DE10054382A1

DE10054382A1 - Verfahren und Testkit zum Nachweis von Analyten in einer Probe

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Publication number: DE10054382A1
Application number: DE10054382A
Authority: DE
Inventors: Werner Lehmann
Original assignee: Attomol Molekulare Diagno GmbH; Attomol Molekulare Diagnostika GmbH
Current assignee: Attomol Molekulare Diagno GmbH; Attomol Molekulare Diagnostika GmbH
Priority date: 2000-10-27
Filing date: 2000-10-27
Publication date: 2002-05-08
Also published as: US7361515B2; WO2002035228A2; AU2002224794A1; EP1332365B1; DE50110174D1; ATE330225T1; WO2002035228A3; US20040106215A1; ES2266297T3; EP1332365A2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und einen Testkit zum Nachweis von Analyten in einer biologischen Probe, wobei mindestens eine Mikropartikelpopulation mit Fluoreszenzfarbstoffen, die als Kodierungs- und Vergleichsfluoreszenzfarbstoffe dienen, markiert und immobilisiert wird und an die Mikropartikelpopulation Akzeptormoleküle gebunden werden, die mit markierten Analyten wechselwirken, so daß aus der Differenz der Fluoreszenzen der Mikropartikel und des/der Analyten bestimmt werden kann, welche Analyten, gegebenenfalls in welche Menge, in der Probe vorhanden sind. Insbesondere findet die Erfindung in der medizinischen Diagnostik Anwendung.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein effizientes und preiswertes Verfahren und einen Testkit zum Nachweis von Analyten in einer Probe.

Im Sinne der Erfindung werden unter einem Analyt chemische und/oder biologische Stukturen verstanden, wobei biologi sche Strukturen alle Moleküle sind, die von Organismen ge bildet, aufgenommen oder abgegeben werden; unter chemischen Strukturen werden alle Verbindungen verstanden, die in der Lage sind, mit anderen Molekülen so zu wechselwirken, daß ihr Nachweis möglich ist. Eine Probe ist im Sinne der Er findung ein durch Probenentnahme entnommenes Gut oder ein Teil bzw. eine kleine Menge eines solchen, dessen Beschaf fenheit physikalisch, chemisch und/oder biologisch geprüft werden soll. Biologische Proben sind beispielsweise ein Teil oder eine kleine Menge von Serum, Blut, Urin, Atem luft, Tränenflüssigkeit oder ähnlichem. Proben gemäß der Erfindung sind aber auch entnommene Teilmengen aus Abwäs sern, Industrieprozeßrückständen, Mooren oder anderen Um weltflüssigkeiten.

Im Stand der Technik sind zahlreiche Verfahren zum Nachweis oder zur Detektion von Analyten bekannt. Im Bereich der biologischen oder klinischen Forschung und Diagnostik kön nen die zu untersuchenden Analyten beispielsweise Proteine, Peptide, Sequenzabschnitte, Kohlenhydrate, Lipide und/oder antigene Strukturen sein.

Die Aussagekraft einer Parameteruntersuchung kann durch eine parallele Erfassung einer größeren Datenmenge aus ei ner einzelnen Probe - der sogenannten Multigarameteranalyse oder Multiligandenanalyse - erweitert und verbessert wer den. Die parallele Erfassung erfordert beispielsweise auch eine Miniaturisierung, durch die die Zahl der erfassbaren Parameter und Liganden beträchtlich erhöht werden kann. Die miniaturisierte DNS-Technologie ermöglicht es, mehr als 106 Parameter pro cm² zu analysieren, damit wird ein Miniaturi sierungsgrad von weniger als 1 µm²/Parameter auf einem Chip erreicht. Die zweidimensionale Positionierung von Akzeptor molekülen - die mit den Liganden wechselwirken - auf einem Chip, beispielsweise durch Elektrolithographie oder andere Verfahren, wie piezoelektrische Drucktechnik, erfordern, daß für jedes Testbesteck das Positionierungsverfahren auf dem Trägermaterial für alle Akzeptormoleküle in gleicher Weise wiederholt werden muß, um deren regelmäßige Anordnung - den sogenannten Array - auf dem Träger zu gewährleisten.

Die für die Elektrolithographie notwendigen aufwendigen Verfahren eignen sich aber nur für spezielle Anwendungsbe reiche, wie für pharmakogenetische Untersuchungen.

Alternativ werden daher zu den genannten Verfahren im Stand der Technik auch Mikropartikel als DNS-Array beschrieben. Ein solcher Mikropartikel-Array beruht darauf, daß mehrere Suspensionen von Mikropartikelpopulationen, die verschie dene, diskrete Fluoreszenzmarkierungen aufweisen, mit je weils spezifischen Akzeptormolekülen konjugiert werden (Lackner et al, 1999, Medgen 11, S. 16-17). Nach der Konjugation der Akzeptormoleküle werden die einzelnen Suspensio nen der verschiedenen Mikropartikelpopulationen gemischt und von der Mischung ein Aliquot zur Probenlösung gegeben, so daß sich Partikel von jeder Suspension im Reaktionsan satz gemischt befinden. Die nachzuweisenden Liganden aus der Probenlösung binden dann ligandenspezifisch an die ent sprechenden Akzeptormoleküle und somit immer nur an dis krete Mikropartikel einer bestimmten Population.

Simultan oder anschließend wird ein Rezeptorfluoreszenz farbstoff an die Liganden gebunden, dessen Emissionswellen länge sich ausreichend von der Emissionswellenlänge des Fluoreszensfarbstoffes zur Markierung der Mikropartikel un terscheidet. Die Fluoreszenz zur Identifizierung der Parti kel, wie auch die Reporterfluoreszenz der an die Partikel gebundenen Liganden, wird anschließend im Durchflußcytome ter analysiert.

Aus den Patentschriften US 5,326,692 und US 5,073,498 sind Mikropartikel bekannt, die Kombinationen von Fluoreszenz farbstoffen enthalten und die für unterschiedliche Detekti onsverfahren eingesetzt werden können. Die Kombination der Fluoreszenzfarbstoffe gestattet die gezielte Beeinflussung der Anregungs- und Emissionswellenlänge über den Energie transfer zwischen verschiedenen, einpolymerisierten Farb stoffen. Weiterhin ist es durch die Kombination verschiede ner Fluoreszenzfarbstoffe möglich, Mikropartikelpopulatio nen gezielter im Durchflußcytometer zu definieren.

Für das durchflußcytometrische Meßverfahren werden jedoch relativ viele Mikropartikel pro Probe, ca. 5.000-10.000 pro Akzeptor (Smith et al., 1998, Clin Chem 44, 2054-2056), benötigt, um in dem Meßvolumen genügend Mikropartikel einer Population erfassen zu können. Dadurch erhöhen sich die Ma terialkosten, was vor allem bei teuren und biochemisch schwer zu synthetisierenden Akzeptormolekülsubstanzen nach teilig ist.

Desweiteren ist die relativ geringe Auflösung von Partikel populationen mit Hilfe des Durchflußcytometers nachteilig. Nach Carson et al. (1999, J. Immunol Methods 227, 41-52) ist lediglich eine Individualisierung von 64 Partikelpopu lationen mittels zweier Fluoreszenzfarbstoffe möglich. Oli ver et al. (1998, Clin Chem 44, 2057-2060) beschreiben wei terhin, daß relativ lange Meßzeiten von ca. 30 min. bis zu 1 Stunde pro Probe notwendig sind, um effektiv mehrere Pa rameter spezifisch parallel zu detektieren. Die langen Meß zeiten führen zum Teil zu einer nachteiligen Modifikation der Liganden und der Fluoreszenzfarbstoffe.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zu Grunde, ein effi zientes Verfahren und einen Testkit bereitzustellen, die eine kürzere Meßzeit sowie eine höhere Sensitivität erlau ben, preiswert sind und im Routinebetrieb eingesetzt werden können.

Die vorliegende Erfindung löst dieses technische Problem durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Detektion von Analyten, wobei das Verfahren die folgenden Schritte um fasst: Fluoreszenzmarkierung mindestens einer Mikroparti kelpopulation, wobei die Mikropartikelpopulation mindestens einen Fluoreszenzarbstoff, der als Kodierungsfluoreszenz dient, und mindestens einen Fluoreszenzfarbstoff, der als Vergleichsfluoreszenz dient, umfasst, Bindung und/oder Kon jugation von Akzeptormolekülen an die Mikropartikelpopula tion, Immobilisierung der Mikropartikelpopulation an einen Träger, Inkubation der Mikropartikelpopulation, mit der zu untersuchenden Probe, Markierung des/der Analyten mit min destens einem Fluoreszenzfarbstoff, der als Reporterfluor eszenz dient, und Nachweis des/der Analyten durch Vergleich der Fluoreszenzen der Mikropartikelpopulation mit der Re porterfluoreszenz.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst mehrere Schritte, die in ihrer Reihenfolge modifiziert werden können. Es ist beispielsweise möglich, daß die Analyten vor bzw. nach der Bindung mit einem Fluoreszenzfarbstoff, der als Reporter fluoreszenz dient, markiert werden.

Wenn mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Paralleluntersu chungen durchgeführt werden sollen, werden mindestens zwei Mikropartikelpopulationen mit Fluoreszenzfarbstoffen mar kiert. Mikropartikel im Sinne der Erfindung sind heterogene und/oder homogene Fraktionen aus mikroskopischen Teilchen, mit einer Größe von 1-500 µm, insbesondere 1-100 µm, bevorzugt 1-10 µm. Die Mikropartikel können hierbei orga nische und/oder anorganische Bestandteile beinhalten. Die Mikropartikel können beispielsweise Polymere sein, die sich nach Emulgierung oder Grenzflächenpolymerisation auf dem einzuschließenden Material, beispielsweise einem Fluores zenzfarbstoff, niederschlagen. Die Mikropartikel können aus Polysteren bzw. Polyphosphorsäure, Polyvinyl oder Po lyacrylsäurekopolymeren bestehen. Es kann jedoch auch vor gesehen sein, daß die Mikropartikel aus oxidischen Keramik partikeln, wie beispielsweise Siliziumdioxid, Titandioxid oder anderen Metalloxiden bestehen. Gemäß des erfindungsge mäßen Verfahrens sind jedoch auch vernetzte Polypeptide, Proteine, Nukleinsäure, Makromoleküle, Lipide, beispiels weise als Vesikel und ähnliches, Mikropartikel im Sinne der Erfindung. Die Herstellung von Mikropartikeln wird bei spielsweise in den Patenten US 6,022,564, 5,840,674, 5,788,991 und 5,7543,261 offenbart.

Unter einer Mikropartikelpopulation im Sinne der Erfindung versteht man Mikropartikel, die sich in Bezug auf die Markierung mit dem Fluoreszenzfarbstoff oder den Fluoreszenz farbstoffen gleichen. Beispielsweise kann eine Mikroparti kelpopulation aus Mikropartikeln bestehen, die mit einem rot-, gelb-, bzw. blaufluoreszierendem Farbstoff und/oder mit Fluoreszenzfarbstoffen, deren Fluoreszenzlebensdauer sich unterscheidet, markiert worden sind. Eine Mikroparti kelpopulation kann jedoch auch durch das Verhältnis an ver schiedenen Fluoreszenzfarbstoffen definiert sein. Zu einer Mikropartikelpopulation können dann beispielsweise alle Mi kropartikel gehören, deren Fluoreszenzmarkierung z. B. aus grünem und rotem Fluoreszenzfarbstoff im Verhältnis 1 : 1 be steht. Die Mikropartikel einer Mikropartikelpopulation wei sen mindestens einen Fluoreszenzfarbstoff auf, der als Ko dierungsfluoreszenz dient, und mindestens einen weiteren Fluoreszenzfarbstoff, der als Vergleichsfluoreszenz dient.

Die Kodierungsfluoreszenz dient der Analyse der Mikroparti kel. Die Mikropartikel können mit verschiedenen Fluores zenzfarbstoffen oder mit verschiedenen Intensitäten der Fluoreszenzfarbstoffe markiert werden. Auf diese Weise ent stehen diskrete Mikropartikelpopulation, die mit Hilfe von Detektoren identifiziert werden können. Neben dem oder den Fluoreszenzfarbstoffen, die als Kodierungsfluoreszenz die nen, weisen die Mikropartikel mindestens einen weiteren Fluoreszenzfarbstoff auf, der als Vergleichsfluoreszenz dient. Mit Hilfe der Vergleichsfluoreszenz ist es möglich, die Kodierungsfluoreszenz effektiv zu referenzieren. Durch die Ausstattung der Mikropartikel mit der Vergleichsfluor eszenz und einer Kodierungsfluoreszenz können die Fluores zenzsignale zueinander in Beziehung gesetzt werden und so mit Meßfehler ausgeglichen werden.

Fluoreszenzfarbstoffe, die der Markierung der Mikropartikel dienen, sind alle Substanzen, die detektierbare Lumines zenzsignale senden können. Es können jedoch auch Farbstoffe eingesetzt werden, die Röntgenstrahlung emitieren oder eine Phosphoreszenz aufweisen. Fluoreszenzfarbstoffe im Sinne der Erfindung sind alle gasförmigen, flüssigen oder festen anorganischen und/oder organischen Verbindungen, die da durch gekennzeichnet sind, daß sie nach Anregung die absor bierte Energie in Form von Strahlung von gleicher oder län gerer Wellenlänge wieder abgeben. Das heißt, auch anorgani sche oder organische lumineszenzfähige Pigmente können als Fluoreszenzfarbstoffe im Sinne der Erfindung verwendet wer den. Es kann jedoch auch vorgesehen sein, daß die Mikropar tikel so beschaffen sind, daß sie eine Eigenfluoreszenz, bzw. sowohl eine Eigenfluoreszenz als auch eine nichteigene Fluoreszenzmarkierung aufweisen. Eine Eigenfluoreszenz der Mikropartikel kann beispielsweise dadurch erzeugt werden, daß die Mikropartikel das Mineral Fluorit beinhalten. Als nichteigene Fluoreszenzfarbstoffe für die Kodierungs- und/oder Vergleichsfluoreszenz können beispielsweise einge setzt werden: Dansylchlorid, Fluoresceinisothiocyanat, 7- Chlor-4-nitrobenzoxadiazol, Pyrenbutyrylessigsäure-anhy drid, N-Iodoacetyl-N'-(5-sulfonsäure-1-naphthyl)-ethylen diamin, 1-Anilinonaphthalen-8-sulfonat, 2-Toluidinonaphtha len-6-sulfonat, 7-(p-Methoxybenzylamino)4-nitro-benz-2-oxa- 1,3-diazol, Formycin, 2-Aminopurinribo-nukleosid, Etheno adenosin, Benzoadenosin, α- und β-Parinarsäure und/oder Δ^9,11,13,15Octaecatetraensäure und andere. Als Fluoreszenzfarb stoffe, die für die Vergleichsfluoreszenz dienen, können z. B. Übergangsmetallkomplexe eingesetzt werden, die fol gende Substanzen enthalten: Ruthenium (II), Rhenium (I) oder Osmium und Iridium als Zentralatom und Diiminliganden; phosphoreszierende Prophyrine mit Platin, Palladium, Lute tium oder Zinn als Zentralatom; phosphoreszierende Komplexe der Seltenerden wie Europium, Dysprosium oder Terbium; phosphoreszierende Kristalle wie Rubin, Cr-YAG, Alexandrit oder phosphoreszierende Mischoxide wie Magnesiumfluoroger manat bzw. Fluorescein, Aminofluorescein, Aminomethylcoumarin, Rhodamin, Rhodamin 6 G, Rhodamin B, Tetramethylrhoda min, Ethidiumbromid und/oder Acridinorange.

Als Fluoreszenzfarbstoffe für die Kodierungsfluoreszenz können z. B. folgende Stoffe eingesetzt werden:
Ruthenium(II)-(tris-4,7-diphenyl-1,10-phenanthrolin)/HPTS
Ruthenium(II)-(tris-4,7-diphenyl-1,10-phenanthro lin)/Fluorescein
Ruthenium(II)-(tris-4,7-diphenyl-1,10-phenanthro lin)/Rhodamin B
Ruthenium(II)-(tris-4,7-diphenyl-1,10-phenanthro lin)/Rhodamin B-octadecylester
Ruthenium(II)-(tris-4,7-diphenyl-1,10-phenanthro lin)/Hexadecyl-Acridinorange
Europium(III)-tris-theonyl-trifluormethylaceto nat/Hydroxymethylcoumarin
Platin(II)-tetraphenylporphyrin/Rhodamin B-octadecylester
Platin(II)-tetraphenylporphyrin/Rhodamin B
Platin(II)-tetraphenylporphyrin/Naphtofluorescein
Platin(II)-tetraphenylporphyrin/Sulforhodamin 101
Platin(II)-octaethylporphyrin/Eosin
Platin(II)-octaethylporphyrin/Thionin
Platin(II)-octaethylketoporphyrin/Nilblau
Cr(III)-YAG/Nilblau und
Cr(III)-YAG/Naphtofluorescein.
Aminocoumarin/Aminofluorescein
Aminocoumarin/Rhodamin 6G
Aminocoumarin/Tetramethylrhodamin
Aminocoumarin/Acridinorange
Aminofluorescein/Rhodamin 6G
Aminofluorescein/Tetramethylrhodamin und
Aminofluorescein/Ethidiumbromid.

Die Fluoreszenzfarbstoffe können beispielsweise während der Herstellung der Mikropartikel einpolymerisiert werden oder nachträglich auf die Mikropartikel coimmobilisiert werden. Die Fluoreszenzfarbstoffe können beispielsweise während der Herstellung der Mikropartikel direkt in einem Lösungsmittel für die Mikropartikel eingebracht werden. Durch die Einpo lymerisierung der Fluoreszenzfarbstoffe ist es möglich, die Menge der an die Mikropartikel gebundenen Fluoreszenzfarb stoffe genau zu bestimmen. Die Fluoreszenzfarbstoffe können entweder so einpolymerisiert vorliegen, daß sie weitestge hend inert sind oder aber mit den Analyten in Wechselwir kung treten. Weiterhin ist der Einbau der Fluoreszenzfarb stoffe in ein Sol-Gel-Glas als Mikropartikel mit anschlie ßendem sieden, pulverisieren und dispergieren des Glases möglich. Bei der Verwendung von pulverisierten Fluoreszenz farbstoffen, kann der Farbstoff als sensitive Schicht, bei spielsweise in Form der Beschichtung der Außenseite der Mi kropartikel, dispergiert werden. Dies kann beispielsweise durch kovalante oder elektrostatische Bindung der Fluores zenzfarbstoffe an die Oberfläche der Mikropartikel erfol gen. Es können beispielsweise Hydroxygruppen, amphiphile Elektrolyte, Phospholipide und ionische Bestandteile ge nutzt werden, um Fluoreszenzfarbstoffe an die Oberfläche der Mikropartikel zu binden.

Erfindungsgemäß ist vorgesehen, daß die fluoreszenzmarkier ten Mikropartikel mit Akzeptormolekülen konjugieren oder binden. Gemäß des erfindungsgemäßen Verfahrens werden an jede Population von Mikropartikeln spezifische Akzeptormo leküle gekoppelt. Die Akzeptormoleküle können funktionelle Gruppen, wie Aminogruppen, Carboxylgruppen, Thiolgruppen, Hydroxylgruppen oder aber auch Epitope, Paratope, Kohlenhy drate, Lektine oder Oligo- oder Polynukleotidsequenzen sein. Epitope, die zur Immobilisierung verwendet werden, können beispielsweise antigene Determinanten sein, die mit dem antigenbindenden Teil eines Antikörpers oder mit einem Rezeptor in Wechselwirkung treten. Paratope im Sinne der Erfindung können beispielsweise die Teile eines Antikörpers sein, die spezifisch mit antigenen Strukturen interagieren. Die Akzeptormoleküle können kovalent, nicht kovalent, durch ionische Bindung oder andere Wechselwirkungen an die jewei lige Mikropartikelpopulation binden. Erfindungsgemäß werden die Mikropartikelpopulationen an einen Träger immobili siert. Durch die Immobilisierung werden die Mikropartikel in einen reaktionsraumbegrenzten Zustand versetzt. Unter Immobilisierung werden im Sinne der Erfindung alle Methoden verstanden, die zur Einschränkung der Beweglichkeit der Mi kropartikel auf biologischem, chemischem oder physikali schem Wege führen. Der Träger, auf dem die Mikropartikel immobilisiert werden, können beispielsweise Glasplättchen, Membranen, Geflechte und/oder Fibrillen sein. Die Immobili sierung der Mikropartikel an ein Träger kann direkt oder über Spacer vorgenommen werden. Spacer im Sinne der Erfin dung sind alle Abstandhalter, die beispielsweise eine kurze Kohlenstoffkette zwischen Mikropartikel und Träger ausbil den können. Es können beispielsweise hydroxilierte Ketten eingesetzt werden, um spezifische hydrophobe Wechselwirkun gen zu vermeiden. Es ist jedoch auch möglich, die Mikropar tikel über die Akzeptormoleküle zu immobilisieren. Bei der Bindung der Mikropartikel mit Hilfe von eigenen Bindungs stellen ist es möglich, die Akzeptormoleküle vollkommen frei zu wählen, da diese die Bindung an einen möglichen Träger nicht vermitteln müssen. Bei einer Immobilisierung der Mirkopartikel mit Hilfe der Akzeptormoleküle ist vorge sehen, daß die Akzeptormoleküle die hierfür die nötigen Ei genschaften aufweisen, wie beispielsweise Molekülladung, chemisch modifizierbare Gruppen und/oder Immun- bzw. Nu kleinsäure-, hybridisierungsaffinitäten u. ä. Durch die Im mobilisierung der Mikropartikel mit Hilfe der Akzeptormole küle muß eine Immobilisierung mit Hilfe der Spacer nicht zwingend vorgenommen werden. Selbstverständlich kann auch vorgesehen sein, daß die Mikropartikel über Bindungsstellen auf die Oberfläche der Mikropartikel an die Träger immobi lisieren.

Erfindungsgemäß wird mindestens eine Mikropartikelpopula tion mit der zu untersuchenden Probe inkubiert. Durch die Inkubation von immobilisierten Mikropartikeln und der zu untersuchenden Probe ist es möglich, daß Analyten aus der Probe mit den Akzeptormolekülen, die an die Mikropartikel gebunden sind, interagieren. Wenn es sich beispielsweise bei den Akzeptormolekülen um gebundene Antikörper handelt, können die Analyten, beispielsweise antigene Strukturen, an diese binden. Da die Akzeptormoleküle an die Mirkopartikel gebunden sind, wird hierdurch eine Bindung der Analyten an die Mikropartikel über die Akzeptormoleküle ermöglicht. Mit Vorteil können während der Inkubation der Mikropartikelpo pulation mit der zu untersuchenden Probe Reaktionsbedingun gen geschaffen werden, die ein effizientes Wechselwirken zwischen den Analyten und der Mikropartikelpopulation er möglichen, solche Reaktionsbedingungen können z. B. eine er höhte Temperatur sein. Es ist jedoch auch möglich, die Mi kropartikelpopulation in der Probe zu schwenken oder zu verrühren. Die Zahl der auf dem Träger zu immobilisierenden Mikropartikelpopulation wird insbesondere durch die Zahl der Akzeptormolekülspezifitäten bestimmt, die für die Cha rakterisierung der Analyten erforderlich sind. Dazu werden z. B. die gewünschten Suspensionen gemischt und kleine Ali quots der Mischung mittels Dispenser auf den Träger pipet tiert. Die Mikropartikel sedimentieren im Tropfen und kon taktieren die Oberfläche des Trägers, wobei 1-1.000.000, insbesondere 1-100.000, bevorzugt 1-10.000 und beson ders bevorzugt 1-1.000 oder weniger Mikropartikel einer Population am Träger zufällig verteilt gebunden werden kön nen. Das Antrocknen des Tropfens auf dem Träger muß insbe sondere verhindert werden, wenn sich das Trocknen der Akzeptormoleküle nachteilig auf die gewünschte Bindung der Analyten auswirkt.

Erfindungsgemäß ist es vorgesehen, die Analyten mit minde stens einer Reporterfluoreszenz zu markieren. Selbstver ständlich ist es möglich, die Analyten vor bzw. nach der Bindung an die Akzeptormoleküle zu markieren. Als fluores zierende Moleküle können beispielsweise Fluoresceini sothiocyanat, Tetramethylrhodaminisothiocyanat, Texasrot, 7-Amino-4-Methyl-Cumarin-3-Essigsäure, Phycoerythrin und/oder Cyanine und andere eingesetzt werden oder antikör perkonjugierten Fluoreszenzpartikeln, die beispielsweise mit Hilfe von Antikörpern an den Analyten binden. Es ist beispielsweise möglich, die Anlayten direkt mit einem Fluoreszenzfarbstoff zu markieren. Durch das direkte Mar kieren der Analyten kann auf fluoreszenzmarkierte Antikör per oder andere markertragende Strukturen verzichtet wer den. Die direkte Markierung der Liganden kann insbesondere durch Fluoreszenzfarbstoffe erfolgen, die ein Fluoreszenz signal emittieren oder die Fluoreszenz anderer Marker ge zielt quenchen. Die Analyten können jedoch auch enzymmar kiert werden. Beispiele für enzymmarkierte Moleküle sind die Meerrettichperoxidase, die alkalische Phosphatase und/oder die Glucoseoxidase.

Der Nachweis des/der Analyten erfolgt gemäß des erfindungs gemäßen Verfahrens durch einen Vergleich der Fluoreszenzen der Mikropartikelpopulation mit der Reporterfluoreszenz. Beispielsweise können in einer fluoreszenzspektrometrischen Bestimmung die Intensitäten der Fluoreszenzen der Mikropar tikelpopulation und der/des Analyten so verglichen werden, daß insbesondere sowohl die Identität der analyttragenden Mikropartikelpopulation als auch die Anzahl der gebundenen Analyten analysiert werden kann. Somit sind beispielsweise Aussägen darüber möglich, welche Analyten an bestimmte diskrete Mikropartikelpopulationen gebunden haben und in wel cher Anzahl.

Es kann vorgesehen sein, daß die Vergleichsfluoreszenz in ihren Parametern von den Analyten nicht beeinflußt wird, während sich beispielsweise die Intensität der Kodierungs fluoreszenz in Abhängigkeit von der jeweiligen Konzentra tion der Analyten verändern kann. So kann die Signalinten sität der Mikropartikelpopulation durch eine interne Refe renzierung charakterisiert werden, insbesondere ohne daß eine weitere Anregungsquelle für die Fluoreszenz oder ein zweiter Detektor zur Bestimmung der Fluoreszenz erforder lich ist. Die Referenzgröße für die interne Referenzierung wird aufgrund der Fluoreszenzintensität und/oder des Zeit verlaufes der Fluoreszenzantwort der Vergleichsfluoreszenz bestimmt. Vorteilhaft ist es, wenn die Kodierungsfluores zenz und die Vergleichsfluoreszenz im gleichen Wellenlän genbereich Licht absorbieren und somit mit der gleichen An regungsquelle angeregt werden können. Mit Vorteil liegen die Emissionssprektren im gleichen Spektralbereich. Das Verfahren gestattet es, daß die Vergleichsfluoreszenz keine für die nachzuweisenden Moleküle spezifische Reaktion auf weisen muß, sondern ein konstantes Signal zur Referenzie rung liefert. Es ist jedoch auch möglich, daß sowohl die Vergleichsfluoreszenz und die Kodierungsfluoreszenz mit den Analyten wechselwirken. Selbstverständlich kann auch vorge sehen sein, daß weder die Vergleichsfluoreszenz noch die Kodierungsfluoreszenz mit den Analyten so interagieren, daß sich die Fluoreszenzsignale ändern. Erfindungsgemäß ist es möglich, daß die Fluoreszenzfarbstoffe für die Kodierungs fluoreszenz und Vergleichsfluoreszenz gleichzeitig und durch eine Quelle gemeinsam angeregt werden und durch einen Detektor gemeinsam erfasst werden.

In einer Ausführungsvariante der Erfindung ist vorgesehen, daß die Mikropartikel an Mikrotestplatten, Glasplättchen, flexible Membranen, Geflechte oder Fibrillen, insbesondere aus Polypropylen und/oder Nitrozellulose, Glas und/oder Po lyvinylidenfluorid (PVDF) binden. Als Mikrotestplatten kön nen z. B. Mikrotiterplatten eingesetzt werden. Vorteilhaf terweise weisen Mikrotestplatten Maße auf, die einen Ein satz in zahlreichen Laborroutinen gestatten. Beispielsweise sind zahlreiche Fluoreszenzmeßgeräte, wie Fluoreszenzmikro skope und ähnliches so ausgebildet, daß Mikrotestplatten als Standard verwandt werden können. Die Immobilisierung der Mikropartikel auf spezielle Laborgefäße, beispielsweise Mikrotiterplatten, Petrischalen, Vielfachschalen, Mul tischalen, Wannenschalen und andere Kulturgefäße und Ob jektträger, ermöglicht daher vorteilhafterweise auch die Verwendung der vorhandenen Labormittel und -geräte zum In kubieren, Einfrieren, Lyophilisieren und ähnlichen Laborge räte in klinischen oder Forschungslaboratorien. Als Mikro testplatten können beispielsweise bevorzugt Mikrotiterplat ten mit transparentem, nicht fluoreszierendem Flachboden verwandt werden.

In einer weiteren Ausführungsvariante der Erfindung ist vorgesehen, daß mehrere Analyten gleichzeitig detektiert werden, indem die Analyten über diskrete Mikropartikelpopu lationen mit jeweils individuellen Akzeptormolekülen bela den werden. Beispielsweise können verschiedene beladene Mi kropartikelpopulationen markiert werden, um sie anschlie ßend zu mischen. Aliquots der Mikropopulationsmischung wer den dann auf einem Träger kontaktiert, um die Mikropartikel an den Träger zu immobilisieren. Danach wird der Träger vorteilhafterweise mit der Probe inkubiert, so daß die Ana lyten an die Akzeptormoleküle, die der jeweiligen Mikropar tikelpopulation zugeordnet sind, binden. Das parallele Er fassen von mehreren Parametern durch die gleichzeitige Detektion von verschiedenen Analyten erlaubt, die Charakteri sierung mehrerer Analyten mit geringem Material und Zeit aufwand.

Es kann jedoch auch vorgesehen sein, daß die Analyten über ein Linkermolekül gebunden werden. Das Linkermolekül kann beispielsweise kovalent oder nichtkovalent an den Analyten gebunden werden. Das Linkermolekül kann die Beweglichkeit der Analyten so modulieren, daß das von dem Analyten oder von dem an den Analyten gebundenen Fluoreszenzfarbstoff emittierte Signal effizient detektierbar ist.

In einer weiteren Ausführungsvariante der Erfindung sind die Analyten spezifisch mit verschiedenen Fluoreszenzfarb stoffen markiert. Die Fluoreszenzfarbstoffe können sich durch die Farbe der Fluoreszenz, die Fluoreszenzlebensdauer bzw. durch die Intensitäten unterscheiden. Mit Vorteil kann durch die Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen in ver schiedenen Intensitäten eine diskrete Mikropartikelpopula tion entstehen, die beispielsweise im Fluoreszenzmikroskop detektiert werden kann. Die mögliche Anzahl diskreter Popu lationen hängt insbesondere von den verfügbaren Farbstoffen und Techniken zur Markierung der Mikropartikel sowie von der Anzahl unterscheidbarer Farben im Detektionsmeßgerät ab. Beispielsweise ist es mit Vorteil möglich, mit zwei Farben ca. 60 bis 100 verschiedene diskrete Mikropartikel populationen herzustellen. Die Anzahl der Population kann durch ein genaueres Bestimmen der Intensitäten bzw. durch eine weitere Farbe auf ca. 500 bis 1000 weitere gut unter scheidbare Mikropartikelpopulationen erhöht werden.

In einer weiteren Ausführungsvariante der Erfindung sind die Analyten mit einem einheitlichen Fluoreszenzfarbstoff markiert. Mit der einheitlichen Markierung der Analyten kann vorteilhafterweise die Gesamtanzahl der an die Mikropartikel gebundenen markierten Analyten bestimmt werden. Die Analyse der Analyten kann beispielsweise durch die Zu ordnung in diskrete Populationen über die Markierung der Mikropartikel erfolgen. Bevorzugt ist, daß die Fluoreszenz farbstoffe und/oder Enzyme in monomerer und/oder polymerer Form vorliegen. Die Fluoreszenzfarbstoffe können beispiels weise anorganische Verbindungen, wie Verbindungen der Sel tenerdmetalle oder beispielsweise Uraniumverbindungen oder organische Verbindungen sein. Es ist jedoch auch möglich, statt der Markierung durch Fluoreszenzsubstrate, chromogene Substrate zu verwenden, die insbesondere chemielumeniszie ren.

In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der Er findung ist vorgesehen, unterschiedliche Antikörper in ei ner serologischen Probe nachzuweisen (siehe Fig. 1). Ver schiedenfarbig fluoreszierende Mikropartikel werden mit je weils unterschiedlichen Antigenen als Akzeptoren konjugiert und über die Antigene an einen Träger immobilisiert. Mit Vorteil binden während der anschließenden Inkubation Anti körper als Analyten aus einem Patientenserum an die Anti gene, für die sie spezifisch sind. Die gebundenen Antikör per werden mit Hilfe eines sekundären Antikörpers nachge wiesen, der eine Reporterfluoreszenz aufweist. Für die Aus wertung wird die Fluoreszenz der Mikropartikel und die Re porterfluoreszenz, insbesondere für jeden Bildpunkt einer Mikrotiterplatten-Kavität, gemessen.

Die Erfindung umfasst auch einen Testkit, wobei der Testkit mindestens eine fluoreszenzmarkierte, immobilisierte Mikro partikelpopulation umfasst, die mit spezifischen Akzeptor molekülen binden kann. Erfindungsgemäß umfassen die immobi lisierten Mikropartikel mindestens zwei Fluoreszenzfarb stoffe, die sich hinsichtlich ihrer spektralen Eigenschaf ten und/oder ihrer Fluoreszenzlebensdauer unterscheiden, wobei jeweils ein Farbstoff für eine Kodierungsfluoreszenz und ein Farbstoff für die Vergleichsfluoreszenz verwendet wird. Die Vergleichsfluoreszenz dient der Referenzierung der Kodierungsfluoreszenz. Mit Vorteil können in dem Test kit die Signale der Kodierungsfluoreszenz in Beziehung zur Vergleichsfluoreszenz gesetzt werden und somit Meßfehler ausgeglichen werden. Durch die Referenzfluoreszenz kann z. B. sicher festgestellt werden, ob sich ein oder mehrere Mikropartikel im Meßfeld befinden. Zu untersuchende Analy ten können beispielsweise auch eine Reporter- und eine Re ferenzfluoreszenz aufweisen. Das Verhältnis von Kodierungs fluoreszenz und Referenzfluoreszenz ist mit Vorteil durch die Vergleichsfluoreszenz exakter detektierbar. Mit dem Testkit ist mit Vorteil trotz geringer verwendeter Mikro partikelzahl eine Meßgenauigkeit, die beispielsweise den Erfordernissen der klinischen Routine genügt, erreichbar. Weiterhin kann der Testkit so aufgebaut sein, daß aufgrund der immobilisierten Mikropartikel die Fluoreszenzen mit Fluoreszenzscannern und/oder Fluoreszenzmikroskopen ausge wertet werden, was beispielsweise eine hohe Meßgenauigkeit und Schnelligkeit des gesamten Vorganges der Auswertung der Fluoreszenz - beispielsweise gegenüber Durchflußcytometern - gestattet. Der Test im Sinne der Erfindung kann so aufge baut sein, daß sich Mikropartikel und Akzeptormoleküle fest oder gelöst in unterschiedlichen Reaktionsgefäßen befinden und die Fluoreszenzfarbstoffe und Reagenzien für die Immo bilisierung ebenfalls separat aufbewahrt werden. Zum Nach weis eines Analyten erfolgt z. B. die Immobilisierung und Fluoreszenzmarkierung der Mikropartikelpopulation und die Bindung der Akzeptormoleküle an die Mikropartikel so, daß die immobilisierte und fluoreszenzmarkierte Mikropartikel population mit den gebundenen Akzeptormolekülen in einem Reaktionsgefäß vorliegen. In dieses Gefäß wird dann die zu untersuchende Probe gegeben. Es ist jedoch auch möglich, den Test so aufzubauen, daß bereits alle Reagenzien, die zum Nachweis des Analyten erforderlich sind, in einem Reak tionsgefäß vorliegen. Mit dem erfindungsgemäßen Testkit ist es vorteilhafterweise möglich, biologische und/oder chemi sche Proben zu analysieren. In biologischen Proben, wie beispielsweise Serum, können molekulare Parameter zur Cha rakterisierung komplexer biomedizinischer Zustände wie dem Immunstatus erfasst werden oder die genetische Prädisposi tion für bestimmte Krankheiten oder die Erfassung und Be einflussung der Expression. Durch die Immobilisierung der Mikropartikelpopulation kann beispielsweise in einem sehr kurzen Zeitraum eine Probe, die nur eine geringe Anzahl von zu untersuchenden Analyten oder kompetitive Analyten auf weist, charakterisiert werden.

Die Erfindung umfasst auch die Verwendung von fluoreszenz markierten Mikropartikelpopulationen, die mit spezifischen Akzeptormolekülen konjugieren, zur Bestimmung serologischer Parameter, wie z. B. humane oder tierische Antikörper gegen Infektionserreger, Autoantigene und Allergene, pharmakolo gisch wichtiger Bindungsstellen in Proteomen, Genomen und anderen Nukleinsäuren, wie z. B. Hormonrezeptoren, Pharmaka bindungsstellen, Peptid-, Kohlenhydrat und DNA-Bindungs stellen und/oder zur Durchführung von Erpressionsanalysen wichtiger Gene und ihrer Produkte, wie z. B. Tumorproteine, HLA-Antigene sowie zur Analyse von Single Nukleotide Poly morphismen und Mutationen.

Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens und des Test kits sind z. B., daß durch die Immobilisierung der Mikropar tikelpopulationen eine Verringerung der Partikelzahlen mög lich ist. Das führt vorteilhafterweise im Vergleich zu durchflußcytometrischen Verfahren zu einem sparsamen Ein satz der Akzeptormoleküle. Der Nachweis der gebundenen Ana lyten über die immobilisierten Mikropartikel führt daher zu einer Sensitivität bis in den Einzelmolekülbereich. Erfindungsgemäß kann also die Anzahl der Mikropartikel pro Probe und die Dauer des Meßvorgangs der Mikropartikel reduziert werden, wobei die Sensitivität des Meßvorgangs erhöht wird. Die Verwendung der Vergleichfluoreszenz ermöglicht insbe sondere besonders einfach die Meßfelder zu erkennen, in de nen nur ein Mikropartikel immobilisiert wurde, was beson ders wichtig für die automatische Auswertung ist.

Durch die Immobilisierung der Mikropartikel auf standarti sierte Träger, wie Mikrotiterplatten oder Objektträger, können beispielsweise vorhandene Laborroutinen, wie ELISA- Automaten, genutzt werden.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungsformen der Erfindung er geben sich aus der Beschreibung.

Im folgenden soll die Beschreibung anhand von Ausführungs beispielen veranschaulicht werden, ohne die Erfindung dar auf einzuschränken.

Beispiel

Nachweis humaner IgG-Antikörper gegen drei humanpathogene Mikroorganismen.

Es wurden carboxymodifizierte Silicamikropartikel (si castar®), 8 µm (micromod) oder screenBEADS, 1 µm (che micell) mit folgenden Fluoresenzeigenschaften unter Zugabe unterschiedlicher Mengen an Fluoreszenzfarbstoffen zum Re aktionsgemisch hergestellt:

Mikropartikelpopulation A

Vergleichsfluoreszenz: Aminocumarin
Kodierungsfluoreszenz: 100% Aminofluorescein

Mikropartikelpopulation B

Vergleichsfluoreszenz: Aminocumarin
Kodierungsfluoreszenz: 50% Aminofluorescein

Mikropartikelpopulation C

Vergleichsfluoreszenz: Aminocumarin
Kodierungsfluoreszenz: 0% Aminofluorescein

Durch Carbodiimidkopplung wurden bakterielle Proteingemi sche von Borrelia burgdorferi an die Mikropartikelpopula tion A, von Yersinia enterocolitica an die Mikropartikelpo pulation B und von Chlamydia trachomatis an die Mikroparti kelpopulation C gekoppelt. Dazu werden:

1. 10 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) in 1 ml destilliertem Wasser gelöst und mit 1 ml Beadsuspension (25 mg Bedas) gemischt und 10 min. bei Raumtemperatur inkubiert,
2. die Beads dreimal mit 5 ml MES-Puffer pH 5,0 gewa schen,
3. 500 µg Bakterienprotein in 1 ml 0,1 M MES-Puffer (pH 5,0) gelöst und mit den aktivierten Beads unter Schüt teln bei Raumtemperatur 4 h inkubiert,
4. die Beads dreimal in MES-Puffer gewaschen und an schließend in MES-Puffer + 0,2 M Glycin 2 h bei Raum temperatur unter Schütteln inkubiert,
5. die Breads dreimal in PBS gewaschen und in 1 ml PBS aufgenommen und 50 µl aliquotiert und bei -20C° bis zur weiteren Verwendung eingefroren.

Um die vorbereiteten Mikropartikelpopulationen auf der Oberfläche der Mikrotiterplatte (384er Format, Polysterol schwarz, Flachboden transparent) zu immobilisieren, werden:

1. je ein Aliquot der Partikelsuspensionen der verschie denen Mikropartikelpopulationen aufgetaut und durch pipettieren von je 2 µl jeder Suspension in destil liertes Wasser gemischt und verdünnt, so daß eine Par tikeldichte von 100 Mikropartikel jeder Population pro 1 µl Wasser erreicht wird,
2. 1 µl des Gemisches in das Zentrum der Kavitäten der Mikrotestplatte pipettiert,
3. die Mikropartikel der drei eingesetzten Populationen durch Trocknung in einem Thermomixer (Eppendorf) bei 45°C immobilisiert.

Anschließend werden die Kavitäten mit PBS + 0,1% Tween 20 (PBS-T) dreimal gespült. Humane Seren werden danach in ei ner Verdünnung von 1 : 100 in PBS-T in die vorbereiteten Ka vitäten der Mikrotestplatte pipettiert und für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert.

Anschließend werden die Kavitäten mit PBS + 011% Tween 20 (PBS-T) dreimal gespült und mit Ziege-Anti-human-IgG-Anti serum-Phycoerythrin-Konjugat (Sigma), welches 1 : 100 in PBS- T verdünnt wurde, für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dreimaligem Spülen mit PBS-T erfolgt die Fluores zenzauswertung mit einem Fluoreszenzmikroskop Axiophot (Zeiss). Die immobilisierten Mikropartikel werden mit einer s/w-CCD-Kamera unter Verwendung von optischen Filterpaaren für folgende Emissions- und Absorptionswellenlängen 390 nm/441 nm, 480 nm/520 nm und 480 nm/578 nm nacheinander fotografiert.

Die Auswertung erfolgt dadurch, daß eine Datenreduktion er folgt und nur die Meßfelder in die Auswertung einbezogen werden, die eine Reporterfluoreszenzintensität oberhalb des festgelegten Schwellenwertes besitzen. Eine zweite Datenre duktion/Fehlerabgleich wird dadurch erreicht, daß alle Meßfehler aus der Berechnung ausgeschlossen werden, die 20% oberhalb und 50% unterhalb der Vergleichsfluoreszenz lie gen. Der Quotient aus der Intensität der Kodierungsfluores zenz und der Vergleichsfluoreszenz ergibt Aufschluß, um welche Mikropartikelpopoulation es sich handelt. Quotien ten, die um mehr als 10% vom Mittel einer Klasse abweichen, führen dazu, daß das Meßfeld aus der Berechnung ausge schlossen wird. Für jede Mikropartikelpopulation werden die Reporterfluoreszenzen aus 20 Meßfeldern durch die zugehö rigen Vergleichsfluoreszenzen dividiert. Die resultierenden Quotienten der 20 Meßfelder werden gemittelt. Sie sind pro portional zur Menge gebundene humanen IgG, daß spezifisch an die bakteriellen Antigene dieser Mikropartikelpopulation gebunden hat.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis von Analyten in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren die folgen den Schritte umfasst:

- Fluoreszenzmarkierung mindestens einer Mikropar tikelpopulation, wobei die Mikropartikelpopula tion mit mindestens einem Fluoreszenzfarbstoff, der als Kodierungsfluoreszenz dient, und minde stens einem Fluoreszenzfarbstoff, der als Ver gleichsfluoreszenz dient, markiert wird
- Bindung oder Konjugation von Akzeptormolekülen an die Mikropartikelpopulation
- Immobilisierung der Mikropartikelpopulation an einen Träger
- Inkubation der Mikropartikelpopulation mit der Probe
- Markierung des/der Analyten mit mindestens einer Reporterfluoreszenz
- Nachweis des/der Analyten durch Vergleich der Fluoreszenzen der Mikropartikel mit der Repor terfluoreszenz.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikropartikel an Mi krotestplatten, Glasplättchen, flexible Membran, Ge flechte, Fibrillen, insbesondere aus Polypropylen und/oder Nitrozellulose, Glas und/oder PVDF immobli siert werden.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere Analyten gleich zeitig detektiert werden, indem die Mikropartikelpo pulationen mit jeweils individuellen Akzeptormolekü len beladen werden.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Analyten mit unter schiedlichen oder mit identischen Reporterfluoreszen zen markiert werden.

5. Testkit, dadurch gekennzeichnet, daß der Testkit mindestens eine immobilisierte Mikropartikelpopulation umfasst, die mit spezifischen Akzeptormolekülen konjugiert ist.

6. Testkit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikropartikelpopula tion mindestens eine Kodierungs- und mindestens eine Vergleichsfluoreszenz umfasst.

7. Verwendung von mindestens einer immobilisierten, fluoreszenzmarkierten Mikropartikelpopulation mit spezifisch konjugierten Akzeptormolekülen, wobei die Mikropartikelpopulation eine Kodierungs- und Ver gleichsfluoreszenz umfasst, zum Nachweis von Analyten in der klinischen und/oder Umweltdiagnostik.