DE10004135A1 - Kammer für Zellkulturen - Google Patents

Abstract

Die Kammer zum Kultivieren und Mikroskopieren von Zellen wird von einem unteren Teil als Boden und einem oberen Teil als Abdeckung gebildet, wobei zumindest der mittlere Bereich des Bodens und der Abdeckung aus transparentem Kunststoff ausgebildet ist und der Boden eine einheitliche Dicke von 40-400 mum, bevorzugt 100-200 mum, aufweist.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine Kammer zum Kultivieren und Mikroskopieren von Zellen, insbesondere für die hochauf­ lösende Mikroskopie von Zellkulturen.

Das Kultivieren von Zellen ist nur in speziell hierfür ausgestatteten Labors möglich, was mit hohen Investitions­ kosten verbunden ist. Wichtige Komponenten sind u. a. eine Flow Hood zum sterilen Arbeiten sowie ein Inkubator, der die optimalen Bedingungen für das Wachstum der Zellen von 37°C, 5% Kohlendioxid und 100% Humidität gewährleistet. Außerdem wird ein einfaches Mikroskop benötigt, um die Profileration der Zellen zu kontrollieren.

Die Zellen wachsen auf dem Boden einer sterilen Kultur­ schale, die meist aus Kunststoff (Polypropylen oder Poly­ styrol) besteht und mit einem Nährmedium gefüllt ist. Sobald die Zellen einen konfluenten Zellrasen bilden, müssen sie vom Boden abgelöst und in neue Kulturschalen ausgesät werden.

Zur Untersuchung der Zellen mit hochauflösender Mikroskopie sind herkömmliche Kulturschalen aufgrund ihres dicken Bodens (ca. 1 mm) und der unzureichenden optischen Qualität des Kunststoffes schlecht geeignet. Zum einen haben die verwen­ deten Kunststoffe doppelbrechende Eigenschaften, zum anderen liegen die Arbeitsabstände von hochauflösenden Objektiven (Distanz von Objektiv und Fokalebene) deutlich unterhalb der Bodendicke solcher Kulturschalen.

Die Zellen werden deshalb auf Deckgläschen aufgebracht, wie sie für die Mikrokopie üblich sind, da die meisten Objektive auf die Deckglasdicke von 170 µm optimiert sind. Dazu werden sterilisierte beschichtete Deckgläschen in die Kulturschalen gelegt und eine Zellsuspension aufgetragen. Die Adhäsion der Zellen auf das Substrat der Glasoberfläche nimmt dabei mindestens 6 bis 12 Stunden in Anspruch. Anschließend können die Deckgläschen entnommen und auf einen Objektträger gelegt werden.

Das Umschichten der Zellproben zwischen den Kulturschalen und den Deckgläschen ist nicht nur zeitaufwendig, sondern erfordert auch exaktes und konzentriertes Arbeiten, um nicht die Zellprobe bei einem der Teilschritte zu verlieren. Der Transfer der präparierten Proben von der Flow Hood zum Mikroskop und deren Untersuchung findet zum großen Teil unter unsterilen Bedingungen statt. Durch die zwangsläufige Verunreinigung der Proben mit Bakterien, die sich mit der Zeit weiter ausbreiten, ist die Beobachtungszeit der Zellen auf wenige Stunden limitiert. Aufgrund derartiger Kontami­ nationen sind keine Langzeituntersuchungen derselben Probe möglich. Für viele Anwendungen wäre das Studium eines identischen Systems als Funktion der Zeit jedoch ein entscheidender Vorteil gegenüber anderen Techniken (z. B. Luziferase-Assay in der Gentechnologie).

Eine weitere Voraussetzung für die Untersuchung der Zellen ist, daß die Zellprobe auf einer konstanten Temperatur von 37°C gehalten und mit ca. 5% Kohlendioxid begast wird. In der Praxis wird dabei der gesamte Objekttisch des Mikroskops beheizt und ein großvolumiges Kompartiment begast. Dies ist mit einem großen Aufwand und erhöhten Kosten verbunden.

In der Praxis kommen auch Hybridschalen mit einem Glasboden und einem Kunststoffrand, sowie einem Kunststoffdeckel als Abdeckung zum Einsatz. Diese sind jedoch sehr teuer. Sie werden deshalb wiederholt verwendet, wozu eine aufwendige Reinigung der Schalen notwendig ist. Außerdem läßt sich eine optimale Ausleuchtung (Köhlersche Beleuchtung) der Probe durch den Kondensor des Mikroskops aufgrund der großen Bauhöhe zwischen Boden und Abdeckung (< 1 cm) in vielen Fällen nicht erreichen und es entsteht Streulicht, worunter die optische Qualität der mikroskopischen Aufnahme leidet.

Durch die polarisierenden und doppelbrechenden Eigenschaften des für den Deckel verwendeten Kunststoffs, eignen sich die Schalen nicht für jede Art von Mikroskopie. Differential- Interferenz-Kontrast- und Phasenkontrastmikroskopie ist des­ halb nur bedingt möglich. Ferner können die Hybridschalen nicht direkt an ein Flußsystem, z. B. zur Begasung, ange­ schlossen werden, wie es für viele Experimente wünschenswert ist.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Kammer zum Kultivieren und Mikroskopieren von Zellen vorzusehen, die die Herstellung von Zellproben vereinfacht, zur hochauflö­ senden Mikroskopie geeignet ist und Langzeitstudien an Zell­ proben ermöglicht.

Diese Aufgabe ist gemäß der Erfindung durch die Merkmale des Anspruchs 1 gelöst.

Demgemäß weist die Kammer zum Kultivieren und Mikroskopieren von Zellen einen unteren Teil als Boden und einen oberen Teil als Abdeckung auf, wobei zumindest der mittlere Bereich des Bodens und der Abdeckung aus transparentem Kunststoff ausgebildet ist und der Boden eine einheitliche Dicke von 40 -400 µm, bevorzugt 100-200 µm aufweist.

Bei der vorliegenden Erfindung ist für die Untersuchung von Zellen ein Transfer der Zellen zwischen dem Aussäen der Zellen und der Beobachtung unter dem Mikroskop nicht mehr notwendig. Ein hierfür speziell ausgestattetes Labor ist daher nicht erforderlich. Die geringe Dicke des Bodens der Kammer ermöglicht es, herkömmliche Mikroskopobjektive einzu­ setzen, ohne vorher die Zellen auf einen geeigneten Objektträger aufbringen zu müssen. Eine Kontamination beim Transport oder durch das Transferieren der Zellproben kann durch die vorliegende Erfindung ausgeschlossen werden. Dadurch werden auch Langzeitstudien von einigen Stunden bis zu Wochen an den Proben möglich.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die Kammer luftdicht und steril verschließbar und weist Zugriffs­ öffnungen auf. Dadurch können an der Kammer Zu- und Abläufe für Flüssigkeiten und Gase vorgesehen werden. Sie dienen z. B. zur Versorgung der Zellen in der Kammer mit frischem Kulturmedium oder der Begasung mit 5% Kohlendioxid zur Stabilisierung des pH-Wertes. Über einen weiteren Kanal ist auch die Applikation verschiedener Substanzen auf die Zellen möglich. Indem die Zugriffsöffnungen beispielsweise durch eine Öffnung in der Kammer, die durch eine Gummischeibe abgedeckt ist, ausgebildet ist, kann das Injizieren von Substanzen oder das Anschließen von Schläuchen zum Einspülen von Medien vorgenommen werden, ohne die Gefahr der Kontami­ nation der Probe in der Kammer.

Die Abdeckung der Kammer weist zumindest im mittleren, für die Mikroskopie relevanten Bereich eine einheitliche Dicke von 40-400 µm, bevorzugt 100-200 µm auf, so dass bei der Beleuchtung der Probe kein störendes Streulicht durch die Abdeckung entsteht und das Mikroskopieren behindert. Der Abstand zwischen dem Boden und der Abdeckung beträgt nicht mehr als 10 mm, wodurch eine optimale Ausleuchtung der Zellprobe erzielt werden kann. Der Durchmesser der Kammer kann im Bereich von mehreren Millimetern bzw. Zentimetern variieren. Die gesamte Kammer, aber zumindest der zur Mikroskopie relevante Bereich des Bodens und der Abdeckung, wird bevorzugt aus neuartigen hochtransparenten Kunststoffen (z. B. cyclischen Olifinen) mit geringen doppelbrechenden und polarisierenden Eigenschaften hergestellt. Darüber hinaus sind sie chemisch gegenüber vielen Substanzen beständig und weisen eine hohe mechanische Stabilität auf. Durch eine derartige Dimensionierung und Ausgestaltung der Kammer wird die Anwendung aller mikroskopischen Techniken (Fluoreszenz-, Phasenkontrast-, Differential-Interferenz-Kontrast- und konfokale Mikroskopie), insbesondere der hochauflösenden Mikroskopie, mit hoher optischer Qualität ermöglicht.

Um Langzeitmessungen durchführen zu können, müssen die Zellen unter physiologischen Bedingungen gehalten werden. Dies erfordert neben der Begasung der Zellen mit 5% Kohlen­ dioxid, die Temperierung der Kammer auf 37°C. Dies kann leicht durch herkömmliche integrierte oder externe Komponen­ ten, wie z. B. einem Heizdraht in der Kammerwand oder einem Mikroinkubator, gewährleistet werden.

Ausserdem kann der Boden innerhalb der Kammer ein Raster mit einer bevorzugten Einteilung zwischen 0,1 und 1,5 mm auf­ weisen. Dadurch können einzelne Zellen auf dem hochtrans­ parenten Bereich lokalisiert, bzw. wiedergefunden werden. Interessant ist dies für Langzeitmessungen, bei der die Probe mehrmals abgerastert wird. So können bestimmte Vor­ gänge an einzelnen Zellen als Funktion der Zeit studiert werden.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können mehrere der Kammern nebeneinander auf einer Grundplatte angebracht werden. Dadurch entstehen sogenannte Multiwell- Platten, die zur Untersuchung mehrerer Proben in Folge dienen. Damit ist es beispielsweise nicht mehr erforderlich, die verschiedenen Kammern einer Versuchsreihe einzeln zu justieren.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht eine einfache und zeitsparende Handhabung von Zellproben, den sterilen Trans­ port der Proben über größere Entfernungen, sowie Langzeit­ studien an den Proben und schafft optimale Bedingungen für hochauflösende Mikroskopie.

Weitere Ausgestaltungen gehen aus den Unteransprüchen hervor.

Die Erfindung ist in Ausführungsbeispielen anhand der Zeichnungen näher erläutert. In diesen stellen dar:

Fig. 1: einen Querschnitt durch eine Kammer zum Kultivieren und Mikroskopieren gemäß der vorliegenden Erfindung,

Fig. 2: eine Aufsicht auf eine Kammer gemäß der Erfindung,

Fig. 3: einen Querschnitt durch eine Kammer gemäß einer zweiten Ausführungsform der Erfindung und

Fig. 4: ein Kammersystem mit mehreren Kammern gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung.

In Fig. 1 ist eine Kammer 2 gemäß der vorliegenden Erfindung mit einem unteren Teil 4 als Boden und einem oberen Teil 6 als Abdeckung gezeigt. Der obere Teil 6 ist von dem unteren Teil 4 abnehmbar. Die beiden Teile weisen einen genauen Paßsitz auf, sodass die Kammer nach dem Zusammensetzen der beiden Teile luftdicht und steril verschließbar ist. Die mittleren, zur Mikroskopie relevanten Bereiche im Boden 8 und der Abdeckung 10 sind aus einem dünnen hochtransparenten Kunststoff ausgebildet.

Zur Herstellung der Kammer 2 werden vorgefertigte runde Rahmen 11, 12 verwendet, die an einem Rand rundherum eine senkrecht nach innen gerichtete Plattform 13, 14 aufweisen. Diese Rahmen bilden die Seitenwand der Kammer. Ein Kunst­ stoff wird in Form einer Kunststofffolie mit Hilfe der Plattformen in den Rahmen gespannt und bildet so den Boden 8, bzw. die Abdeckung 10 der Kammer. Der Rahmen 11 für das untere Teil 4 hat einen entsprechend kleineren Durchmesser als der Rahmen 12 für das obere Teil 6, so dass die beiden Teile beim Zusammensetzen genau auf einander passen und die Kammer verschließen.

Die Kammer weist in dieser Ausführungsform einen runden Querschnitt von ca. 30 mm Durchmesser auf. Sie kann aber auch in einer beliebigen anderen Form hergestellt werden. Der Abstand des Bodens 8 und der Abdeckung 10 beträgt weniger als 10 mm, um eine gute Ausleuchtung der Probe zu erreichen und Streulicht zu vermeiden. Die für den Boden 8 und die Abdeckung 10 verwendete Kunststofffolie weist eine einheitliche Dicke von 170 µm auf, da herkömmliche Objektive auf dieses Maß normiert sind.

Für das Flußsystem zur Versorgung der Kammer 2 sind Zugriffsöffnungen vorhanden. In dem Rahmen 11 des unteren Teils 4 der Kammer sind zwei sich gegenüberliegende Zugriffsöffnungen durch die Seitenwand vorgesehen, wovon eine als Zulauf 16 und die andere als Ablauf 18 von Flüssigkeiten dient. In der Plattform 14 des Rahmens 12 für das obere Teil 6 sind zwei weitere sich gegenüberliegende, von oben zu bedienende Zugriffsöffnungen als Begasungszufuhr 20 und -abfuhr 22 vorgesehen. Die Kunststofffolie wird im Bereich der Zugriffsöffnungen 20 und 22 ausgespart. Die Kammer kann noch weitere Öffnungen beispielsweise für die Applikation verschiedener Substanzen auf die Zellprobe aufweisen. Die Zugriffsöffnungen sind z. B. durch einen passenden Gummi 24 abgedichtet. Die jeweiligen Kanäle können dann durch den Gummi hindurch gestochen werden. Auf diese Weise wird die Sterilität der Kammer nicht durch das Anbringen der Kanäle gefährdet.

Auf dem Boden 8 des unteren Teils 4 der Kammer 2 ist ein Raster 26 aufgebracht, wie in Fig. 2 gezeigt ist. Das Raster 26 kann beispielsweise schon auf der Kunststofffolie vorge­ fertigt sein. Die Einteilung des Rasters richtet sich nach den zu beobachtenden Probengrößen und beträgt zwischen 0,1 mm und 1,5 mm. Durch das Raster wird das Verfolgen der zeitlichen Entwicklung einer Zellprobe bei Langzeitmessungen erleichtert.

In Fig. 3 ist eine weitere Ausführungsform der Kammer gezeigt. Hierfür wird das untere Teil 4 und das obere Teil 6 aus einem identischen Bauteil 28 gebildet. Dieses wird dann einmal als Kammerboden und in umgekehrter Weise als Kammer­ abdeckung verwendet. Durch herkömmliche Dichtmittel kann die Kammer verschlossen werden. Die Zugriffsöffnungen 20 und 22 für die Begasung liegen bei dieser Ausführungsform in der Kammerwand.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden in Fig. 4 sechs Kammern paarweise neben­ einander auf einer Grundplatte 30 angebracht und bilden so eine Multiwell-Platte 32. Bei den hierfür verwendeten Kammern sind die Zugriffsöffnungen 16 und 20 um 90° versetzt zu den Zugriffsöffnungen 18 und 22 angeordnet. Auf diese Weise sind die Zugriffsöffnungen vom Randbereich der Grund­ platte 30 zugänglich und es kann eine einfache Zu- und Abfuhr von Flüssigkeiten und Gasen bei allen auf der Grundplatte 30 angebrachten Kammern gewährleistet werden. Natürlich können auch mehr als sechs Kammern auf einer Platte angebracht werden.

Claims (15)

1. Kammer zum Kultivieren und Mikroskopieren von Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass ein unterer Teil (4) als Boden und ein oberer Teil (6) als Abdeckung vorgesehen ist, wobei zumindest der mittlere Bereich des Bodens (8) und der Abdeckung (10) aus transparentem Kunststoff ausgebildet ist und der Boden (8) eine einheitliche Dicke von 40-400 µm, bevorzugt 100- 200 µm aufweist.

2. Kammer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass an der Kammer (2) wenigstens eine Zugriffsöffnung vorgesehen ist.

3. Kammer nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass jeweils eine Zugriffsöffnung als Zulauf (16, 20) und Ablauf (18, 22) für Flüssigkeiten oder Gase vorgesehen ist.

4. Kammer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Kunststoff des mittleren Bereichs der Abdeckung (10) eine einheitliche Dicke von 40-400 µm, bevorzugt 100- 200 µm aufweist.

5. Kammer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstand zwischen dem Boden (8) und der Abdeckung (10) im mittleren Bereich nicht mehr als 10 mm beträgt.

6. Kammer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Abdeckung (10) abnehmbar ist.

7. Kammer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kammer luftdicht und steril verschließbar ist.

8. Kammer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der für den Boden (8) und die Abdeckung (10) verwendete Kunststoff bevorzugt keine doppelbrechenden und polarisierenden Eigenschaften aufweist.

9. Kammer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Innenraum der Kammer (2) beheizbar ist.

10. Kammer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass für den Boden (8) bzw. die Abdeckung (10) der Kunststoff auf vorgefertigten Rahmen (11, 12), die die Seitenwand der Kammer bilden, aufgebracht wird.

11. Kammer nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der für den Boden (8) und die Abdeckung (10) verwendete Kunststoff eine Kunststofffolie ist.

12. Kammer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der untere Teil (4) und der obere Teil (6) der Kammer (2) durch ein identisches Bauteil (28) gebildet werden, das einmal als Kammerunterteil und einmal als Kammerabdeckung vorgesehen ist.

13. Kammer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Boden (8) innerhalb der Kammer (2) ein Raster (26) aufweist.

14. Kammer nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Einteilung des Rasters (26) zwischen 0,1 und 1,5 mm liegt.

15. Kammersystem dadurch gekennzeichnet, dass mehrere wie in Anspruch 1 beschriebene Kammern 2 nebeneinander auf einer Grundplatte (30) angeordnet sind.