Distickstoff (N_) aus der Atmosphäre; jedoch muß der freie Distickstoff "als solcher gebunden und in eine Form umgewandelt werden, die von der Pflanze genutzt werden kann.
2.1. Biologische Stickstoffbindung
Die biologische Distickstoffbindung (allgemeiner als biologische Stickstoffbindung bezeichnet) ist ein komplizierter Vorgang, der die schrittweise Reduktion von freiem Stickstoff zu Ammoniak über eine Reihe Zwischenstufen umfaßt. Er wird von stxckstoffbindenden Mikroorganismen, von denen einige Gattun- gen in Symbiose mit bestimmten Gefäßpflanzen leben, bewirkt. Die wichtigste Gattung der symbiotischen stickstoffbindenden Bakterien ist Rhizobium, wovon es zahlreiche Species gibt, von denen jede einzelne in Symbiose mit einer oder mehreren nahe verwandten Leguminosenspecies lebt (z. B. Erbsen, Bohnen, Klee etc.). Folglich benötigen Leguminosen im Unterschied zu anderen Pflanzen, die nicht in der Lage sind, Stickstoff zu binden, keine Stickstoffdungeraittel zum Wachstum; vielmehr können Leguminosen den Stickstoffgehalt des Bodens anreichern. Angesichts der wirtschaftlichen Bedeutung vieler Leguminosen sind Bakterienkulturen zum Beimpfen von Leguminosensamen erhältlich; außerdem wurden Leguminosensamenuberzuge, die lebensfähige Rhizobia enthalten, offenbart (US-PS 3,499,748 und US-PS 4,149,869).
Die symbiotische Stickstoffbindung sieht folgendermaßen aus: Ein Rhizobiumbakterium, das fur einen bestimmten Leguminosenwirt spezifisch ist, infiziert die Wurzel des Leguminosenwirtes. Danach entwickelt sich an der Wurzel ein Knöllchen, in dem die Rhizobia in einem endosymbiotischen Zustand, bekannt als Bakteroiden, leben. Sie führen einzigartige Funktionen, wie die Stickstoffbindung, in engem Zusammenwirken mit dem Leguminosenwirt aus. Das Bakteroid verhält sich fast wie eine Organelle. Interessant ist, daß Rhizobia im allgemeinen keinen Stickstoff ex planta binden. Bezüglich eines Oberblicks über verschiedene Aspekte der biologischen Stickstoffbindung in Leguminosen siehe Kapitel 3, 4 und 5 in "Plant Gene Research - Genes Involved in Microbe-Plant Interactions" (Pflanzengenforschung - An Mikroben-Pflanzen-Wechselwirkungen beteiligte Gene), D.P.S. Verma, T. H. Hohn, Springer-Verlag, New York, 1984.
Infektion, Wurzelknöllchenbildung (Nodulation) und Stickstoffbindung erfordern jeweils eine komplizierte Wechselwirkung zwischen dem Rhizobium und seinem spezifischen Leguminosenwirt· Damit die anfängliche Infektion stattfindet, müssen Rhizobium und Legurainose einander "erkennen1*· Es wird angenommen, daß diese sehr spezifische Erkennung eine Wechselwirkung zwischen einem Lectin des Leguminosenwirtes (ein an den Wurzelhaaren gefundenes Glycoprotein) und Polysacchariden an der Bakterienoberfläche einschließt. Diese Wechselwirkung kann als ein sehr spezifischer."Schloß-und-Schlussel"-Mechanismus betrachtet werden, dessen Spezifizität mit einer Antikörper-Antigen-Wechselwirkung, ohne die keine Infektion erfolgen kann, verglichen worden ist. Nach der spezifischen Erkennung und der Anlagerung des Rhizobiums an die Wurzel eines bestimmten Leguminosenwirtes erfolgt die Infektion des Wirtes in einer nicht-pathogenen Weise, die durch die Reaktionen des Wirtes auf die eindringenden Rhizobien gesteuert wird. Im allgemeinen dringen die Rhizobien durch die Wurzelhaare in die Leguminose ein, und das Eindringen der Bakterien wird durch eine von der Wirtspflanze gebildete und Infektions faden genannte tubuläre Struktur, die in die inneren Zellen der Wurzelkortex dringt, vermittelt. Die Rhizobien werden vom Infektionsfaden freigegeben, verbleiben aber in einer vom Wirt herstammenden Membranhülle, die Peribakteroidmembran genannt wird; auf diese Weise sind die Bakteroiden auf extrazelluläre Kammern beschränkt. Eine Störung dieser komplizierten Folge von Ereignissen könnte zu einer Infektion führen, die für den Wirt pathogen wäre.
Nach der Infektion der Wirtsleguminose durch das Rhizobium erfolgt die anschließende Wurzelknöllchenbildung lediglich als Reaktion auf eine komplizierte Wechselwirkung von Ereignissen, bei der dis Leguminose die Expression von Rhizobiumgenen beeinflußt und das Rhizobium wiederum die für die Wurzelknöllchenbildung erforderliche Wirksamkeit der Leguminosengene beeinflußt. Die Zellen im Knöllchengewebe sind in Zonen mit pflanzen-spezifischen Anordnungen hoch organisiert; die Bakterien finden sich in der Regel in den Peribakteroidmembranen,
die die Bakterien aus den epidermalen und meristematischen Zonen ausschließen. Die Organisation und Morphologie des Wurzelknöllchens ist signifikant biochemisch, da Diffusionsprobleme gelöst werden müssen, um Sauerstoff- und Nährstoffeintritt für die Bakteroiden und Ammoniakaustritt für die Wirtspflanze zu gewährleisten» Ein charakteristisches Merkmal von wirksamen Wurzelknöllchen, d. h. Knöllchen, die tatsächlich Stickstoff binden, ist die Anwesenheit von Leghämoglobin, einem sauerstoffbinden Protein, das anscheinend an der Knöllchenatmung (d. h. die hohe Konzentration dieses Proteins erleichtert die Diffusion von Sauerstoff in die Bakteroidbereiche) und am Schutz von Nitrogenase (einem Hauptenzym im Stickstoffbindungsweg) vor Vergiftung durch überschüssigen Sauerstoff beteiligt ist· Leghämoglobin ist offensichtlich ein echt symbiotisches Produkt - die Globinproteine werden durch Pflanzengene codiert, und an der Hämsynthese sind die Bakterien beteiligt.
Schließlich ist die symbiotische Stickstoffbindung,- die im Knöllchen erfolgt, ein gemeinsames Unternehmen. Die Bakteroiden enthalten die Mechanismen für die Stickstoffbindung, und der Leguminosenpartner wandelt das erzeugte Ammoniak in eine organische Form um, die dann für die Ernährung der gesamten Pflanze und der Bakteroiden verwendet wird; der Leguminosenpartner schafft eine geeignete Umgebung und eine Energiequelle, die die Bakteroiden in die Lage versetzt, Stickstoff zu binden. Viel kann bei dem gesamten Prozeß fehlgehen. Wenn die VVirtspflanzenbakterien "fehlangepaßt" sind, wird die Infektion nicht erfolgreich sein. Folglich wird der ganze Prozeß der Wurzelknöllchenbildung und symbiotischen Stickstoffbindung nicht erfolgen. Außerdem bedeutet erfolgreiche Wurzelknöllchenbildung nicht, daß Stickstoffbindung zwangsläufig erfolgt, da das entstehende Knöllchen fehlerhaft sein könnte.
2.1.1. An der Symbiose beteiligte Lequminosenqene
Zwei Hauptgrupperi von Wirtsgenprodukten, Leghämoglobine und Noduline, werden während der symbiotischen Stickstoffbindung spezifisch induziert. Während Struktur und Funktion von Leg-
hämoglobin in den Wurzelknöllchen relativ klar sind, ist über die Noduline wenig bekannt. Interessanterweise berichtete ein kürzlich erschienener Artikel, daß Leghämoglobin-Pflanzen-DNS-Sequenzen in Nichtleguminosen nachweisbar seien, womit angedeutet wurde, daß die Gene für diese sauerstoffbindenden Proteine möglicherweise weiter verbreitet sind, als bisher angenommen wurde (Hattori & Johnson, 1985, Plant. Mol. Biol. 4:285-292).
2.1.2. An der Symbiose beteiligte Rhizobiumqene
Vor einigen Oahren wurde entdeckt, daß sich für die Wurzelknöllchenbildung (Nodulation) benötigte Rhizobiengene (nod) auf einem großen Plasmid (genannt Symbioseplasmid) befinden, das auch die Stickstoffbindungsgene (nif) selbst trägt. Es wurde seitdem festgestellt, daß viele der Rhizobiabakterien induziert werden könnten, einen neuen Leguminosenpartner zu erkennen, indem in jenes Rhizobium ein Symbioseplasmid von einer anderen Rhizobiumspecies mit einer anderen Wirtsspezifität übertragen wird. Es gibt keinen Hinweis darauf, daß Transfer von Rhizobiumsymbiqseplasmidenvon einem Rhizobium auf ein anderes den Wirtsbereich auf Nichtleguminosen ausdehnen könnte. Interessanterweise verleiht der Einbau eines Rhizobiumsymbioseplasmids in Aqrobacterium tumefaciens (ein Bakteriura, das Tumorwachstum bei Pflanzen, genannt Wurzelhalsgallen, verursacht) dem Aqrobacterium die Fähigkeit, Wurzelknöllchen bei Leguminosen zu erzeugen; die Knöllchen sind jedoch insofern nicht in Ordnung, als sie keinen Stickstoff binden (Hooykaas, in "Molecular Genetics of the Bacteria-Plant Interaction" (Molekulargenetik der Bakterien-Pflanzen-Wechselwirkung), A. Puhler, Hsg., Springer-Verlag, New York, 1983, S. 229-239).
Im Verlaufe der Oahre haben zahlreiche Beweise belegt, daß die Knöllchenbildungswirksamkeit in Leguminosen durch Einwirkung bestimmter Pflanzenexsudate erhöht wird. Möglicherweise stimuliert diese Einwirkung die Expression des nod-Gens. Alle Leguminosen-Wurzelexsudate rufen diese Wirkung hervor, aber
die Exsudate einer Vielzahl von Nichtleguminosen nicht.
2.1.3. Biologische Stickstoffbindung und Nichtleguminosen
Eine Nicht-Rhizobium-Bakteriengattung, genannt Frankia, lebt in Symbiose mit einigen Nichtleguminosen-Gefäßpflanzen wie Alnus (Erle), Casuarina (Streitkolbenbaum)/ Ceanothus, Eleagnus, Myrica (Immergrün) und Psychotria (eine tropische Holzpflanze). Ein Bericht, der auf von In-vitro-Vergesellschaftung eines Tabakzellen-Kultursystems und Rhizobien abgeleiteten Daten basiert, gibt an, daß einige Nichtleguminosen Faktoren erzeugen können, die von Rhizobien genutzt werden können (Gibson et al.» 1976, Planta 128: 233-239); es wurden jedoch keine spezifische Erkennung, symbiotisches Verhältnis oder spezifische Wechselwirkungen angedeutet oder beobachtet. Tatsächlich ist das einzige bekannte Beispiel einer stabilen Symbiose zwischen einer Nichtleguminosen-Samenpflanze und Rhizobium, außerhalb der Leguminosen, das von Parasponia, einer großen tropischen malayischen Familie (Ulme). Es wurde festgestellt, daß in Australien isolierte, natürlich vorkommende Rhizobiumstärame bei Parasponia Wurzelknöllchenbildung auslösen und Stickstoff binden (Trinick, 1980, New Phytol. 85: 37-45 und 86: 17-26; Trinick, 1981, Current Perspectives in Nitrogen Fixation (Gegenwärtige Perspektiven bei der Stickstoffbindung) Gibson et al., Hsg. Elsevier Press. S. 480; Trinick et al.f 1976, Arch. Microbiol. 108: 159-156; siehe auch Bender et al.; 1985, Plant Science 38: 138-140).
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Ziel der Erfindung ist es, auf einfache Weise auch in Nichtleguminosen Wurzelknöllchenbildung auszulösen und Stickstoff in ihnen zu binden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen geeigneten Rhizobium-Transformanten aufzufinden, der symbiotisch Stickstoff in Nichtlegurainosen bindet.
3. Zusammenfassung der Erfindung
Es werden Rhizobia-Transformanten beschrieben, die symbiotisch Stickstoff in Nichtleguminosen binden können. Genauer gesagt, können die erfindungsgemäßen Rhizobium-Transformanten a) die Wurzeln von Nichtleguminosenpflanzen, die von mit einem für den Rhizobium-Transformanten spezifischen Proteingemisch überzogenen Samen stammen, infizieren, b) Knöllchenbildung an den Wurzeln dieser Nichtleguminosenpflanzen hervorrufen, und c) Stickstoff in den Wurzelknöllchen binden, wodurch die Notwendigkeit der Gabe von Stickstof fdüngemitteln zur Förderung von Pflanzenwachstum und -entwicklung bei diesen Nichtleguminosen
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ausgeschaltet wird. Es wird ein Nährmedium beschrieben, das bei der Identifikation verschiedener Rhizobiaspecies und der erfindungsgemäßen Transformanten nützlich ist.
Es werden auch überzogene Samen von Nichtleguminosen beschrieben, die teilweise zur Verwirklichung der syrabiotischen Stickstoffbindung in Nichtleguminosen durch die erfindungsgemäßen Rhizobia-Transformanten beitragen. Diese Samenüberzüge enthalten Leguminosenextrakte, chromatografische Fraktionen von Leguminosenextrakten, Kristalle oder gereinigte Proteine, die für den Rhizobium-Transformanten spezifisch sind. Die Samenüberzüge können auch den Rhizobium-Transformanten selbst als Bestandteil enthalten. Es werden Methoden zur Erzeugung von Rhizobiura-Transformanten, zum Überziehen der Nichtleguminosen und zum Bewirken der Symbiose zwischen den Rhizobium-Transformanten und der Nichtleguminosen beschrieben.
3.1. Definitionen
Der Terminus "Rhizobium-Transformant" bedeutet hier ein Rhizobium, das eingebaute DNS enthält, das durch eine einer Reihe von Methoden hergestellt werden kann, die einschließen, aber nicht beschränkt sind auf: Transformation (d. h. Infektion mit Plasmid-DNS), Transfektion (d. h. Infektion mit freier DNS, Phage-DNS oder Virus-DNS) oder Konjugation (d. h. Transfer eines Replica-Plasmids von einem Bakterium auf das andere). Die von der Konjugation stammenden Transformanten sind eine Untergruppe der erfindungsgemäßen Transformanten und können spezifisch als Transkonjuganten bezeichnet werden.
Der Terminus "Eltern-Rhizobia" bedeutet hier, die Elternspecies, die konjugiert werden, um erfindungsgemäße Rhizobium-Transkonjuganten zu erzeugen, sowie die Rhizobiaspecies, von denen Plasmide oder DNS-Sequenzen isoliert und verwendet werden können, um Rhizobia zu transformieren, um die erfindungsgemäßen Rhizobium-Transformanten zu erzeugen.
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4. Kurze Beschreibung der Figuren
Fig. 1 ist ein Diagramm, das den Trockensubstanzgehalt (A) und den Stickstoffgehalt (B) von zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Pflanzen geernteten Weizenpflanzen darstellt. Es werden drei Weizengruppen dargestellt: Weizen, bei dem Wurzelknöllchenbildung durch Rhizobium-Transkonjuganten ausgelost wurde (+R-N); Weizen, der mit einem Stickstoffdüngeraittel gedüngt, aber nicht mit Rhizobium-Transkonjuganten behandelt wurde (-R+N)j und Weizen, bei dem keine Wurzelknöllchenbildung durch Rhizobium-Transkonjuganten bewirkt wurde und der auch nicht mit Stickstoffdüngemittel behandelt wurde (-R-N).
Fig. 2 ist ein Diagramm, das den Trockensubstanzgehalt (A) und den Stickstoffgehalt (B) von zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Pflanzen geernteten Gerstenpflanzen darstellt. Es werden drei Gerstengruppen dargestellt: Gerste, bei der Wurzelknöllchenbildung durch Rhizobium-Transkonjuganten ausgelöst wurde (+R-N) j Gerste, die mit einem Stickstoffdüngemittel gedüngt, aber nicht mit Rhizobium-Transkonjuganten behandelt wurde (-R+N); und Gerste, bei der keine Wurzelknöllchenbildung durch Rhizobium-Transkonjuganten erzeugt wurde und die auch nicht mit Stickstoffdüngemittel behandelt würde (-R-N).
5. Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung betrifft Rhizobia-Transformanten, die bei Nichtleguminosen Wurzelknöllchenbildung auslösen und Stickstoff binden. Die Nichtleguminosenpflanzen mit ausgebildeten Wurzelknöllchen (= nodulierte Nichtleguminosenpflanzen) können ohne Stickstoffdüngemittel angebaut werden und haben den gleichen oder einen höheren Proteingehalt, Trockensubstanzgehalt und Stickstoffgehalt als ihre Gegenstücke ohne ausgebildete Wurzel· knöllchen (nicht-nodulierte Gegenstücke), die durch Stickstoffdüngemittelgabe gedüngt wurden. Das nach der Ernte der nodulierten Nichtleguminosen verbleibende Stroh weist einen hohen Proteingehalt auf.
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Genauer gesagt, sind die erfindungsgemäßen Rhizobia-Transformanten "in der Lage, bei Nichtleguminosenpflanzen, die aus Samen gezogen wurden, der mit einem für den bestimmten Transformanten spezifischen Material überzogen worden ist, Knollchenbildung hervorrufen. Die Erfindung betrifft die Rhizobia-Transformanten,, Methoden zur Erzeugung der Rhizobia-Transformanten, das zum Überziehen der Nichtleguminosensaraen verwendete Material, die überzogenen Samen selbst, Methoden zur Auslösung der VVurzelknöllchenbildung bei den Nichtleguminosenpflanzen mit den Rhizobia-Transformanten und die entstehanden nodulierten Nichtleguminosen, die einen hohen Proteingehalt aufweisen.
Aus Gründen der Klarheit der Beschreibung wird die Erfindung in den nachstehenden Unterabschnitten in folgender Reihenfolge behandelt: a) Die Rhizobium-Transformanten; b) Die Überzüge für die Nichtleguminosensamen; c) Die Verwirklichung der symbiotischen Stickstoffbindung in den Nichtleguminosenϊ und d) Die nodulierten Nichtleguminosen.
5.1. Die Rhizobia-Transformanten
Die Erzeugung und Identifizierung der erfindungsgemäßen Rhizobia-Transformanten gründete sich auf die ursprüngliche Entdeckung, daß jede Rhizobiaspecies, wenn sie auf Nährmedium außerhalb ihres Leguminosenwirtes gezüchtet wird, eine Kolonie mit einer bestimmten Farbe erzeugt, vorausgesetzt, daß das Nährmedium zusätzlich zu den für die Unterstützung des Bakterienwachstums notwendigen Nährstoffen einen nicht-denaturierten Extrakt enthält, der von dem Leguminosenwirt abgeleitet ist, der der spezifische Partner der Rhizobiumspecies ist. Die Koloniefarbe kann als Mittel zur Identifizierung der bestimmten Rhizobiumspecies ausgenutzt werden. Tatsächlich können verschiedene Rhizobiaspecies auf einem Nährmedium gezüchtet werden, das ein Gemisch aus den nicht-denaturierten Extrakten jedes einzelnen artspezifischen Leguminosenwirtes enthält; jede Species bildet Kolonien mit einer charakteristischen Farbe.
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Die Erfindung basiert auch auf der weiteren Entdeckung, daß die Rhizobia-Transformanten, die die Nichtleguminosen infizieren, VYurzelknöllchenbildung bei ihnen bewirken und Stickstoff in ihnen binden können, schneeweiße Kolonien auf Nährmedium bilden, das Extrakte der Leguminosenwirtspartner der Eltern-Rhizobia des Transformanten enthält, und daß die. Transformant-Bakteroiden, die von dem Nichtleguminosenwurzelknöllchen isoliert und auf dem oben definierten Medium, welches zusätzlich einen Extrakt des Nichtleguminosenwirtes enthält, gezüchtet werden, Kolonien bildet, deren Farbe gräulich ist. Folglich stellen die Nährraedien ein relativ unkompliziertes Mittel zur Identifizierung der erfindungsgemäßen Transformanten zur Verfugung. Die Nährmedien werden im nachstehenden Unterabschnitt beschrieben.
5.1.1. Nährmedien zur Identifizierung von Rhizobia-Transformanten
Das Nährmedium sollte die für das Rhizobiumwachstum notwendigen Nährstoffe enthalten, d. h. einschließen, aber nicht beschränkt sein auf irgendeine der bekannten Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und Salzen sowie Vitamine der B-Gruppe und die essentiellen Aminosäuren wie L-Alanin, L-Serin und L-Tryptophan, die in Form einzelner Aminosäuren, Tripeptide oder Oligopeptide usw. vorliegen können. Der Leguminosenextraktbestandteil ist für die Identifizierung von Rhizobiaspecies nützlich, aber für die Ernährung der Rhizobia nicht erforderlich, d. h., wenn ein Rhizobium auf einem Nährmedium gezüchtet wird, das entweder nicht seinen Leguminosenwirtsextrakt enthält oder denaturierten Leguminosenwirtsextrakt enthält (z. B. denaturiert Autoklavenbehandlung der Medien nach dem Zusetzen des Leguminosenextrakts den Extrakt), entstehen Kolonien, aber die Kolonie jeder einzelnen Rhizobiumspecies wird eine eindeutige Farbe aufweisen. Nachstehende Tabelle I führt die charakteristischen Koloniefarben auf, die durch die verschiedenen Rhizobiaspecies, die auf Nährmedium mit Gehalt des Extrakts des Leguminosenwirtspartners jeder auf die Platte gestrichenen Species gezüchtet wurden, entstehen. Es ist zu beachten, daß Inkubation des in den Ausführungsbeispielen
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der Erfindung verwendeten Mediums bei einer Temperatur über 32 c durch alle auf dem Medium gezüchteten Rhizobiakolonien die Ausbildung roter Kolonien verursacht; das ist ein reversibler Farbwechsel insofern, als sich die charakteristische Farbe jeder Kolonie wieder einstellt, wenn die Temperatur abgesenkt wird, beispielsweise auf einen Wert zwischen 18 0C und 30 0C.
Außerdem kann das Nährmedium durch den Zusatz von Cystein und Phenylalanin so verändert werden, daß Kolonien mit unterschiedlichen Farbnuancen der für diese Species charakteristischen Farbe entstehen.
Koloniefarbe von verschiedenen Rhizobiaspecies, die auf Nährmedium gezüchtet wurden, das Extrakt des wirtsspezifischen Leguminosenpartners enthielt χ
Rhizobium R. cowpea
R. japonicum R. lequminosarum R. lupini R. meliloti R, phaseoli R. trifoli
Leguminose Wirtspartner Vigna (Erdnuß, Mimosa Acacia, Leucaena) Glycin (Sojabohne) Lathyrus (Erbse) Lupinus (Lupine) Melilotus (Steinklee) Phaseolus (Bohne) Trifolium (Klee)
Koloniefarbe gräulichbraun
rötlichorange goldgelb hellgelb gelblichbraun dunkelbraun hellbraun
κ ο
Kolonien werden bei einer Temperatur unter 32 C (z. 8.
zwischen 18 0C und 30 0C) auf dem in Abschnitt 6.1. ausführlicher beschriebenen Nährmedium inkubiert.
Die in dem Nährmedium verwendeten Leguminosenextrakte können aus irgendeinem Teil der Leguminosenwirtspflanze, einschließlich, aber nicht ausschließlich Trieben, Stengeln, Wurzeln oder Samen, gewonnen werden. Die Extrakte junger Triebe schei-
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nen die schnellste Farbreaktion zu ergeben. Die Leguminosenextrakte können durch Teilen der Pflanze in feine Teilchen, Homogenisieren des mazerierten Materials in Ethanol mit einem Puffer bei einem pH-Wert von etwa 7,2 und Pelletieren des unlöslichen Materials durch Zentrifugieren hergestellt werden. Die überstehende Flüssigkeit kann unter Verwendung von destilliertem Wasser dialysiert werden, bis sie klar ist, wonach sie erneut zentrifugiert werden kann. Der ganze Vorgang wird bei 4 0C durchgeführt, um die Zersetzung der pflanzlichen Substanzen zu minimieren.
Der Leguminosenextrakt kann chromatografisch nach einer Methode fraktioniert werden, die eine Modifikation der Methode von Allen et al., 1973, Biochem. J, 131: 155-162; Allen et al., Februar 1975, FEBS Letters 50(3): 362-364; Gordon et al., August 1972 FEBS Letters 24(2): 193-196; Peomans et al., 1982, Plantä 156: 568-572; und Trowbridge, 1974, 3. Biol. Chem. 249: 6004-6012, darstellt. Kurz" gesagt, umfaßt das die chromatografische Trennung des Extrakts unter Verwendung einer Säule aus von Galactose abgeleiteter CH-Sepharose 4B (Pharmacia, Schweden) und DEAE-52 (Whatman) wie folgt: a) Der Extrakt wird zunächst auf die Säule aus von Galactose abgeleiteter CH-Sepharose 4B gebracht. Nichtgebündene Substanzen werden entfernt und durch Waschen der Säule mit Puffer und Sammeln von 5-ml-Fraktionen, die spektrophotometrisch auf Extinktion bei einer Wellenlänge von 280 nm analysiert werden, ruckgewonnen. Die Wäsche wird fortgesetzt, bis im Ablauf keine signifikante Extinktion mehr festgestellt wird. Die Fraktionen, die Extinktion bei 280 nm zeigen, werden gesammelt und für Chromatografie auf DEAE-52 verwendet. Die Substanzen, die an die von Galactose abgeleitete Sepharose-4B-Schicht gebunden sind, werden durch Zusatz von 4 % Glucose zu der Säule eluiert; das EIutionsmittel wird in 5-ml-Fraktionen gesammelt, die auch auf Extinktion bei 280 nm analysiert werden, b) Die Fraktionen, welche die Substanzen enthalten, die nicht an die von der Galactose abgeleitete Sepharose 4B gebunden wurden, werden auf eine DEAE-52-Säule gebracht, die zuerst bei pH 7,2 und dann bei pH 9,2 eluiert wird; 5-ml-Fraktionen werden gesammelt und
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auf Extinktion bei 280 nm analysiert. Die Fraktionen, die bei pH 7,2 die maximale Extinktion aufweisen, werden zusammengenommen, und die Fraktionen mit einer maximalen Extinktion bei pH 9,2 werden zusammengenommen. Diese drei Fraktionen eines bestimmten Leguminosenwirtes (d. h. die Fraktion , die unter Verwendung von Glucose eluiert wurde , und die Fraktionen, die bei pH 7,2 und pH 9,2 eluiert wurden) können zusammengenommen werden und anstelle des ganzen Extrakts in dem oben beschriebenen Nährmedium verwendet werden. Tatsächlich kann die Wirkkomponente der drei Fraktionen auskristallisiert und aufbewahrt werden. Diese von dem Leguminosenwirt abgeleiteten Kristalle können anstelle des Leguminosenwirtsextrakts als Bestandteil der zum Identifizieren der Rhizobia-Transformanten der Erfindung verwendeten Nährmedien eingesetzt werden.
Es besteht zwar keine Bindung an irgendeine Theorie oder Erklärung der Erfindung, es kann aber festgestellt werden, daß die chromatografischen Fraktionen wahrscheinlich Protein, und möglicherweise Glycoproteine, enthalten. Die Affinität der abgeleiteten Sepharose 4B legt nahe,daß wahrscheinlich mindestens eines der Proteine ein Lectin ist. Das könnte signifikant sein, weil angenommen wird, daß Leguminosenlectine wichtig bei der anfänglichen Erkennung von Rhizobiumpartnern sind. Wenn die Aminosäuresequenzen dieser Proteine einmal bestimmt sind, können diese Proteine durch chemische Synthesemethoden oder mit Hilfe von Rekombinant-DNS-Techniken unter Verwendung prokaryotischer oder eukaryotischer Wirt-Vektor-Expressionssysteme zur Ausprägung der Proteine hergestellt werden. Die Expression des Proteins in einem eukaryotischen Wirt-Vektor-Expressionssystem mag bevorzugt werden, weil die Eukaryoten das Protein in einer Weise verarbeiten können, die den natürlich vorkommenden Proteinen ähnlicher ist. Das könnte besonders dann von Wichtigkeit sein, wenn das Protein ein Lectin ist. Außerdem können die identifizierten Proteine von anderen Quellen als dem Leguminosenwirt isoliert werden. Durch diese Theorie wird die Möglichkeit nicht ausgeschlossen, daß andere in dem Extrakt vorhandene Bestandteile wie Carbohydrate, Alkaloide, Hormone usw. ein signifikanter Faktor für die
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Obgleich die oben beschriebenen Nährmedien zur Identifizierung der erfindungsgemäßen Transformanten geeignet sind, erfolgte eine einleitende Charakterisierung der Transformant-DNS. Die erfindungsgemäßen Rhizobia-Transformanten, die symbiotisch Stickstoff in Nichtleguminosen binden, besitzen Plasmide, die nicht in den Eltern-Rhizobia des Transkonjuganten enthalten sind. Wenngleich keine Bindung an eine Theorie oder Erklärung der Erfindung besteht, so ist es doch interessant festzustellen, daß diese Plasmide die DNS-Sequenzen enthalten könnten, die für den neuen Wirtsbereich der Rhizobium-Transformanten verantwortlich sind.
Methoden zur Erzeugung der erfindungsgemäßen Rhizobia-Transformanten werden nachstehend ausführlicher behandelt.
5.1.2. Die Wechsellinien-Kulturmethode für die Erzeugung von Rhizobia-Transkonjuganten
Die Wechsellinien-Kulturmethode für die Erzeugung erfindungsgemäßer Rhizobia-Transkonjuganten beinhaltet folgendes: zwei unterschiedliche Rhizobiaspecies (die Elterngeneration) werden in abwechselnden Reihen auf ein festes Nährmedium gestrichen, welches zusätzlich zu den für das Bakterienwachstum wichtigen Nährstoffen enthält entweder: a) ein Gemisch nicht-denaturierter Extrakte der Leguminosenwirtspartner jeder Rhizobiaspecies; b) die drei chromatografischen Fraktionen, die aus dem Extrakt jedes einzelnen Leguminosenwirtes nach Beschreibung in Abschnitt 5.1.1. oben gewonnen wurden: c) die aus den chromatograf ischen Fraktionen jedes Leguminosenwirtes gewonnenen Kristalle; oder d) damit verwandte Proteine (einschließlich Glycoproteine). Im folgenden werden diese Komponenten als Leguminosenextrakt, chromatografische Fraktionen, Kristalle oder Proteine bezeichnete 3ede Rhizobium-Elternspecies bildet längs des Striches Kolonien mit einer charakteristischen Farbe. Rizobia-Transkonjuganten (hier Rhizobia-F -Transkonjuganten genannt) werden zwischen den abwechselnden Reihen der Elternko-
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lonien gebildet. Die Rhizobia-F -Transkonjuganten bilden im Unterschied zu ihren Eltern milchig-weiße Kolonien und können keine Wurzelknöllchenbildung an Pflanzen hervorrufen.
Die Rhizobia-F^-Transkonjuganten werden von den milchig-weißen Kolonien isoliert und in abwechselnden Reihen mit einer dritten Rhizobium-Elternspecies auf festem Nährmedium kultiviert, das zusätzlich zu den Leguminosenextrakten, chromatografischen Fraktionen, Kristallen oder Proteinen, die zur Erzeugung des F -Transkonjuganten verwendet werden, einen dritten nicht-denaturierten. Leguminosenextrakt, chromatografische Fraktionen, Kristalle oder Proteine enthält, die von dem Legtiminosenwirtspartner der dritten Rhizobium-Elternspecies abgeleitet wurden. Rhizobium-F -Transkonjuganten werden zwischen den abwechselnden Reihen der milchig-weißen Kolonien, die von dem Rhizobium-F -Transkonjuganten gebildet werden, und den von dem dritten Eltern-Rhizobium gebildeten farbigen Kolonien erzeugt. Die Rhizobium-F -Transkonjugant-Kolonien werden durch ihre schneeweiße Farbe identifiziert und sind in der Lage, Nichtleguminosen, die aus Samen gezüchtet wurden, die, wie hier beschrieben, behandelt und gesät wurden, zu infizieren, Wurzelknöllchen an ihnen zu bilden und Stickstoff in ihnen zu binden.
Die Identifizierung und Selektion der oben erzeugten Rhizobium-F -und -F -Transkonjuganten wird aufgrund der verwende-12
ten spezialisierten Medien ermöglicht .'Wenn die einzelnen Kreuzungen ausgeführt werden, entwickeln sich zwischen .den Reihen der Eltern zwei Arten von Kolonien: a) Kolonien mit einer Farbe, die eine Mischung der Farben der Elternkolonien*darstellt, und b) die milchig-weißen F -Transkonjugantenkolonien oder die schneeweißen Fo-Transkonjugantenkolonien. Die Mischfarbenkolonien enthalten Rhizobia, die nicht stabil sind; diese Rhizobia können Wurzelknollchenbildung bei den Leguminosenwirtspartnern beider Eltern-Rhizobia bewirken, allerdings nur in einer Generation. Mit anderen Worten, die von den Wurzelknöllchen jedes einzelnen Leguminosenwirtes gewonnenen Bakteroiden können nur wieder an diesem speziellen Leguminosen-
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wirt Knöllchenbildung auslösen. Die- F^Transkonjuganten der milchig-weißen Kolonien sind stabil, aber nicht in der Lage, bei irgendeiner Pflanze Knöllchenbildung auszulösen. Überraschenderweise sind die F -Transkonjuganten der schneeweißen Kolonien stabile Rhizobia, die bei Nichtleguminosen Wurzelknöllchen ausbilden und symbiotisch Stickstoff in ihnen binden können.
Die zur Erzeugung der F -Transkonjuganten verwendeten Eltern-Rhizobia können eine dritte Rhizobiaspecies, einen weiteren F -Transkonjuganten und eventuell einen weiteren F-Transkonjuganten enthalten· Wenn das dritte Elternteil einen weiteren F -Transkonjuganten umfaßt, dann enthalten die Nährmedien mindestens vier Leguminosenextrakte, chromatografische Fraktionen, Kristalle oder Proteine; d. h. diejenigen des Leguminosenwirtspartners "für jedes der zwei Eltern-Rhizobia, die zur Erzeugung jedes einzelnen der beiden F -Transkonjuganten verwendet wurden. Wenn das dritte Elternteil einen F -Transkonjuganten umfaßt, dann enthalten die Nährmedien mindestens fünf Wirtslegurainosenextrakte, chromatografische Fraktionen, Kristalle oder Proteine, d. h. diejenigen des Leguminosenwirtspartners für jedes der beiden Eltern-Rhizobia, die zur Erzeugung des F -Transkonjuganten verwendet wurden, sowie den Leguminosenwirtspartner für jedes der drei Eltern-Rhizobia, d: det wurden.
Rhizobia, die zur Erzeugung des F -Transkonjuganten verwen-
Die Methode der abwechselnden Reihen von Elternkolonien ist eine geeignete Lösung für die Erzeugung der Transkonjuganten; es kann jedoch jedes beliebige Muster oder jede beliebige Methode der Inokulation angewendet werden, um Elternkolonien so dicht beieinander zu züchten, daß Konjugation erfolgen kann. Es können also Kreise, Ellipsen, Wellen- oder Spiralmuster verwendet werden. Es kann in der Tat eine Anzahl unterschiedlicher Eltern auf die Platten gestrichen werden, um eine Anzahl unterschiedlicher Transkonjuganten auf der gleichen Platte zu erzeugen.
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5.1.3. Andere Methoden zur Erzeugung von Rhizobia-Transformanten
Die Wechsellinien-Kulturmethode ist zwar eine geeignete Methode zur Erzeugung von Rhizobiurn-F -Transformanten,. die Erfindung ist jedoch nicht auf diese Methode beschränkt. Vieiraehr wird neben der Konjugation die Transformation-mit dem geeigneten Plasmid, das für die erhöhte Wirtsbereichspezifität des Rhizobiums verantwortlich ist, als im Geltungsbereich der Erfindung befindlich angesehen. Außerdem werden Rekombinant-DNS-Techniken einschließlich der Verwendung von Phagen und anderen Vektoren für die Infektion von Rhizobia mit den geeigneten Sequenzen als zum Geltungsbereich der Erfindung gehörig betrachtet.
Zum Beispiel ist das Tn5-Transposon, das in einem Schema zur Rhizobia-Transformation verwendet werden kann, ein besonders brauchbares System fur Rhizobia. Symbioseplasmide CSym-Plasmide) können durch Hybridisierung mit einer markierten DNS-Sonde mit Gehalt an nif-Genen identifiziert werden. Transfer dieses Sym-Plasmids kann erfolgen unter Verwendung von Tn5 zum Einbau a) eines Markierungsgens in das Sym-Plasmid; beispielsweise kann ein Gen für Antibiotikaresistenz in das Sym-Plasmid unter Verwendung von Transposon Tn5 durch einen konjugierenden Spender und Empfänger-Bakterien und Hybridselektion auf der Grundlage der erworbenen Resistenz eingebaut werden; b) durch Klonierung des Sym-Plasmids oder von Teilen davon in E. coli und Transformieren von Rhizobia mit dem Plasmid selbst; c) durch Rekombinieren des Plasmids mit Transportgenen zusammen mit dem Markierungsgen (z. B. Antibiotikaresistenz) wie pvw5ai oder Tn5-Mob; und d) durch Hybridisierung der das Plasmid mit seinem eingebauten Markierungsgen enthalt tenden Bakterien mit dem Empfängerbakterium gleichzeitig mit einem Helferbakterium zur Transferförderung.
5.2. Samenüberzüge für Nichtleguminosen und überzogene Samen
Um die Symbiose zwischen den erfindungsgemäßen Rhizobia-Transformanten zu bewirken, sollten die Samen der Nichtleguminosen
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mit einem fur die Rhizobia-Transformanten spezifischen Material behandelt oder überzogen werden. Solche Oberzüge können den Rhizobiumtransformanten selbst einschließen oder ausschließen. Die Anwesenheit oder Abwesenheit des Rhizobia-Transformanten im Oberzug wirkt sich lediglich auf die Methode aus, die angewendet wird, um später Symbiose in der wachsenden Pflanze hervorzurufen«
5.2.1. Samenüberzug für Nichtlequminosen
Der Samenüberzug schließt ein, aber beschränkt sich nicht auf das folgende, das den Rhizobium-Transformanten ein- oder ausschließen kann: a) ein Gemisch von Extrakten, die von jeder der Leguminosenwirtspflanzen stammen, die ein Partner jedes Elternteils des Rhizobia-Transformanten istj b) chromatografische Fraktionen, die von jeder Leguminosenwirtspflanze stammen, die ein Partner für jedes Eltern-Rhizobium des Transformanten ist; c) Kristalle, die von dem Leguminosenextrakt und/oder seinen chromatografischen Fraktionen stammen oder d) damit verwandte Proteine. Wie vorstehend erklärt wurde, können die Proteine mit Hilfe chemischer Synthesemethoden, Rekombinant-DNS-Techniken gewonnen oder von anderen Quellen isoliert werden.
Es besteht zwar keine Bindung an irgendeine Theorie oder Erklärung der Erfindung, aber diese beschriebenen Samenüberzüge können jeden einer Reihe von Faktoren enthalten, einschließlich, aber nicht ausschließlich, Lectine, Flovone, usw., die wichtig für die Verwirklichung der Symbiose zwischen der Nichtleguminosen und dem Rhizobia-Transformanten sein können. Kurzlich wurde berichtet, daß die Expression von Rhizobium-Nodulingenen, die an der normalen Wurzelhaarkräuselung und daher an der Symbiont/Wirt-Erkennung und Wurzelknöllchenbildung (Nodulation) beteiligt sind, durch ein Leguminosenwurzelexsudat induziert worden sei (Rossen et al., 1985, EMBO 4 (13A): 3369-3373). Neulich wurde berichtet, daß eine Gruppe von Verbindungen, genannt Flavone, die von Leguminosenwurzeln abgesondert werden, Expression vo.3 Nodulationsgenen bei Rhizobium
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induzieren· (siehe Redmond et al., 1986, Nature 323: 632-635). Flavone werden normalerweise in Blüten und Blättern verschiedener Pflanzen erzeugt, nur von Leguminosen ist bekannt, daß sie Flavone, absondern oder in Wurzeln enthalten· Nach dem Bericht von Redmond et al. induzierten bestimmte Flavone im Wurzelexsudat von Erbse, Bohne, Sojabohne, Luzerne und Klee Expression des nodA-Gens in R. trifoli, was bei Wurzelexsudat von den Nichtleguminosen Mais, Reis und Parasponia nicht der Fall war. Die Stimulierung des Rhizobiums war aus symbiotischer Sicht nicht leguminosenwirtsspezifisch; d. h., die Expression von nodA wurde im Rhizobium als Reaktion auf eine Reihe unterschiedlicher Leguminosenexsudate induziert. Daher können die Flavone.eines der frühen Signale zwischen einem Rhizobium und einer Leguminose sein, wonach eine zweite, wirtsspezifischere Erkennung stattfindet (z. B. das Lectin-Polysaccharid-Erkennungssystem), um diese besondere Wirts-Symbiont-Partnerschaft herzustellen. Möglicherweise ist das Flavoninduktionssystera ein frühes Ereignis, welches den mit Leguminosenextrakten behandelten Nichtleguminosensamen gestattet, für die Infektion mit den erfindungsgemäßen F -Rhizobium-Transformanten empfänglich zu werden. Vielleicht werden die in den Leguminosenextrakten vorhandenen Flavone von den Nichtleguminosensamen während der Imbibition oder Vorkeimung aufgenommen, zur Wurzel des jungen Sämlings transportiert und ziehen, wenn sie exsudiert werden, den Rhizobium-Transformänten an.
Andere Faktoren aus den in den Samenuberzügen enthaltenen Leguminosenestrakten können bei der Verwirklichung der F -Transkonjugant-Infektion des Nichtleguminosenwirtes wichtig sein. Beispielsweise können die Samenüberzüge Lectine enthalten, von denen angenommen wird, daß sie an der spezifischen Erkennungs-Wechselwirkung zwischen Rhizobia und ihren Leguminosenwirtspartnern beteiligt sind. Ein vor kurzem erschienener Bericht beschreibt eine aus Einzelteilchen bestehende Form des Lectins, Trifolin A, das von Kleewurzelexsudaten isoliert werden kann und spezifisch an R. trifoli gebunden wird (Truchet et al«, 1986, Physiol. Plant 66: 575-582). Interessanterweise stellten Lectin enthaltende Leguminosenwurzelexsudate die Fähigkeit
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von Rhizobiamutanten wieder her, ihren Leguminosenwirt zu erkennen und Wurzelknöllchenbildung auszulösen (siehe Halverson et al., 1984, Plant Physiol. 74: 84-89 und 1985, Plant Physiol. 77: 621-625). Möglicherweise sind in den erfindungsgeraäßen Samenüberzügen ein oder mehrere Lectine enthalten, die ermöglichen, daß die spezifische Erkennung zwischen dem Rhizobia-Transformanten und seinem Nichtleguminosenpartner stattfindet.
5.2.2. Methoden zum Oberziehen der Nichtleguminosensamen
Die Nichtleguminosensamen können durch eine Vielzahl Methoden überzogen werden, einschließlich, aber nicht ausschließlich Immersion und Lufttrocknung, Besprühen, Einbettung (zum Beispiel in Polymere), Immersion und Trommeltrocknung usw. Die gewählte Methode ist von dem zu verwendenden Oberzug abhängig. Wenn der Rhizobia-Transformant zum Beispiel in das Oberzugsgemisch eingeschlossen wird, sollten Methoden oder Ingredienzien verwendet werden, die die Lebensfähigkeit der Bakterien garantieren. Dazu gehören, ohne darauf beschränkt zu sein: Oberzugsgemische, die ein Gelmaterial enthalten, um den Feuchtigkeitsgrad hoch zu halten; wahlweise können die Samen mit pulverisierten Samenhülsen überzogen werden, die Fungizide enthalten. In jedem Fall sollte die Methode so gewählt werden, daß die Wirkstoffe im Oberzug nicht denaturiert oder zerstört werden.
In den erfindungsgemäßen Beispielen wurden die Samen der Nichtleguminosen durch Eintauchen in die Leguminosenextrakte und Lufttrocknung überzogen; vorzugsweise dreimal. Zwei Immersionen ergaben eine schlechte Penetration der Rhizobia-Transformanten, während vier Immersionen die Penetration anscheinend nicht verbesserten.
5.3. Verwirklichung der syrabiotischen Stickstoffbindung in den Nichtleguminosen
Eine Reihe Methoden kann angewendet werden, um die Infektion der Nichtleguminosen durch die Rhizobia-Transformanten zu gewährleisten; die ausgewählte Methode hängt zum Teil von der
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Beschaffenheit des verwendeten Oberzugs für die Nichtleguminosensamen ab.
Beispielsweise können Nichtleguminosensamen, die gemäß der Beschreibung mit einem Überzug versehen worden sind, der den Rhizobium-Transformanten nicht enthält, mit einer Suspension des Rhizobium-Transformanten befeuchtet werden. So kann der Samen, Sämling oder die Pflanze mit einem entsprechenden Volumen der Bakteriensuspension begossen werden. Wo der Samen-Überzug Rhizobium-Transformanten enthält, sind nur Pflanzen und Gießen erforderlich.
Es kann erwünscht sein, je nach Art der Pflanze, Zustand des Bodens oder Geländes usw. nichtstickstoffhaltigen Dünger zuzusetzen. Tatsächlich wurde bei den Laborversuchen festgestellt, daß der Zusatz von 2 mM Stickstoff ganz am Anfang bei Aussaat der Samen ausreicht, um das Anfangswachstum der Pflanze zu erhöhen, ohne den Rhizobia-Transkonjuganten zu schaden oder sie "lahmzulegen1*» Das simuliert eher den natürlichen Zustand, weil die meisten Böden (selbst ungedüngte) eine gewisse Menge Stickstoff enthalten (nicht mehr als 2 mM); auf dem Feld ist die Gabe von Stickstoff nicht erforderlich. .
5.4. Die nodulierten Nichtlequminosen
Die Nichtleguminosen, die durch die erfindungsgemäßen Rhizobia-Transformanten zur Wurzelknöllchenbildung angeregt (noduliert) werden, weisen einen Stickstoff- und Trockensubstanzgehalt auf, der gleich oder größer ist als der ihrer mit Stickstoff gedüngten nicht-nodulierten Gegenstücke. Die nodulierten Pflanzen haben einen höheren Stickstoff- und Trockensubstanzgehalt als ihre ungedüngten nicht-nodulierten Gegenstücke. Analysen der Aminosäurezusammensetzungen der nodulierten Pflanzen belegten, daß in den meisten Fällen der Anteil jeder Aminosäure der gleiche bleibt, aber die Gesamtkonzentration pro Pflanze erhöht wird. In einigen Fällen wurden jedoch höhere Tryptophan- und Leucinwerte beobachtet.
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5s wurde nun interessanterweise festgestellt, daß das Stroh, das nach der Ernte einiger der nodulierten Nichtleg'uminosenspecies verbleibt, beständig einen Proteingehalt von etwa 6% bis etwa 9 % aufwies; das ist ein krasser Unterschied zu dem Proteingehalt von 1,5 % bis 2 %, der normalerweise im Stroh der nicht-nodulierten Gegenstücke festgestellt wird. Dieses Stroh mit dem hohen Proteingehalt kann vorteilhaft als Proteinquelle eingesetzt werden, zum Beispiel in Viehfuttergemischen sowohl für landwirtschaftliche Nutztiere als auch Haustiere.
Die erfindungsgemäßen Rhizobia-Transformanten, die bei Nichtleguminosen Wurzelknöllchenbildung auslösen und Stickstoff in ihnen binden, können den Einsatz kostspieliger Stickstoffdüngemittel reduzieren und schließlich den Boden verbessern.
5.4.1. VVurzelknöllchenmerkmale
Die Morphologie der durch die erfindungsgemäßen Rhizobia-Transformanten gebildeten Wurzelknöllchen an den Nichtleguminosen ist allem Anschein nach ziemlich normal im Aussehen, allerdings wird ein größerer Prozentsatz kleinerer Knöllchen gebildet. Die Rhizobia gelangen offensichtlich über Infektionsfäden in die Wurzel, und die Bakteroiden sind in Kammern enthalten. Tatsächlich wird in dem Wurzelknöllchen eine rötliche Farbe festgestellt, die auf Leghämoglobin oder ein damit engverwandtes Protein zurückzuführen sein mag. Elektronenmikroskopie der Knöllchen zeigt, daß die in der Kortex gefundenen Gefäßbündel peripher
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liegen, während die Gefäßbündel der Seitenwurzeln zentral liegen. Die meisten Zellen im mittleren Teil der Wurzelknöllchen sind mit Bakteroiden angefüllt.
Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert.
6. Beispiel: Material und Methoden für die Erzeugung von Rhizobia-Transkonjuganten und die Wurzelknöllchenbildunq bei Nichtleguminosen
Die folgenden Beispiele beschreiben die Wurzelknöllchenbildung durch erfindungsgemäße Rhizobium-Transformanten bei den folgenden zur Familie der Gräser (Poaceae) gehörenden Nichtleguminosen: Weizen, Gerste, Sorghum und Reis. Außerdem wird bei
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einem Mitglied der Brassicaceae, einer Pflanzengattung außerhalb der Familie der Gräser (d.)h. Familie Cruciferae) ebenfalls durch einen erfindungsgemäßen Rhizobium-Transformanten Wurzelknöllchenbildung ausgelöst.
Interessanterweise wurde bei einer weiteren Pflanze außerhalb der Familie der Gräser, Eucalyptus (ein Mitglied der Familie Myrtaceae) eine positive Wirkung festgestellt. Bei jedem Beispiel wurde die Wechsellinien-Kulturmethode zur Erzeugung von Rhizobium-Transkonjuganten angewendet. Die Samen der Nichtleguminosen wurden durch Immersion der Samen in Leguminosenextrakte, die für den zur Knöllchenausbildung bei den Nichtleguminosen verwendeten bestimmten Rhizobium-Transkonjuganten spezifisch waren, überzogen. Die überzogenen Nichtleguminosensamen wurden mit den Rhizobia-Transkonjuganten infiziert, indem die überzogenen Samen ausgesät wurden, man die Samen keimen ließ und die Sämlinge mit einer Suspension des Rhizobium-Transkonjuganten gegossen wurden. Innerhalb von 8 bis 12 Wochen entwickelten sich stickstoffbindende Wurzelknöllchen.
In den Beispielen wurden Laborversuche durchgeführt, bei denen die Nichtleguminosen in drei Gruppen eingeteilt wurden, die folgendermaßen behandelt wurden: a) die erste Gruppe wurde mit dem Rhizobium-Transkonjuganten ohne Stickstoffdüngemittel behandelt (+R-N); b) die zweite Gruppe wurde mit Stickstoffdüngemittel ohne den Rhizobium-Transkonjuganten behandelt (-R+N); und c) die dritte Gruppe wurde weder mit dem Rhizobium-Transkonjuganten noch mit Stickstoffdüngemittel behandelt (-R-N). Zu bestimmten Zeitpunkten während des Wachstums wurden Pflanzen als Proben entnommen, und der Gesamtgehalt an organischem Stickstoff pro Pflanze, die Menge an Trockensubstanz pro Pflanze und bei einigen Versuchen der Proteingehalt pro Pflanze und seine Aminosäurezusammensetzung wurden bestimmt. Bei einigen Beispielen wurden Feldversuche durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, daß in jedem Fall die durch die Rhizobia-Transkonjuganten zur Wurzelknöllchenbildung gebrachten Nichtleguminoseripflanzen in der Lage waren, Stickstoff zu binden und zum Wachstum kein Stickstoffdüngemittel benötigten. Vielmehr wiesen die
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nodulierten Nichtleguminosen (+R-N) in vielen Fällen einen höheren Stickstoff- und Trockensubstanzgehalt auf als die gedüngte nicht-nodulierte Gruppe (-R+N) oder die unbehandelte Gruppe (-R-N).
Sofern nicht anderes angegeben ist, wurden die nachstehend beschriebenen Materialien und Methoden in jedem der folgenden Beispiele angewendet.
6.1. Die Wechsellinien-Kulturmethode
Die in jedem der folgenden Beispiele angewendete Wechsellinien-Kulturmethode beinhaltet folgendes: zwei unterschiedliche Rhizobiaspecies (die Elterngeneration) wurden in abwechselnden Reihen (3 mm auseinander) auf ein Agar-Nährmedium gestrichen, das neben den für das Wachstum notwendigen Nährstoffen einen nicht-denaturierten Extrakt von jedem für jedes Eltern-Rhizobium spezifischen Leguminosenwirt enthielt. Nach Inkubation bei einer Wachstumstemperatur unter 32 0G, z. B. zwischen 18 0C und 30 0C, bildete jedes Eltern-Rhizobium Kolonien mit einer für diese Species charakteristischen Farbej zwischen den abwechselnden Reihen der farbigen Elternkolonien wurden Rhizobia-Transkonjuganten (F.-Transkonjuganten) erzeugt. Im Unterschied zu ihren Eltern bildeten die Rhizobia-F.-Transkonjugan«. ten milchig-weiße Kolonien und konnten keine Wurzelknöllchenbildung an Pflanzen bewirken. Es ist zu beachten, daß Inkubation bei einer Temperatur über 32 C auf dem hier verwendeten Agarmedium die Bildung roter Kolonien durch alle auf die Platte gestrichenen Rhizobiaspecies ergibt; wird jedoch die Temperatur auf einen Wert unter 32 C gesenkt (z. B. vorzugsweise zwischen 18 c und 30 C) stellt sich die charakteristische Farbe jeder Kolonie wieder ein.
Die Rhizobia-F -Transkonjuganten wurden von den milchig-weißen Kolonien isoliert und, wie beschrieben, in abwechselnden Reihen (3 mm auseinander) mit einer dritten Rhizobium-Elternspecies auf Agar-Nährmedium kultiviert, das zusätzlich zu den nicht-denaturierten Leguminosenextrakten, die zur Erzeugung
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der milchig-weißen Kolonien verwendet wurden, einen dritten nicht-denaturierten Legurainosenextrakt enthielt, der von dem für die dritte Eltern-Rhizobiumspecies spezifischen Leguminosenwirt stammte. Es wurden Rhizobia-F -Transkonjuganten zwischen den abwechselnden Reihen der milchig-weißen, von dem Rhizobium-F -Transkonjuganten gebildeten Kolonien und den farbigen, von dem dritten Eltern-Rhizobium gebildeten Kolonien erzeugt. Die Kolonien des Rhizobium-F -Transkönjuganten wurden durch ihre schneeweiße Farbe identifiziert; diese F -Transkonjuganten waren in der Lage, Nichtleguminosen^ie gemäß der Beschreibung behandelt und gepflanzt worden waren, zu infizieren, Wurzelknöllchenbildung bei ihnen auszulösen und Stickstoff in ihnen zu binden. Die zur Erzeugung der Rhizobium-Transkonjuganten verwendeten Materialien und Methoden werden nachstehend ausführlicher beschrieben.
6.1.1. Isolierung von Eltern-Rhizobia
Die als Elterngenerationen verwendeten Rhizobiaspecies wurden entweder von Bodenproben oder von Leguminosenwurzelknöllchen, die sich in einem fortgeschrittenen Entwicklungsstadium befanden, isoliert.
Die Isolierung der. Eltern-Rhizobia aus dem Boden erfolgte, indem Samen der Wirtsleguminosenpflanze, bei der durch die Rhizobia Wurzelknöllchenbildung ausgelöst wird, in die Bodenproben gelegt wurden. Die Pflanzen wurden nach 3 bis 4 Wochen (normalerweise) oder 10 bis 12 Wochen, wenn es langsamwachsende Pflanzen waren, geerntet.
Die Isolierung der Eltern-Rhizobia von den Leguminosenwurzelknöllchen erfolgte folgendermaßen: Die Knöllchen wurden zusammen mit etwa 1 cm des das Knöllchen umgebenden Wurzelgewebes von den Wurzeln abgetrennt. Das Knöllchen wurde durch Eintauchen in 3%iges HgCl sterilisiert und in 80%igem Ethanol gespült. Die Knöllchen wurden dann aus dem Wurzelgewebe herausgeschnitten und unter aseptischen Bedingungen in einem Mörser zerquetscht. Das mazerierte Material wurde auf dem unten be-
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schriebenen Agar-Nährmedium verteilt. Die Kolonien wurden durch Abimpfen auf ein Medium gleicher Zusammensetzung gereinigt, bis Einzelkolonien zweimal ausgebildet waren. Die von den gereinigten Einzelkolonien isolierten Rhizobia wurden in abwechselnden Reihen auf das beschriebene Agar-Nährmedium gestrichen, um die abwechselnden Reihen von Eltern-Rhizobia-Kolonien zu züchten.
6.1.2. Aqar-Nährmedium
Das zum Zuchten der Rhizobia in abwechselnden Linien verwendete Agarmedium wurde durch Zusetzen folgender Nährstoffe in den angegebenen Mengen zu 100 ml destilliertem Wasser hergestellt:
| KH2PO4 | 0,15 g |
| K2HPO4 | 0,15 g |
| KNO3 | 2,50 g |
| (NH ) SO | 0,135 g |
| MgSO4 . 7H2O | 0,25 g |
| Mannitol | 10,00 g |
| Aga r | 12,00 g |
| Lösung Nr. 1 | 1,00 ml |
| Hefeextrakt | 5,00 ml |
Lösung Nr. 1 hatte folgende Zusammensetzung:
| MnCl2 . | 4H2O | ml. | 500 | mg |
| H3B03 | 300 | mg | ||
| ZnSO^ . 4 | 2H2O | 200 | mg | |
| NaMoO,, | . 2H2O | 20 | mg | |
| CuSO. . 4 | 5H2O | 2 | mg | |
| CoCl2 . | 6HO | 2 | mg | |
| Destilliertes Wasser | zum Auffüllen auf ein Endvolumen | |||
| von 100 | ||||
Das oben beschriebene Agarmedium wurde dann 20 Minuten bei
2 Bar im Autoklaven behandelt und auf eine Temperatur zwischen
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55 c und 60 C abgekühlt, worauf folgendes zugesetzt wurde: je 1,0 ml von Lösung Nr. 2, Lösung Nr. 3 und Lösung Nr. 4; je 20 ml nicht-denaturierte Leguminosenpflanzenextrakte, die von der fur jede auf dem Medium zu kultivierende Eltern-Rhizobiaspecies spezifischen Vtfirtsleguminosenpflanze abgeleitet worden waren, und je 15 mg folgender Aminosäuren: L-Alanin, L-Serin und L-Tryptophan· Um das Denaturieren der Proteine in dem Leguminosenextrakt zu vermeiden, sollte die endgültige Medienzusammensetzung nicht im Autoklaven behandelt werden.
Lösung Nr. 2, Lösung Nr. 3 und Lösung Nr. 4 hatten die unten angegebenen Zusammensetzungen. CJede wurde unter Verwendung von sterilem destilliertem Wasser hergestellt.
| Losung Nr. 2: | 50 mg |
| Nicotinsäure | 50 mg |
| Thiamin-Hcl | 50 mg |
| Pyridoxin-HCl | 50 mg |
| Myoinositol | 50 mg |
| Biotin | |
Steriles destilliertes Wasser bis zu einem Endvolumen von 100 ml
| Losung Nr. 3: | Wasser | 75 | mg |
| Kaliumiodat | 100 | ml | |
| Steriles destilliertes | |||
| Lösung Nr. 4: | V/asser | 15 | gm |
| CaCl2 . H2O | 100 | ml | |
| Steriles destilliertes | 6.1.3. Lequminosenpflanzenextrakt | ||
Die im Agarmedium und zum Oberziehen der Nichtleguminosensaraen verwendeten Leguminosenpflanzenextrakte wurden, wie nachstehend beschrieben, hergestellt.
Die gesamte Pflanze oder ausgewählte Pflanzenteile, z. B.
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saubere gewaschene Wurzeln, sterilisierte Samen oder oberii— dische Teile oder, vorzugsweise, junge Triebe wurden in feine Teilchen zerteilt, in einem Mörser mit 80%igem Ethanol zu einer dönnen, homogenen Paste gemahlen, in die ein gleiches Volumen Kalium-Natriumsalzpuffer, pH 7,2, folgender Zusammensetzung gegeben wurde:
K2HPO4 0,430 g
NaH2PO4 1,469 g
NaCl 7,200 g
Steriles destilliertes Wasser bis zu einem Endvolumen von 1000 ml.
Die Mischung aus homogenisiertem Pflanzenextrakt und Puffer wurden 48 Stunden bei 4 c stehengelassen und durch 30minütiges Zentrifugieren bei ungefähr 5000 χ g pelletiert. Dann wurde die überstehende Flüssigkeit etwa 48 Stunden lang bei 4 0C unter Verwendung von sterilem Wasser dialysiert, währenddessen das Wasser 5 bis 6mal ausgetauscht wurde, bis eine klare, färb-, lose Flüssigkeit, d. h. der Extrakt, gewonnen wurde. Die Extrakte wurden bei 4 0C aufbewahrt.
6.1.4. Isolierung von Rhizobia-Transkonjuganten
Wenn die beiden Eltern-Rhizobia bei einer Temperatur unter 32 C in abwechselnden Linien (3 mm auseinander) auf dem Agarmedium, das die passenden Leguminosenextrakte, wie oben beschrieben, enthielt, kultiviert wurden, bildeten die Eltern-Rhizobia Kolonien mit einer charakteristischen Farbe aus. Zwischen den Reihen farbiger Elternkolonien entwickelten sich jedoch zwei Arten von Kolonien: a) Kolonien mit einer Farbe, die ein Gemisch der Farben der Elternkolonien darstellte und b) die milchig-weißen Kolonien des Rhizobium-F^Transkonjuganten. Das Verhältnis zwischen den farbigen Kolonien und den milchig-weißen F -Transkonjugant-Kolonien variierte etwas, aber im Durchschnitt betrug es etwa 100 : 3 (Mischfarbenkolonien: milchig-weißen Kolonien). Die Mischfarbenkolonien bildeten bei beiden Wirtsleguminosenspecies Wurzelknöllchen aus, aber nur in einer Generation; d. h. die Rhizobia der Misch-
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farbenkolonien nodulierten die Leguminosenwirtspartner beider Eltern-Rhizobia, aber die von den Wurzelknöllchen jedes einzelnen Leguminosenwirtes gewonnenen Rhizobia konnten nur wieder bei diesem bestimmten Leguminosenwirt Wurzelknöllchenbildung hervorrufen. Im Gegensatz dazu riefen die milchig-weißen F -Transkonjugant-Kolonien bei keiner Pflanze Wurzelknöllchenbildung hervor.
Da es schwierig war, eine einzelne Hybridkolonie auf ein neues Medium zu übertragen, ohne es mit einer oder mehreren farbigen Kolonien zu verunreinigen, wurden ein- oder mehrmalige biologische Reinigungen durchgeführt, indem die milchig-weißen Kolonien auf ein anderes Agarmediura (der gleichen Zusammensetzung) übertragen wurden, bis, im allgemeinen nach 10 bis 12 Wochen, eine reine Kultur des F -Transkonjuganten mit einer beständigen und gleichmäßigen milchig-weißen Farbe gewonnen wurde.
Die reine F -Transkonjugantenkultur, die die milchig-weißen Kolonien bildete, wurde dann bei einer Temperatur unter 32 0C in abwechselnden Linien (3 mm auseinander) mit einer anderen Rhizobiumspecies auf einem Agarmedium der gleichen, für den F -Transkonjuganten verwendeten Zusammensetzung kultiviert, das zusätzlich einen dritten, von dem für das dritte Eltern-Rhizobium spezifischen Leguminosenwirt abgeleiteten Leguminosenextrakt enthielt. Der F -Transkonjugant erzeugte seine charakteristischen milchig-weißen Kolonien, während das Eltern-Rhizobium Kolonien mit seiner spezifischen Farbe erzeugte. Zwei Koloniearten entwickelten sich zwischen den Linien milchig-weißer Kolonien und den farbiger Kolonien: farbige Kolonien und schneeweiße Kolonien. Die schneeweißen Kolonien enthalten die Rhizobium-Fp-Transkonjuganten, die bei Nichtleguminosen stickstoffbindende VVurzelknöllchen bilden können. Die schneeweißen F -Transkonjugantkolonien wurden gereinigt und isoliert, wie es für die milchig-weißen Kolonien beschrieben wurde, und sie wurden zur Wurzelknöllchenausbildung bei Nichtleguminosen eingesetzt.
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Nach der Wurzelknöllchenbildung bei der Nichtleguminosenpflanze können die Rhizobia-F -Transkonjugant-Bakteroiden von dem Knöllchen isoliert und in einem Agarmedium gezüchtet werden. Wenn das Agarmedium die gleiche Zusammensetzung wie das zur Erzeugung des Transkonjuganten verwendete Agarmedium aufweist (d. h., das Agarmedium enthält die drei Leguminosenextrakte, die von dem Leguminosenwirt abgeleitet wurden, der für jedes zur Erzeugung des F -Transkonjuganten verwendete Eltern-Rhizobium spezifisch ist) und dazu einen Extrakt seiner Nichtlegurainosenwirtspflanze, dann bilden die von dem Nichtleguminosenwurzelknöllchen isolierten F -Transkonjuganten Kolonien mit einer graulichen Farbe.
6.2. Vorbereitung der Nichtleguminosensamen
Samen der Nichtleguminosenpflanze wurden überzogen, indem sie dreimal bei 20 0C für je 3 Stunden in eine wäßrige Lösung getaucht wurden, die 3 % Calciumsulfat und bis zu 10 % eines Gemisches der drei, wie in Abschnitt 6.1.3. beschrieben, hergestellten Leguminosenextrakte enthielten, die zur Erzeugung des Rhizobium-F -Transkonjuganten verwendet wurden. Nach jeder Immersion wurden die Samen 12 Stunden bei 40 0C luftgetrocknet.
6.3. Infektion von Nichtleguminosen mit Rhizobia-F2-Transkonjuganten
Die Infektion von Nichtleguminosen mit Rhizobia-F -Transkonjuganten erfolgte durch Aussäen der überzogenen Nichtleguminosensamen und Gießen der gekeimten Sämlinge mit einer Suspension des Rhizobium-Fp-Transkonjuganten. Bei den folgenden Seispielen wurden Labor- und Feldversuche durchgeführt, bei denen die gekeimten Sämlinge behandelt wurden entweder a) mit dem Rhizobium-F2-Transkonjuganten ohne anorganisches Stickstoffdüngemittel (+R-N); b) mit dem anorganischen Stickstoffdüngemittel ohne den Rhizobium-F -Transkonjuganten (-R+N) oder c) weder mit dem Rhizobium-F -Transkonjuganten noch mit dem anorganischen Stickstoffdüngemittel (-R-N). Der Stickstoffgehalt pro Pflanze, die"Trockenmasse und in einigen Fällen die
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Aminosäurenzusammensetzung der entstehenden Pflanzen wurden bestimmt.
Die eingesetzten Materialien und Methoden werden nachstehend ausführlicher beschrieben.
6.3.1. Laborversuche
Bei den Laborversuchen wurden die überzogenen Nichtleguminosensamen in 1-Liter-Behälter (üydsk Papir Vaerk, Arhus) gesät, die mit 3-mm-"Fibo"(R)-Klinkermaterial gefüllt waren; 4 bis 5 Samen wurden in jeden Behälter gesät. Das "Fibo"-Klinkermaterial besteht aus luftgefüllten, gebrannten Tonkugeln (Pebbles) von etwa 3 mm Durchmesser, die normalerweise als Isolier-^ material verwendet werden.
Wenn die gekeimten Samen einige Zentimeter über die "Fibo"-Klinkermaterialoberfläche gewachsen waren, wurden die Sämlinge in jedem Behälter wie folgt gegossen: a) die +R-Nr-Gruppe wurde mit einer 50-ml-Suspension des Rhizobium-F_-Transkonjuganten gegossen; danach wurden die Pflanzen einmal wöchentlich mit 50 bis 80 ml eines nichtstickstoffhaltigen Düngemittels pro Behälter gegossen; b) die -R+N-Gruppe wurde nicht mit dem Rhizobium-F2-Transkonjuganten behandelt, sondern statt dessen mit einem anorganischen Stickstoffdüngemittel gegossen; danach wurden die Pflanzen einmal wöchentlich mit 50 bis 80 ml des gleichen anorganischen Stickstoffdüngemittels pro Behälter gegossen; und c) die -R-N-Gruppe wurde mit 50 bis 80 ml des nichtstickstoffhaltigen Düngemittels pro Behälter gegossen. Das anorganische Stickstoffdüngemittel und das nichtstickstoffhaltige Düngemittel sind nachstehend definiert.
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| NH4NO3 | 2H2O | . 7H | 4H2O | (1 | ,0 M) | P | 110,7 mg/1) |
| CaSO4 . | Na2 EDTA | (O | ,012 M) | 9,0 mg/1) | |||
| KH2 PO4 | 7H2O | Endvolumen | 7H2O | (O | ,10 M) | (11,1 mg/1) | |
| MgSO4 . | : | MnCl3 . | 5H2O | (O | ,20 M) | ||
| Fe(EDTA) | H3B03 | . 2H | |||||
| FeSO4 | ZnSO4 . | 2° | (2,490 g) | ||||
| CuSO4 . | (3,716 g) | ||||||
| Na2MoO | 1 Liter | ||||||
| ( | 106,1 mg/1) | ||||||
| (142,2 mg/1) | |||||||
| ( | |||||||
| ( |
Düngemittel ml Vorratslösunq/Liter Endvolumen
| stickstoff- haltiq | nichtstickstoff- haltiq |
| 20 | 0 |
| 65 | 65 |
| 20 | 20 |
| 15 | 15 |
10
10 10 10 10 10
10
10 10 10 10 10
Die Suspension von Rhizobia-F^Transkonjuganten, die zum Gießen der Sämlinge verwendet wurden, wurden bereitet, indem der Rhizobium-F -Transkonjugant in 300-ml-Kolben mit einem Gehalt von 200 ml des folgenden Nährmediums kultiviert wurde:
1,0 g
1,0 g
0,36 g
0,17 g
0,005 g
0,7 g
1,0 g
3,0 g
Destilliertes Wasser bis zu einem Endvolumen von 1000 ml.
| KH2PO4 | 7H | 2° |
| K2HPO4 | 2H | 2° |
| MgSO4 . | 6H | 2 |
| CaSO4 . | ||
| FeCl3 . | Hefeextrakt | |
| KNO3 | Mannitol | |
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Die Bakterien wurden zwei bis drei Tage lang bei 28 C gezüchtet, bis die spektrophotometrisch bei OD gemessene Bakteriendichte 0,8 betrug, was anzeigte, daß sich die Bakterien in der logarithmischen Wachstumsphase befanden und die Kultur noch nicht in die stationäre Phase eingetreten war. Dann wurden die Zellen durch 30minütiges Zentrifugieren bei ungefähr 5000 χ g pelletiert und durch Resuspension in sterilem Wasser gewaschen. Diese Wäsche wurdeein- oder zweimal wiederholt, um alle Stickstoffverbindungen von den Bakterienzellen zu entfernen. Das entstehende Zellenpellet wurde in 1,8 Liter sterilen Wassers erneut suspendiert. Diese fertige Bakteriensuspension wurde zum Gießen der Nichtleguminosensämlinge verwendet.
6.3.2. Feldversuche
Bei den Feldversuchen wurden die überzogenen Nichtleguminosensamen in Erde gesät, die niemals bebaut worden war. Das Land wurde gesäubert und in Streifen von 30 Fuß Breite mal 90 Fuß Länge eingeteilt. Die Samen wurden nur wechselweise in die Streifen eingesät (d. h. Streifen ohne Saat verblieben zwischen den Streifen, in die Samen gebracht worden waren), um zu verhindern, daß aus einem Streifen ausgelaugte Chemikalien in einen anderen Streifen gelangen und diesen verunreinigen konnten. Innerhalb eines Streifens wurden die Samen in sechs Reihen ausgesät; die einzelnen Reihen waren 60 Zoll voneinander entfernt, und die Samen innerhalb jeder Reihe wurden in einem Abstand von 8 Zoll gesät.
Deder Streifen enthielt eine der folgenden Gruppen: a) die +R-N-Gruppe, die mit dem Rhizobium-F -Transkonjuganten behandelt und mit dem oben definierten nichtstickstoffhaltigen Düngemittel gegossen worden war, b) die -R+N-Gruppe, die nicht mit dem Rhizobium-F2-Transkonjuganten behandelt, sondern statt dessen mit dem oben definierten anorganischen Stickstoffdüngemittel gegossen worden war; und c) die -R-N-Gruppe, die weder mit dem Rhizobium-F -Transkonjuganten noch mit dem anorganischen Düngemittel behandelt, sondern statt dessen mit dem nichtstickstoffhaltigen Düngemittel gegossen worden war.
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Das folgende Verfahren wurde angewendet, um die +R-N-Gruppe mit dem Rhizobium-F -Transkonjuganten zu infizieren: eine Kultur des Rhizobium-F -Transkonjuganten wurde 4 Zoll unter jeden ausgesäten Samen geimpft. Säen und Beimpfen des Bodens wurden mit einer Maschine durchgeführt, die einen 300-Gallonen-Tank hatte, der eine Suspension des Rhizobia-F -Transkonjuganten enthielt, die gemäß vorhergehender Beschreibung, aber in einem viel größeren Maßstab hergestellt worden war (d. h., der Rhizobia-F_-Transkonjugant wurde in einem 10 OOO-Gallonen-Tank bis zur log-Phase gezüchtet und auf einen 0Dfi --Wert von 0,8 verdünnt). Etwa 1,5 ml Rhizobiura-F Transkonjugant-Kultur pro Samen wurden in die darunterliegende Erde eingeimpft. Danach wurden Samen und Sämlinge, wie beschrieben, gegossen.
6.4. Protokoll für die Analyse von Trockenmasse, Stickstoff- und Proteingehalt von nodulierten Nichtleguminosen
Periodisch wurde eine Anzahl Behälter jeder Pflanzengruppe aus den Laborversuchen auf 3 Pflanzen pro Behälter vereinzelt und für die Kjeldahl-Analyse entnommen, bei der der Gesamtgehalt an organischem Stickstoff und die Trockensubstanzmenge pro Behälter (d. h. pro 3 Pflanzen) bestimmt wurden. Zu diesem Zweck wurden die oberirdischen Teile der Pflanze entfernt, 48 Stunden bei 80 0C getrocknet, gewogen, zerkleinert und in einem Mörser gemahlen. Proben des mazerierten Materials wurden für die Kjeldahl-Analyse entnommen, die nach der Standardmethode durchgeführt wurde. CJede, Kjeldahl-Analyse wurde 4 bis 6mal wiederholt. Die Ergebnisse wurden als Stickstoffmenge und Trockenmasse pro Pflanze aufgezeichnet. In allen Fällen hatten die mit Rhizobium zur V/urzelknöllchenbildung gebrachten Pflanzen einen höheren Trockensubstanzgehalt und Stickstoffgehalt als die mit Stickstoff gedüngten oder unbehandelten Gruppen.
Bei den Felduntersuchungen wurde eine Anzahl Pflanzen periodisch geerntet, und der Proteingehalt pro Pflanze wurde bestimmt, indem zuerst der Stickstoffgehalt pro Pflanze mit
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Hilfe der Kjeldahl-Analyse bestimmt und die Prozent Stickstoff dann mit einem Faktor von 6,25 multipliziert wurden. Bei einigen Versuchen wurde die Aminosäurezusammensetzung des Proteins bestimmt. In allen Fällen hatten die durch Rhizobium nodulierten Nichtleguminosen einen höheren Proteingehalt als die Pflanzen, die mit dem anorganischen Stickstoffdünger behandelt worden waren und die Pflanzen, die mit dem nichtstickstoffhaltigen Dünger behandelt worden waren.
7. Beispiel: Rhizobium tritici, das Wurzelknöllchenbildung bei Weizen auslöst
Rhizobium tritici, das Weizen noduliert (Knöllchenbildung auslöst) wurde nach der in Abschnitt 6 beschriebenen Methode erzeugt, indem zuerst R. phaseoli mit R. cowpea leucaena gekreuzt wurde, um den F -Transkonjuganten zu erzeugen, der dann mit R. trifoli gekreuzt wurde. Das auf diese Weise gewonnene R. tritici wurde eingesetzt, um bei vier VVeizensorten Wurzelknöllchen auszubilden: Anja, Kraka, Vuka und Williams.
7.1. Gewinnung von Rhizobium tritici
Für die Gewinnung von R. tritici wurden die folgenden Eltern-Rhizobia verwendet, um die milchig-weißen F -Transkonjugantkolonien zu erzeugen: a) R. phaseoli, isoliert von der französischen Bohnenkulturvarietät, Prospector, die in einer in der Nähe von Aarhus, MS-I, entnommenen Bodenprobe gezogen worden war, und b) R. cowpea leucaena, isoliert von dem tropischen Baum Leucaena leucocephala (zur Familie der Fabaceae gehörig) aus Papua Neuguinea.
Die Eltern-Rhizobia wurden in abwechselnden Linien auf dem vorstehend beschriebenen Agarmedium gezüchtet; die in dem Medium verwendeten Leguminosenextrakte wurden von den oberirdischen Teilen der französischen Bohne bzw. von den Blättern von Leucaena leucocephala gewonnen. Die von R. phaseoli gebildeten Kolonien hatten eine charakteristische dunkelbraune Farbe, während die von Γ?. cowpea leucaena eine charakteri-
- 39 stische gräulichbraune Farbe aufwiesen.
Der von den milchig-weißen Kolonien stammende Rhizobium-F Transkonjugant wurde gereinigt und, wie beschrieben, in abwechselnden Linien mit einem R. trifoli-Stamm kultiviert, der von Rotklee isoliert worden war, der in einer bei Randers gefundenen Erdprobe gewachsen war. Die in dem Medium verwendeten Leguminosenextrakte stammten von den oberirdischen Teilen der französischen Bohne, den Blättern von Leucaena leucocephala und den oberirdischen Teilen von Rotklee. Die von dem F -Transkonjuganten gebildeten Kolonien waren milchigweiß, während die von R. trifoli gebildeten Kolonien eine charakteristische hellbraune Farbe aufwiesen.
Der von den schneeweißen, zwischen den Strichen gewonnenen Kolonien stammende Rhizobium-F -Transkonjugant, hier Rhizobium tritici genannt, wurde gereinigt und isoliert, wie es beschrieben wurde. Das nahm etwa 20 Wochen in Anspruch. Danach wurde der F -Transkonjugant eingesetzt, um V/urzelknöllchenbildung bei Weizen auszulösen.
7.2. Wurzelknöllchenbildung bei Weizen mit Hilfe von Rhizobium tritici
Das Rhizobium tritici wurde verwendet, um bei vier Weizensorten, nämlich Anja, Kraka, Vuka und Williams Wurzelknöllchenbildung auszulösen. Die Weizensamen wurden behandelt, indem sie dreimal in die vorstehend beschriebene wäßrige Lösung getaucht wurden, die 3 % Calciumsulfat und bis zu etwa 10 % Leguminosenextrakte, die zur Erzeugung von R. tritici verwendet wurden, enthielten, d. h. die drei zum Oberziehen der Samen verwendeten Leguminosenextrakte wurden von den oberirdischen Teilen der französischen Bohne, den Blättern von Leucaena leucocephala und den oberirdischen Teilen von Rotklee gewonnen. Nach jeder Immersion wurden die Samen luftgetrocknet und gemäß nachstehender Beschreibung gesät.
7.2.1. Laborversuch Der oben beschriebene Versuchsablauf wurde für drei verwen-
- 40 - *
dete Weizensorten: Anja, Kraka und Vuka durchgeführt; d. h.f 4 bis 5 Samen wurden pro mit 1*FiboH-Klinkermaterial gefüllten Ein-Liter-Behälter gesät und keimen gelassen. CJede der drei Weizensorten wurde in die folgenden drei Gruppen eingeteilt: a) +R-N, deren Sämlinge mit einer 50-ml-Suspension von, wie oben beschrieben, hergestellten R. tritici gegossen wurden, woran sich wöchentliches Gießen mit dem nichtstickstoffhaltigen Düngemittel anschloß; b) -R+N, deren Sämlinge kein R. tritici erhielten, aber mit dem anorganischen Stickstof f düngemittel gegossen wurden; und c) -R-N, deren Sämlinge weder R. tritici noch anorganischen Stickstoffdünger erhielten und statt dessen mit dem oben beschriebenen nichtstickstoffhaltigen Düngemittel gegossen wurden. Die mit R. tritici behandelten Pflanzen entwickelten innerhalb von 8 bis 10 Wochen •ifurzelknöllchen. Die Pflanzen in jedem Behälter wurden auf 3 Pflanzen vereinzelt, und 10 Behälter wurden in jeder Gruppe für die Analyse von Trockenmasse und Stickstoffgehalt verwendet· -
7.2.2. Feldversuch
Für den Feldversuch wurden die überzogenen Weizensamen, wie in Abschnitt 6.3.2. beschrieben, gesät. Die Samen von Posten a) +R-N1 wurden, wie beschrieben, mit einer Suspension von R. tritici behandelt und mit nichtstickstoffhaltigem Düngemittel gegossen; die von Posten b) -R+N, wurden nicht'mit R. tritici behandelt, aber mit dem anorganischen Stickstoffdünger gegossen, und die von Posten c) -R-N, wurden weder mit R. tritici, noch mit anorganischem Stickstoffdünger behandelt, sondern wurden einfach mit dem nichtstickstoffhaltigen Dünger gegossen.
7.3. Analyse von Trockenmasse, Stickstoffgehalt" und Proteingehalt von noduliertem Weizen
Zur Charakterisierung der nodulierten Weizenpflanzen wurden die in Abschnitt 6.4. beschriebenen Analysenraethoden angewendet.
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7.3.1. Ergebnisse des Laborversuchs
Die Weizenpflanzen wurden 56, 70, 87, 100 und 118 Tage nach dem Säen von den Behältern geerntet. Die Trockenmasse pro Pflanze und der Stickstoffgehalt pro Pflanze (Kjeldahl-Analyse) wurden, wie oben beschrieben, analysiert.
Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt, wo die Trockenmasse pro Pflanze (A) und der Stickstoffgehalt pro Pflanze (B) über der Anzahl Tage nach der Aussaat aufgetragen wurden.
Zur Erleichterung des Verständnisses der Figur sind die folgenden Angaben über die durchschnittliche Trockensubstanzmasse und den durchschnittlichen Stickstoffgehalt für die drei Weizensorten von Nutzen;
| Trockensubstanz | pro 100 Samen | - | Stickstoff | 56 | Tage | 70 | nach | der Saat | 118 |
| Weizen Gramm | 4,403 | mq pro Samen | 87 | 100 | |||||
| Anja | 3,611 | 1,103 | 33 | 30 | 25 | ||||
| Kraka | 4,052 | zu den | 0,896 | 24 | 30 | 21 | 23 | 20 | |
| Vuka | Pflanzen | 0,819 | 24 | 26 | 20 | 21 | 35 | ||
| Die Anzahl geernteter | 22 | 26 | |||||||
| ten betrug: | 11 | 10 | 8 | ||||||
| 8 | 10 | 7 | 8 | 7 | |||||
| 8 | 9 | 7 | 7 | 12 | |||||
| Pflanzenqruppe | 7 | 9 | |||||||
| Versuch 1: | verschiedenen Zeitpunk- | ||||||||
| +R-N | |||||||||
| -R+N | |||||||||
| -R-N | Anzahl qeernteter Pflanzen | ||||||||
| Versuch 2: | |||||||||
| +R-N | |||||||||
| -R+N | |||||||||
| -R-N | |||||||||
Die in Fig. 1 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß die mit Rhizobium behandelten IVeizenpflanzen während der Wachstums-
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periode einen höheren Gehalt an Stickstoff und Trockensubstanz aufwiesen als die mit Stickstoff gedüngten Pflanzen; am Ende des Experiments lag der Trockensubstanzgehalt der +R-N-Pflanzen fast 40 % höher als der der -R+N-Pflanzen, und diese beiden Kategorien besaßen eine höhere Masse als die unbehandelten -R-N-Weizenpflanzen.
7.3.2. Ergebnisse des Feldversuchs
Die Weizenpflanzen wurden bei dem Feldversuch nach einer Wachstumsperiode geerntet, und der Proteingehalt pro Pflanze wurde, wie oben beschrieben, analysiert. Die in Tabelle II dargestellten Ergebnisse zeigen eindeutig, daß die mit R^
tritici (+R-N) behandelten Pflanzen einen höheren Proteingehalt hatten sowohl als die mit anorganischem Stickstoffdungemittel behandelte Gruppe (-R+N) als auch die mit nichtstickstoffhaltigem Dünger behandelte Gruppe (-R-N),
| Tabelle Proteinqehalt | II. voh Weizen | pro | Pflanze | O/ /O P/ /O | |
| Pflanzenqruppe | Proteinqehalt | 28 14 χ | |||
| +R-N -R+N -R-N | 22 - 12 - ND | ||||
ND = Keine Angaben (No data): diese unbehandelten Pflanzen starben nach 8 Wochen ab.
8. Beispiel: Rhizobium hordei, das Wurzelknöllchenbildunq bei Gerste auslöst
Rhizobium hordei, das Wurzelknöllchenbildung bei Gerste auslöst, wurde nach der in Abschnitt 6 beschriebenen Methode erzeugt, indem zuerst R. phaseoli mit R. lequminosarum gekreuzt wurde, um den F -Transkonjuganten zu gewinnen, der dann mit R. cowpea leucaena gekreuzt wurde. Das auf diese V/eise gewon-
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nene R. hordei wurde benutzt, um bei vier Gerstesorten: Hasso, Cerise, Harry und Igri, Wurzelknöllchenbildung auszulösen.
8.1. Gewinnung von Rhizobium hordei
Für die Erzeugung von R. hordei wurden die folgenden Eltern-Rhizobia verwendet, um die milchig-weißen F -Transkonjugant- Kolonien zu gewinnen: a) R. phaseoli, das von der französischen Bohnenkulturvarietät. Prospector isoliert wurde, die in einer in der Nähe von Aarhus entnommenen Erdprobe gezogen worden war, und b) R. lequminosarum, das von der Gartenerbse isoliert worden war.
Die Eltern-Rhizobia wurden in abwechselnden Linien auf dem vorstehend beschriebenen Agarmedium gezüchtet j die in dem Medium verwendeten Leguminosenextrakte stammten von den oberirdischen Teilen der französischen Bohne bzw. der Gartenerbse. Die durch R. phaseoli gebildeten Kolonien hatten eine charakteristische dunkelbraune Farbe, während die durch R. lequminosarum gebildeten Kolonien ein charakteristisches Goldgelb aufwiesen.
Der von den milchig-weißen Kolonien abgeleitete Rhizobium-* F -Transkonjugant wurde gereinigt und gemäß der Beschreibung in abwechselnden Linien mit einem Stamm von R. cowpea leucaena gezüchtet, der von dem tropischen Baum Leucaena leucocephala isoliert worden war. Die in dem Medium verwendeten Leguminosenextrakte wurden von den oberirdischen Teilen der französischen Bohne, der Gartenerbse und den Blättern von Leucaena leucocephala gewonnen. Die von dem F -Transkonjuganten gebildeten Kolonien waren milchig-weiß, während die durch R. cowpea leucaena gebildeten Kolonien eine charakteristische gräulichbraune Farbe aufwiesen.
Der von den schneeweißen, zwischen den Strichen gewonnenen Kolonien stammende Rhizobium-F -Transkonjugant, hier Rhizol: um hordei genannt, wurde gereinigt und isoliert,wie es be-
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schrieben worden ist. Der F -Transkonjugant wurde verwendet, um Wurzelknöllchenbildung bei Gerste auszulösen.
8.1.1. Charakterisierung von Rhizobiuro hordei
Plasmid-DNS der drei Eltern-Stämme,des F^Transkonjuganten und des F -Transkonjuganten (R. hordei) wurden unter Anwendung einer Modifikation der Methode von Hirsch et al« (1980, 0. Gen. Microbiol. 120: 403-412) isoliert, das Lysieren der Rhizobia durch eine Inkubation über Nacht bei 4 C in 40%igem SDS (Natriumdodecylsulfat) und Isolieren der Plasmid-DNS, die durch Elektrophorese in 0,7%igen Agarosegelen separiert wurde, einschloß. Die Ergebnisse einer solchen Analyse zeigten, daß das R. hordei zusätzliche Plasmide mit niedrigem Molekulargewicht aufwies, die weder bei den drei Eltern-Rhizobia noch bei dem F -Transkonjuganten gefunden wurden.
8.2. Wurzelknöllchenbildung bei Gerste mit Hilfe von Rhizpbium hordei
Das Rhizobium hordei wurde verwendet, um Wurzelknollchenbildung bei vier Gerstensorten hervorzurufen; nämlich bei Hasso, Cerice, Igri und Harry. Die Gerstensamen wurden behandelt, indem sie dreimal in die vorstehend beschriebene wäßrige Lösung getaucht wurden, die 3 % Calciumsulfat und bis zu etwa 10 % Leguminosenextrakte enthielt, die verwendet wurden, um R. hordei zu erzeugen; d. h. die zum Oberziehen der Samen verwendeten Leguminosenextrakte wurden von den oberirdischen Teilen der französischen Bohne, der Gartenerbse und den Blättern von Leucaena leucocephala gewonnen. Nach jeder Immersion wurden die Samen luftgetrocknet und, wie nachstehend beschrieben, gesät.
8.2.1. Laborversuch
Der vorstehend beschriebene Versuchsablauf wurde für jede verwendete Gerstenart ausgeführt; d. h., 4 bis 5 überzogene Samen wurden pro l-Liter-3ehälter, der mit "Fibo"-Klinkermaterial gefüllt war, ausgesät und keimen gelassen. Oede Gerstenart wurde in die folgenden drei Gruppen eingeteilt: a) +R-N,-
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deren Sämlinge mit einer 50-ml-Suspension von R, hordei, die gemäß vorstehender Beschreibung hergestellt worden war, gegossen wurden, woran sich wöchentliches Gießen mit dem nichtstickstoffhaltigen Düngemittel anschloß; b) -R+N, deren Sämlinge kein R. hordei erhielten, aber mit dem anorganischen Stickstof fdungemittel gegossen wurden, und c) -R-N1 deren Sämlinge weder R. hordei noch das anorganische Stickstoffdüngemittel erhielten, statt dessen aber mit dem nichtstickstoffhaltigen Düngemittel gegossen wurden. Die mit R. hordei behandelten Pflanzen entwickelten innerhalb von 8 bis 10 Wochen V/urzelknöllchen. Die in jedem Behälter befindlichen Pflanzen wurden auf je drei Pflanzen vereinzelt, und zehn Behälter wurden von jeder Gruppe für die Analyse von Trockenmasse und Stickstoffgehalt verwendet.
8.3. Analyse von Trockenmasse, Stickstoffgehalt und Proteinqehalt von nodulierter Gerste
Die in Abschnitt 6.4. beschriebenen Analysenmethoden wurden angewendet, um die nodulierten Gerstenpflanzen zu charakterisieren.
8.3.1. Ergebnisse des Laborversuchs
Die Pflanzen aus den Behältern wurden 59, 71, 85, 108 und 128 Tage nach dem Säen geerntet. Die Trockenmasse pro Pflanze und der Stickstoffgehalt pro Pflanze (Kjeldahl-Analyse) wurden, wie vorstehend beschrieben, analysiert.
Die Ergebnisse werden in Fig. 2 dargestellt, in der die Trockenmasse pro Pflanze (A) und der Stickstoffgehalt pro Pflanze (B) über der Anzahl Tage nach der Aussaat aufgetragen sind.
Zur Erleichterung des Verständnisses der Figur sind die folgenden Angaben über die durchschnittliche Trockensubstgnzmasse und den durchschnittlichen Stickstoffgehalt jeder Gerstensorte nützlich:
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Gerste
Hasso Cerise igpi Ha r ry
Die Anzahl der geernteten Pflanzen zu den verschiedenen Zeitpunkten betrug:
Anzahl geernteter Pflanzen
| Trockensubstanz | Stickstoff |
| Gramm pro 100 Samen | mq pro Samen |
| 3,922 | 0,732 |
| 4,217 | 0,792 |
| 3,932 . | 0,775 |
| 5,068 | 0,826 |
| Pflanzengruppe | 59 | Tage nach 71 | der 85 | Saat 108 | 128 |
| Versuch 1: | |||||
| +R-N | 23 | 23 | 27 | 31 | 37 |
| -R+N | 17 | 14 | 30 | 23 | 40 |
| -R-N | 14 | 18 | 28 | 20 | 32 |
| Versuch 2: | |||||
| +R-N | 8 | 8 | 9 | 10 | 12 |
| -R+N | 6 | 5 | 10 | 8 | 13 |
| -R-N | 5 | 6 | 9 | 7 | 11 |
Die in Fig. 2 aufgeführten Ergebnisse zeigen, daß die mit Rhizobium behandelten Pflanzen während der Wachstumsperiode einen höheren Gehalt an Stickstoff und Trockensubstanz hatten als die mit Stickstoff gedüngten Pflanzen. Am Ende des Experiments war der Trockensubstanzgehalt der +R-N-Pflanzen fast 18 bis 22 % höher als der der -R+N-Pflanzen, und beide Kategorien hatten eine höhere Masse als die -R-N-Gerstenpflanzen, die mit nichtstickstoffhaltigam Dünger behandelt worden waren.
15 8.4. N-Anreicherunq in nodulierter Gerste
Eine Gerstenpflanze wurde in Anwesenheit von atmosphärischem
N inkubiert, wonach Teile der Pflanze auf N-Gehalt als Hinweis auf Stickstoffbindung analysiert wurden. Genauer gesagt, wurde eine Gerstenpflanze (Alter 95 Tage) mit kleinen mirzelknöllchen in eine Kammer gelegt, 'so daß die Wurzeln in
Anwesenheit von atmosphärischem
- 47 15
23 Tage lang inkubiert
wurden. Die Atmosphäre in der Wurzelkammer enthielt 80 % N 15
(wobei
15
Nach der Inkubations
N 12,85 At% war) und 20 % O2 zeit wurden die Proben auf N-Gehalt analysiert, und der Gesamtstickstoffgehalt der Pflanze wurde mit der Kjeldahl-Methode bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle ΙΪΙ aufgeführt.
| Tabelle | III | nodulierter | |
| Stickstoffgehalt Gerstenpflanzen | von Teilen | Gesamt-N (mcj) | |
| Pflanzenteil | Trockenmasse (Q) | N (mq/g) | 3,99 |
| Wurzeln | 0,448 | 8,9 | 7,63 |
| Triebe | 1,017 | 7,5 | 11,62 |
| Gesamte Pflanze | 1,465 | 7,93 | |
Wurzeln Triebe
N-Gehalt von Teilen nodulierter Gerstenpflanzen
Anzahl der ^c
Proben
At%
4 3
0,450 + 0,011 0,392 + 0,003
κ 15
Der N-Gehalt in atmosphärischer Luft beträgt etwa
0,370 At%.
Die Angaben in Tabelle III demonstrieren, daß sowohl die Wurzeln als auch die Triebe der nodulierten Gerstenpflanzen be-
15
deutend mehr N enthalten als die Atmosphäre. Diese Ergebnisse zeigen, daß Stickstoffbindung in der nodulierten Gerstenpflanze stattfand.
8.5. Morphologie der Wurzelknöllchen bei Gerste
Elektronenmikroskopie wurde an einigen der großen Wurzelknöllchen vorgenommen. Das schloß die Untersuchung ultradünner Schnitte, die mit Uranylacatat und Bleicitrat gefärbt
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worden waren, ein. Die Zellenanordnung der Gerstenwurzelknöllchen war die gleiche wie die von Newcomb (1976, Can. 3. 3ot. 54: 2163-2186) für Erbsenwurzelknöllchen angegebene; d. h. die Gefäßbündel wurden in der peripheren Cortex gefunden, während der mittlere Teil der Knöllchen von mit Bakteroiden angefüllten Pflanzenzellen eingenommen wurde.
Unter Einschluß von Lichtmikroskopie und Elektronenmikroskopie (sowohl mit Abtastung als auch Durchstrahlung) erfolgte eine weitere Untersuchung der Oberfläche von kleinen Gerstenwurzelknöllchen und der Oberfläche und von Schnitten großer Gerstenwurzelknöllchen. Die festgestellte Morphologie wurde mit der von Erbse, Weißklee und Sojabohne verglichen. Kleine Wurzelknöllchen an den Gerstenpflanzen waren nach einer Wachstumszeit von etwa 50 Tagen sichtbar und bildeten sich an ungefähr 75 % der Pflanzen (die Beobachtung wurde auch bei Weizenpflanzen gemacht). Große Wurzelknöllchen wurden nach etwa 89 bis 110 Wachstumstagen festgestellt. Die großen Wurzelknöllchen traten bei Gerste selten, aber unverkennbar auf. Sie wiesen etwa 2 bis 4 mm Länge und 1 bis 2 ram Durchmesser auf und erschienen an der Hauptwurzel an einer etwa 2 bis 6 cm unterhalb der Position des alten Samens befindlichen Stelle. Elf von dreizehn großen Knöllchen, die^zerschnitten worden waren, wiesen innen eine rotbraune Farbe auf, d. h. die gleiche Färbung wie Leghämoglobin in Leguminosenwurzelknöllchen mit einem Alter von etwa 20 bis 35 Tagen. Von den übrigen beiden großen zerteilten Knöllchen war eines weiß und sah wie ein junges unreifes Leguminosenknöllchen aus und das andere war grün, genau wie ein altwerdendes Leguminosenknöllchen. Die Infektion erfolgt bei Gerste möglicherweise in zwei Stufen: in der Anfangsstufe dringt R. hordei in die Wurzel ein, ruft aber keine Reaktion in Form von Knöllchenbildung hervor; in der nächsten Stufe beginnt die Bildung der Wurzelknöllchen nach einer Verzögerungsperiode .
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3.6. Antibiotikaresistenz von reisolierten Gerstenbakteroiden
Von den großen Gerstenwurzelknöllchen wurden Bakterien reisoliert und auf Antibiotikaresistenz getestet. Die reisolierten Bakterien waren resistent gegenüber Spectinomycindihydrochlorid bei einer Konzentration von bis zu 400 ug/ml. Der ursprunglich zum Infizieren der Gerstenpflanzen verwendete R. hordei-F -Transkon.juqant (d. h., der Impfstoff) weist die gleiche Resistenz auf. Sowohl der Impfstoff als auch das reisolierte Material bildeten bei Züchtung auf gewöhnlichem Hefe-Mannitol-Agar weiße undurchsichtige Kolonien. Ein Elternteil des R. hordei-F -Transkon.-juganten ist auch resistent gegenüber Spectinomycindihydrochlorid bei der gleichen Konzentration. Dieses Elternteil ist der R. lequminosarum-Stamm MAl, der hellgelbe undurchsichtige Kolonien bildet, wenn er auf gewöhnlichem Hefe-Mannitol-Agar gezüchtet wird. Das Spectinomycinresistenzgen ist nicht auf dem Sym-Plasmid vorhanden, der R. hordei-F -Transkonjugant ist also wahrscheinlich ein Hybrid, der ein nichtsymbiotdsches Plasmid oder das Hauptchromosom des Eltern-R. leguminosarum MAl enthält. Das schließt jedoch nicht die Möglichkeit aus, daß der R. hordei-F -Transkonjugant auch das Sym-Plasmid von Mal beherbergt.
9. Beispiel: Rhizobium sorghi, das Wurzelknöllchenbildung bei Sorghum auslöst
Rhizobium sorghi, das Wurzelknöllchenbildung bei Sorghum auslöst, wurde nach der in Abschnitt 6 beschriebenen Methode erzeugt, indem zuerst R. lupini mit R. cowpea leucaena gekreuzt wurde, um den F -Transkonjuganten zu erzeugen, der dann mit R. meliloti gekreuzt wurde. Das auf diese Weise erzeugte R. sorghi wurde eingesetzt, um bei drei Sorghumsorten, nämlich Safra, Dabar und Feterita, Wurzelknöllchenbildung auszulösen.
9.1. Gewinnung von Rhizobium sorghi
Für die Gewinnung von R. sorghi wurden die folgenden Eltern-Rhizobia verwendet, um die milchig-weißen F -Transkonjugant-
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Kolonien zu erzeugen: a) R. lupini, das von in Mitteljütland gefundener Lupine isoliert wurde, und b) R. cowpea leucaena, das von dem tropischen Saum Leucaena leucocephala (zur Fami-lie Fabaceae gehörig) aus Papua Neuguinea isoliert wurde.
Die Eltern-Rhizobia wurden in abwechselnden Linien auf dem vorher beschriebenen Agarmedium kultiviert; die in dem Medium verwendeten Leguminosenextrakts wurden von Lupine bzw. von den Blättern von Leucaena leucocephala gewonnen. Die von R. lupini gebildeten Kolonien hatten eine charakteristische hellgelbe Farbe, während die von R. cowpea leucaena gebildeten Kolonien eine charakteristische gräulichbraune Farbe aufwiesen.
Der von den milchig-weißen Kolonien stammende Rhizobium-F Transkonjugant wurde gereinigt und, wie beschrieben, in abwechselnden Linien mit einem R. meliloti-Stamm gezüchtet, der von in Stahr gefundener Luzerne isoliert wurde. Die in dem Medium verwendeten Leguminosenextrakte wurden von der Lupine, den Blättern von Leucaena leucocephala und der Luzerne gewonnen. Die von dem F -Transkonjuganten gebildeten Kolonien waren milchig-weiß, während die von R. meliloti gebildeten Kolonien eine gelblichbraune Farbe aufwiesen.
Der von den schneeweißen Kolonien, die zwischen'den Strichen gewonnen wurden, abgeleitete Rhizobium-F -Transkonjugant, hier Rhizobium sorqhi genannt, wurde gereinigt und isoliert, wie es beschrieben worden ist. Der F -Transkonjugant wurde verwendet, um bei Sorghum Wurzelknöllchenbildung auszulösen.
9.2. Wurzelknöllchenbildung bei Sorghum mit Hilfe von Rhizobium sorqhi
Das Rhizobium sorqhi wurde verwendet, um bei drei Sorghumsorten, nämlich Safra, Dabar und Feterita, Wurzelknöllchenbildung hervorzurufen. Die Sorghumsamen wurden behandelt, indem sie dreimal in die vorstehend beschriebene wäßrige Lösung getaucht wurden, die 3 % Calciumsulfat und bis zu 10 %
« 9 *J
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Leguminosenextrakte enthielt, die zur Erzeugung von R. sorghi verwendet wurden; d. h. die zum Oberziehen der Samen verwendeten Leguminosenextrakte wurden von der Lupine, den Blättern von Leucaena leucocephala und von der Luzerne gewonnen. Nach jeder Immersion wurden die Samen luftgetrocknet und gemäß nachstehender Beschreibung gesät.
9;2.1. Laborversuch
Der vorstehend beschriebene Versuchsablauf wurde für die Sorghumsorten Safra, Dabar und Feterita ausgeführt, d. h. 4 bis 5 überzogene Samen wurden in mit "Fibo"-Klinkermaterial gefüllte l-Liter-3ehälter gesät und keimen gelassen. CJede Sorghumsorte wurde in die drei folgenden Gruppen eingeteilt: a) +R-N, deren Sämlinge mit einer 50-ml-Suspension von, wie oben beschrieben, hergestellten R. sorghi gegossen wurden, woran sich wöchentliches Gießen mit dem nichtstickstoffhaltigen Düngemittel anschloß; b) -R+N, deren Sämlinge kein R. sorghi erhielten, aber mit dem anorganischen Stickstof fdüngemittel gegossen wurden; und c) -R-N, deren Sämlinge weder R. sorghi noch den anorganischen Stickstoffdünger erhielten, sondern statt dessen mit dem nichtstickstoffhaltigen Düngemittel gegossen wurden. Die mit R. sorghi behandelten Pflanzen entwickelten innerhalb von IO Wochen Wurzelknöllchen. Die Pflanzen in jedem Behälter wurden auf drei Pflanzen vereinzelt, und 10 Behälter wurden in jeder Gruppe für die Analyse herangezogen.
9.2.2. Feldversuch
Für den Feldversuch wurden die überzogenen Sorghumsamen (Sorte Feterita), wie in Abschnitt 6.3.2. beschrieben, gesät. Die Samen von Posten a) +R-N wurden gemäß Beschreibung mit einer Suspension von R. sorghi behandelt und mit nichtstickstoffhaltigem Dünger gegossen; die Samen von Posten b) -R+N wurden nicht mit R. sorghi behandelt, aber mit dem anorganischen Stickstoffdünger gegossen; und die Samen von Posten ό) -R-N wurden weder mit R. sorqhi, noch mit anorganischem Stickstoffdünger behandelt, sondern einfach mit dem
- 52 nichtstickstoffhaltigen Dünger gegossen.
9.3. Analyse von Trockenmasse, Stickstoffgehalt und Proteinqehalt von noduliertem Sorghum
Zur Charakterisierung der nodulierten Sorghumpflanzen wurden die in Abschnitt 6.4 beschriebenen Analysemethoden angewendet.
9.3.1. Ergebnisse des Laborversuchs
Die Pflanzen wurden 76 bis 152 Tage nach der Saat geerntet. Die Trockenmasse pro Pflanze und der Stickstoffgehalt pro Pflanze (Kjeldahl-Analyse) wurden gemäß vorstehender Beschreibung analysiert.
Die folgenden Angaben über die durchschnittliche Trockensubstanzmasse und den durchschnittlichen Stickstoffgehalt sind von Nutzen:
Sorghum
Saf ra Dabar Feterita
Die Anzahl geernteter Pflanzen zu den verschiedenen Zeitpunkten betrug:
Gesamtzahl der 76 bis 152 Tage nach Pflanzengruppe der Saat geernteten Pflanzen
+R-N 121
-R+N 62
-R-N 70
9.3.2. Ergebnisse des Feldversuchs
Bei dem Feldversuch wurden die Sorghumpflanzen nach einer Wachstumsperiode geerntet, und der Proteingehalt pro Pflanze sowie die Aminosäurezusammensetzung wurden, wie vorstehend
| Trockensubstanz | % Stickstoff |
| Gramm pro 100 Samen | pro Samen |
| 3,724 | 2,32 |
| 2,944 | 2,17 |
| 3,840. | 1,42 |
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beschrieben, analysiert. Die in Tabelle IV aufgeführten Ergebnisse zeigen deutlich, daß die mit R, sorqhi behandelten Pflanzen (+R-N) einen höheren Proteingehalt hatten als die mit Stickstoffdünger behandelte Gruppe (-R+N) oder die unbehandelte Gruppe (-R-N).
Die Analyse der Aminosäurezusammensetzung zeigte, daß die relative Aminosäurezusammensetzung der mit Rhizobium behandelten Pflanzen etwa die gleiche ist wie die der mit Stickstoff gedüngten Pflanzen; allerdings scheinen bei den mit Rhizobium behandelten Pflanzen Tryptophan und Leucin erhöht zu sein.
| Tabelle IV | |
| Proteinqehalt von Sorghum | |
| Pflanzengruppe | Proteingehalt der Samen pro Pflanze |
| +R-N | 34 bis 52 % |
| -R+N | 16 % |
| -R-N | 4 % κ |
* Da die Pflanzen der -R-N-Gruppe nach 14 Tagen eingingen, konnte kein Samen gewonnen werden. Der Stickstoff- und Proteingehalt der Pflanzen wurde, wie beschrieben, bestimmt.·
10. Beispiel: Rhizobium oryzae, das Wurzelknöllchenbildunq bei Reis auslöst
Rhizobium oryzae, das Wurzelknöllchenbxldung bei Reis auslöst, wurde nach der in Abschnitt 6 beschriebenen Methode erzeugt, indem zuerst R. meliloti mit R. cowpea leucaena gekreuzt wurde, um den F -Transkonjuganten zu gewinnen, der dann mit R. trifoli gekreuzt wurde. Das auf diese Weise erzeugte R. oryzae wurde eingesetzt, um Wurzelknöllchenbxldung bei Reis auszulösen.
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10.1. Gewinnung von Rhizobium oryzae
Für die Gewinnung von R. oryzae wurden die folgenden Eltern-Rhizobia verwendet, um die milchig-weißen F.-Transkonjugant-Kolonien zu erzeugen: a) R. meliloti, das von in der Nähe von Victoria gefundener Luzerne isoliert wurde, und b) R. cowpea leucaena, das von dem tropischen Baum Leucaena leucocephala (der zur Familie Fabaceae gehört) aus Papua Neuguinea isoliert wurde.
Die Eltern-Rhizobia wurden in abwechselnden Linien auf dem vorstehend beschriebenen Agarmedium gezüchtet; die in dem Medium verwendeten Leguminosenextrakte wurden von der Luzerne bzw. von den Blättern von Leucaena leucocephala gewonnen. Die von R. meliloti gebildeten Kolonien hatten eine charakteristische gelblichbraune Farbe, während die von R. cowpea Leucaena gebildeten Kolonien eine charakteristische gräulichbraune Farbe aufwiesen.
Der von den milchig-weißen Kolonien abgeleitete Rhizobium-F -Trankonjugant wurde gereinigt und, wie beschrieben, in abwechselnden Linien mit einem R. trifoli-Stamm kultiviert, der von aus Randers stammenden Rotklee isoliert wurde. Die in dem Medium verwendeten Leguminosenextrakte wurden von der Luzerne, den Blättern von Leucaena leucocephala und dem Rotklee gewonnen. Die von dem F -Transkonjuganten gebildeten Kolonien waren milchig-weiß, während die von R. trifoli gebildeten Kolonien eine charakteristische hellbraune Farbe aufwiesen.
Der von den schneeweißen Kolonien, die zwischen den Strichen gewonnen wurden, stammende Rhizobium-F.-Transkonjugant, hier Rhizobium oryzae genannt, wurde gereinigt und isoliert, wie es beschrieben worden ist; der F^-Transkonjugant wurde eingesetzt, um Wurzelknöllchenbildung bei Reis auszulösen.
10.2. VVurzelknöllchenbildung bei Reis mit Hilfe von Rhizobium oryzae
Die Reissamen wurden, wie beschrieben, behandelt, indem sie
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dreimal in die vorstehend beschriebene wäßrige Lösung getaucht wurden, die 3 % Calciumsulfat uhd bis zu etwa IO % Leguminosenextrakte enthielt, die zur Erzeugung von R. oryzae verwendet wurden; d. h. die zum Oberziehen der Samen verwendeten Leguminosenextrakte wurden von der Luzerne, den Blättern von Leucaena leucocephala und dem Rotklee gewonnen. Nach jeder Immersion wurden die Samen luftgetrocknet und, wie nachstehend beschrieben, ausgesät.
10.2.1. Feldversuch
Für den Feldversuch wurden die überzogenen Reissamen, wie in Abschnitt 6.3.2. beschrieben, gesät. Die Samen von Posten a) +R-N würden, wie beschrieben, mit einer Suspension von R. oryzae behandelt und mit .nichtstickstoffhaltigem Düngemittel gegossen % die Samen von Posten b) -R+N wurden nicht mit R. oryzae behandelt, sondern mit dem anorganischen Stickstoffdüngemittel gegossen; und die Samen von Posten c) -R-N wurden weder mit R. oryzae noch mit dem anorganischen Stickstoffdüngemittel behandelt, sondern einfach mit dem nichtstickstoffhaltigen Düngemittel gegossen.
10.3. Analyse von Proteingehalt und Stickstoffgehalt von noduliertem Reis
Es wurden die in Abschnitt 6.4. beschriebenen Methoden zur Charakterisierung der nodulierten Reispflanzen angewendet.
10.3.1. Ergebnisse des Feldversuchs
Die Pflanzen wurden alle 4 1/2 Monate über eine Periode von 2 1/2 Oahren (2 Kulturen pro Oahr) geerntet, und der Proteingehalt pro Pflanze wurde, wie vorstehend beschrieben, analysiert.
Die in Tabelle V gezeigten Ergebnisse zeigen deutlich, daß die mit R. oryzae (+R-N) behandelten Reispflanzen einen höheren Proteingehalt aufwiesen als die mit Stickstoffdünger behandelte Gruppe (-R+N) und auch als die unbehandelte Gruppe (-R-N).
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| Tabelle | V | Reis | |
| Proteingehalt | von | Proteingehalt pro Pflanze | |
| Pflanzeng | ruppe | 12,0 bis 18 % | |
| +R-N | 1,5 bis 3 % | ||
| -R+N | 0,5 bis 1 % | ||
| .-R-N | |||
11. Beispiel: Rhizobium als Stickstoffdüngemittel für Eucalyptus
Eine positive Wirkung von Rhizobium als Stickstoffdungemittel· wurde bei Eucalyptus (Familie Myrtaceae), einer Pflanzenart außerhalb der Familie der Gräser beobachtet. Von den zwei getesteten Species reagierte E. qlobulus sehr eindeutig mit erhöhter Biomasse. Wurzelknöllchen wurden allerdings nicht festgestellt.
11.1. Gewinnung von Rhizobium 081324
Rhizobium 081324, das einen gunstigen Einfluß auf Eucalyptus hat, wurde nach der Methode von Abschnitt 6 erzeugt, indem zuerst R. cowpea leucaena mit R. leguminosarum gekreuzt wurde, um den F.-Transkonjuganten zu gewinnen, der dann mit R. trifoli gekreuzt wurde. Der so gewonnene F -Transkonjugant, Stamm 081324·, wurde zur Behandlung von zwei Eucalyptusspecies eingesetzt. Dieser Rhizobiumstamm infiziert keinen anderen der hier in den Beispielen beschriebenen Pflanzenwirte.
11.2. Behandlung von Eucalyptus mit Rhizobium 081324
Eucalyptussamen wurden, wie bereits für Getreide beschrieben, in einem Leguminosenpflanzenextrakt von Erbse, Bohne, Lupine, Klee, Luzerne und Leucaena vorgekeimt. Die behandelten Samen wurden in groben Sand gesät, und unbehandelte Samen wurden als Kontrolle gesät.
Nach der Keimung wurden die vorbehandelten Sämlinge mit nicht-
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stickstoffhaltigem Düngemittel und einer Suspension von einem von sechs verschiedenen Rhizobium-F -Transkonjuganten (+R-N) gegossen. Nach der Keimung wurde eine Gruppe unbehandelter Sämlinge- mit einem Stickstoffdüngemittel gegossen (-R+N), und eine andere Gruppe erhielt nichtstickstoffhaltigen Dünger (-R-N). Vier lochen später waren die mit fünf der sechs Rhizobiumstämme behandelten Sämlinge alle eingegangen; aber die mit Rhizobium-Stamm 081324 behandelten überlebten. Die überlebenden Pflanzen wurden einzeln in Sechs-Liter-Töpfe mit Erde und einer Deckschicht von ".FiboH-Klinkermaterial zum Zurückhalten der Feuchtigkeit im Topf und zur Verhinderung von Pilzwachstum gepflanzt. Der Boden der Töpfe wurde perforiert, so daß überschüssiges Wasser herausfließen konnte, aber die Menge an verabreichtem nichtstickstoffhaltigem Düngemittel wurde so eingestellt, daß keine stauende Nässe oder Bakterienverunreinigung möglich waren. Es waren insgesamt 28 Töpfe; 14 davon +R-N und 14 -R+N. Die 14 +R-N-Töpfe wurden erneut mit Rhizobium 081324 geimpft. Nach einer Wachstumszeit von 4 Monaten hatten die +R-N Eucalyptuspflanzen zwei- bis dreimal so viel Biomasse wie die +R-N-Pflanzen. Die Untersuchung einer -R+N-Pflanze ergab keine Wurzelknöllchen; allerdings ist der Nachweis von kleinen Knöllchen sehr schwierig, wenn die Wurzeln in Erde wachsen, weil die Erdteilchen an den Wurzeln haften und die feinen Wurzeln entfärben. Trotz der Tatsache, daß bei dieser +R-N-Eucalyptuspflanze keine Wurzelknöllchen festgestellt wurden, zeigen die Ergebnisse, daß die erhöhte Biomasse auf die Stickstoffbindung durch Rhizobien zurückzuführen ist.
12. Beispiel: Rhizobium Rl, das Wurzelknöllchenbildung bei Brassicaceae auslöst
Ein Mitglied der Brassicaceae, eine weitere Pflanze außerhalb der Familie der Gräser, reagierte ebenfalls positiv auf Rhizobiumbehandlung. Die Behandlung von Raps (Brassica napus) mit Rhizobium Rl (010824) bewirkte Pflanzenwachstum und das Erscheinen von Wurzelknöllchen.
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12.1. Gewinnung von Rhizobium Rl 010824
Rhizobium Rl (010824), das Wurzelknöllchenbildung bei Raps auslöst, wurde nach der in Abschnitt 6 beschriebenen Methode erzeugt, indem zuerst R.phaseoli mit R. cowpea leucaena gekreuzt wurde, um den F -Transkonjuganten zu erzeugen, der dann mit R. trifoli gekreuzt wurde
/DR. NIELSEN: SIND DIESE KREUZUNGEN RICHTIG?7
12.2. Behandlung von Raps mit Rhizobium Rl 010824
Die Rapssamen wurden, wie zuvor für Getreide beschrieben, in einem Leguminosenpflanzsnextrakt von Bohne, Leucaena und Klee vorgekeimt. Die behandelten Samen wurden in Zwei-Liter-Behälter gesät, und'nach der Keimung wurde eine Gruppe (-R+N) normal gedüngt, eine zweite Gruppe (-R-N) wurde nur mit nichtstickstoffhaltigem Dünger gegossen, und eine dritte Gruppe (+R-N), die ebenfalls mit nichtstickstoffhaltigem Dünger gegossen wurde, wurde mit sechs verschiedenen Rhizobia-Stämmen behandelt. Nach 3 1/2 Monaten hatten die -R-N-Pflanzen noch immer nur die ersten drei juvenilen Blätter, und die +R-N-Pflanzen, die mit drei Rhizobia-stämmen behandelt worden waren, nämlich R4, R5 und Rohwaren ebenso schwach entwickelt. Einer der Rhizobia-Transkonjuganten, nämlich der Stamm Rl oder 010824 war jedoch vorteilhaft. Die mit Rl 010824 behandelte Pflanze hatte fast die gleiche Größe und Schötchen wie die größte -R+N-Pflanze, und es waren kleine Wurzelknöllchen •sichtbar.
13. Beispiel: Gesamtstickstoffanalyse von nodulierten Nichtlequminosen .
Um zu demonstrieren, daß die durch die erfindungsgemäßen Rhizobia-Transformanten bei Nichtleguminosen hervorgebrachten Wurzelknöllchen aktiv bei der Stickstoffbindung waren, wurden Kjeldahl-Analysen des Gehalts der Pflanzen an organischem Stickstoff durchgeführt.
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15.1. Materialien und Methoden
Alle getesteten Nichtlegurainosen wurden in drei Gruppen ein-? geteilt: a) eine wurde mit dem Rhizobium-Transkonjuganten und einem nichtstickstoffhaltigen Dünger (+R-N) behandelt; fr) die zweite Gruppe wurde mit Stickstoffdünger ohne den Rhizobiura-Transkonjuganten (-R+N) behandelt; und c) die dritte Gruppe wurde weder mit dem Rhizobium-Transkonjuganten noch mit dem Stickstoffdünger (-R-N) behandelt. Diese Gruppe wurde unter ansonsten identischen Bedingungen im Gewächshaus gezogen und einige Male im Verlaufe der Wachstumsperiode geerntet, bis die Samen reif waren. Drei bis fünf Pflanzen wurden in jedem Behälter gezogen, und bei der Ernte wurden ihre Triebe zusammengenommen. Von diesem Material wurde eine Probe entnommen und auf den Gesamtgehalt an organischem Stickstoff hin analysiert. Die in den nachfolgenden Unterabschnitten angegebenen Ergebnisse zeigen, daß die nodulierten Nichtleguminosenpflanzen in der Lage waren, Stickstoff zu binden.
13.2. Weizen- und Gerstenpflanzen
Zwei Weizenvarietäten, nämlich Cornette und Ralle, wurden, wie in Abschnitt 7 beschrieben, mit Hilfe von Rhizobium tritici noduliert (zur Wurzelknöllchenbildung gebracht). Der Stickr stoffgehalt, ausgedrückt in mg Stickstoff pro Pflanzenoberteil, und die Trockenmasse des Pflanzenoberteils wurden analysiert.. Die Resultate sind in der nachstehenden Tabelle VII angegeben.
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| • | und | Tabelle VII | 4) | +R-N | 4) 36, | 5 | Ve | rsuch | 1 | 2 | 39, | -R-N | = 2) | 3 | |
| N-Gehalt | 23, | (η = 85 + | O, | 5 | -R+N | O, | (n | ί 6' | |||||||
| O, | 59 + | 83, | 8 | (n = | 2) | 2) 72,3 | 82, | 69 | + O | 6 | |||||
| Tage | Pflanze | 27, | 88 + | 1, | 3 | 90, | 89 + | 26,3 | 0,8 | O, | 51 | + 13, | 3 | ||
| 56, | O, | 28 + | 120, | 8 | 2, | 67 + | 0,6 | 37,0 | 72, | 61 | + O, | 7 | |||
| 30 | TM | 1, | Trockenmasse von noduliertem Weizen | 21, | 37 + | 1. | 3 | 257, | 56 + | 62,3 | 1,9 | O, | 66 | + 8, | 1 |
| N | 120, | O, | 61 + | 25, | 5 | 3, | 99 + | 1,4 | 205,5 | 117, | 21 | + O, | 6 | ||
| 50 | TM | 2, | 112, | 53 + | O, | 3 | 331, | 99 + | 5,8 | 2,4 | O, | 44 | + 44, | 2 | |
| N | 244, | +R-N | 1, | 81 + | 5 | 5, | Ol + | 0,4 | 166,4 | 117, | 53 | + O, | 2 | ||
| 64 | TM | 3, | (η β | 68, | 7 | 400, | 64 + | 83,2 | 1,39 | O1 | 69 | + 54, | 2 | ||
| N | 314, | 05 + | O, | 6 | 6, | 56 + | 2,1 | 82, | O | + O, | 2 | ||||
| 76 | TM | 4, | 14 + | 38, | 2 | 666, | 71 + | 60,3 | O, | 6 | + 3, | 1 | |||
| N | 431, | 49 + | 1, | 2 | 7, | 52 + | 1,4 | 113, | 96 | + O, | 3 | ||||
| 97 | TM | 5, | 26 + | 23, | 4 | 668, | 55 + | 113,4 | O, | 42 | + 12, | ||||
| N | 523, | 78 + | O, | 9, | 94 + | 3,5 | 94 | + O | |||||||
| 115 | TM | 5, | 04 + | 700, | 77 + | 79,4 | 67 | ||||||||
| N | 565, | 38 + | 3 | 11, | 43 + | 1,9 | 90, | ?-N | 4 | ||||||
| 124 | TM | 8, | 28 + | 5 | Ve | rsuch | O, | * 2) + 12, | 1 | ||||||
| N | 47 + | 1 | -R+N | 39, | η = 30 | + O, | O | ||||||||
| 19 + | 2 | 304, | ( Π = 91 + | O, | 51 | + 23, | 2 | ||||||||
| 158, | 49 + | 7 | 7, | 46 + | 117, | 54 | + O, | 6 | |||||||
| 54 | TM | 3, | 98 + | 1 | 705, | 64 + | O, | 54 | + 2, | 1 | |||||
| N | 447, | 11 + | 6 | 12, | 48 + | 131, | 04 | + O, | 3 | ||||||
| 71 | TM | 6, | 15 + | 871, | 57 + | O, | 71 | + 11, | 1 | ||||||
| N | 513, | 12, | 15 + | 18 | + O, | ||||||||||
| 80 | TM | 7, | 1128 | !,85+ | 72 | ||||||||||
| N | 903, | 45 U | ^,56+ | ||||||||||||
| 92 | TM | 11, | |||||||||||||
| N | |||||||||||||||
κ TM.= Trockenmasse
Die Pflanzen in Versuch 1 wurden unter suboptimalen Lichtverhältnissen gezogen.
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Die in Tabelle VII aufgeführten Ergebnisse zeigen, daß die Trockenmasse der +R-N-Pflanzen etwa 82 % der der -R+N-Pflanzen beträgt und daß der Stickstoffgehalt der +R-N-Pflanzen etwa 80 % der -R+N-Pflanzen beträgt.
Fünf Varietäten Gerste, nämlich Oenny, Taarn, Lina, Grith und Triumph wurden, wie zuvor in Abschnitt 8 beschrieben, mit Hilfe von Rhizobium hordei zur Wurzelknöllchenausbildung gebracht. Der Stickstoffgehalt, ausgedrückt als mg Stickstoff pro Pflanzenoberteil, und die Trockenmasse des Pflanzenoberteils wurden analysiert. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle VIII aufgeführt.
Die mit Rhizobium nodulierten Gerstenpflanzen erreichen die gleiche Größe und Trockenmasse wie die mit normalem Stickstoffdünger behandelten Pflanzen. Der Stickstoffgehalt der +R-N-Gerste beträgt etwa 83 % dessen der -R+N-Pflanzen und ist 20mal so hoch wie der Stickstoffgehalt der -R-N-Pflanzen. Der in den -R-N-Pflanzen festgestellte Stickstoff rührt vom Samen her und vergrößert sich während der Wachstumsperiode nicht.
Die Wirkung der Rhizobium-Transkonjuganten als Ersatz für Stickstoffdünger ist vornehmlich auf die Wirkung kleiner Wurzelknöllchen zurückzuführen, die an 75 % der Pflanzen vorhanden waren. Da pro Behälter 3 bis 5 Pflanzen gezogen wurden, war es nicht möglich, die Wurzeln zu trennen und nur die Pflanzen mit Wurzelknöllchen zu analysieren. Es wird erwartet, daß Wurzelknöllchenausbildung an 100 % der Pflanzen und die Entwicklung großer Wurzelknöllchen noch effektiver wären.
Um die Möglichkeit auszuschließen, daß die nodulierten +R-N-Nichtleguminosenpflanzen das Rhizobium-Impfmaterial oder die Bakterien, die sich später in den Behältern ausbreiten mögen, als Stickstoffquelle benutzen, wurde das folgende Experiment durchgeführt: Die Weizenvarietät Cornette und die Gerstenvarietät Taarn wurden jeweils mit R. lequminosarum Stamm Ml unter Anwendung der gleichen Verfahren, Mengen und Bedingungen
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Tabelle VIII N-Gehalt und Trockenmasse von nodulierter Gerste
| Pflanze | +R-N | 10) | Ve | rsuch 1 | 5) | [ | 3) | 19 | -R-N | 5) | 5,2 | |
| Tage | (n = | + 9 | -R+N | + 21,7 | + 38,4 | 0 | (n = | 0,1 | ||||
| TM | 43,85 | + 0 | (n = | + 0,9 | + 0,7 | 35 | ,15 + | 4,2 | ||||
| 31 | N | 0,99 | + 28 | ,2 | 71,84 | + 44,5 | +120,8 | 0 | ,27 + | 0,1 | ||
| TM | 121,53 | + 0 | ,2 | 2,15 | + 1,3 | + 0,8 | 41 | ,40 + | 7,1 | |||
| 50 | N | 2,56 | + 50 | ,7 | 224,95 | + 36,8 | + 94,3 | 0 | ,41 + | 0,1 | ||
| TM | 198,41 | + 0 | ,5 | 4,03 | + 1,1 | + 2,4 | 49 | ,87 + | 4,8 | |||
| 64 | N | 2,61 | + 56 | ,7 | 269,92 | + 76,9 | +196,4 | 0 | ,35 + | 0,3 | ||
| TM | 301,04 | + 0 | ,5 | 4,05 | + 2.9 | + 1,6 | 55 | ,58 + | 15,7 | |||
| 76 | N | 4,09 | +106 | ,1 | 296,76 | + 106,5 | 0 | ,61 + | 0,1 | |||
| TM | 499,23 | + 1 | .6 | 5,22 | + 1,2 | 64 | ,19 + | 11,5 | ||||
| 96 | N | 5,34 | +123 | ,9 | 506,33 | + 124,3 | 0 | ,35 + | 0,1 | |||
| DW | 535,47 | + 1 | ,4 | 9,90 | + 3,7 | ,10 + | ||||||
| 123 | 5,55 | ,7 | 556,38 | ,44 + | ||||||||
| ,1 | 10,34 | 3) | ||||||||||
| +R-N | 6) | Ve | rsuch 2 | 49 | -R-N | 11,8 | ||||||
| (n = | + 20 | -R+N | 0 | (n = | 0,1 | |||||||
| TM | 118,89 | + 0 | (n = | 53 | ,76 + | 9,9 | ||||||
| 54 | N | 3,30 | + 46 | .6 | 264,84 | 0 | ,45 + | 0,1 | ||||
| TM | 313,06 | + 0 | ,4 | 7,78 | 68 | ,49 + | 2,6 | |||||
| 71 | N | 5,81 | +279 | ,1 | 405,53 | 0 | ,41 + | 0,1 | ||||
| TM | 711,29 | + 1 | ,6 | 7,78 | 57 | ,42 + | 19,5 | |||||
| 80 | N | 7,85 | + 147 | ,6 | 617,75 | 0 | ,53 + | 0,2 | ||||
| TM | 802,30 | + 1 | ,2 | 10,26 | ,07 + | |||||||
| 92 | N | 10,08 | ,3 | 837,08 | ,46 + | |||||||
| ,6 | 11,99 | |||||||||||
TM = Trockenmasse
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beimpft, die für das Beimpfen dieser Nichtleguminosenpflanzen mit dem Rhizobium-Transkonjuganten, R. tritici bzw. R. hordei/beschrieben worden sind. Die mit R. lequminosarum beimpften Pflanzen wurden mit nichtstickstoffhaltigem Dünger gegossen, und die Speicherung von Stickstoff wurde mit der der -R-N-Pflanzen verglichen. Weder die mit R. lequminosarum beimpften Pflanzen noch die -R-N-Pflanzen sammelten Stickstoff an. Die Schlußfolgerung ist, daß ein nichtspezifischer Bakterienimpfstoff als solcher der Pflanze keinen Stickstoffdünger zuführt. Im Gegenteil, die in den Tabellen VII und
VIII dargestellte Stickstoffspeicherung, die als Reaktion auf die Nodulation (Wurzelknöllchenausbildung) mit R. tritici bzw· R. hordei erfolgt, muß auf Stickstoffbindung zurückzuführen sein.
13.3. Sorghum- und Reispflanzen
Drei Sorghumvarietäten, nämlich Dabar, Safra und Feterita wurden, wie in Abschnitt 9 beschrieben, mit Hilfe vqn Rhizobium sorqhi zur Wurzelknöllchenausbildung gebracht. Der Stickstoffgehalt, ausgedrückt in mg Stickstoff pro Pflanzenoberteil, und die Trockenmasse des Pflanzenoberteils wurden analysiert. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle
IX aufgeführt.
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Tabelle IX N-Gehalt und Trockenmasse von noduliertem Sorghum
+R-N -R+N -R-N
| Tage | mg/ χ Pflanze |
| 30 | TM |
| N | |
| 59 | TM |
| N | |
| 80 | TM |
| N | |
| 101 | TM |
| N | |
| 125 | TM |
| N |
(n = 6) (n "- 3) (n = 3)
33,83 + 10,1 49,60 + 22,5 25,50 + 4,2
0,40 + 0,1 1,42 + 0,7 0,26 + O
102,93 + 15,2 329,51 + 87,7 42,84 + 8,0
1,00 + 0,2 5,93 + 2,3 0,31 + O
179,84 + 62,2 602,34 + 44,9 43,77 +21,5
2,00+ 0,8 9,86+ 2,7 0,31+0
439,83 + -95,8 576,18 + 75,4 53,71 +12,4
4,40 + 0,9 11,02 + 0,9 0,31 + O
1242,94 + 391,4 1198,99 +596,0 56,76 + 7,8
11,65 + 2,4 12,44 + 6,8 0,27 + O
TM = Trockenmasse
Eine Reissorte M-20!wurde mit Hilfe von Rhizobium oryzae, wie in Abschnitt 10 beschrieben, zur Wurzelknöllchenausbildung gebracht. Der Stickstoffgehalt, ausgedrückt als mg Stickstoff pro Pflanzenoberteil, und die Trockenmasse des Pflanzenoberteils wurden analysiert. Die Resultate sind in der nachstehenden Tabelle X angegeben.
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| Tage | TM | Tabelle | +R-N | X | naduliertem | Reis | -R-N | |
| 62 | N | : und Trockenmasse von | 32,28 | -R+N | 23,44 | |||
| N-Gehalt | TM | IS | 0,32 | 48,87 | 0,16 | |||
| 74 | N | 48,04 | 1,10 | 21,63 | ||||
| TM | 1,15 | 94,73 | 0,16 | |||||
| 98 | N | 107,47 | 2,65 | 29,9 | ||||
| TM | 2,91 | 115,40 | 0,36 | |||||
| 128 | N | 174,89 | 3,45 | 22,16 | ||||
| 5,16 | 130,83 | 0,38 | ||||||
| * TM = | 4,33 | |||||||
| Trockenmasse |
Die Ergebnisse zeigen, daß die Trockenmasse der +R-N-Pflanzen anfänglich hinter der der -R+N-Pflanzen zurücksteht; am Ende des Versuchszeitraums gleicht die von den +R-N-Pflanzen angesammelte Trockenmasse jedoch der der -R+N-Pflanzen und kann sie übersteigen. Die Stickstoffspeicherung in den +R-N-Pflanzen und den -R+N-Pflanzen scheint etwa gleich zu sein.
13.4. Raps
Zwei Raps-Varietäten, nämlich Hanna und Topas, wurden, wie in Abschnitt 12 beschrieben, unter Verwendung von Rhizobium Rl 010824 zur Wurzelknöllchenausbildung gebracht. Der Stickstoffgehalt, ausgedrückt als mg Stickstoff pro Pflanzenoberteil und die Trockenmasse des Pflanzenoberteils wurden analysiert. Die Resultate sind in der nachstehenden Tabelle XI aufgeführt.
iö4 y
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Tabelle XI N-Gehalt und Trockenmasse von noduliertem Raps
-R+N
-R-N
47 TM · 67,25 + 17,4 344,91 + 31,6 9,71 + 0,2
6,71 + 0,1 0,22 + 0,2
59 TM 99,40 + 14,3 477,07 + 62,8 13,90 + 4,5
7,03 + 0,2 0,11 +0,1
73 ' TM 248,56 + 24,3 766,47 + 72,7 14,92 + 9,9
10,25 + 1,9 0,10.+ 0,04
| Prlanze | +R-N | + 17,4 |
| TM | 67,25 | + 0,3 |
| N | 0,89 | + 14,3 |
| TM | 99,40 | + 0,4 |
| N | 1,64 | + 24,3 |
| TM | 248,56 | + 0,7 |
| N | 2,00 | * 72.5 |
| TM | 424,80 | + 1,1 |
| N | 3,42 | + 22,2 |
| TM | 547,37 | + 1,9 |
| N | 5,73 | +241,8 |
| TM | 1013,59 | + 0,9 |
| N | 10,24 | |
| TM | 2231,55 | |
| N | 16,66 | |
98 TM 424,80 * 72,5 704,73 + 12,11 + 7,9
17,66 + 5,1 0,10 + 0,05
110 TM 547,37 + 22,2 1049,77 +388,6 17,86 +12,1
24,33 + 7,9 0,26 + 0,2
129 TM 1013,59 +241,8 1955,60 + 330,0 15,39 + 6,0
33,21 + 8,6 0,16+0,09
147 TM 2231,55 , ND ND
ND ND
TM = Trockenmasse
η = 4 Pflanzen pro Probe ND = Keine Angaben (No data)
Die Ergebnisse zeigen, daß die +R-N-Pflanzen etwa 50 % der von den -R+N-Pflanzen angesammelten Trockenmasse speicherten, und der Stickstoffgehalt der +R-N-Pflanzen betrug etwa 30 % dessen der -R+N-Pflanzen. Obgleich die Speicherung niedriger als bei den mit Stickstoff gedüngten Pflanzen war, erklären die bei den Rapspflanzen beobachteten kleinen Wurzelknöllcheri den Fortbestand der in Abwesenheit von Stickstoffdünger gezogenen nodulierten Rapspflanzen (vergleiche die Ergebnisse für +R-N mit denen für -R-N, wo weder Trockenmasse noch Stickstoff angesam-
- 67 -
melt wurden).
14, Mikroorqanismenbank
Die folgenden Rhizobiumstämme wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD; hinterlegt und erhielten die folgenden Eintragungsnummern:
| R. | tritici | 53.407 | - |
| R. | hordei | 53.404 | |
| R. | sorqhi | 53.405 | |
| R. | oryzae | 53.406 | |
| R. | Rl (010824) |
Der Geltungsbereich der Erfindung ist nicht durch die hinterlegten Mikroorganismen begrenzt, da die hinterlegte Probe als eine Veranschaulichung eines Aspekts der Erfindung zu verstehen ist und alle Mikroorganismen, die eine äquivalente Funktion haben, im Geltungsbereich der Erfindung liegen. Tatsächlich werden Fachleuten verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu den dargestellten und beschriebenen aus der Beschreibung und den zugehörigen Zeichnungen offenbar werden. Es ist beabsichtigt, daß solche Modifikationen in den Geltungsbereich der anhängigen Patentansprüche fallen.
Claims (8)
- Berlin,' den 18. 7. 198868 124/13Patentansprüche. .1. Verfahren zur Bindung von Stickstoff. in.llichtleguminosen, dadurch gekennzeichnet, daß die Samen einer Hichtleguminosea) mit einem LIa te rial behandelt werden, das die Infektion der genannten Samen bei der Keimung mit' einem Rhiaobia-Transformanten ermöglicht,b) ausgesät werden, · ' 'c) in Kontakt mit einem Rhizobia-Transformanten gebracht werden, der die genannten behandelten keimenden Samen infizieren kann, undd) ohne oder fast ohne Zusatz von Stickstoffdünger angebaut "werden.
- 2. Verfahren gemäß'Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufen a) -und c) vereinigt werden, indem das genannte' Liaterial und 'der genannte Rhizobia-Transformant kombiniertwerden, und Behandlung der genannten Samen vor den Aussäen mit der genannten Kombination.
- 3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die genannten Samen von iTichtleguminosen zur Pamilie; der Poaceae gehören, wie Weizen, vorzugsweise die Stämme Anja, Kraka'oder Vuka; Gerste, vorzugsweise'die Stämme Hasso, Cerise, Harry oder Igri; Sorghum, vorzugsweise' dieStamme Safra, Dabar oder Peterita; oder Reis.
- 4. Verfahren gemäß .Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, ' daß. die genannten Samen von Hichtleguininosen zur Familie der Cruciferae gehören, wie Kohl oder Raps, oder zur Familie der IJyrtaceae, wie Eucalyptus.
- 5. Verfahren zur Produktion von Rhizobia-Fp-Transkonjugaiiten zur Verwendung in einem. Verfahren gemäß einem der Ansprüche bis 4j gekennzeichnet durcha) Streichen eines ersten Rhizobium-Elters und eines zweiten .Rhizobiurn-Elters in abwechselnden Reihen auf ein festes liährmedium, welches außer den für das Wachstum erforderlichen Nährstoffen enthält: (i) einen nichtdenaturierten Extrakt eines Leguminosen-Y/irtspartners ' jedes Eltern-Rhizobiums oder (ii) chromatographische Fraktionen aus einem nichtdenaturierten Extrakt eines Leguminosen-vTirtspartners- jedes Eltern-Rhizobiums oder (iii) Kristalle aus den chromatographischen Fraktionen eines nichtdenaturierten Extrakts eines Leguminosen-. . \7irtspartners jedes Eltern-Rhiaobiums oder (iv) Pro-, teine, die mit dem Extrakt, den chromatographischen Praktionen oder ie-a Kristallen verwandt sind;b) Züchtung der Rliizobia-Eltern bei einer Temperatur von etwa 13 0G bis etwa 30 °G, so daß die Rhizobia-Eltem Kolonien mit einer bestimmten Farbe bilden;c) Selektieren einer milchig-weißen Rhizobium-F^-Trahskonjugant-Kolonie, .die zwischen den Rhizobia-Elternkolonienwächst; ^ "d) Streichen des Rhizobium-F..-Transkon,juganten in abwechselnden Reihen mit einem dritten Rhizobium-Elter auf das IJährmedium der Stufe a), das außerdem einen Leguminosenextrakt, chromatographische Fraktionen, Kristalle oder Proteine des dritten Rhizobia-Elters enthält, und 'e) Züchten des Rhizobium-I^-Transkonjuganten und des dritten Rhizobium-Elters bei' einer Temperatur von etwa 18 0C bis etwa 30 0C, so daß die Rhizobia-Eltern Kolonien bilden;f) Selektieren eines Rhizobium-P2-Transkonjuganten einer schneeweißen Kolonie, die zwischen dem RhXZObIa-F1-Transkonjuganten und dem dritten Rhizobia-Elter wächst.
- 6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das dritte Rhizobia-Elter eine dritte Rhizobia-Art,.ein zweiter Rhizobium-P.-Transkonjugant oder ein zweiter Rhizobium-j?2-Transkonjugant ist.
- 7. Material zur Behandlung von Samen einer Hichtleguminose zur Verwendung in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß es besteht aus (1) einem nichtdenaturierten Leguminosenestrakt, (ii) chromatographischen Praktionen aus einem solchen Extrakt, (iii) einem Material, hergestellt aus Kristallen aus einem solchen Extrakt oder (iv) Proteinen, die mit einem solchen Extrakt verwandt sind, aus jedem Leguminosen-vYirtspartner für jedes Rhizobium-Elter eines Rhizobium-Transformaten, der der symbiotiseh . Stickstoff in der Hichtleguminose bindet.
- 8. Material gemäß Anspruch 7, zur Verwendung bei einem der An- ..A-spräche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem den Rhizobia-Transformanten enthält, welcher, symbiotisch Stickstoff in der Hichtleguniinose bindet.
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