DD292084A5 - PROCESS FOR THE RASTERMICROSCOPIC DETERMINATION OF CALCIUMION CONCENTRATION IN CELLS - Google Patents

PROCESS FOR THE RASTERMICROSCOPIC DETERMINATION OF CALCIUMION CONCENTRATION IN CELLS Download PDF

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Abstract

Verfahren zur Bestimmung von Calciumkonzentrationen in Zellen. Das Verfahren ermoeglicht die absolute Bestimmung der Ca2-Konzentration in biologischen Materialien mit Hilfe solcher Indikatorfarbstoffe, die auf eine Konzentrationsaenderung mit einer Veraenderung der Fluoreszenzquantenausbeute reagieren. Die Loesung besteht darin, dasz die Zellen mit einem solchen Indikatorfarbstoff eingefaerbt und dann mit kurzen Lichtimpulsen zur Fluoreszenz angeregt werden, das Fluoreszenzlicht mit zeitlicher Aufloesung registriert wird und durch Auswertung des Abklingverhaltens das Verhaeltnis der Anteile der beiden Fluoreszenzkomponenten, die dem freien Farbstoff einerseits und dem Farbstoff-Ca2-Komplex andererseits entsprechen, und daraus die Ca2-Konzentration ermittelt werden.{Rastermikroskopie; Ca2-Konzentration, intrazellulaer; Indikatorfarbstoff; Fluoreszenz; Fluoreszenzquantenausbeute}Method for the determination of calcium concentrations in cells. The method enables the absolute determination of the Ca 2+ concentration in biological materials with the aid of indicator dyes which react to a change in concentration with a change in the fluorescence quantum yield. The solution is that the cells are tinted with such an indicator dye and then excited to fluorescence with short light pulses, the fluorescent light is registered with temporal resolution and by evaluating the Abklingverhaltens the ratio of the proportions of the two fluorescent components, the free dye on the one hand and the On the other hand, and from this the Ca2 concentration can be determined {Scanning Microscopy; Ca2 concentration, intracellular; Indicator dye; Fluorescence; Fluorescence quantum yield}

Description

Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

Die Erfindung betrifft die Bestimmung intrazellulärer Ca2*-Konzentrationen. Calcium nimmt eine zentrale Stellung bei der biochemischen Signalübertragung auf zellulärer Ebene ein; es steuert die Aktivierung von Transmittern, Enzymen oder Hormonen ausgehend von Potentialänderungen oder Rezeptoren in tierischen und pflanzlichen Zellen. Die Messung von Ca2*-Konzentrationen im Zeilinneren ist deshalb von herausragender Bedeutung in der experimentellen Zellbiologie und Neurobiologie.The invention relates to the determination of intracellular Ca 2 * concentrations. Calcium occupies a central position in biochemical signaling at the cellular level; It controls the activation of transmitters, enzymes or hormones from potential changes or receptors in animal and plant cells. The measurement of Ca 2 * concentrations in Zeilinneren is therefore of paramount importance in experimental cell biology and neurobiology.

Charakteristik des bekannten Standes der TechnikCharacteristic of the known state of the art

Es sind verschiedene Verfahren zur Bestimmung von intrazellulären Ca2+-Konzentrationen bekannt, die auf dem Einsatz von Ca2"-empfindlichen Mikroelektroden, Biolumineszenz von Biopolymeren "nd Fluoreszenzindikatoren beruhen. Die letztgenannte Methode wird wegen ihrer hohen Empfindlichkeit und ihres Verzichts auf mechanische Eingriffe in den letzten Jahren in wachsendem Maße breit eingesetzt. Sie bnruht auf der Verwendung von speziellen Sondenfarbstoffen, die eine hohe Affinität und Selektivität für die Bindung von Ca2^ sowie eine möglichst effiziente Fluoreszenz mit starker Änderung von Fluoreszenzparametern bei Ca2"-Anlagerung aufweisen. Die Fluoreszenzregistrierung wird mit mikroskopischen oder durchflußzytometrischen Verfahren kombiniert. Dabei ist das Verfolgen von Aktivierungsprozessen im Echtzeitbetrieb zusammen mit räumlicher Darstellung („optical recording") von besonderem Interesse. Es wurden spezielle Mikroskopphotometer entwickelt, mit denen für solche Indikatorfarbstoffe, die eine deutliche spektrale Änderung bei Ca2r-Bindung aufweisen, aus der Fluoreszenzmessung bei zwoi verschiedenen Anregungs- bzw. Fluoreszenzwellenlängen mittels eines Quotientenverfahrens auf die Ca2*-Konzentration geschlossen wird (DE 3604815; Mature 318 [1985) 558-561). Der Einstz der Laserrastermikroskopie ist vor allem im Zusammenhang mit der Möglichkeit der 3D-Auflösung und Tiefendiskriminierung attraktiv.Various methods for the determination of intracellular Ca 2+ concentrations are known which are based on the use of Ca 2 "-sensitive microelectrodes, bioluminescence of biopolymers and fluorescence indicators. The latter method is being widely used in recent years because of its high sensitivity and its lack of mechanical intervention. They bnruht on the use of special probe dyes which have a high affinity and selectivity for binding Ca 2 ^ as well as the most efficient fluorescence with a strong change in fluorescence parameters in Ca 2 "-Anlagerung. The fluorescence registration is combined with microscopic or flow cytometric methods. The pursuit of activation processes in real-time operation together with spatial representation ("optical recording") is of particular interest. There have been developed special microscope photometer with which for such indicator dyes, which have a significant spectral change in Ca 2r bond, from the fluorescence measurement at zwoi different excitation and fluorescence wavelengths by means of a quotient method to the Ca 2 + concentration is closed (DE 3604815 Mature 318 (1985) 558-561). The use of laser scanning microscopy is particularly attractive in the context of the possibility of 3D resolution and deep discrimination.

Einige wenige Indikatorfarbstoffe haben sich in der breiten Anwendung durchgesetzt (J. Biol. Chem. 260 [1985] 3440-3450; Biochem. J. 248 [19871,313-328; Trans. inNeurosci. 11 [1988] 419-424). Bei den Farbstoffen „fura-2" und „indo-1" ändert sich im wesentlichen das Absorptions- bzw. Fluoreszenzspektrum bei Ca2+-Anlagerung, bei „quin-2" und „fluo-3" die Fluoreszenzquantenausbeute. Während die übrigen Farbstoffe im UV-Bereich angeregt werden müssen, bietet „fluo-3" den entscheidenden Vorzug, im sichtbaren Wellenlängenbereich um 500nm anregbar zu sein. Das ist einerseits hinsichtlich der Verfügbarkeit von Lichtquellen (Argonlaser) sowie optischen Bauelementen günstig. Andererseits entfällt weitestgehend die bei Anregung im nahen UV-Bereich störend in Erscheinung tretende Eigenfluoresenz von Zellen. Zudem wird der parallele Einsatz von UV-Strahlung z. B. zur photostimulierten Ca2+-Freisetzung möglich.A few indicator dyes have become widely used (J. Biol. Chem. 260 [1985] 3440-3450; Biochem J. 248 [19871,313-328; Trans. In Neurosci. 11 [1988] 419-424). For the dyes "fura-2" and "indo-1" essentially the absorption or fluorescence spectrum changes with Ca 2+ addition, with "quin-2" and "fluo-3" the fluorescence quantum yield. While the other dyes have to be excited in the UV range, "fluo-3" offers the decisive advantage of being excitable in the visible wavelength range around 500 nm, which is favorable on the one hand with regard to the availability of light sources (argon lasers) and optical components In addition, the parallel use of UV radiation, eg for the photostimulated release of Ca 2+, is possible due to the intrinsic fluorescence of cells which is disturbing when excited in the near UV range.

Die Absolutbestimmung der Ca2+-Konzentration mittels solcher Farbstoffe, die keine wesentliche Spektrenverschiebung bei C '"-Anlagerung aufweisen, ist jedoch mit einer außerordentlich komplizierten, zeitaufwendigen und zeilschädigenden Eichprozedur verbundenThe absolute determination of the Ca 2+ concentration by means of such dyes, which have no significant spectral shift in C '"annealing, however, is associated with an extremely complicated, time-consuming and zeilschädigenden calibration procedure

Es ist eine absolute Intensitätsmessung nötig, die durch lokale oder zeitliche Änderungen An absolute intensity measurement is necessary, due to local or temporal changes

- der Farbstoffkonzentration,the dye concentration,

- der optischen Weglänge in der Zelle,the optical path length in the cell,

- der Anregungsintensität,- the intensity of stimulation,

- der Detektorempfindlichkeit- the detector sensitivity

beeinträchtigt wird. Unter Erhaltung dieser Bedingungen ist für jedes konkrete Objekt in situ die Bestimmung der Fluoreszenzintensitäten für praktisch verschwindende und sehr hohe r ~ Konzentration erforderlich. Die von „Mol. Probes Inc." dafür angegebene Eichprozedir beinhaltet einen z. B. durch dt sierte Zugabe von lonomycin ausgelösten Ca2+-Einstrom aus dsm umgebenden Medium bis in den Sättigungsbereich; anschließend wird durch Mn2*-Zugabo die Fluoreszenz gelöscht, um einen Bezug zu dem Wert ohne Ca2" zu erhalten.is impaired. While preserving these conditions, it is necessary to determine the fluorescence intensities for practically every objec- tive object in situ for practically vanishing and very high r ~ concentration. The of "Mol. Probes Inc.'s designated calibration procedure involves, for example, adding saturated ionized Ca 2+ influx from the surrounding medium to the saturation region, then quenching the fluorescence by Mn 2 * addition to reference the value without Ca 2 "to obtain.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Ziel der Erfindung ist die Senkung des Aufwandes für Eichprozeduren und Herabsetzung der damit verbundenen Belastung des Zellmaterials hei der absoluten Ca2+-Konzentrationsbestimmung mittels Fluoreszenzindikatoren.The aim of the invention is to reduce the cost of calibration procedures and reduce the associated burden of cell material hei the absolute Ca 2+ concentration determination by means of fluorescence indicators.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, oin Verfahren anzugeben, mit dem die absolute Bestimmung der Ca'+-Konzentration in biologischen Materialien mit Hilfe solcher Indikatorfarbstoffe, die auf eine Veränderung der Ca2*-Konzentration mit einer Veränderung der Flureszenzquantenausbeute reagieren, unter Vermeidung sonst üblicher aufwendiger Eichprozeduren gelingt. Die Lösung gelingt erfindungsgemäß dadurch, daß die Zellen mit einem solchen Indikatorfarbstoff, der auf eine Veränderung der Ca2+-Konzontration mit einer Voränderung dar Fluoreszonzquantonausbeute reagiert, eingefärbt und dann mit kurzen Lichtimpulsen zur Fluoreszenz angeregt werden, das Fluoreszenzlicht mit zeitlicher Auflösung registriert wird und durch Auswertung des Abklingverhaltens das Verhältnis der Anteile der beiden Fluoreszenzkomponenten, die dem freien Farbstoff einerseits und dem Farbstoff-Ca2~-Komplex andererseits entsprechen, und daraus die Ca2+-Konzentration ermittelt werden. In der flüssigen Lösung, deren Ca2~-Gehalt zu bestimmen ist (Cytosol der Zellen), liegen nach Zugabe des Indikatorfarbstoffes freie Farbstoffanionen (FS; Index 1) und Farbstoff-Ca2"-Komplexe (FSCa; Index 2) im chemischen Gleichgewicht vor. Ihr Konzentrationsverhältnis hängt in bekannter Weise gemäß dem Massenwirkungsgestez mit der Ca2*-Konzentration über die Dissoziationskonstante Ko zusammen.The invention has for its object to provide oin method by which the absolute determination of the Ca ' + concentration in biological materials using such indicator dyes that respond to a change in the Ca 2 * concentration with a change in the Flureszenzquantenausbeute, while avoiding otherwise conventional elaborate calibration procedures succeed. The solution according to the invention succeeds according to the invention in that the cells are colored with an indicator dye which reacts to a change in the Ca 2+ concentration with a change in fluoreszonzquanton yield and then excited to fluorescence with short light pulses, the fluorescent light is registered with temporal resolution and by evaluating the decay behavior, the ratio of the proportions of the two fluorescent components corresponding to the free dye on the one hand and the dye Ca 2 ~ complex on the other hand, and from this the Ca 2+ concentration can be determined. In the liquid solution, whose Ca 2 - content is to be determined (cytosol of the cells), free dye anions (FS, Index 1) and dye-Ca 2 "complexes (FSCa, Index 2) are in chemical equilibrium after addition of the indicator dye Their concentration ratio depends in a known manner according to the Massenwirkungsgestez with the Ca 2 * concentration on the dissociation constant Ko together.

[Ca2^l = K0 c2/c„ (1)[Ca 2 ^ l = K 0 c 2 / c "(1)

hierbei ist 1:1 -Stöchiometrie des Komplexes vorausgesetzt.this requires 1: 1 stoichiometry of the complex.

Die Messung hat die Aufgabe, das Verhältnis C2Zc1 zu ermitteln; erfindungsgemäß wird dazu die zeitaufgelöste Registrierung des Abklingens der Fluoreszenz herangezogen.The measurement has the task to determine the ratio C 2 Zc 1 ; According to the invention, the time-resolved registration of the decay of the fluorescence is used for this purpose.

Ursache für eine bei Ca2+-Bindung eintretende Änderung der Qua 'tenausbeute bzw. Intensität der Fluoreszenz des Indikatorfarbstoffes sind Veränderungen der Raten verschiedener Relaxationsprozesse aus dem angeregten Zustand der Farbstoffmoleküle. Diese bestimmen andererseits die Lebensdauer des angeregten Zustandes, die insbesondere als Abkling eit des Fluoreszenz nach Impulsanregung der Beobachtung zugänglich ist. Deshalb sind für solche Indikatorfarbstoffe, von denen bekannt ist, daß sie auf Ca2*-Bindung mit einer erheblichen Veränderung der Fluoreszenzquantenausbeute reagieren (insbesondere quin-2 und fluo-3), auch deutliche Unterschiede der Fluoreszenzabklingzeiten für FS und FSCa zu erwarten. Die Fluoreszenzintensität bei gleichzeitigem Vorliegen von FS und FSCa hat unter der Voraussetzung, daß nur diese beiden Spezies fluoreszieren und jeweils einfach-expenentielles Abklingverhalten aufweisen, einen zeitlichen Verlauf der FormCause of a Ca 2+ bond occurring change in the Qua' tenausbeute or intensity of the fluorescence of the indicator dye are changes in the rates of different relaxation processes from the excited state of the dye molecules. On the other hand, these determine the life of the excited state, which is particularly accessible as Abkling with the fluorescence after impulse excitation observation. Therefore, for those indicator dyes known to react to Ca 2 * binding with a significant change in fluorescence quantum yield (particularly quin-2 and fluo-3), significant differences in fluorescence decay times for FS and FSCa are also expected. The fluorescence intensity in the simultaneous presence of FS and FSCa has a time course of the form, provided that only these two species fluoresce and each have a simple-expen- sive decay behavior

Mt) = a (c, · kn · exp{-t/r,} + C2 · kf2 · exp{-t/r2}), (2)Mt) = a (c, · k n · exp {-t / r,} + C 2 · k f 2 · exp {-t / r 2 }), (2)

wenn die Anregung mit einem im Vergleich zu den Abklingzeiten r)i2 kurzen Lichtimpuls erfolgt. Der Faktor a hängt mit der absorbierten Anregungsenergie sowie der Effektivität des Fluoreszenznachweises zusammen. kn, 2 sind die Raten der strahlenden Desaktivierung des angeregten Zustandes füi die beiden Farbstoffspezies. Im weiteren wird angenommen, daß kFι = kp2 gilt; anderenfalls sind Eichmessungen z.B. an Lösungen bekannter Ca2~-Konzentration heranzuziehen. Die lineare Abhängigkeit der Fluoreszenzintensität von der Konzentration ist an ausreichend schwache Absorption und nicht zu starke Anregung gebundenwhen the excitation occurs with a short light pulse compared to the decay times r ) i2 . The factor a is related to the absorbed excitation energy and the effectiveness of fluorescence detection. kn, 2 are the rates of radiative deactivation of the excited state for the two dye species. In the following it is assumed that k F ι = kp2 applies; otherwise, calibration measurements should be used, for example, on solutions of known Ca 2 ~ concentration. The linear dependence of the fluorescence intensity on the concentration is bound to sufficiently weak absorption and not too strong excitation

Die zeitaufgelöste Messung der Fluoreszenzintensität liefert The time-resolved measurement of fluorescence intensity provides

Mt) = A, exp{-t/r,} + A2 exp{-t/r2).Mt) = A, exp {-t / r,} + A 2 exp {-t / r 2 ).

Aus den Amplituden A1,2, die in bekannter Weise durch Kurvenanpassung aus der gemessenen Abklingkurve erhalten werden können, ist gemäß (2) und für den Fall kn = kF2 From the amplitudes A 1 , 2 , which can be obtained in a known manner by curve fitting from the measured decay curve, according to (2) and for the case k n = k F 2

A2/A, = c2/c,, (4)A 2 / A, = c 2 / c ,, (4)

woraus sich nach (1) mitresulting from (1) with

(Ca2T] = KD · A2/A, (5)(Ca 2T ] = K D · A 2 / A, (5)

unmittelbar die Ca2*-Konzentration ergibt.immediately gives the Ca 2 * concentration.

AusführuiigsbeispielAusführuiigsbeispiel

Das Weser, der Erfindung soll an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden. Eine zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignete Anordnung ist in Fig. Ί schematisch dargestellt. Das biologische Objekt 1, dessen Ca^-Konzentrationzi' h"-t'mmen ist, wird gemäß üblicher Vorschrift mit dem Indikatorfarbstoff quin-2 oder fluo-3 eingefärbt. Die Anregung des Fluoreszenz erfolgt durch einen mittels des Mikroskopobjektivs 2 fokussierten Laserstrahl 3, der in einem modensynchronisierten kontinuierlichen Laser4 erzeugt wird und demzufolge aus einem £ug von Picosekundenimpulsen besteht. Das Strahlablenksystem 5 dient der Positionierung des Laserfokus auf dem Objekt 1. Die vom Objekt 1 ausgehende Fluoreszenzstrahlung wird in Rückwärtsrichtung vom Mikroskopobjektiv 2 erfaßt, am Teilerspiegel 6 reflektiert und gelangt auf den Sekundärelektronenvervielfacher 7. Dieser liefert Einzelphotonenimpulse, die in einem Meßsystem für zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung 8 registriert werden. Die Fluoreszenzabklingkurve, die den zeitlichen Verlauf der Fluoreszenzintensität nach Impulsanregung repräsentiert und von der Ca^-Konzentration abhängt (vgl. Fig. 2), wird in dem angeschlossenen Computer 9 ausgewertet, so daß das Verhältnis der Amplituden der beiden Fluoreszenzkomponenten, die von Farbstoff-Ca2+-Komplexen bzw. freien Farbstoffanionen herrühren, erhalten wird. Daraus wird mit der bekannten Dissoziationskonstante unmittelbar die Ca2+-Konzentration berechnet. Sie kann nach Messung an vielen Punkten des Objektes 1 in Abhängigkeit von der mit der Kontrolleinrichtung 10 ermittelten Position des Laserstrahls als Rasterbild dargestellt werden.The Weser, the invention will be explained in more detail in an embodiment. An arrangement suitable for carrying out the method according to the invention is shown schematically in FIG. The biological object 1, whose -t'mmen Ca ^ -Konzentrationzi 'h' will be colored in accordance with conventional procedure with the indicator dye quin-2 or fluo-3. If the excitation of the fluorescence by means of a focused laser beam 2 of the microscope objective 3, The beam deflection system 5 is used to position the laser focus on the object 1. The fluorescence emitted by the object 1 fluorescence radiation is detected in the reverse direction of the microscope objective 2, reflected at the beam splitter 6 and This yields single photon pulses registered in a time-correlated single photon counting system 8. The fluorescence decay curve, which represents the time course of the fluorescence intensity after pulse excitation and depends on the Ca 2 concentration (see Fig. 2), becomes in that computer 9 is evaluated, so that the ratio of the amplitudes of the two fluorescent components resulting from dye-Ca 2+ complexes or free dye anions is obtained. From this, the Ca 2+ concentration is calculated directly with the known dissociation constant. It can be displayed as a raster image at many points of the object 1 as a function of the position of the laser beam detected by the control device 10.

Fig. 2 zeigt als Beispiel das Fluoreszenzabklingen für quin-2-Lösungen definierten Ca2+-Gehaltes(a: 10~emol/l,b: 1(T7mol/l)bei festem pH-Wert 6,72 (Pufferlösung 10~2mol/l MOPS) und einer Wellenlänge 490 nm. Die Kurve c repräsentiert den Anregungsimpuls (Wellenlänge 350nm).Fig. 2 shows as an example the fluorescence decay for quin-2 solutions defined Ca 2+ content (a: 10 ~ e mol / l, b: 1 (T 7 mol / l) at a fixed pH 6.72 (buffer solution 10 ~ 2 mol / l MOPS) and a wavelength 490 nm. The curve c represents the excitation pulse (wavelength 350 nm).

Claims (2)

Verfahren zur rastermikroskopischen Bestimmung von intrazellulären Ca2+-Konzentrationen, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen mit einem solchen Indikatorfarbstoff, der auf eine Veränüerung der Ca2+-Konzentration mit einer Veränderung der Fluoreszenzquantenausbeute reagiert, eingefärbt und dann mit kurzen Lichtimpulsen zur Fluoreszenz angeregt werden, das Fluoreszenzlicht mit zeitlicher Auflösung registriert wird und durch Auswertung des Abklingverhaltens das Verhältnis der Anteile der beiden Fluoreszenzkomponenten, die dem freien Farbstoff einereits und dem Farbstoff-Ca2+-Komplex andererseits entsprechen, und daraus die Ca2+-Konzentration ermittelt werden.A method for scanning microscopic determination of intracellular Ca 2+ concentrations, characterized in that the cells are colored with such an indicator dye, which responds to a decrease in the Ca 2+ concentration with a change in the fluorescence quantum yield, and then excited to fluorescence with short light pulses in that the fluorescent light is registered with temporal resolution and, by evaluating the decay behavior, the ratio of the proportions of the two fluorescent components corresponding to the free dye already and the dye Ca 2+ complex on the other hand, and from this the Ca 2+ concentration are determined. HierzuFor this 2 Seiten Zeichnungen2 pages drawings
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