DE10050873A1

DE10050873A1 - Metallbindende, proteinhaltige Verbindungen, Verfahren zu deren Gewinnung und ihre Verwendung

Info

Publication number: DE10050873A1
Application number: DE2000150873
Authority: DE
Inventors: Manfred Kuehn; Manfred Otto; Wolfgang Wiesner
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2000-10-11
Filing date: 2000-10-11
Publication date: 2002-04-25

Abstract

Die Erfindung betrifft neue metallbindende Verbindungen, die aus Getreidekeimlingen isoliert wurden und mit hoher Affinität Schwermetallionen binden. Gegenstand der Erfindung ist auch das Verfahren zur Gewinnung dieser Verbindungen sowie deren Verwendung und die Verwendung des Rohextraktes von Getreidekeimlingen als Metallabsorber.

Description

Die Erfindung betrifft neue metallbindende Verbin dungen, die aus Getreidekeimlingen isoliert wurden und mit hoher Affinität Schwermetallionen binden. Gegen stand der Erfindung ist auch das Verfahren zur Gewinnung dieser Verbindungen sowie deren Verwendung und die Verwendung der Rohextrakte von Getreide keimlingen als Metallabsorber.

Aus der Literatur sind eine Vielzahl von Absorp tionsmitteln bekannt, die zum Entfernen von toxischen Schwermetallionen wie z. B. Chrom-, Kupfer-, Blei-, Quecksilber-, Zink- oder Cadmiumionen aus industriellen Abwässern dienen können. Dies sind beispielsweise aus organischen Materialien (wie Rübenschnitzel oder Biomasse) durch chemische Modifizierung hergestellte Sorbentien. Auch Phytochelatine, die L-Cysteinyl- und γ-L-Glutamyl-reiche Isopeptide der Formel (γ-Glu-Cys)_n-X mit n = 2-11 und X = Gly oder β-Ala darstellen, sind als Strukturen bekannt, die Metallionen fest binden können (vgl. auch Grill, Winnacker, Zenk; SCIENCE, 1985, Vol. 230, 674-676). In ihrer Entgiftungsfunktion entsprechen sie den Metallothioneinen des Tierreichs.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, weitere metallbindende Verbindungen bereitzustellen, die Schwermetallionen mit hoher Affinität binden können und somit zum Entfernen und Rückgewinnen dieser aus fluiden Medien geeignet sind.

Es wurde gefunden, daß derartige Verbindungen in Getreidekeimlingen enthalten sind oder deren Bildung durch Inkubation der Getreidekörner mit Lösungen von Schwermetallionen induziert werden kann, wobei die Konzentration an Schwermetallionen in diesen Inkuba tionslösungen von 10-500 µM/l, vorzugsweise 20-80 µM/l beträgt.

Als Getreide sind erfindungsgemäß alle Getreidearten zu verstehen, z. B. Weizen, Gerste, Hafer, Roggen, Triticale, Hirse, Mais oder Reis.

Erfindungsgemäß wurden aus den Getreidekeimlingen, insbesondere aus Weizenkeimlingen, metallbindende, proteinhaltige Verbindungen gemäß der Ansprüche isoliert, die Schwermetallionen mit einer Affinität K_D < 10^-6 M binden. Bei den erfindungsgemäßen metallbindenden, proteinhaltigen Verbindungen handelt es sich um Metall(Me²⁺)-Proteinkomplexe mit einer Größe von 25-30 KD (festgestellt mittels Gelpermeations chromatographie), die die N-terminalen Sequenzen
SEQ ID No. 1:
Xaa-Gly-Pro-Gly-Met-Pro-Tyr-Xaa-Xaa-Gln-Met
SEQ ID No. 2:
Xaa-Gly-Pro-Gly-Met-Pro-Tyr-Xaa-Xaa-Gln-Leu
SEQ ID No. 3:
Xaa-Pro-Pro-Gly-Met-Pro-Tyr-Xaa-Xaa-Gln-Met
SEQ ID No. 4:
Xaa-Pro-Pro-Gly-Met-Pro-Tyr-Xaa-Xaa-Gln-Leu
SEQ ID No. 5:
Xaa-Ala-Glu-Val-Ser-Xaa-Ala-Ala-Gln-Leu-Xaa-Thr- Ala-Xaa
oder deren zu 90% homologe Sequenzen aufweisen, wobei Me²⁺ Cu²⁺, Cd²⁺, Zn²⁺ bedeutet und die Homologie sich auf die definierten Aminosäuren bezieht. Xaa steht für nicht bestimmte Aminosäuren.

So wurden in einer ersten Ausführungsform der Erfindung nach Me²⁺-Induktion von Getreidekörnern, insbesondere Weizenkörnern, und deren Keimung aus den Wurzeln der Keimlinge mit hochauflösenden analytischen und präpa rativen Verfahren der Proteinreinigung Me²⁺-Protein komplexe mit einer Größe von ca. 30 KD isoliert, die die N-terminale Sequenz SEQ ID No. 5 oder deren zu 90% homologe Sequenzen aufweisen, wobei je nach den zur Induktion eingesetzten Metallionen Cd²⁺-, Cu²⁺-, Zn²⁺- Komplexe erhalten werden, vorzugsweise Cd²⁺-Protein komplexe.

Als homologe Sequenzen werden im Sinne der Erfindung solche Sequenzen verstanden, in denen eine oder mehrere Aminosäuren durch andere Aminosäuren ersetzt oder ausgetauscht sein können, wobei die Homologie aber mindestens 90% betragen muß und die vorteilhafte Affinität der Me²⁺-Proteinkomplexe zum Binden von Schwermetallionen durch die Substitution von Amino säuren nicht verlorengeht.

In einer zweiten Ausführungsvariante der Erfindung werden aus dem Rohextrakt, der durch Aufschluß von Keimlingen, die in Leitungswasser gekeimt wurden, gewonnen wird, durch Affinitätschromatographie an einem Trennmaterial, das reversibel Metalle binden kann, Me²⁺-Proteinkomplexe mit einer Größe von ca. 25 KD isoliert, die eine der N-terminalen Sequenzen SEQ ID No. 1-SEQ ID No. 4 oder deren zu 90% homologe Sequenzen besitzen, wobei Me²⁺, Cu²⁺, Cd²⁺ oder Zn²⁺ bedeutet.

Es hat sich gezeigt, daß die erfindungsgemäßen Me²⁺- Proteinkomplexe Schwermetalle mit einer hohen Affinität binden können, so daß auch deren Verwendung als Metall absorber, insbesondere zur Entfernung von Schwermetal len aus fluiden Medien, Gegenstand der Erfindung ist. Vorzugsweise werden die Me²⁺-Proteinkomplexe zur erfin dungsgemäßen Verwendung in an sich bekannter Art und Weise an einen Träger fixiert. Als Träger kommen hierbei insbesondere solche in Frage, die Stickstoff ringgebunden enthalten (z. B. Imidazol oder Pyridin) oder Polymere mit Chelatgruppen oder SH-Gruppen darstellen.

Aber nicht nur die aus den Rohextrakten der Getreidekeimlinge gewonnenen Me²⁺-Proteinkomplexe, sondern auch der Rohextrakt der Getreidekeimlinge, insbesondere der der Weizenkeimlinge, selbst, der durch mechanisches Aufschließen der Getreidekeimlinge und anschließende Zentrifugation (klarer Überstand) gewonnen wurde, zeigt gute metallbindende Eigenschaften und kann zur Entfernung von Schwermetallionen einge setzt werden. Ganz besonders hohe Affinität zu Schwer metallionen zeigt der Rohextrakt, der durch das Aufschließen der Wurzeln der Getreidekeimlinge, deren Körner mit Schwermetallionen inkubiert wurden, gewonnen wird.

Zur Anwendung des Rohextraktes zum Binden von Schwermetallionen wird der Rohextrakt beispielsweise in einen Hohlfaserfiltrationsmodul eingebracht. Die Ausschlußgrenze der Membran sollte 10.000 Dalton sein. Für den Fall, daß enthaltene Phytochelatine zur Metallabsorption mit ausgenutzt werden sollen, kann sie aber auch kleiner sein.

Es ist auch möglich, den Rohextrakt als Suspension, z. B. in einen Dialyseschlauch einzubringen und diesen in die zu reinigende metallhaltige Lösung zu tauchen. Die aus der Lösung zu entfernenden Metalle dringen in den Dialyseschlauch und werden dort vom Rohextrakt gebunden.

Gemäß der Erfindung werden die metallbindenden, proteinhaltigen Verbindungen aus Getreidekeimlingen, insbesondere aus Weizenkeimlingen, isoliert, wobei

a) Getreidekörner mit wäßrigen Schwermetalllösungen inkubiert werden, die Körner zum Keimen gebracht werden, die Wurzeln der Keimlinge geerntet, mechanisch aufgeschlossen, mit NaBH₄-Lösung extrahiert und durch Zentrifugation der erhaltenen Suspension der Wurzel-Rohextrakt als klarer Überstand erhalten wird, aus welchem die Isolierung der proteinhaltigen Verbindungen mittels üblicher Trennverfahren für Proteine vorgenommen wird

oder

a) die unbehandelten, d. h. nicht mit Schwerme talllösungen inkubierten, aber in Leitungswasser gekeimten Keimlinge mechanisch aufgeschlossen werden, mit NaBH₄-Lösung extrahiert werden und durch Zentrifugation der erhaltenen Suspension der als klarer Überstand erhaltene Rohextrakt an einem Trennmaterial, das reversibel Metalle binden kann, chromatographiert wird, die gebundenen Substanzen eluiert werden und mittels üblicher Trennverfahren für Proteine die Isolierung der metallbindenden, proteinhaltigen Verbindungen aus dem Eluat vorgenommen wird.

Anstelle des NaBH₄, das zur Extraktion und Reduktion eingesetzt wird, können beispielsweise auch Mercaptoethanol oder ähnlich reduzierende Verbindungen eingesetzt werden.

In der Ausführungsvariante a) des erfindungsgemäßen Gewinnungsverfahrens werden Getreidekörner in wäßrigen Schwermetallionenlösungen einer Konzentration zwischen 10-500 µM/l Me²⁺, vorzugsweise von 20-80 µM/l Me²⁺, ganz besonders bevorzugt von 20-40 µM/l Me²⁺, für ca. 15- 20 Stunden gequollen und anschließend die Körner zum Keimen gebracht, wobei Bedingungen gewählt werden, die eine maximale Wurzelbildung erlauben. Die Wurzeln werden geerntet, mechanisch aufgeschlossen, die erhaltene Suspension zentrifugiert und aus dem Wurzel- Rohextrakt, der als klarer Überstand vorliegt, die oben beschriebenen Me²⁺-Proteinkomplexe mit einer Größe von ca. 30 KD gewonnen, oder der Wurzel-Rohextrakt wird direkt als Absorptionsmittel eingesetzt.

Die Isolierung dieser Me²⁺-Proteinkomplexe aus dem Wurzel-Rohextrakt erfolgt zunächst mittels Anionenaus tauschchromatographie, wobei übliche Anionenaustauscher eingesetzt werden können, vorzugsweise solche mit quarternären Ammoniumgruppen. Besonders bevorzugt wird der Anionenaustauscher MONO Q (Pharmacia/LKB) ver wendet. Es wird die Fraktion mit dem höchsten Me²⁺- Gehalt gewonnen und diese einer Ultrafiltration an einer 10 KD-Membran unterzogen, um eventuell vorhandene Phytochelatine abzutrennen. Phytochelatine sind kleiner 10 KD und werden deshalb bei der Ultrafiltration nicht zurückgehalten, während das Schwermetall im Retentat deutlich angereichert wird, die gewünschten Me²⁺- Proteinkomplexe also im Retentat verblieben sind.

Aus dem mit Me²⁺-Proteinkomplex angereicherten Retentat wird dann mittels Gelchromatographie, vorzugsweise an Superose 12, der Me²⁺-Proteinkomplex mit 30 KD eluiert.

In Abb. 1 ist beispielhaft die Isolierung eines Cd²⁺- Proteinkomplexes mit 30 KD schematisch dargestellt.

In der Ausführungsvariante b) des erfindungsgemäßen Gewinnungsverfahrens werden Keimlinge, die in Leitungswasser gekeimt wurden, mechanisch (mit Waring Blendor, im Mörser mit Sand oder in der Kugelmühle) aufgeschlossen. Die erhaltene Suspension wird zur Abtrennung partikulären Materials zentrifugiert und der als klarer Überstand erhaltene Rohextrakt durch Affinitätschromatographie, bevorzugt an einem Imidazolträger, aufgetrennt. Die Me²⁺-Proteinkomplexe werden am Imidazolträger gebunden und mit Imidazolpuffer eluiert. Als Trennmaterial, das reversibel Metalle binden kann, können jedoch auch andere heterocyclische Verbindungen eingesetzt werden, die Stickstoff ringgebunden enthalten, so z. B. Pyridin, oder auch Polymere mit Chelatgruppen oder SH- Gruppen. Vorzugsweise wird ein Imidazolträger einge setzt, wie er in J. Amer. Chem. Soc. 95(1973) 2048 beschrieben ist.

Es hat sich gezeigt, daß in diesem Fall, wenn die Keimlinge in Leitungswasser gekeimt werden, auf eine zusätzliche Metallinduktion verzichtet werden kann, da im Trinkwasser in der Regel bereits ca. 100 µg/l Kupfer enthalten sind (0,1 ppm) und so bereits offensichtlich eine Induktion stattfindet. Eine zusätzliche Induktion mit Cd²⁺-ionen z. B., würde natürlich die Metallauf nahmefähigkeit noch verbessern.

Aus dem Eluat werden dann mittels Ultrafiltration an einer 10 KD-Membran mögliche Phytochelatine abgetrennt und nachfolgend aus dem Retentat mittels Gelchroma tographie analog der oben beschriebenen Ausführungs variante a) der Me²⁺-Proteinkomplex mit 25 KD isoliert.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1 Beschreibung des Keimverfahrens am Beispiel Weizen

Weizen wurde jeweils bei 25°C für 8 h unter Rühren gewässert und das gefärbte Quellwasser verworfen. Die Keimung wurde bei 25-28°C in einer Keimanlage mit Frischluftzufuhr durchgeführt. Die Zuluft wurde auf <80% Luftfeuchtigkeit und ca. 25-28°C gebracht. Bei Bedarf wurde mit einer Nebeldüse zusätzlich befeuchtet. Das Keimbett wurde nach 24 h und in 8-12 Stunden- Intervallen von Hand aufgelockert. Sobald die Sprossen ca. 1-2 cm und die Wurzeln (meist drei Wurzeln) je ca. 3-5 cm Länge erreicht haben, wurden Keimlinge entnommen.

Mit der verwendeten Keimanlage können Chargen von stark bewurzelten Weizenkeimlingen von ca. 50 kg hergestellt werden.

Im Verlauf der Untersuchungen zeigte sich, daß die Wurzeln besonders vorteilhaft für die Metallaufnahme sind. Es wurde daher das Keimverfahren auf möglichst starke Wurzelbildung modifiziert. Solche Keimlinge werden für die erfindungsgemäße Herstellung des Rohextraktes bzw. die Isolierung der Metallbinder eingesetzt.

Beispiel 2 Cadmium- und Kupferinduktion von Weizenkeimlingen

Um Bedingungen zu schaffen, bei der die Induktion von metallbindenden Verbindungen in Weizenkeimlingen erfolgt, wurde der Einfluß von Kupfer- und Cadmiumionen auf das Wachstum der Keimlinge untersucht. Dazu wurden Weizenkörner in Lösungen verschiedener Kupfer- bzw. Cadmiumkonzentrationen gequollen (für 19 h). Dabei nimmt das Korn die Hauptmenge des für die Keimung erfor derlichen Wassers auf. Nach der Quellung werden die Körner in der Keimanlage zum Keimen gebracht und das Gewicht nach 96 h bestimmt. Es wird eine Hemmung des Sproß- und Wurzelwachstums und entsprechend eine verringerte Gewichtszunahme mit Zunahme der Kupfer- bzw. Cadmiumionenkonzentration in der Quell-Lösung beobachtet.

Als Bedingungen für die Induktion der metallbindenden Verbindungen wurde das halbmaximale Wachstum gewählt, da hier noch Stoffwechsel beobachtet wird, die Pflanze also noch in den Zellen zur Komplexierung der in die Zelle gelangenden Schwermetallionen Metallbinder bilden kann. Die Induktion mit Cadmiumacetat wurde mit 30 µM/l Cd²⁺ durchgeführt.

Beispiel 3 Isolierung und Charakterisierung eines 30 KD Cd²⁺- Proteinkomplexes mit der N-terminalen Sequenz SEQ ID No. 5 aus Weizenkeimlingen

Zur Isolierung von Metallbindern wurden wäßrige Extrakte aus induzierten Weizenkeimlingen mittels für Proteintrennung üblichen Trennverfahren fraktioniert, die sich bei der Reinigung von Proteinen im Labor- und industriellen Maßstab bewährt haben. Es wurde zur Proteinfraktionierung im Mikromaßstab die Ausrüstung Pharmacia Smart-System mit Mikrofraktionierung und im klein- und großvolumigen Labormaßstab die Ausrüstung Pharmacia FPLC und Biopilot eingesetzt. Als Trennmedien kamen zur Verwendung: Mono-Q-, QAE-Sepharose, Q- Sepharose (Ionenaustauschchromatographie), P-Sepharose (Chromatofocussing), Superdex 200, Superdex Peptide (Gelpermeationschromatographie), HPLC-C-18-Säulen (Reversed Phase HPLC).

Als Kriterium für die Fähigkeit zur Metallbindung wird der Cadmiumgehalt der Fraktion herangezogen. Es wurde dabei ein Reinigungsverfahren angestrebt, das mit möglichst wenigen Reinigungsschritten zu homogenen Substanzfraktionen führt.

Abb. 1 zeigt das Schema einer solchen Reinigung.

Tabelle 1 zeigt exemplarisch den Cd-Gehalt solcher Fraktionen.

Tabelle 1

Am Ionentauscher (Mono Q) werden drei Cd-haltige Fraktionen erhalten, wobei maximaler Cadmiumgehalt bei Fraktionen auftritt, die bei ca. 0,25 M NaCl im ansteigenden Kochsalzgradienten eluieren. Die Analyse der Fraktionen mit hochauflösender Gelpermeations- und Umkehrphasen-HPLC ergibt jeweils mehrere Substanzen.

Um Phytochelatine abzutrennen, wurden Ultrafiltra tionsschritte mit 10 KD bzw. 30 KD Trenngrenze durchgeführt. Phytochelatine sind kleiner 10 KD und werden deshalb bei der Ultrafiltration nicht zurück gehalten.

Nach dem Ultrafiltrationsschritt wurde Cadmium im Retentat deutlich angereichert (s. Tabelle 1), was auf Metallbinder mit einer molekularen Masse < 10 KD hinweist.

Durch Gelpermeationschromatographie wurden aus dem Retentat Cadmium-haltige Banden isoliert, deren Analyse am Sequenzanalysator die N-terminale Sequenz (SEQ ID No. 5):

Xaa-Ala-Glu-Val-Ser-Xaa-Ala-Ala-Gln-Leu-Xaa-Thr-Ala-Xaa

für eine Bande bei ca. 30 KD ergab.

Diese Sequenz zeigt keine Homologie zu bekannten N- terminalen Sequenzen. Es besteht Teilhomologie zu internen Sequenzabschnitten von Getreideproteinen.

Beispiel 4 Isolierung und Charakterisierung eines 25 KD Cd²⁺- Proteinkomplexes mit der N-terminalen Sequenz SEQ ID No. 1, No. 2, No. 3 oder No. 4 aus Weizenkeimlingen (Reinigung mittels Affinitätschromatographie am Imidazolträger) Isolierung

250 g Keimlinge (96 Stunden gekeimt) wurden in kleine Bruchstücke zermahlen (Mixer) und in 1 Liter 1 mM NaBH₄ bei 4°C 18 Stunden extrahiert. Anschließend wurden die unlöslichen Bestandteile in der Kühlzentrifuge bei 4°C und 5000 rpm 15 min lang abzentrifugiert. Das Pellet wurde verworfen und der Überstand auf pH 7,0 eingestellt. Die Lösung wurde zur Affinitäts chromatographie auf eine Säule mit Imidazolträger (J. Amer. Chem. Soc. 95 (1973) 2048)aufgetragen, so daß die zu isolierende metallbindende proteinhaltige Verbindung an dem Träger binden konnte. Die metallbindende, proteinhaltige Verbindung wurde mit einem 0,2 mM Imidazolpuffer pH 10,0 eluiert. Es wurden Fraktionen mit ca. 1,8 ml Eluat gesammelt.

Nach photometrischer Auswertung bei 405, 453 und 530 nm wurden die aktivsten Fraktionen (Fraktionen 18-32) vereinigt. Die Lösung wurde 18 Stunden bei 4°C gegen 50 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 dialysiert und ergab ein Volumen von 29 ml mit 2,887 mg/ml Protein. Daraufhin wurde ein Spektrum des dialysierten Extrakts aufge nommen.

Um Phytochelatine abzutrennen, wurde anschließend ein Ultrafiltrationsschritt mit 10 KD Trenngrenze durchgeführt. Phytochelatine sind kleiner 10 KD und werden deshalb bei der Ultrafiltration nicht zurück gehalten.

Die über die Affinitätschromatographie an der Imidazol- Säule und Ultrafiltration angereicherte metallbindende proteinhaltige Verbindung wurde mit 0,15 M NaCl vermischt und über eine Gelfiltration an Superose 12 mit 50 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 weiter gereinigt.

Die hoch angereicherte metallbindende proteinhaltige Verbindung der Fraktion 16 wurde am Sequenzanalysator sequenziert und ergab entweder die N-terminale Sequenz No. 1, No. 2, No. 3 oder No. 4 wie in der Beschreibung dargelegt.

Zur Molekulargewichtsbestimmung wurde eine Gelchro matographiesäule geeicht. Dazu wurden 0,125 mg Aldolase (MG 158 KD), 0,125 mg Rinderserumalbumin (MG 67 KD) und 0,125 mg Myoglobin (MG 17,8 KD) in 50 µl Kaliumphosphatpuffer 50 mM, pH 7,0 mit 0,15 M NaCl aufgetragen. Die Elution der Proteine wurde durch Messung der Extinktion bei 254 nm verfolgt. Die metallbindende proteinhaltige Verbindung der Fraktion 16 ergab ein natives Molekulargewicht von 25 KD.

Beispiel 5 Metallbindungsverhalten eines Rohextraktes aus Roggen keimlingen am Beispiel der Cadmiumbindung

250 g Roggen wurden entsprechend den Beispielen 1 und 4 gekeimt und anschließend in einem Mixer zerkleinert. Zum Roggenkeimlingsbrei wurden 300 ml 1 mM NaBH₄-Lösung addiert, und die Suspension wird in einen Dialy seschlauch gefüllt. Die Keimlingssuspension wird 24 Stunden gegen destilliertes Wasser dialysiert und danach in einen Liter einer wäßrigen Lösung getaucht, die 56,2 µg (0,5 µmol) Cadmium enthält. Die Lösung wird kontinuierlich gerührt. Nach 3 Stunden und danach stündlich werden Proben der Cadmiumlösung zur Bestim mung des Cadmiumgehaltes entnommen. Nach 12 Stunden war der Cadmiumgehalt der Lösung auf 0,46 µg/l Cadmium gesunken.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Metallbindende, proteinhaltige Verbindungen, die Metall(Me²⁺)-Proteinkomplexe mit einer Größe von 25-30 KD (GPC) darstellen und die N-terminalen
Sequenzen
SEQ ID No. 1:
Xaa-Gly-Pro-Gly-Met-Pro-Tyr-Xaa-Xaa-Gln-Met
SEQ ID No. 2:
Xaa-Gly-Pro-Gly-Met-Pro-Tyr-Xaa-Xaa-Gln-Leu
SEQ ID No. 3:
Xaa-Pro-Pro-Gly-Met-Pro-Tyr-Xaa-Xaa-Gln-Met
SEQ ID No. 4:
Xaa-Pro-Pro-Gly-Met-Pro-Tyr-Xaa-Xaa-Gln-Leu
SEQ ID No. 5:
Xaa-Ala-Glu-Val-Ser-Xaa-Ala-Ala-Gln-Leu-Xaa-Thr- Ala-Xaa
oder deren zu 90% homologe Sequenzen aufweisen,
wobei Me²⁺ Cu²⁺, Cd²⁺, Zn²⁺ bedeutet.

2. Metallbindende, proteinhaltige Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Me²⁺ Cd²⁺ bedeutet.

3. Verfahren zur Gewinnung von metallbindenden, pro teinhaltigen Verbindungen gemäß der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß diese aus Getreidekeimlingen isoliert werden, wobei

a) Getreidekörner mit wäßrigen Schwermetalllösungen inkubiert werden, die Körner zum Keimen gebracht werden, die Wurzeln der Weizenkeimlinge geerntet und aufgeschlossen werden und aus dem erhaltenen Wurzel-Rohextrakt die Isolierung der proteinhaltigen Verbindungen mittels üblicher Trennverfahren für Proteine vorgenommen wird

oder

a) in Leitungswasser gekeimte Getreidekeimlinge aufgeschlossen werden, der erhaltene Rohextrakt an einem Trennmaterial, das reversibel Metalle binden kann, chromatographiert wird, die gebundenen Substanzen eluiert werden und mittels üblicher Trennverfahren für Proteine die Isolierung der metallbindenden, proteinhaltigen Verbindungen aus dem Eluat vorgenommen wird.

4. Verfahren zur Gewinnung von metallbindenden Verbindungen gemäß Anspruch 3, die Me²⁺- Proteinkomplexe mit einer Größe von ca. 30 KD darstellen und die N-terminale Sequenz Xaa-Ala-Glu- Val-Ser-Xaa-Ala-Ala-Gln-Leu-Xaa-Thr-Ala-Xaa oder deren zu 90% homologe Sequenzen aufweisen, dadurch gekennzeichnet, daß Getreidekeimlinge mit wäßrigen Schwermetalllösungen inkubiert werden, die Wurzeln geerntet und aufgeschlossen werden und aus dem erhaltenen Wurzel-Rohextrakt mittels Anionenaustauschchromat ographie, Ultrafiltration an einer 10 KD-Membran und Gelchromatographie der Me²⁺-Proteinkomplex gewonnen wird.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, gekennzeichnet dadurch, daß als wäßrige Schwermetalllösungen Cu²⁺-, Cd²⁺-, Zn²⁺- Lösungen eingesetzt werden, vorzugsweise Cd²⁺- Lösungen.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrigen Schwermetalllösungen eine Schwermetallionenkonzentration von 10-500 µM/l aufweisen, vorzugsweise von 20 bis 80 µM/l.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Anionenaustauschchromatographie des erhaltenen Wurzel-Rohextraktes mit einem Anionenaustauscher, der quarternäre Ammoniumgruppen beinhaltet, durch geführt wird und die Fraktion mit dem höchsten Me²⁺-Gehalt zur weiteren Auftrennung mittels Ultra filtration und Gelchromatographie verwendet wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Anionenaustauschchromatographie die Frak tion mit dem höchsten Me²⁺-Gehalt einer Ultra filtration an einer 10 KD-Membran unterzogen wird und das Me²⁺-reiche Retentat durch Gelchroma tographie aufgetrennt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Gelchromatographie an einem Gelchromatographie material auf Zuckerbasis, durchgeführt wird, vorzugsweise mit Superose 12.

10. Verfahren zur Gewinnung von metallbindenden, proteinhaltigen Verbindungen gemäß Anspruch 3, die Me²⁺-Proteinkomplexe mit einer Größe von ca. 25 KD darstellen und die N-terminalen Sequenzen Xaa- Gly(Pro)-Pro-Gly-Met-Pro-Tyr-Xaa-Xaa-Gln-Met(Leu) oder deren zu 90% homologe Sequenzen aufweisen, dadurch gekennzeichnet, daß Getreidekeimlinge aufgeschlossen werden und der erhaltene Rohextrakt an einem Imidazolträger chromatographiert wird, die gebundenen Substanzen mit Imidazolpuffer eluiert werden und aus dem Eluat mittels Ultrafiltration an einer 10 KD-Membran und nachfolgende weitere Fraktionierung am hochauflösenden Molekülsieb der Me²⁺-Proteinkomplex gewonnen wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Getreidekeimlinge Weizenkeimlinge eingesetzt werden.

12. Verwendung von metallbindenden, proteinhaltigen Verbindungen gemäß Anspruch 1 oder 2 zum Binden von Schwermetallionen, insbesondere zur Entfernung und Rückgewinnung von Schwermetallionen aus fluiden Medien.

13. Verwendung gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die metallbindenden, proteinhaltigen Verbindungen an einem Träger fixiert eingesetzt werden.

14. Verwendung des Rohextraktes von Getreidekeimlingen zum Binden von Schwermetallionen, wobei der Rohextrakt durch Aufschließen von Getreide keimlingen erhalten wird, die in Leitungswasser gekeimt wurden.

15. Verwendung des Wurzel-Rohextraktes von Getreidekeimlingen zum Binden von Schwermetall ionen, wobei der Wurzel-Rohextrakt erhalten wird durch Inkubation von Getreidekörnern mit wäßrigen Schwermetalllösungen, Keimen der Körner, Ernten und Aufschließen der Wurzeln der Keimlinge.

16. Verwendung gemäß Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Rohextrakt als Suspension, vorzugsweise in einem Dialyseschlauch, eingesetzt wird, wobei die Suspension erhalten wird durch mechanisches Aufschließen und Extrahieren mit NaBH₄-Lösung.

17. Verwendung gemäß Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Rohextrakt als klare Lösung, vorzugsweise in einem Hohlfaserfiltrationsmodul, eingesetzt wird, wobei die klare Lösung durch mechanisches Aufschließen und Zentrifugieren erhalten wird.