DE10032042A1 - Elektrochemischer Einwegbiosensor für die quantitative Bestimmung von Analytkonzentrationen in Flüssigkeiten - Google Patents
Elektrochemischer Einwegbiosensor für die quantitative Bestimmung von Analytkonzentrationen in FlüssigkeitenInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft einen Einwegbiosensor, umfassend ein Trägermaterial (1), auf dem elektrische Leiterbahnen (2) sowie ein Elektrodensystem, umfassend eine Gegenelektrode (6) und eine aus einer Reaktionsschicht gebildete Arbeitselektrode (5) aufgebracht sind, eine dielektrische Isolatorschicht (3), welche das Trägermaterial (1) sowie die elektrischen Leiterbahnen (2) bedeckt und Aussparungen für die Kontaktierung (4) einer Potentiostateinheit und für das Elektrodensystem aufweist, sowie eine analyterkennnde Biokomponente. Die Reaktionsschicht des erfindungsgemäßen Einwegbiosensors enthält neben einem elektronenleitenden Material einen leicht sublimierenden Elektronentransfermediator. Das Elektrodensystem des erfindungsgemäßen Biosensors ist von einer polymeren Schutzschicht (8) bedeckt. Die Erfindung betrifft außerdem Verfahren zur Bestimmung von Analyten in einer flüssigen Probe unter Verwendung der erfindungsgemäßen Biosensoren, die Verwendung leicht sublimierender Verbindungen als Elektronentransfermediatoren eines elektronsichen Sensors zur Überführung von Elektronen von einem Enzym zu einem elektronenleitenden Material, sowie die Verwendung der erfindungsgemäßen Biosensoren zur Bestimmung von Analytkonzentrationen in Körper- oder Probenflüssigkeiten.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Einwegbiosensor umfassend ein
Trägermaterial, elektrische Leiterbahnen, ein Elektrodensystem umfassend eine
Gegenelektrode und eine aus einer Reaktionsschicht gebildete Arbeitselektrode, eine
dielektrische Isolatorschicht, welche das Trägermaterial sowie die elektrischen
Leiterbahnen bedeckt und Aussparungen für die Kontaktierung einer
Potentiostateinheit und für das Elektrodensystem aufweist, sowie eine
analyterkennende Biokomponente. Die Erfindung betrifft außerdem Verfahren zur
Bestimmung von Analyten in einer flüssigen Probe unter Verwendung der
erfindungsgemäßen Einwegbiosensoren, die Verwendung leicht sublimierender
Verbindungen als Elektronentransfermediatoren eines elektrochemischen Sensors
zur Überführung von Elektronen von einem Enzym zu einem elektronenleitenden
Material, sowie die Verwendung der erfindungsgemäßen Einwegbiosensoren zur
Bestimmung von Analytkonzentrationen in Körper- oder Probenflüssigkeiten.
Elektrochemische Detektionssysteme auf der Basis mediatormodifizierter
Biosensoren zur spezifischen quantitativen Bestimmung eines Analyten in einer
flüssigen Probe sind in der Literatur und in vielen Patenten bereits ausführlich
beschrieben worden (zum Beispiel in der EP 0 552 223, US 5,288,636, US 4,711,245).
Dabei handelt es sich zumeist um Biosensoren für Analyte, die durch
Enzyme der Klasse der Oxidoreduktasen spezifisch umgesetzt werden können
(Laktat, Cholesterol, Ethanol, Wasserstoffperoxid, Harnsäure usw.). Teilweise sind
mediatormodifizierte Biosensoren bereits als kommerzielle Produkte erhältlich. Das
bekannteste Beispiel eines solchen Biosensors ist der Glukosebiosensor, der in der
medizinischen Diagnostik von Diabetikern genutzt wird, um Glukosekonzentrationen
im Vollblut zu bestimmen. Das Detektionsprinzp eines mediatormodifizierten
Biosensors ist zum Beispiel in der EP 0 552 223 für einen Glukosebiosensor
beschrieben.
Das in einem Glukosebiosensor verwendete Enzym ist die Glukoseoxidase (GOD).
Die GOD besitzt eine prosthetische Gruppe in Form eines Flavinadenindinukleotid-
Moleküls (FAD) und katalysiert die Reaktion der Glukose zu Glukonolakton gemäß
Gleichung (I):
(I) Glukose + GOD-FAD ⇔ Glukonolakton + GOD-FADH2
Grundsätzlich ist es nun möglich, in einer weiteren Redox-Reaktion das reduzierte
Enzym (GOD-FADH2) mit Sauerstoff (O2) zu GOD-FAD unter Bildung von
Wasserstoffperoxid (H2O2) gemäß Gleichung (IIa) zu oxidieren und anschließend
durch die Bestimmung der Wasserstoffperoxid-Konzentration mittels einer
Platinelektrode die Glukosekonzentration in der Probe direkt zu ermitteln.
(IIa) GOD-FADH2 + O2 ⇔ GOD-FAD + H2O2
In den meisten Ausführungen des Glukosebiosensors wird jedoch ein
elektronenübertragender Mediator verwendet, um die Glukosemenge in der Probe zu
quantifizieren. Dieser Mediator oxidiert in einem zweiten Reaktionsschritt das Enzym,
so dass dieses für die Reaktion (I) wieder zur Verfügung steht:
(IIb) GOD-FADH2 + MEDox ⇔ GOD-FAD + MEDred
Die Glukosekonzentration in der Probe läßt sich nun bestimmen, indem man in einer
amperometrischen Messung den reduzierten Mediator (MEDred) an der
Arbeitselektrode des Biosensors wieder oxidiert und den dabei fließenden Strom
quantifiziert:
(III) MEDred ⇔ MEDox + e-
Um diese Reaktion ablaufen zu lassen, benötigt man eine Potentiostateinheit, die ein
geeignetes Meßpotential vorgibt und den fließenden Strom mißt. Der Strom ist dabei
proportional zur Konzentration der Glukose in der Probe.
Das Detektionsprinzip eines mediatormodifizierten Biosensors hat gegenüber der
direkten Quantifizierung des Wasserstoffperoxids an einer Platinelektrode den
Vorteil, dass bei einem niedrigen Arbeitspotential (0-350 mV vs. Ag/AgCl) gearbeitet
werden kann. Dies dient der Verminderung, im Idealfall sogar der Vermeidung von
störenden Interferenzen, die durch die Oxidation von Begleitsubstanzen entstehen
können (Störsubstanzen im Blut sind beispielsweise Ascorbinsäure, Harnsäure, oder
Paracetamol).
Eine weitere Möglichkeit, modifizierte Biosensoren zu nutzen, besteht darin, Analyte,
die sich spezifisch in einem enzymmarkierten Assay einbinden lassen, zu
quantifizieren. Dazu wird der Analyt spezifisch an ein auf der Oberfläche des
Sensors immobilisiertes Fängermolekül (analyterkennende Biokomponente)
gebunden. An diesen Komplex aus Fängermolekül und Analyt wird wiederum ein mit
einem Enzym gelabeltes Molekül gekoppelt. Die Konzentration des eingebundenen
Analyten läßt sich bestimmen, indem man die Enzymmenge, die über den Assay an
der Oberfläche des Biosensors immobilisiert ist, quantifiziert. Dies erfolgt durch
Zugabe einer definierten Konzentration eines Substrates, welches durch das Enzym
umgesetzt wird. Der Mediator des Biosensors regeneriert das an den Assay
gebundene Enzym entsprechend Gleichung (IIb). Die Detektionsreaktion ist
wiederum die Oxidation bzw. Reduktion des Mediators an der Biosensoroberfläche
(siehe Gleichung III). Der dabei zu messende Strom ist proportional zur gelabelten
Enzymmenge und damit auch proportional zur im Assay gebundenen Analytmenge.
Dieses Sensorprinzip wird beispielsweise in der Immunosensorik oder der DNA-
Analytik angewendet.
Verbindungen, die als Mediatoren in den Biosensoren eingesetzt werden, sollten sich
dadurch auszeichnen, dass sie ein niedriges Redoxpotential aufweisen, dass sie
hohe Umsetzungsraten mit dem Enzym erreichen, dass sie im reduzierten Zustand
nicht leicht löslich sind und dass sie stabil und inert gegenüber anderen
Begleitsubstanzen sind. In der Literatur und in zahlreichen Patenten sind viele
Verbindungen publiziert, die sich als Mediatoren in Biosensoren einsetzen lassen.
Eine große Gruppe von Mediatoren stellen metallorganische Verbindungen dar.
Beispiele dafür sind Ferrocen-Derivate (Britisches Patent 8132034, US 4,711,245),
Übergangsmetallkomplexe (US 5,710,011), z. B. Kaliumhexacyanoferrat (US 5,645,709),
Nickel- oder Kobaltbipyridyl sowie Osmium enthaltende organische
Verbindungen (US 5,846,702). Diese metallorganischen Mediatoren weisen jedoch
den Nachteil auf, dass sie eine vergleichsweise geringe Umsetzungsrate aufweisen
und dementsprechend in hohen Konzentrationen eingesetzt werden müssen. Dies ist
ungünstig vor allem für die Verwendung dieser Mediatoren in Einwegbiosensoren in
Form von Teststreifen. Ein weiterer Nachteil der metallorganischen Mediatoren ist
ihre gute Löslichkeit in Wasser. Diese hat zur Folge, dass die Mediatoren bei einem
Kontakt mit der Probeflüssigkeit relativ leicht aus dem Elektrodenraum
herausdiffundieren können, so dass sich zum einen die Sensitivität des Biosensors
aufgrund einer Abnahme der Mediatorkonzentration im Elektrodenraum
verschlechtert und es zum anderen durch den Kontakt der Mediatoren mit
Begleitsubstanzen, die vor allem bei der Analyse von Blutproben vorhanden sind, zu
störenden Nebenreaktionen kommen kann. Vorteilhafter sind daher Verbindungen,
die eine geringere Löslichkeit aufweisen und auch in geringerem Umfang mit
Begleitsubstanzen wechselwirken.
Diese gewünschten, vorteilhaften Eigenschaften werden in der Regel von Molekülen
erfüllt, die chinoide Strukturen ausbilden (Hydrochinon/Benzochinon, p-
Aminophenol/p-Iminochinon) und die daher ebenfalls als Mediatoren in Biosensoren
eingesetzt werden. Häufig verwendete Verbindungen sind auch das Tetrathiafulvalen
(TTF), Tetracyanoquinodimethan (TCNQ) oder N-Methyl-Phenazinium (NMP) (US 5,876,952).
Viele dieser Verbindungen zeichnen sich vor allem aufgrund ihrer
photosensorischen Eigenschaften als gute Elektronendonatoren bzw. -akzeptoren
aus und werden daher häufig als Mediatoren in Biosensoren eingesetzt. Zu nennen
sind in diesem Zusammenhang beispielsweise N,N,N',N'-tetrakis-(2'hydroxyethyl)-p-
phenylendiamin (THEPD) und N,N,N',N'-tetrakiscarboxymethyl-pphenylendiamin
(TCPD) (US 5,609,749) sowie 1,4-Diamino-2,3,5,6-tetramethylbenzen, 2,5-Diethyl-
1,4-bis(dimethylaminobenzen), N-(4-Morpholinophenylhexahydroazepin),
Meldolablau u. a. (WO 9207263). Diese Moleküle sind im wesentlichen Derivate des
Phenylendiamins (PPD), das, wie auch das N,N,N',N'-Tetraphenylendiamin (TMPD),
ebenfalls gute Donator/Akzeptoreigenschaften aufweist (J. Anal. Chem. USSR 45
(1990)). Im Vergleich zu den metallorganischen Mediatoren zeichnen sich die
Derivate des PPDs zwar durch eine erhöhte Umsetzungsrate sowie eine geringere
Löslichkeit aus, der Nachteil dieser leicht sublimierenden Verbindungen besteht
jedoch darin, dass sie einen verhältnismäßig hohen Dampfdruck besitzen. Dies führt
dazu, dass der Mediator, nachdem er auf das Substrat des Biosensors aufgetragen
wurde, sich im Laufe der Zeit verflüchtigt und so die Sensitivität des Biosensors bei
einer längeren Lagerung abnimmt. Problematisch ist des Weiteren die Tatsache,
dass die Derivate des PPDs aufgrund einer wenn auch im Vergleich zu den
metallorganischen Mediatoren geringen Löslichkeit in Wasser bei einem Kontakt mit
der wässrigen Probenflüssigkeit aus dem Elektrodenraum herausdiffundieren und
folglich durch die Abnahme der Mediatorkonzentration eine geringere Sensitivität des
Biosensors beobachtet wird.
Die der vorliegenden Anmeldung zugrunde liegende Aufgabe bestand demnach in
der Entwicklung eines mediatormodifizierten Biosensors, der trotz der Verwendung
leicht sublimierender Verbindungen als Mediatoren die oben genannten Nachteile
eines Sensitivitätsverlustes aufgrund einer längeren Lagerung oder als Folge des
Kontaktes mit der Probenflüssigkeit nicht aufweist.
Die Aufgabe wurde erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass in einem Biosensor der
eingangs genannten Art das Elektrodensystem mit einer polymeren Schutzschicht
versehen wurde. Durch diese Schutzschicht läßt sich nicht nur die Sensitivität des
Biosensors steigern, indem die Schutzschicht den Mediator, der sich aus der
Elektrode löst, in Elektrodennähe hält, sondern vor allem auch eine deutliche
Verbesserung der Langzeitstabilität des Biosensors trotz der Verwendung leicht
sublimierender Mediatoren erzielen. Dies ist vor allem darauf zurückzuführen, dass
die polymere Schutzschicht der Verdampfung des Mediators entgegenwirkt. Auch
läßt sich durch die Wirkung dieser polymeren Schutzschicht als Diffusionsbarriere
der lineare Meßbereich des Biosensors verlängern.
Viele in Publikationen und Patenten vorgestellte Biosensoren sind aus den
unterschiedlichsten Gründen mit polymeren Schichten versehen worden. So werden
beispielsweise polymere Membranen verwendet, um die Enzyme auf der
Sensoroberfläche zu immobilisieren (EP 0 851 244, EP 0 894 869, EP 0 856 586, EP 0 909 952).
In anderen Anwendungen wird mit Hilfe eines Polymers eine sogenannte
Reaktionsschicht über der Arbeitselektrode aufgebaut, die sowohl den Mediator als
auch das Enzym enthält (Patente der Matsushita Electric Ind. Co. LTD, JP, z. B.: US 5,192,415,
EP 0 901 018, WO 9835225). Polymere Schichten können darüber
hinaus dazu dienen, Interferenzen durch Störsubstanzen zu vermeiden oder die
Sensoroberfläche vor Kontaminationen zu schützen (letzteres ist besonders bei
Mehrwegbiosensoren und der Entwicklung von in vivo Sensoren von großer
Bedeutung). Nafionschichten werden häufig verwendet, um Interferenzen durch
anionische Störsubstanzen (z. B. Ascorbat) zu verringern (US 5,312,590). Eine
Schicht aus Polyacrylamid kann dazu dienen, den Einfluß des Hämatocrit einer
Blutprobe auf das Sensorsignal zu reduzieren (EP 0 769 558). Letztendlich lassen
sich polymere Schichten auch dazu nutzen, eine Passivierungsschicht zu erzeugen,
die unspezifische Bindungen an der Sensorelektrode verhindert (DE 198 06 642).
Die Verwendung einer polymeren Schutzschicht zur Verhinderung des Verdampfens
eines leicht sublimierenden Mediators und somit auch zur Verbesserung der
Langzeitstabilität von Biosensoren ist hingegen bisher in der Literatur noch nicht
beschrieben worden.
Die Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft einen Einwegbiosensor
umfassend ein Trägermaterial, elektrische Leiterbahnen, ein Elektrodensystem
umfassend eine Gegenelektrode und eine aus einer Reaktionsschicht gebildete
Arbeitselektrode, eine dielektrische Isolatorschicht, welche das Trägermaterial sowie
die elektrischen Leiterbahnen bedeckt und Aussparungen für die Kontaktierung einer
Potentiostateinheit und für das Elektrodensystem aufweist, sowie eine
analyterkennende Biokomponente. Der erfindungsgemäß Einwegbiosensor ist
dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionschicht einen leicht sublimierenden
Mediator enthält und dass das Elektrodensystem von einer polymeren Schutzschicht
bedeckt ist. Der erfindungsgemäße Einwegbiosensor wird in der Form eines Chips
hergestellt und in Kombination mit einer Potentiostateinheit angewendet. Er dient zur
schnellen Vor-Ort-Quantifizierung von Analytkonzentrationen in Flüssigkeiten. Die
nachweisbaren Analyte sind Substanzen, die sich spezifisch durch Oxidoreduktasen
umsetzen oder sich in einem enzymmarkierten Immuno- oder Rezeptorassay
einbinden lassen. Die Quantifizierung erfolgt amperometrisch oder
zyklovoltametrisch.
Der Aufbau einer der bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen
Biosensors ist als Beispiel in der Abb. 1 dargestellt. Der Biosensor umfaßt ein
Trägermaterial (1), auf dem nacheinander elektrische Leiterbahnen (2), eine
Isolatorschicht (3), ein Elektrodensystem umfassend eine Gegenelektrode (6) und
eine Arbeitselektrode (5), sowie eine das Elektrodensystem bedeckende polymere
Schutzschicht (8) vorzugsweise durch Masken- oder Siebdruck aufgebracht worden
sind, sowie eine analyterkennende Biokomponente. Die Arbeitselektrode (5) wird aus
einer einen leicht sublimierenden Mediator sowie ein elektronenleitendes Material
enthaltenden Reaktionsschicht gebildet. Die Leiterbahnen dienen dazu, die
jeweiligen Elektroden mit den Anschlußpunkten (4), über die der Biosensor mit der
Potentiostateinheit kontaktiert wird, zu verbinden. Die Isolatorschicht (3) bedeckt die
Leiterbahnen und weist Aussparungen für die Anschlußpunkte (4) und sowie für das
Elektrodensystem auf und dient der Verhinderung von parasitären Strömen. In der in
dieser Abb. 1 dargestellten bevorzugten Ausführungsform des
erfindungsgemäßen Einwegbiosensors umfaßt das Elektrodensystem neben der
Gegenelektrode (6) und der Arbeitselektrode (5) noch eine Referenzelektrode (7).
Durch die Verwendung dieser Referenzelektrode kann eine deutliche Verbesserung
der Meßgenauigkeit erzielt werden.
Die Leiterbahnen (2) bestehen aus einer als wesentliche Bestandteile Kohlenstoff-,
Silber-, Platin- oder Goldpartikel enthaltenden Polymerpaste. Die Leiterbahnen (2)
werden vorzugsweise durch Sieb- oder Maskendruck auf das Trägermaterial (1)
aufgebracht und anschließend ausgehärtet.
Das zur Herstellung der Einwegbiosensoren verwendete Trägermaterial (1) besteht
bevorzugt aus Polycarbonat, Polyvinylchlorid (PVC), Polyethylenterephtalat (PET),
Polypropylen, Polyester oder Polystyrol.
Zur Herstellung der Gegenelektrode (6) und der Referenzelektrode (7) wird
bevorzugt eine Silberpartikel- und Silberchlorid-haltige Leitpaste, der ein leicht
lösliches Chloridsalz (z. B. Natriumchlorid oder Kaliumchlorid) zugesetzt worden ist,
verwendet. Die Gegenelektrode (6) und die Referenzelektrode (7) werden
vorzugsweise durch Sieb- oder Maskendruck auf das Trägermaterial (1) aufgebracht
und anschließend ausgehärtet.
Die Reaktionschicht, aus der die Arbeitselektrode (5) gebildet worden ist, enthält
neben dem leicht sublimierenden Elektronentransfermediator ein elektronenleitendes
Material, welches aus einer als wesentliche Bestandteile Kohlenstoff-, Platin-,
Palladium-, Rhodium- oder Goldpartikel enthaltenden, aushärtbaren Polymerpaste
besteht. Die Reaktionsschicht wird vorzugsweise durch Sieb- oder Maskendruck auf
das Trägermaterial (1) aufgebracht und anschließend ausgehärtet.
Bei den in der vorliegenden Erfindung verwendeten leicht sublimierenden Mediatoren
handelt es sich um Verbindungen, die einen Dampfdruck von mindestens 1. 10-5mmHg
bei 25°C aufweisen. Die Mediatoren besitzen vorzugsweise die in der
Abb. 2 dargestellte Struktur, in der die Reste R1, R2, R3 und R4 gleich oder
verschieden sein können und ein Wasserstoffatom, einen C1-C10-Alkylrest, bevorzugt
einen C1-C5-Alkylrest, oder einen Arylrest darstellen. Bevorzugte Mediatoren sind p-
Aminodiphenylamin, p-Phenylendiamin oder N,N,N',N'-Tetramethyl-p-
phenylendiamin.
Eine den Mediator stabilisierende hydrophile Schutzschicht (8) in Form eines
polymeren Hydrogels, die der Verdampfung des Elektronentransfermediators
entgegenwirkt und gleichzeitig die Sensitivität des Biosensors erhöht und als
Diffusionsbarriere fungiert, bedeckt das vollständige Elektrodensystem. Die
vorzugsweise sieb- oder maskengedruckte polymere Schutzschicht (8) besteht im
wesentlichen aus einem Hydrogel aus Polyvinylpyrrolidon (PVP), Polyethylenoxid
(PEO), Stärke oder Gelatine.
Als analyterkennende Biokomponente kann ein Enzym, ein DNA-Molekül, ein
Fänger-Antikörper oder ein Rezeptor-Molekül fungieren. Als Enzym wird bevorzugt
eine Oxidoreduktase, eine Dehydrogenase, eine β-Galaktosidase oder eine
alkalische Phosphatase verwendet. Besonders bevorzugte Enzyme sind
Glukoseoxidase (GOD), Laktatoxidase (LOD), Uricase, Ascorbatoxidase,
Ethanoloxidase, Cholesteroloxidase oder Peroxidase (POD).
In der in der Abb. 1 dargestellten bevorzugten Ausführungsform des
erfindungsgemäßen Biosensors ist des Weiteren über dem Elektrodensystem des
Biosensors ein Kunststoffgewebe (9) mit einem einseitig klebenden Tape (10)
befestigt. Das einseitig klebende Tape (10) weist eine Aussparung auf, in welche die
flüssige Probe gebracht werden kann, so dass die Probe über das Kunststoffgewebe
(9) die Elektroden, welche durch die Potentiostateinheit mit einer Meßspannung
versorgt werden, kontaktiert. Dieses Gewebe dient jedoch nicht nur der schnellen
und gleichmäßigen Verteilung der Probe über den Elektroden, sondern auch zum
dem Schutz der Biosensoroberfläche vor Zerstörung oder Kontamination, die
beispielsweise auftreten können, wenn als Probe Kapillarblut mit dem Finger
aufgetragen wird. Das Kunststoffgewebe (9) besteht bevorzugt aus einem
Polyethylen-, Polypropylen- oder Polyamidnetz, während das Tape (10) aus einer
einseitig klebenden Polyester-, PVC- oder Papierklebefolie besteht.
Je nach Lokalisation der analyterkennenden Biokomponente und nach Struktur der
Reaktionschicht können grundsätzlich fünf verschiedene Ausführungsformen des
erfindungsgemäßen Biosensors unterschieden werden.
- 1. In einer ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Biosensors besteht die Reaktionsschicht aus einer einzigen Schicht enthaltend die elektronenleitende Polymerpaste, den leicht sublimierenden Mediator sowie die analyterkennende Biokomponente.
- 2. In einer zweiten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Biosensors besteht die Reaktionsschicht aus einer einzigen Schicht enthaltend die elektronenleitende Polymerpaste und den leicht sublimierenden Mediator. In dieser Ausführungsform ist die analyterkennende Biokomponente jedoch in der polymeren Schutzschicht (8) lokalisiert.
- 3. In einer dritten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Biosensors besteht die Reaktionsschicht aus zwei Schichten, wobei die erste Schicht aus der elektronenleitenden Polymerpaste sowie dem leicht sublimierenden Mediator gebildet wird und von einer zweiten, hydrophilen polymeren Deckschicht bedeckt ist, die als Träger der analyterkennenden Biokomponente fungiert.
- 4. In einer vierten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Biosensors besteht die Reaktionsschicht ebenfalls aus zwei Schichten, wobei in diesem Fall die erste Schicht aus der elektronenleitenden Polymerpaste gebildet wird und von einer zweiten, hydrophilen polymeren Deckschicht bedeckt ist, die als Träger der analyterkennenden Biokomponente und des leicht sublimierenden Mediators fungiert.
- 5. In einer fünften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Biosensors besteht die Reaktionsschicht ebenfalls aus zwei Schichten, wobei die erste Schicht aus der elektronenleitenden Polymerpaste gebildet wird und von einer zweiten, hydrophilen polymeren Deckschicht bedeckt ist, die als Träger des leicht sublimierenden Mediators fungiert. Die analyterkennende Biokomponente ist in dieser Ausführungsform in der polymeren Schutzschicht (8) lokalisiert.
Die analyterkennende Biokomponente kann sowohl direkt oder aber über eine
Avidin/Biotin-Wechselwirkung (siehe Abb. 18 und 20) in der Reaktionschicht
oder aber in der polymeren Schutzschicht (8) immobilisiert sein.
Die gegebenenfalls in der Reaktionschicht enthaltende polymere Deckschicht
besteht im wesentlichen aus einem Hydrogel aus Polyvinylpyrrolidon (PVP),
Polyethylenoxid (PEO), Stärke oder Gelatine, welches bevorzugt durch Sieb- oder
Maskendruck aufgedruckt worden ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Bestimmung von
Analytkonzentrationen in wässrigen Lösungen unter Verwendung der
erfindungsgemäßen Einwegbiosensoren.
Bei der Verwendung derjenigen Ausführungsform des Biosensors, bei der die
analyterkennende Biokomponente ein Enzym, z. B. Glukoseoxidase, Laktatoxidase,
Alkoholoxidase, Peroxidase oder Uricase ist, wird eine flüssige Probe zunächst auf
das Elektrodensystem des Biosensors gebracht. Der zu bestimmende Analyt, z. B.
Glukose, wird dann durch das jeweilige Enzym, wie dies für den Fall des Glukose-
Nachweises in Gleichung (I) beschrieben ist, reduziert. Das reduzierte Enzym
reduziert dann in einem weiteren Reaktionsschritt entsprechend der Gleichung (IIb)
den Mediator. Über eine Potentiostateinheit, die ein geeignetes Meßpotential vorgibt,
wird dann der Mediator oxidiert und der dabei fließende Strom, der proportional zur
Analytkonzentration ist, bestimmt.
Wenn der erfindungsgemäße Biosensor als enzymmarkierter Immunoassay, als
DNA-Assay oder als Ligand-Assay eingesetzt wird, so wird auch in diesem Fall
zunächst eine flüssige Probe auf das Elektrodensystem des Biosensors gebracht.
Das in der Probenflüssigkeit enthaltende Antigen, das sequenzspezifische DNA-
Molekül oder der Ligand binden dann an die in der Reaktionschicht oder der
polymeren Schutzschicht (8) immobilisierte analyterkennende Biokomponente
(Antikörper, DNA-Sonde oder Rezeptor). Anschließend wird die Sensoroberfläche
gewaschen und danach mit einer Lösung bedeckt, die ein analytspezifisches Enzym-
Konjugat enthält, welches die sequenzspezifische DNA, das Antigen oder den
Liganden erkennt. Dieses Enzym-Konjugat bindet an den Analyten (Antikörper, DNA-
Sonde oder Rezeptor) und die Menge des in der Reaktionschicht oder der polymeren
Schutzschicht (8) gebundenem Enzym-Konjugates ist proportional zur Analytmenge
in der zu Beginn aufgetragenen Probenflüssigkeit. Nach erneutem gründlichen
Waschen der Oberfläche der Arbeitselektrode wird diese mit einer weiteren Lösung
enthaltend ein Substrat des Enzym-Konjugates beschichtet. Das Substrat wird vom
Enzym umgesetzt und das reduzierte oder oxidierte Enzym reagiert dann
entsprechend Gleichung IIb) mit dem Mediator. Über eine Potentiostateinheit, die ein
geeignetes Meßpotential vorgibt, wird dann der dabei fließende Strom bestimmt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung leicht sublimierender
Verbindungen mit einem Dampfdruck von mindestens 1 . 10-5 mmHg bei 25°C als
Elektronentransfermediatoren zur Überführung von Elektronen von einem Enzym zu
einem elektronenleitenden Material, wobei sich diese Mediatoren in einer
Reaktionsschicht befinden, welche durch eine polymere Schutzschicht (8) bedeckt
ist. Die polymere Schutzschicht (8) wirkt der Sublimation des Mediators entgegen, so
dass sich die Langzeitstabilität des Sensors erheblich verlängern läßt. Bei den zur
Überführung von Elektronen von einem Enzym zu einem elektronenleitenden
Material bevorzugt verwendeten Mediatoren handelt es sich um leicht sublimierende
Verbindungen mit der Struktur (I),
in der die Reste R1, R2, R3 und R4 gleich oder verschieden sein können und ein
Wasserstoffatom, einen C1-C10-Alkylrest, bevorzugt einen C1-C5-Alkylrest, oder einen
Arylrest darstellen. Bevorzugte zur Überführung von Elektronen von einem Enzym zu
einem elektronenleitenden Material verwendete Mediatoren sind p-
Aminodiphenylamin, p-Phenylendiamin oder N,N,N',N'-Tetramethyl-p-
phenylendiamin.
Die vorliegende Erfindung betrifft des weiteren die Verwendung des
erfindungsgemäßen Einwegbiosensors zur Bestimmung von Analytkonzentrationen
in Körper- oder Probenflüssigkeiten. Bei den mit dem erfindungsgemäßen Biosensor
nachweisbaren Analyten handelt es sich bevorzugt um Glukose, Laktat, Harnsäure,
Ascorbat, Ethanol, Cholesterol oder Wasserstoffperoxid. Auch sequenzspezifische
DNA-Fragmente, spezifische Antigene oder auch Liganden können mit besonderen
Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Biosensors nachgewiesen werden. Bei
den Flüssigkeiten, die mit dem vorliegenden Biosensor analysiert werden können,
handelt es sich um wäßrige synthetische Lösungen, Nährlösungen, oder aber auch
um Blut, Blutserum, Blutplasma oder um Urin.
Das Redox-Verhalten des im Einwegbiosensor eingesetzten Mediators läßt sich
anhand von zyklischen Voltammogrammen in einer gepufferten Lösung (PBS, pH
7,4, 154 mM Cl-) darstellen. Darin auftretende Peaks verdeutlichen die
elektrochemische Oxidierbarkeit bzw. Reduzierbarkeit des Mediators. Die
Peakpotentiale bestimmen das Arbeitspotential des Biosensors. Die Peakströme sind
ein Maß für die oxidierte bzw. reduzierte Stoffmenge. Sinkende Peakströme nach
längeren Lagerzeiten der Biosensoren deuten demnach auf den Verlust oder den
Zerfall des Mediators hin.
Zur Überprüfung der Stabilität eines Mediators werden zyklische Voltammogramme
in gepufferten wässrigen Lösungen in regelmäßigen Zeitabständen mit jeweils
unbenutzten Biosensoren durchgeführt und die erhaltenen Peakströme verglichen.
Sowohl zyklische Voltammogramme als auch amperometrische Messungen in
analythaltigem Puffer zeigen die Fähigkeit des jeweiligen Mediators, das Enzym zu
regenerieren und die Elektronen auf die Elektrode zu übertragen. Dies äußert sich in
beiden Experimentformen in einer Erhöhung der Ströme gegenüber Messungen, die
in analytfreiem Puffer durchgeführt werden. Mit Hilfe amperometrischer Messungen
bei verschiedenen Analytkonzentrationen läßt sich die Sensitivität der Biosensoren
ermitteln. Diese ist definiert als der Anstieg des Stromes mit größer werdender
Konzentration. Sowohl die mit zunehmendem Sensoralter auftretende Änderung der
Sensitivität als auch die Änderung der Peakströme im zyklischen Voltammogramm
dienen der Charakterisierung der Langzeitstabilität.
Mit dem zuvor beschriebenen Sensoraufbau lassen sich unterschiedlich gestaltete
Glukosebiosensoren herstellen. Die verschiedenen Modifikationen dieser
Glukosebiosensoren unterscheiden sich dabei unter anderem in der Wahl der
Verbindung, die als Mediator eingesetzt wird, oder aber im Material der polymeren
Schutzschicht. Als Enzym wird in den aufgeführten Beispielen 1-3 Glukoseoxidase
(von Aspergillus niger) verwendet. Die schützende und sensitivitätssteigernde
Wirkung der polymeren Schutzschicht wird verdeutlicht, indem Meßergebnisse von
Biosensoren mit und ohne Schutzschicht einander gegenüber gestellt werden.
Elektrodenmaterial: Kohlenstoff-Paste
Mediator: p-Aminodiphenylamin (ADPA)
Enzym: Glukoseoxidase (Aspergillus niger)
Schutzschicht: Polyvinylpyrrolidon (PVP)
Ausführungsform: Die Reaktionsschicht besteht aus einer einzelnen Schicht enthaltend ein elektronenleitendes Material, den Mediator und die analyterkennende Biokomponente (Glukoseoxidase)
Mediator: p-Aminodiphenylamin (ADPA)
Enzym: Glukoseoxidase (Aspergillus niger)
Schutzschicht: Polyvinylpyrrolidon (PVP)
Ausführungsform: Die Reaktionsschicht besteht aus einer einzelnen Schicht enthaltend ein elektronenleitendes Material, den Mediator und die analyterkennende Biokomponente (Glukoseoxidase)
Der Peakstrom (Oxidationsstrom) eines ADPA-modifizierten Biosensors ohne
Schutzschicht beträgt bei 200 mV (vs. Ag/AgCl) zu Beginn der Meßreihe 216 nA
(Abb. 3). Durch die signalerhöhende Wirkung einer PVP-Schutzschicht läßt sich
der Peakstrom auf 2000 nA verstärken (Abb. 4). Während die ADPA-
Biosensoren ohne Schutzschicht innerhalb von 54 Tagen 55% ihrer oxidierbaren
ADPA-Menge verlieren, bleibt diese Menge bei Biosensoren mit PVP-Schutzschicht
in diesem Zeitraum konstant.
Die zyklische Voltammogramme in gepufferter Glukoselösung (cGlukose = 15 mM)
zeigen, dass ADPA als Mediator geeignet ist. Der Strom im Potentialbereich der
Oxidation von ADPA steigt durch die Anwesenheit von Glukose bei Biosensoren
ohne Schutzschicht auf 550 nA, bei Biosensoren mit Schutzschicht auf annähernd
6000 nA. Während die ADPA-Biosensoren ohne Schutzschicht innerhalb von 54
Tagen deutliche Signalverluste aufweisen (Abb. 5), bleibt der Signalwert der
PVP-bedeckten Biosensoren in diesem Zeitraum konstant (Abb. 6). Eine
deutliche Verbesserung bewirkt die Verwendung der PVP-Schutzschicht in den
ADPA-Biosensoren auch hinsichtlich der Sensitivität der Sensoren. Anfänglich
beträgt die Sensitivität der ungeschützten ADPA-Biosensoren 204 nA/mM (Abb.
7). Bei geschützten Biosensoren liegt die Sensitivität anfänglich bei 325 nA/mM
(Abb. 8). Während die PVP-Schutzschicht dafür sorgt, dass diese Sensitivität
von 325 nA/mM auch nach 54 Tagen erhalten bleibt, sinkt sie bei den ungeschützten
Biosensoren innerhalb von 54 Tagen bereits auf 136 nA/mM ab. Auffällig ist weiterhin
die Verlängerung des linearen Meßbereichs des ADPA-Biosensors durch die PVP-
Schutzschicht. Ohne diese Schutzschicht beobachtet man bei 4 mM Glukose bereits
eintretende Sättigung des Sensorsignals, wohingegen bei geschützten Biosensoren
diese Konzentration noch im linearen Bereich des Biosensors erfaßt wird.
Elektrodenmaterial: Kohlenstoff-Paste
Mediator: N,N,N',N'-Tetramethyl-Phenylendiamin (TMPD)
Enzym: Glukoseoxidase (Aspergillus niger)
Schutzschicht: Polyvinylpyrrolidon (PVP)
Ausführungsform: Die Reaktionsschicht besteht aus einer einzelnen Schicht enthaltend ein elektronenleitendes Material, den Mediator und die analyterkennende Biokomponente (Glukoseoxidase)
Mediator: N,N,N',N'-Tetramethyl-Phenylendiamin (TMPD)
Enzym: Glukoseoxidase (Aspergillus niger)
Schutzschicht: Polyvinylpyrrolidon (PVP)
Ausführungsform: Die Reaktionsschicht besteht aus einer einzelnen Schicht enthaltend ein elektronenleitendes Material, den Mediator und die analyterkennende Biokomponente (Glukoseoxidase)
TMPD-modifizierte Biosensoren ohne Schutzschicht weisen zu Beginn der Meßreihe
im zyklischen Voltammogramm in glukosefreiem Puffer bei 100 mV einen
Oxidationspeak mit einem Peakstrom von 90 nA (vs. Ag/AgCl) auf (Abb. 9).
Durch eine PVP-Schutzschicht läßt sich dieses Signal auf 850 nA verstärken
(Abb. 10). Innerhalb von 46 Tagen reduziert sich die oxidierbare TMPD-Menge
der ungeschützten Biosensoren um 57%. Bei TMPD-Biosensoren mit PVP-
Schutzschicht hingegen bleibt der Oxidationsstrom und damit die oxidierbare TMPD-
Menge in diesem Zeitraum nahezu konstant.
TMPD zeigt in den zyklischen Voltammogrammen in gepufferter Glukoselösung
(cGlukose = 15 mM) die Verwendbarkeit als Mediator. Der Strom im Potentialbereich der
Oxidation von TMPD liegt anfänglich bei Biosensoren ohne Schutzschicht bei 450 nA
(Abb. 11), bei Biosensoren mit Schutzschicht bei 3500 nA (Abb. 12).
Dieser Wert kann auch nur bei Biosensoren mit PVP-Schutzschicht nahezu konstant
gehalten werden. Ohne Schutzschicht sinkt der Oxidationsstrom innerhalb von 46
Tagen bis auf 160 nA ab. Die stabilisierende und signalerhöhende Wirkung der PVP-
Schutzschicht wird auch bei der Betrachtung der Sensitivität deutlich. Diese steigt
durch die PVP-Schutzschicht von 60 nA/mM (Abb. 13) auf 341 nA/mM
(Abb. 14) an und kann über 46 Tage auf diesem Niveau konstant gehalten
werden. Wie bereits beim ADPA-Biosensor zu beobachten ist, verlängert die PVP-
Schutzschicht auch beim TMPD-Biosensor den linearen Meßbereich, so dass eine
Glukosekonzentration von 4 mM noch erfaßt werden kann.
Elektrodenmaterial: Kohlenstoff-Paste
Mediator: N,N,N',N'-Tetramethyl-Phenylendiamin (TMPD)
Enzym: Glukoseoxidase (Aspergillus niger)
Schutzschicht: Stärke
Ausführungsform: Die Reaktionsschicht besteht aus einer einzelnen Schicht enthaltend ein elektronenleitendes Material, den Mediator und die analyterkennende Biokomponente (Glukoseoxidase)
Mediator: N,N,N',N'-Tetramethyl-Phenylendiamin (TMPD)
Enzym: Glukoseoxidase (Aspergillus niger)
Schutzschicht: Stärke
Ausführungsform: Die Reaktionsschicht besteht aus einer einzelnen Schicht enthaltend ein elektronenleitendes Material, den Mediator und die analyterkennende Biokomponente (Glukoseoxidase)
Ein TMPD-Biosensor läßt sich auch durch eine Schutzschicht aus Stärke
stabilisieren. Die Signalintensität im zyklischen Voltammogramm in gepufferter
Glukoselösung steigt durch diese Schicht auf 175 nA (Abb. 15) an (im Vergleich
zu 90 nA ohne Schutzschicht, Abb. 9) und bleibt über einen Zeitraum von 46
Tagen nahezu konstant. In einer gepufferten Glukoselösung (cGlukose = 15 mM) erhält
man im Zeitraum von 46 Tagen Oxidationströme zwischen 470 und 520 nA
(Abb. 16) im Vergleich zu 450 nA ohne Schutzschicht (Abb. 11). Die
signalerhöhende Wirkung der Stärke ist somit nicht so intensiv wie bei PVP, eine
Stabilisierung läßt sich mit dieser Schutzschicht dennoch erreichen. Dies wird auch
bei den Sensitivitätsuntersuchungen deutlich (Abb. 17).
Mit dem zuvor beschriebenen Sensoraufbau lassen sich neben Analyten, die durch
spezifische Enzyme umgesetzt werden, auch DNA-Einzelstrangfragmente oder aber
auch Antigene in Proben- oder Körperflüssigkeiten quantifizieren.
Elektrodenmaterial: Kohlenstoff-Paste
Mediator: p-Aminodiphenylamin (ADPA)
Enzym: Peroxidase
Biokomponente: biotinylierte einzelsträngige DNA
Schutzschicht: Stärke
Ausführungsform: Die Reaktionsschicht besteht aus einer einzelnen Schicht enthaltend ein elektronenleitendes Material, den Mediator und die analyterkennende Biokomponente (DNA-Sonde).
Mediator: p-Aminodiphenylamin (ADPA)
Enzym: Peroxidase
Biokomponente: biotinylierte einzelsträngige DNA
Schutzschicht: Stärke
Ausführungsform: Die Reaktionsschicht besteht aus einer einzelnen Schicht enthaltend ein elektronenleitendes Material, den Mediator und die analyterkennende Biokomponente (DNA-Sonde).
Die biotinylierte sequenzspezifische DNA-Sonde liegt über Avidin in der
Reaktionsschicht immobilisiert vor (Abb. 18). Die zu bestimmende Menge an
komplementärem DNA-Strang ist mit Digoxigenin markiert. Nach Hybridisierung
dieses komplementären DNA-Stranges an den immobilisierten DNA-Einzelstrang
erfolgt der Nachweis nach Zugabe eines Anti-Digoxigenin-Antikörper-Konjugates
(Enzym-Konjugat). Die Peroxidase katalysiert die Reduktion von Wasserstoffperoxid
(Substrat des Enzym-Konjugates) zu Wasser, wodurch die Peroxidase oxidiert wird.
Die Regeneration der Peroxidase erfolgt durch den Mediator ADPA, der oxidierte
Mediator wird anschließend an der Arbeitselektrode bei einem Potential von -150 mV
(vs. Ag/AgCl) wieder reduziert. In der Abb. 19 ist eine Kalibriergerade für
den Nachweis eines 20mer Oligonukleotids dargestellt. Die Nachweisgrenze liegt bei
80 amol an DNA.
Elektrodenmaterial: Kohlenstoff-Paste
Mediator: p-Aminodiphenylamin (ADPA)
Enzym: Peroxidase
Biokomponente: Fänger-Antikörper
Schutzschicht: Stärke
Ausführungsform: Die Reaktionsschicht besteht aus eine einzelnen Schicht enthaltend ein elektronenleitendes Material, den Mediator und die analyterkennende Biokomponente (Fänger-Antikörper).
Mediator: p-Aminodiphenylamin (ADPA)
Enzym: Peroxidase
Biokomponente: Fänger-Antikörper
Schutzschicht: Stärke
Ausführungsform: Die Reaktionsschicht besteht aus eine einzelnen Schicht enthaltend ein elektronenleitendes Material, den Mediator und die analyterkennende Biokomponente (Fänger-Antikörper).
Der Fänger-Antikörper liegt entweder direkt immobilisiert vor oder wird über zuvor
immobilisiertes Avidin (Abb. 20) auf der Oberfläche fixiert. Nach Anbindung des
Analyten aus der zu untersuchenden Probe an den analytspezifischen Fänger-
Antikörper erfolgt der Nachweis nach Zugabe eines zweiten analytspezifischen
Antikörper-Peroxidase-Konjugates (Enzym-Konjugat). Die Peroxidase katalysiert die
Reduktion von H2O2 zu H2O, wodurch die Peroxidase oxidiert wird. Die Regeneration
der Peroxidase erfolgt durch den Mediator ADPA; der oxidierte Mediator wird an der
Arbeitselektrode (bei E = -150 mV vs. Ag/AgCl) wieder reduziert. In der Abb. 21
ist am Beispiel des Interleukin-4 eine Kalibriergerade dargestellt. Die
Nachweisgrenze liegt bei 200 amol an Interleukin-4.
Claims (30)
1. Einwegbiosensor umfassend ein Trägermaterial (1), auf dem elektrische
Leiterbahnen (2) sowie ein Elektrodensystem umfassend eine Gegenelektrode
(6) und eine aus einer Reaktionsschicht gebildete Arbeitselektrode (5)
aufgebracht sind, eine dielektrische Isolatorschicht (3), welche das
Trägermaterial (1) sowie die elektrischen Leiterbahnen (2) bedeckt und
Aussparungen für die Kontaktierung (4) einer Potentiostateinheit und für das
Elektrodensystem aufweist, sowie eine analyterkennende Biokomponente,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Reaktionsschicht neben einem elektronenleitenden Material einen leicht sublimierenden Elektronentransfermediator enthält und
das Elektrodensystem von einer polymeren Schutzschicht (8) bedeckt ist.
die Reaktionsschicht neben einem elektronenleitenden Material einen leicht sublimierenden Elektronentransfermediator enthält und
das Elektrodensystem von einer polymeren Schutzschicht (8) bedeckt ist.
2. Einwegbiosensor gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der
Elektronentransfermediator in der Reaktionsschicht eine Verbindung der Struktur
(I) ist,
in der die Reste R1, R2, R3 und R4 gleich oder verschieden sein können und ein Wasserstoffatom, einen C1-C10-Alkylrest, bevorzugt einen C1-C5-Alkylrest, oder einen Arylrest darstellen.
in der die Reste R1, R2, R3 und R4 gleich oder verschieden sein können und ein Wasserstoffatom, einen C1-C10-Alkylrest, bevorzugt einen C1-C5-Alkylrest, oder einen Arylrest darstellen.
3. Einwegbiosensor gemäß Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass der
Elektronentransfermediator in der Reaktionsschicht entweder p-Phenylendiamin,
N,N,N',N'-Tetramethyl-p-Phenylendiamin (TMPD) oder p-Aminodiphenylamin
(ADPA) ist.
4. Einwegbiosensor gemäß Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das
Elektrodensystem zusätzlich eine Referenzelektrode (7) umfaßt.
5. Einwegbiosensor gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die
Referenzelektrode (7) aus einer als wesentliche Bestandteile Silberpartikel,
Silberchlorid und ein leicht lösliches Chloridsalz enthaltenden Polymerpaste
besteht.
6. Einwegbiosensor gemäß Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das
Trägermaterial (1) aus Polycarbonat, Polyvinylchlorid (PVC),
Polyethylenterephtalat (PET), Polypropylen, Polyester oder Polystyrol besteht.
7. Einwegbiosensor gemäß Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die
Leiterbahnen (2) aus einer als wesentliche Bestandteile Kohlenstoff-, Silber-,
Platin- oder Goldpartikel enthaltenden Polymerpaste bestehen.
8. Einwegbiosensor gemäß Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass zur
Herstellung der Reaktionsschicht eine Polymerpaste als elektronenleitendes
Material verwendet worden ist, die als wesentliche Bestandteile Kohlenstoff-,
Platin-, Palladium-, Rhodium- oder Goldpartikel enthält.
9. Einwegbiosensor gemäß Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die
Gegenelektrode (6) aus einer als wesentliche Bestandteile Silberpartikel,
Silberchlorid und ein leicht lösliches Silbersalz enthaltenden Polymerpaste
besteht.
10. Einwegbiosensor gemäß Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die
hydrophile, polymere Schutzschicht (8) im wesentlichen aus einem Hydrogel aus
Polyvinylpyrrolidon (PVP), Polyethylenoxid (PEO), Stärke oder Gelatine besteht.
11. Einwegbiosensor gemäß Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass über
dem Elektrodensystem ein Kunststoffgewebe (9) lokalisiert ist, welches mit einem
die polymere Schutzschicht (8) bedeckenden Tape (10) über den Elektroden
fixiert ist, wobei das Tape (10) eine Aussparung zur Aufnahme einer Flüssigkeit
aufweist.
12. Einwegbiosensor gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das
Kunststoffgewebe (9) aus einem Polyethylen-, Polypropylen- oder Polyamidnetz
besteht.
13. Einwegbiosensor gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Tape
(10) aus einer einseitig klebenden Polyester-, PVC- oder Papierklebefolie
besteht.
14. Einwegbiosensor gemäß Anspruch 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die
analyterkennende Biokomponente ein Enzym ist.
15. Einwegbiosensor gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das
Enzym eine Oxidoreduktase, eine Dehydrogenase, eine β-Galaktosidase oder
eine alkalische Phosphatase ist.
16. Einwegbiosensor gemäß Anspruch 14 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das
Enzym entweder Glukoseoxidase (GOD), Laktatoxidase (LOD), Uricase,
Ascorbatoxidase, Ethanoloxidase, Cholesteroloxidase oder Peroxidase (POD)
ist.
17. Einwegbiosensor gemäß Anspruch 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die
analyterkennende Biokomponente ein DNA-Molekül, ein Fänger-Antikörper oder
ein Rezeptor ist.
18. Einwegbiosensor gemäß Anspruch 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die
Reaktionsschicht aus einer einzigen Schicht enthaltend die elektronenleitende
Polymerpaste, den leicht sublimierenden Mediator sowie die analyterkennende
Biokomponente gebildet wird.
19. Einwegbiosensor gemäß Anspruch 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die
Reaktionsschicht aus einer einzigen Schicht enthaltend die elektronenleitende
Polymerpaste und den leicht sublimierenden Mediator gebildet wird und dass die
analyterkennende Biokomponente in der polymeren Schutzschicht (8) lokalisiert
ist.
20. Einwegbiosensor gemäß Anspruch 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die
Reaktionsschicht aus zwei Schichten besteht, wobei die erste Schicht eine
elektronenleitende Polymerpaste sowie einen leicht sublimierenden Mediator
enthält und von einer zweiten, hydrophilen polymeren Deckschicht bedeckt ist,
die als Träger der analyterkennenden Biokomponente fungiert.
21. Einwegbiosensor gemäß Anspruch 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die
Reaktionsschicht aus zwei Schichten besteht, wobei die erste Schicht aus der
elektronenleitenden Polymerpaste gebildet wird und von einer zweiten,
hydrophilen polymeren Deckschicht bedeckt ist, die als Träger der
analyterkennenden Biokomponente und des leicht sublimierenden Mediators
fungiert.
22. Einwegbiosensor gemäß Anspruch 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die
Reaktionsschicht aus zwei Schichten besteht, wobei die erste Schicht aus der
elektronenleitenden Polymerpaste gebildet wird und von einer zweiten,
hydrophilen polymeren Deckschicht bedeckt ist, die als Träger des leicht
sublimierenden Mediators fungiert und dass die analyterkennende
Biokomponente in der polymeren Schutzschicht (8) lokalisiert ist.
23. Einwegbiosensor gemäß Anspruch 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die
hydrophile polymere Deckschicht im wesentlichen aus einem Hydrogel aus
Polyvinylpyrrolidon (PVP), Polyethylenoxid (PEO), Stärke oder Gelatine besteht.
24. Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer flüssigen Probe unter
Verwendung des Biosensors gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet,
dass eine flüssige Probe auf das Elektrodensystem des Biosensors gebracht
wird und anschließend über eine Potentiostateinheit, mit der ein definiertes
Meßpotential vorgegeben wird, der zur Analytkonzentration proportionale Strom,
welcher das Meßsignal des Biosensors darstellt, bestimmt wird.
25. Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer flüssigen Probe unter
Verwendung des Biosensors gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet,
dass eine flüssige Probe, welche eine sequenzspezifische DNA, ein Antigen oder
einen Liganden enthält, auf das Elektrodensystem des Biosensors gebracht wird,
danach der Sensor mit einer Pufferlösung gründlich gewaschen wird,
anschließend die Elektroden zunächst mit einer Lösung enthaltend ein Enzym-
Konjugat, welches die sequenzspezifische DNA, das Antigen oder den Liganden
erkennt, und nach erneutem Waschen mit einer Lösung enthaltend ein Substrat
bedeckt werden und schließlich über eine Potentiostateinheit, mit der ein
definiertes Meßpotential vorgegeben wird, der zur DNA-Konzentration, zur
Antigen-Konzentration oder zur Ligand-Konzentration proportionale Strom,
welcher das Meßsignal des Biosensors darstellt, bestimmt wird.
26. Verwendung von leicht sublimierenden Verbindungen als
Elektronentransfermediatoren eines elektrochemischen Sensors zur Überführung
von Elektronen von einem Enzym zu einem elektronenleitenden Material, wobei
sich die Verbindung in einer sogenannten Reaktionsschicht befindet.
27. Verwendung von leicht sublimierenden Verbindungen als
Elektronentransfermediatoren gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet,
dass die Verbindung eine Struktur gemäß der Formel (1) aufweist,
in der die Reste R1, R2, R3 und R4 gleich oder verschieden sein können und ein Wasserstoffatom, einen C1-C10-Alkylrest, bevorzugt einen C1-C5-Alkylrest, oder einen Arylrest darstellen.
in der die Reste R1, R2, R3 und R4 gleich oder verschieden sein können und ein Wasserstoffatom, einen C1-C10-Alkylrest, bevorzugt einen C1-C5-Alkylrest, oder einen Arylrest darstellen.
28. Verwendung von leicht sublimierenden Verbindungen als
Elektronentransfermediatoren gemäß Anspruch 26 und 27, dadurch
gekennzeichnet, dass es sich bei der Verbindung um p-Phenylendiamin,
N,N,N',N'-Tetramethyl-p-Phenylendiamin (TMPD) oder p-Aminodiphenylamin
(ADPA) handelt.
29. Verwendung eines Einwegbiosensors gemäß 1 bis 23 zur Bestimmung von
Analytkonzentration in einer synthetischen Lösung, in einer Nährlösung oder in
einer Körperflüssigkeit wie etwa Blut, Blutplasma, Blutserum oder Urin.
30. Verwendung eines Einwegbiosensors gemäß Anspruch 1 bis 23, dadurch
gekennzeichnet, das der Analyt Glukose, Laktat, Harnsäure, Ascorbat, Ethanol,
Cholesterol oder Wasserstoffperoxid ist.
Priority Applications (8)
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|---|---|---|---|
| DE10032042A DE10032042A1 (de) | 2000-07-05 | 2000-07-05 | Elektrochemischer Einwegbiosensor für die quantitative Bestimmung von Analytkonzentrationen in Flüssigkeiten |
| DE20022642U DE20022642U1 (de) | 2000-07-05 | 2000-07-05 | Elektrochemischer Einwegbiosensor für die quantitative Bestimmung von Analytkonzentrationen in Flüssigkeiten |
| ES01962825T ES2244646T3 (es) | 2000-07-05 | 2001-07-04 | Biosensor electroquimico desechable para la determinacion cuantitativ a de concentraciones de analitos en liquidos. |
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| AT01962825T ATE299947T1 (de) | 2000-07-05 | 2001-07-04 | Elektrochemischer einwegbiosensor für die quantitative bestimmung von analytkonzentrationen in flüssigkeiten |
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