DE10112992A1

DE10112992A1 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien

Info

Publication number: DE10112992A1
Application number: DE10112992A
Authority: DE
Inventors: Mike Farwick; Brigitte Bathe; Jennifer Brehme; Klaus Huthmacher
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2001-03-17
Filing date: 2001-03-17
Publication date: 2002-09-26
Also published as: US20030092137A1; WO2002074944A1; US6921651B2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren, bei dem man folgende Schritte durchführt: DOLLAR A a) Fermentation der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden coryneformen Bakterien, in denen man zumindest das für die 6-Phosphofruktokinase kodierende Gen und/oder das für die 1-Phosphofruktokinase kodierende Gen abschwächt, DOLLAR A b) Anreicherung der gewünschten L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Bakterien und DOLLAR A c) Isolierung der L-Aminosäure, DOLLAR A und gegebenenfalls Bakterien einsetzt, in denen man zusätzlich weitere Gene des Biosyntheseweges der gewünschten L-Aminosäure verstärkt, oder Bakterien einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der gewünschten L-Aminosäure verringern.

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, unter Verwendung coryneformer Bakterien, in denen das pfkA-Gen kodierend für die 6-Phosphofruktokinase und/oder das pfkB-Gen kodierend für die 1- Phosphofruktokinase abgeschwächt ist.

Stand der Technik

L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung.

Es ist bekannt, daß Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.

Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite wie zum Beispiel das Lysin-Analogon S-(2-Aminoethyl)-Cystein oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und L- Aminosäuren produzieren.

Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung L- Aminosäure produzierender Stämme von Corynebacterium glutamicum eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure- Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die L- Aminosäure-Produktion untersucht.

Aufgabe der Erfindung

Die Erfinder haben sich die Aufgabe gestellt, neue Grundlagen für verbesserte Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, mit coryneformen Bakterien bereitzustellen.

Beschreibung der Erfindung

Werden im folgenden L-Aminosäuren oder Aminosäuren erwähnt, sind damit eine oder mehrere Aminosäuren einschließlich ihrer Salze, ausgewählt aus der Gruppe L-Asparagin, L- Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L- Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L- Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan und L-Arginin gemeint. Besonders bevorzugt ist L-Lysin.

Wenn im Folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt werden, sind damit nicht nur die Basen, sondern sind auch die Salze wie z. B. Lysin-Monohydrochlorid oder Lysin-Sulfat gemeint.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, unter Verwendung von coryneformen Bakterien, in denen man zumindest die für die 6-Phosphofruktokinase kodierende Nukleotidsequenz und/oder die für die 1-Phosphofruktokinase kodierende Nukleotidsequenz abschwächt, insbesondere ausschaltet oder auf niedrigem Niveau exprimiert.

Gegenstand dieser Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren in dem folgende Schritte durchführt werden:

a) Fermentation der L-Aminosäure produzierenden coryneformen Bakterien, in denen zumindest die für die 6-Phosphofruktokinase kodierende Nukleotidsequenz und/oder die für die 1-Phosphofruktokinase kodierende Nukleotidsequenz abgeschwächt, insbesondere ausgeschaltet oder auf niedrigem Niveau exprimiert wird;
b) Anreicherung der L-Aminosäuren im Medium oder in den Zellen der Bakterien; und
c) Isolierung der gewünschten L-Aminosäuren, wobei gegebenenfalls Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder der Biomasse in Anteilen oder in ihren Gesamtmengen im Endprodukt verbleiben.

Die eingesetzten Stämme produzieren bevorzugt bereits vor der Abschwächung des für die 6-Phosphofruktokinase kodierenden pfkA-Gens und/oder des für die 1- Phosphofruktokinase kodierenden pfkB-Gens L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin.

Bevorzugte Ausführungsformen finden sich in den Ansprüchen.

Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.

Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können Aminosäuren aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich um Vertreter coryneformer Bakterien insbesondere der Gattung Corynebacterium handeln. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu produzieren.

Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum, sind besonders die bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Aminosäuren produzierende Mutanten bzw. Stämme
wie beispielsweise die L-Lysin produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 und
Corynebacterium glutamicum DSM 5715.

Es wurde gefunden, daß coryneforme Bakterien nach Abschwächung des für die 6-Phosphofruktokinase (EC: 2.7.1.11) kodierenden Gens und/oder des für die 1- Phosphofruktokinase (EC 2.7.1.56) kodierenden Gens in verbesserter Weise L-Aminosäuren produzieren.

Die Nukleotidsequenz des für die 6-Phosphofruktokinase von Corynebacterium glutamicum kodierenden Gens kann der Patentanmeldung WO 01/00844 unter dem Identification Code RXA00206 als SEQ ID No. 53 entnommen werden.

Die Nukleotidsequenz des für die 1-Phosphofruktokinase von Corynebacterium glutamicum kodierenden Gens kann der Patentanmeldung WO 01/00844 unter dem Identification Code RXA01882 als SEQ ID No. 57 entnommen werden.

Ebenfalls sind die Nukleotidsequenzen in der Genbank unter der Accession Number AX064927 bzw. AX064931 hinterlegt.

Die beanspruchten Nukleotidsequenzen der für die 1-Phosphofruktokinase und für die 6-Phosphofruktokinase kodierenden Gene, dargestellt in den SEQ ID No. 3 bzw. SEQ ID No. 1, sind gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten Sequenzen um jeweils bevorzugt bis zu 700 Basenpaare vor dem Startkodon und hinter dem Stopkodon des Gens verlängert.

Die Verlängerungen gegenüber der aus dem Stand der Technik bekannten Sequenz bestehen in der SEQ ID No. 3 aus den Basenpaaren 1 bis 508 bzw. 1684 bis 2234.

In SEQ ID No. 1 bestehen die Verlängerungen gegenüber der aus dem Stand der Technik bekannten Sequenz aus den Basenpaaren 1 bis 531 bzw. 1621 bis 2160.

Die Aminosäuresequenzen der dazugehörigen Genprodukte sind in SEQ ID No. 4 bzw. SEQ ID No. 2 dargestellt.

Es wurde gefunden, daß mit Hilfe der so bereitgestellten verlängerten Sequenzen an sich bekannte Verfahren zur Abschwächung besonders erfolgreich eingesetzt werden können.

Eine solches Verfahren ist die Methode des Genaustausches ("gene replacement"). Dabei wird eine Mutation wie z. B. eine Deletion, Insertion oder Basenaustausch in dem interessierenden Gen in-vitro hergestellt. Das hergestellte Allel wird wiederum in einen für C. glutamicum nicht replikativen Vektor kloniert und dieser anschließend durch Transformation oder Konjugation in den gewünschten Wirt von C. glutamicum überführt. Nach homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration bewirkenden "cross-over"- Ereignisses und eines geeigneten zweiten, eine Exzision bewirkenden "cross-over"-Ereignisses im Zielgen bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau der Mutation bzw. des Allels. Diese Methode wurde beispielsweise in EP: 00110021.3 verwendet, um das secG-Gen von C. glutamicum auszuschalten.

Die Verlängerung der eingesetzten Sequenzen ist nicht auf 600 Basenpaare vor dem Startkodon und hinter dem Stopkodon beschränkt. Sie liegt bevorzugt im Bereich von 300 bis 700 Basenpaaren, kann aber auch bis zu 800 Basenpaaren betragen. Die Verlängerungen können auch unterschiedliche Mengen an Basenpaaren enthalten.

Die in den angegebenen Textstellen beschriebenen Sequenzen kodierend für die 6-Phosphofruktokinase bzw. 1- Phosphofruktokinase, können erfindungsgemäß verwendet werden. Weiterhin können Allele der 6-Phosphofruktokinase bzw. 1-Phosphofruktokinase verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit des genetischen Codes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen ("sense mutations") ergeben.

Zur Erzielung einer Abschwächung können entweder die Expression des für die 6-Phosphofruktokinase kodierenden Gens und/oder des für die 1-Phosphofruktokinase kodierenden Gens oder die katalytischen Eigenschaften der Genprodukte herabgesetzt oder ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls werden beide Maßnahmen kombiniert.

Die Genexpression kann durch geeignete Kulturführung oder durch genetische Veränderung (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression verringert werden.

Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann z. B. in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Boyd und Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), bei Voskuil und Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998), bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998)), bei Pátek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990).

Mutationen, die zu einer Veränderung bzw. Herabsetzung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind aus dem Stand der Technik bekannt; als Beispiele seien die Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762 (1997)) und Möckel ("Die Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms", Berichte des Forschungszentrums Jülichs, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich, Deutschland, 1994) genannt. Zusammenfassende Darstellungen können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.

Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit von der Wirkung des Aminosäureaustausches auf die Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen ("missense mutations") oder Nichtsinnmutationen ("nonsense mutations") gesprochen. Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar in einem Gen führen zu Rasterverschiebungsmutationen ("frame shift mutations"), in deren Folge falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Deletionen von mehreren Kodonen führen typischerweise zu einem vollständigen Ausfall der Enzymaktivität. Anleitungen zur Erzeugung derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.

Eine gebräuchliche Methode, Gene von C. glutamicum zu mutieren, ist die von Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)) beschriebene Methode der Gen-Unterbrechung ("gene disruption") und des Gen-Austauschs ("gene replacement").

Bei der Methode der Gen-Unterbrechung wird ein zentraler Teil der Kodierregion des interessierenden Gens in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pK18mobsacB oder pK19mobsacB (Jäger et al., Journal of Bacteriology 174: 5462-65 (1992)), pGEM-T (Promega corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84; US-Patent 5,487,993), pCR®Blunt (Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) oder pEM1 (Schrumpf et al. 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516) in Frage. Der Plasmidvektor, der das zentrale Teil der Kodierregion des Gens enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "cross-over"- Ereignisses wird die Kodierregion des betreffenden Gens durch die Vektorsequenz unterbrochen und man erhält zwei unvollständige Allele, denen jeweils das 3'- bzw. das 5'- Ende fehlt. Diese Methode wurde beispielsweise von Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575-580 (1994)) zur Ausschaltung des recA-Gens von C. glutamicum verwendet.

Bei der Methode des Genaustausches ("gene replacement") wird eine Mutation wie z. B. eine Deletion, Insertion oder Basenaustausch in dem interessierenden Gen in-vitro hergestellt. Das hergestellte Allel wird wiederum in einen für C. glutamicum nicht replikativen Vektor kloniert und dieser anschließend durch Transformation oder Konjugation in den gewünschten Wirt von C. glutamicum überführt. Nach homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration bewirkenden "cross-over"-Ereignisses und eines geeigneten zweiten, eine Exzision bewirkenden "cross-over"-Ereignisses im Zielgen bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau der Mutation bzw. des Allels. Diese Methode wurde beispielsweise von Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915-927 (1998)) verwendet, um das pyc-Gen von C. glutamicum durch eine Deletion auszuschalten.

In das für die 6-Phosphofruktokinase kodierende Gen und/oder das für die 1-Phosphofruktokinase kodierende Gen kann auf diese Weise eine Deletion, Insertion oder ein Basenaustausch eingebaut werden.

Zusätzlich kann es für die Produktion von L-Aminosäuren vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des für die 6-Phosphofruktokinase kodierenden Gens und/oder des für die 1-Phosphofruktokinase kodierenden Gens, eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, der Glykolyse, der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus, des Pentosephosphat- Zyklus, des Aminosäure-Exports und gegebenenfalls regulatorische Proteine zu verstärken, insbesondere überzuexprimieren.

Der Begriff "Verstärkung" bzw. "Verstärken" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor oder ein Gen verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.

So kann für die Herstellung von L-Lysin neben der Abschwächung des für die 6-Phosphofruktokinase kodierenden Gens und/oder des für die 1-Phosphofruktokinase kodierenden Gens eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe

- das für eine feed-back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC (Accession No.P26512, EP-B-0387527; EP-A-0699759; WO 00/63388),
- das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA (EP-B 0 197 335),
- das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen gap (Eikmanns (1992). Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- gleichzeitig das für die Pyruvat Carboxylase kodierende Gen pyc (DE-A-198 31 609),
- das für die Malat: Chinon Oxidoreduktase kodierende Gen mqo (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)),(Abschwächung oder Verstärkung???)
- das für die Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen zwf (JP-A-09224661),
- gleichzeitig das für den Lysin-Export kodierende Gen lysE (DE-A-195 48 222),
- das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1 (DE: 199 59 328.0, DSM 13115)
- das für die Triosephosphat Isomerase kodierende Gen tpi (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), und
- das für die 3-Phosphoglycerat Kinase kodierende Gen pgk (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),

verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.

Weiterhin kann es für die Produktion von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des für die 6-Phosphofruktokinase kodierenden Gens und/oder des für die 1-Phosphofruktokinase kodierenden Gens gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe

- das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende Gen pck (DE 199 50 409.1, DSM 13047),
- das für die Glucose-6-Phosphat-Isomerase kodierende Gen pgi (US 09/396,478, DSM 12969),
- das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB (DE: 199 51 975.7, DSM 13114),
- das für die Fruktose-Bisphosphat Aldolase kodierende Gen fda (Mol. Microbiol. 3 (11), 1625-1637 (1989); Genbank Accession Number X17313) und
- das für das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2 (DE: 199 59 327.2, DSM 13113)

abzuschwächen, insbesondere die Expression zu verringern.

Schließlich kann es für die Produktion von Aminosäuren, vorteilhaft sein, neben der Abschwächung des für die 6- Phosphofruktokinase kodierenden Gens und/oder des für die 1-Phosphofruktokinase kodierenden Gens unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).

Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung und können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch - Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Aminosäuren kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.

Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.

Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Als Stickstoffquelle können organische Stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.

Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.

Methoden zur Bestimmung von L-Aminosäuren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin Derivatisierung erfolgen, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) beschrieben.

Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien, enthaltend verlängerte für die 1-Phosphofruktokinase und/oder 6-Phosphofruktokinase kodierende Polynukleotidsequenzen, dadurch gekennzeichnet, daß sie jeweils vor dem Startkodon und hinter dem Stopkodon des Gens jeweils um bis zu ca. 700 Basenpaaren verlängert sind.

2. Isoliertes Polynukleotid gemäß Anspruch 1, enthaltend eine für die 1-Phosphofruktokinase und/oder 6-Phosphofruktokinase kodierende Polynukleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie vor dem Startkodon und hinter dem Stopkodon des Gens jeweils um bis zu ca. 700 Basenpaare verlängert sind, wobei die verlängerten Aminosäurensequenzen für das 1-Phosphofruktokinase-Gen in SEQ ID No. 3 und für das 6-Phosphofruktokinase-Gen in SEQ ID No. 1 dargestellt sind und die Verlängerungen gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten Sequenzen in SEQ ID No. 3 aus den Basenpaaren 1 bis 508 bzw. 1684 bis 2234 und in SEQ ID No. 1 aus den Basenpaaren 1 bis 531 bzw. 1621 bis 2160 bestehen.

3. Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt,

a) Fermentation der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden coryneformen Bakterien, in denen man zumindest das für die 6-Phosphofruktokinase kodierende Gen und/oder das für die 1- Phosphofruktokinase kodierende Gen abschwächt,
b) Anreicherung des gewünschten Produkts im Medium oder in den Zellen der Bakterien, und
c) Isolierung der gewünschten L-Aminosäure, wobei gegebenenfalls Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder Biomasse in Anteilen oder in ihren Gesamtmengen im Endprodukt verbleiben.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man coryneforme Bakterien einsetzt, in denen man die Abschwächung unter Verwendung der Polynukleotidsequenzen erzielt, die vor dem Startkodon und hinter dem Stopkodon des jeweiligen Gens um jeweils 300 bis 800 Basenpaare verlängert sind.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man coryneforme Bakterien einsetzt, in denen man die Abschwächung unter Verwendung der Polynukleotidsequenzen erzielt, die vor dem Startkodon und hinter dem Stopkodon des Gens jeweils um ca. 700 Basenpaare verlängert sind, wobei die verlängerten Nukleotidsequenzen für das 1-Phosphofruktokinase-Gen in SEQ ID No. 3 und für das 6-Phosphofruktokinase-Gen in SEQ ID No. 1 dargestellt sind und die Verlängerungen in SEQ ID No. 3 gegenüber der aus dem Stand der Technik bekannten Sequenz aus den Basenpaaren 1 bis 508 bzw. 1684 bis 2234 und in SEQ ID No. 1 gegenüber der aus dem Stand der Technik bekannten Sequenz aus den Basenpaaren 1 bis 531 bzw. 1621 bis 2160 bestehen.

6. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien einsetzt, in denen man zusätzlich weitere Gene des Biosyntheseweges der gewünschten L- Aminosäure verstärkt.

7. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der gewünschten L-Aminosäure verringern.

8. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Expression des (der)Polynukleotides (e), das (die) für die 6-Phosphofruktokinase und/oder für die 1-Phosphofruktokinase kodiert (en), verringert.

9. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die katalytischen Eigenschaften des (der) Polypeptid(s)e (Enzymprotein(s)e) verringert, für das das (die) Polynukleotid(e) aus SEQ ID NO. 1 bzw. SEQ ID No. 3 kodieren.

10. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Herstellung von L-Lysin coryneforme Mikroorganismen fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe

1. 10.1 das für eine feed-back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC,
2. 10.2 das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA,
3. 10.3 das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen gap,
4. 10.4 das für die Pyruvat Carboxylase kodierende Gen pyc,
5. 10.5 das für die Malat: Chinon Oxidoreduktase kodierende Gen mqo,
6. 10.6 das für die Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen zwf,
7. 10.7 gleichzeitig das für den Lysin-Export kodierende Gen lysE,
8. 10.8 das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1
9. 10.9 das für die Triosephosphat Isomerase kodierende Gen tpi, und
10. 10.10 das für die 3-Phosphoglycerat Kinase kodierende Gen pgk,

verstärkt insbesondere überexprimiert.

11. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von L-Aminosäuren coryneforme Mikroorganismen fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe

1. 11.1 das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende pck-Gen,
2. 11.2 das für die Glucose-6-Phosphat Isomerase kodierende pgi-Gen
3. 11.3 das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxß,
4. 11.4 das für die Fruktose-Bisphosphat Aldolase kodierende Gen fda oder
5. 11.5 das für das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2

abschwächt.

12. Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen der Art Corynebacterium glutamicum einsetzt.

13. Coryneforme Bakterien, in denen zumindest das für die 6-Phosphofruktokinase kodierende Gen und/oder das für die 1-Phosphofruktokinase kodierende Gen abgeschwächt vorliegt.