DE10145568A1

DE10145568A1 - Verfahren zur Kultivierung und Analyse mikrobieller Einzelzellkulturen

Info

Publication number: DE10145568A1
Application number: DE10145568A
Authority: DE
Inventors: Peter-Juergen Mueller; Martin Roth; Matthias Hilliger; Ingrid Groth; Christel Kummer; Karin Martin; Volker Schroeckh; Josef Metze; J Michael Koehler; Thomas Henkel; Gunter Gastrock; Karen Lemke
Original assignee: Institut fuer Bioprozess und Analysenmesstechnik eV; Institut fuer Physikalische Hochtechnologie eV; Leibniz Institut fuer Naturstoff Forschung und Infektionsbiol eVi
Current assignee: Institut fur Photonische Technologien Ev 0 De; Institut fuer Bioprozess und Analysenmesstechnik eV; Leibniz Institut fuer Naturstoff Forschung und Infektionsbiol eVi
Priority date: 2001-09-14
Filing date: 2001-09-14
Publication date: 2003-04-03
Also published as: ATE348875T1; EP1425384B1; WO2003025113A2; AU2002339300A1; JP2005502378A; DE50209027D1; US20050084923A1; EP1425384A2; WO2003025113A3

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Vereinzelung der Mikroorganismen aus einer Suspension oder Kultur, der parallelen Kultivierung der vereinzelten Zellen und der Analyse ihrer Stoffwechselleistungen. DOLLAR A Mit der Erfindung können mikrobielle Grundoperationen wie Medienoptimierung, Screening nach Bildnern neuer Naturstoffe und spezieller Stoffwechselleistungen, qualitativer und quantitativer Nachweis der Wirkungen von Nährsubstraten, Effektoren und Wirkstoffen einschließlich der Medienoptimierung sowie die Selektion von Mikroorganismenklonen mit bestimmten Eigenschaften aus hochzahligen Populationen nach Mutagenese, Transformation, Transfektion und gentechnischer Bearbeitung sowie der Nachweis von mikrobiellen Kontaminationen durchgeführt werden. Die Erfindung ist mit besonderem Vorteil immer dann anwendbar, wenn aus einer vielzahligen Population Mikroorganismen mit herausragenden Eigenschaften jeweils als Einzelzellen oder Einzelorganismen gewonnen und als Reinkulturen charakterisiert werden sollen, oder wenn die Wirkung von Einflußgrößen an vielen, untereinander vollständig vergleichbaren Kulturen untersucht werden soll.

Description

Mit der Erfindung kann eine der am häufigsten durchgeführten Grundoperationen der Mikrobiologie, das Vereinzeln und die parallele Kultivierung der Einzelorganismen mit einer bisher nicht erreichten großen Anzahl von mikrobiellen Individuen durchgeführt werden.
Ziel der Vereinzelung ist beispielsweise das Auffinden von Mikroorganismen mit herausragenden Eigenschaften. Mikroorganismen mit herausragenden Eigenschaften treten in Mikroorganismenkulturen und -populationen häufig in einer sehr kleinen Zahl, gemessen an der Gesamtzahl, auf. Sie entstehen ständig in jeder mikrobiellen Population durch spontane Mutation, sie werden gezielt durch Mutagenese, durch Transfektion, Transformation und durch gentechnische Methoden künstlich erzeugt oder kommen als Kontamination in die Kultur.

Die Suche (Screening) nach neuen Mikroorganismen mit neuen, besseren Eigenschaften aber auch der Nachweis von Mikroorganismen mit pathogenen oder schädlichen Eigenschaften erfolgt in Proben, die als Suspensionen an natürlichen oder anthropomorph beeinflußten Standorten oder Produkten, beispielsweise Böden oder Nahrungsmittel, und in wäßrigen Habitaten, beispielsweise Abwassereinrichtungen, oder aus lebenden höheren Organismen gewonnen werden.

Mit der Erfindung wird ein Weg eröffnet, um mikrobielle Einzelorganismen bzw. mikrobielle Individuen mit neuen bzw. besonderen Leistungen oder Eigenschaften in einer vielzahligen, in Bezug auf die Mikroorganismen homogen oder heterogen zusammengesetzten Populationen aufzufinden und damit das große Potential der mikrobiellen Leistungen besser nutzen zu können.

Gleichfalls ist die Erfindung mit Vorteil einzusetzen, wenn die Lebenstätigkeit von Mikroorganismen als Indikator zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung von Nährsubstraten oder Effektoren des Wachstums und des Stoffwechsels, z. B. von Antibiotika oder von essentiellen Nährstoffkomponenten, eingesetzt wird. Auch die Optimierung von Nährstoffzusammensetzungen der zur Kultivierung verwendeten Medien ist möglich.

Es entsteht die Möglichkeit, diese Untersuchungen mit seiner sehr hohen Zahl von monoklonalen Zellen bzw. Kulturen in Form von Mikro-Reinkulturen durchzuführen.

Die Erfindung kann überall dort genutzt werden, wo mikrobielle Leistungen oder Wirkungen gesucht, angewendet, verbessert oder analysiert werden, beispielsweise in der Biotechnologie, der Gentechnik, der medizinischen Mikrobiologie, der Pharmazie, der Mikrobiologie und der Lebensmittel- und Umweltmikrobiologie.

Das Herstellen von Reinkulturen bzw. monoklonalen Kulturen bzw. nicht kontaminierten Kulturen ist eine Grundoperation in der Mikrobiologie [1]. Eine Reinkultur besteht aus den Nachkommen einer einzigen Zelle. Ihre Zellen haben gleiche Wachstums- und Stoffwechseleigenschaften. Zur Gewinnung von Reinkulturen ist die Isolierung von Einzelzellen für die Beimpfung der Kulturen notwendig.

Das Auffinden und Gewinnen der interessanten Individuen aus einer aus sehr vielen Mikroorganismen zusammengesetzten Submerskultur (Flüssigkultur) bzw. einer Zellsuspension stellt aber ein bisher nicht befriedigend gelöstes wissenschaftlichtechnisches Problem dar [2]. Bisher wurden diese Arbeiten nur mit unzulänglichen Methoden bzw. durch Plattieren stark verdünnter Kultursuspensionen auf Agaroberflächen durchgeführt, oder es wurden durch mechanische Manipulation Einzelzellen isoliert, beispielsweise mit einer sogenannten Laserpipette [3]. Die Anwendung von Methoden der mechanischen Zellsortierung ist beim jetzigen Stand der Technik wegen der großen Anzahl zu trennender Organismen noch sehr zeitaufwendig bzw. praktisch nicht durchführbar.

Für die parallele Durchführung von großzahligen Kultivierungen könnten theoretisch sehr kleine Kultivierungsgefäße eingesetzt werden. Die prinzipielle Verwendung mikrotechnisch hergestellter Kavitäten und Kanäle für biotechnologische Kultivierungen wurde bereits vorgeschlagen [4]. Erste Versuche zum praktischen Einsatz der Mikrosystemtechnik zeigten, dass die Parallelbeimpfung und Kultivierung von 16 Mikrokulturen (Escherichia coh) im 0.1-µl-Maßstab möglich ist [5]. Eine Pipettierung von Mikroorganismen ist mit Portionierern realisierbar [6].

Eine Vereinzelung der zur Beimpfung eingesetzten Mikroorganismen aus einer großzahligen, z. B. 10⁵ bis 10⁸ Zellen umfassenden Population wird bisher wegen der dann erheblich größeren Anzahl von verfügbaren Mikrokulturgefäßen nicht durchgeführt.

Mikroorganismen werden für eine Reihe von biotechnischen Anwendungen in Gelkugeln eingeschlossen. Es wird das gesamte Volumen einer Mikroorganismen enthaltenden Suspension mit Hilfe eines speziellen Düsensystems zu möglichst kleinen Kugeln verfestigt bzw. in einer anderen Variante mikroverkapselt. Die bisher hergestellten und in der Literatur beschriebenen Kugeln haben Größen zwischen 0,5 und 2 mm. Die Methode wurde bisher nicht zur Vereinzelung von Mikroorganismen und nachfolgender Kultivierung von hochzahligen Mikrokulturen angewendet.

Beim Isolieren von Mutanten, Selektanten, Kontaminanten oder von gentechnisch veränderten Mikroorganismen werden fast ausschließlich klassische Methoden angewendet. Die Zellpopulationen werden soweit verdünnt, dass nach Auftragen der verdünnten Bakteriensuspensionen auf die Oberfläche von Agarnährböden separate Kolonien bzw. Einzelkolonien entstehen, die jeweils aus einer Mikroorganismenzelle hervorgegangen sind.

Zusätzlich werden häufig selektive Bedingungen durch gezieltes Substratangebot oder Zusatz von Wachstumseffektoren erzeugt, bei denen nur die angestrebten Mikroorganismen wachsen können.

Bei gentechnischen Arbeiten werden die Gene, die übertragen werden sollen, mit Markergenen gekoppelt. Es handelt sich bei den Markergenen häufig um Resistenzgene gegen Antibiotika. Dadurch wachsen in Kulturen, die mit Antibiotikum versetzt wurden, nur die Klone, die das übertragene Gen enthalten.

In vielen Fällen existiert keine einfache Möglichkeit, die meist in geringer Zahl vorhandenen interessanten Mikroorganismen auf einfachem und direktem Weg zu erkennen und zu gewinnen, d. h. zu isolieren.

Exemplarisch soll der Stand der Technik an der Vorgehensweise bei einem Primärscreening bzw. Suche nach neuen Mikroorganismen mit neuen Leistungen dargestellt werden [7]. Hochrechnungen von Zählungen in Extrakten aus Bodenproben zeigten, dass maximal nur etwa 1 bis 10% der mit einer durchschnittlichen Anzahl von insgesamt etwa 10⁶ bis 10⁸ pro g Bodenprobe vorkommenden Mikroorganismen gleicher und unterschiedlicher Arten mit dieser traditionellen Suchtechnik aufgefunden werden.

Die Proben werden beim traditionellen Primärscreening in einem Puffer oder Wasser suspendiert, um definierte mikrobielle Suspensionen (Submersproben) zu erhalten. Die festen Begleitstoffe z. B. Erde werden abgetrennt und der flüssige, die abgespülten Mikroorganismen enthaltende Überstand (Extrakt) so lange verdünnt (Verdünnungsschritte), bis bei nachfolgendem Auftragen auf Agaroberflächen emers wachsende, durch wachstumsfreie Zonen voneinander getrennte bzw. isolierte mikrobielle Einzelkolonien auftreten. Diese werden isoliert und auf interessierende Leistungen und Eigenschaften geprüft. Das vorrangige Ziel der Verdünnung ist es, separate bzw. nicht kontaminierte Kolonien (Reinkulturen) zu erhalten.

Bei einer typischen Vorgehensweise wird im Primärscreening 1 g einer Erdprobe (berechnet als Trockengewicht) mit 10 ml eines Puffers, einer Salzlösung oder Wasser suspendiert und bei gut besiedelten Gartenböden durch Verdünnungsschritte bis etwa 106-fach verdünnt. Mit der Verdünnungstufe, bei der Einzelkolonien auftreten, werden Petrischalen mit Agarmedien mit je 0,1 ml Extraktverdünnung beimpft: Diese Vorgehensweise führt dazu, dass nur die Mikroorganismen, die nach der Verdünnung noch in 0,1 ml Extraktverdünnung anwesend sind, theoretisch auf der Agaroberfläche anwachsen können.

Nach der Inkubation kann auf der Basis der gewachsenen Koloniezahlen und der angewandten Verdünnungsschritte die Anwesenheit von beispielsweise 10 bis 108 koloniebildenden Einheiten je g Bodentrockenmasse berechnet werden. Die Kultivierung dieser großen Zahl von Mikroorganismen ist jedoch mit der angewandten Methode nicht möglich. Aus der Vielzahl der gewachsenen Mikroorganismenkolonien wird anschließend meist unter Berücksichtigung morphologischer Merkmale von ausgewählten Kolonien überimpft und weiter kultiviert. Die ausgewählten Klone werden anschließend in einem Sekundärscreening auf neue Stoffwechselleistungen untersucht. Mikroorganismenspezies, die z. B. in einer 100mal geringeren Konzentration in der Bodenprobe vorhanden sind, werden mit einer 100fach geringeren Wahrscheinlichkeit mit der beschriebenen Vorgehensweise gefunden.

Neben dem durch das Verdünnungsregime bedingten Verlust an Mikroorganismen im Probenmaterial gibt es weitere Gründe, die einem kompletten Auffinden entgegenstehen, die in der Physiologie der Mikroorganismen zu suchen sind.

Etwa 90% der in der Bodenprobe vorhandenen Mikroorganismen werden pauschal zu den "nicht kultivierbaren" Mikroorganismen gerechnet. Nicht kultivierbar bedeutet, dass diese Mikroorganismen unter den gewählten Wachstumsbedingungen nicht wachsen. Um sie zu kultivieren, müssen die Wachstumsbedingungen den speziellen Anforderungen der Mikroorganismen an Nährstoffe und physikalische Parameter angepaßt werden. Es besteht das Problem, dass sich ein Teil der Mikroorganismen in ihrem Biotop/Ökosystem in einem physiologisch inaktiven Zustand (Dormanz) befinden (K-Strategen). Sie sind lebensfähig, aber unter den üblicherweise verwendeten Standardbedingungen sowie den angewendeten Kultivierungszeiten nicht kultivierbar. Andere Mikroorganismen (r-Strategen) wachsen sehr schnell. Ein Grund für das Nichtfinden eines Großteils der Mikroorganismen könnte darin bestehen, dass die K- Strategen bzw. die "nicht kultivierbaren" unter den Mikroorganismen häufig nicht anwachsen bzw. durch r-Strategen überwachsen werden.

Es gibt inzwischen Hinweise, dass das Wachstum von Mikroorganismen durch Wachstumsfaktoren reguliert wird. Es ist ein bekanntes Phänomen, dass hin und wieder zu dünn beimpfte Kulturen nicht anwachsen. Gibt man zu der beimpften Kultur eine geringe Menge des Filtrates aus einer wachsenden Kultur eines Mikroorganismus, wird das Wachstum induziert.

Es ist das Ziel der Erfindung, die mikrobiologischen Grundoperationen der Zellvereinzelung und Einzelzellkultivierung in großer Zahl auf einfachem Weg parallel durchzuführen. Damit soll der mikrobiellen Spezifik Rechnung getragen werden, dass Reinkulturen für viele Anwendungen eigentlich erforderlich wären, aber wegen der hohen Individuenzahlen in den Kulturen bisher nicht auf einfachem Weg realisiert werden können. Dies führte beispielsweise bisher dazu, dass in einer Mikroorganismenpopulation in sehr geringer Zahl vorhandene Arten mit interessanten oder herausragenden Eigenschaften nicht gefunden werden. Mikrobielle Submerskulturen sollen deshalb so behandelt werden, dass möglichst jeder der in einer Zellsuspension vorhandenen Mikroorganismen die Möglichkeit erhält, als Einzelorganismus in einer separaten Kultivierungssphäre als Reinkultur bzw. Mikrokultur zu wachsen. Es soll damit auch verhindert werden, dass bei einem Screening durch die traditionell notwendigerweise angewendeten Verdünnungsschritte die praktisch isolierbare Individuenzahl in großem Maß vermindert wird.

Um Mikroorganismen mit auffälligen Eigenschaften oder mikrobielle Infektionen oder neue bzw. seltene Mikroorganismen, darunter die K-Strategen sowie die nicht oder schwer kultivierbaren Mikroorganismen, zu erkennen, zu finden und zu isolieren oder um die Wirkung von Effektoren an Hand einer großen Zahl paralleler Wachstumsversuche statistisch auswertbar zu untersuchen, stellt sich die erfinderische Aufgabe, Verfahren zu entwickeln, mit denen alle Mikroorganismen einer wässrigen Mikroorganismensuspension, die eine hohe Zahl von gleichartigen oder unterschiedlichen Mikroorganismen enthalten, in Form von Reinkulturen kultiviert werden können.

Diese Aufgabe beinhaltet die Entwicklung einer Methode zur Vereinzelung aller in einer Kultur vorhandenen Mikroorganismen durch die Nutzung der durch die Mikrosystemtechnik gegebenen Möglichkeiten. Weiterhin sollen gegebenenfalls die Wachstumsbedingungen so variiert werden können, dass vereinzelten Mikroorganismen mit ausgewählten Eigenschaften ein Wachstum ermöglicht wird, andere, nicht erwünschte jedoch nicht oder nur begrenzt wachsen können.

Zur Lösung dieser Aufgaben wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Parallelkultivierung von Mikroorganismen vorgeschlagen, dass dadurch gekennzeichnet ist, dass einer von groben Feststoffen befreiten Suspension oder Kultur einer homogen oder heterogen zusammengesetzten Mikroorganismenpopulation gegebenenfalls Nährsubstrate und/oder Effektoren des mikrobiellen Wachstums und/oder mikrobielle Metabolite zugesetzt werden, anschließend ein Volumen v der mikrobiellen Suspension, welche N Mikroorganismen enthält, mit einem Portionierer in n₁ gleichvolumige Volumenäquivalente geteilt wird, wobei die Zahl n₁ zwischen N und 100 N, bevorzugt zwischen N und 10 N gewählt wird, anschließend die Volumenäquivalente gegebenenfalls unter Zuführung von Nährsubstraten und/oder Effektoren des mikrobiellen Wachstums zur Beimpfung von n₂ separaten Mikrokulturen in Mikroarealen oder Mikrokavitäten, wobei n₂ größer/gleich n₁ ist, verwendet werden, anschließend die Mikrokulturen inkubiert und während des Wachstums gegebenenfalls weitere Nährsubstrate und/oder Effektoren des mikrobiellen Wachstums zugeführt und physiologische Parameter der Mikrokulturen bestimmt werden.

Mikroorganismen im Sinne dieser Erfindung sind in erster Linie Bakterien und einzellige Pilze.

Die Zahl N/v wird beispielsweise mikroskopisch durch Zählen in einer Bakterienzählkammer oder durch andere an sich bekannte Methoden ermittelt. Die Zahl n₁ liegt erfindungsgemäß zwischen 10⁴ und 10⁸.

Die Volumina der bei der Vereinzelung entstehender Kulturäquivalente liegen zwischen 0,1 nl und 1 µl, die sie aufnehmenden Mikrokavitäten und die Mikrokulturen haben Volumina von 0,1 nl bis 10 µl.

Alle für den Aufbau der Mikroorganismenzellen essentiellen Elemente (C, O, H, N, S, P, K, Na, Ca, Mg, Fe) und sogenannte Spurenelemente werden in für die Zellen verfügbarer Form als Nährsubstrate zugeführt.

Darüber hinaus werden den Mikrokulturen erfindungsgemäß Effektoren des mikrobiellen Wachstums zugesetzt wie z. B. Wachstumsaktivatoren oder Wachstumsinhibitoren, Ezyminhibitoren oder Enzymaktivatoren, Antibiotika, Cytokine, Enzyme, Vitamine, Aminosäuren, Antimetabolite sowie mikrobielle Metabolite. Mikrobielle Metabolite können in reiner Form oder als Kulturflüssigkeiten aus Mikroorganismenkulturen und/oder eukaryontischen Zellkulturen oder als Konzentrate der Kulturflüssigkeiten oder Extrakte aus Mikroorganismenkulturen zugesetzt werden. Dadurch wird beispielsweise das Wachstum von schwer kultivierbaren Mikroorganismen stimuliert.

Durch die gezielte Zugabe von Effektoren des mikrobiellen Wachstums kann das Wachstum unerwünschter Mikroorganismen unterdrückt bzw. das Wachstum von gewünschten Mikroorganismen gefördert werden, oder es werden bestimmte Produktbildungen bzw. Stoffwechselleistungen der Mikrokulturen induziert.

Effektoren des mikrobiellen Wachstums beeinflussen das Wachstum positiv oder negativ. Die Zugabe antibiotischer Substanzen entsprechend der Art der Reinkultur und in Abhängigkeit von ihrer Konzentration führt zur Wachstumsinhibition nichtresistenter Mikroorganismen. Beispielsweise verhindert der Zusatz von antifungalen Antibiotika das Wachstum von Pilzen, die die für das erfindungsgemäße Vorgehen sehr nachteilige Eigenschaft aufweisen, bakterielle Mikrokulturen zu überwachsen. Wenn Bakterien kultiviert werden sollen, werden deshalb antifungal wirkende Substanzen zugegeben, um das Wachstum störender Pilze zu verhindern.

Der Zusatz von Antimetaboliten inhibiert das Wachstum über eine negative Beeinflussung von Stoffwechselwegen. Außerdem können bei einer weiteren Art der Kultivierung ein oder mehrerer Antibiotika in hoher Konzentration zugesetzt werden, die nur auf wachsende Mikroorganismen wirken und diese hemmen (z. B. ein Penicillinderivat). Anschließend wird die Kultur zentrifugiert und die Antibiotika werden mit dem Überstand entfernt.

Die technische Realisierung der Mikrokulturen erfolgt erfindungsgemäß in Mikrokavitäten. Erfindungsadäquate Methoden sind Entfernung von Feststoffen, Vereinzeln, Portionieren, Beimpfen, Nährstoffversorgung einschließlich Sauerstoffversorgung und Zuführung von mikrobiellen Metaboliten und Effektoren des mikrobiellen Wachstums, Herstellung selektiver Wachstumsbedingungen und Messen von Wachstum und Produktbildung. Der Vorgang der Vereinzelung ist vorzugsweise technisch mit dem Vorgang der Mikrokultivierung eng verbunden. Die an sich bekannten Bedingungen für mikrobielle Kultivierungen wie Konstanthaltung physiologisch verträglicher Temperaturen und der Azidität werden mit an sich bekannten Methoden eingehalten. Die Sterilität der Vorrichtungen wird in an sich bekannter Weise durch Erhitzen mit Dampf auf 121°C, durch trockenes Erhitzen auf Temperaturen über 150°C, durch chemische Sterilisation oder Sterilisation mittels Strahlung erreicht.

Die Details der erfindungsgemäßen Vorgehensweise werden im folgenden erläutert.

Es wird z. B. eine Bodenprobe mit einem einfachen Puffer oder Wasser versetzt und nach gründlichem Schütteln durch Zentrifugieren die Feststoffe sedimentiert, diese entfernt und anschließend die Mikroorganismen durch Zentrifugation als Pellet gewonnen. Das Pellet wird in einem Medium, das alle essentiellen Nährsubstrate sowie gegebenfalls Effektoren des mikrobiellen Wachstums enthält, suspendiert.

Unerwünschte, schnellwachsende Bakterien werden abgetötet, indem ein oder mehrere Antibiotika zugesetzt werden, die nur auf wachsende Mikroorganismen wirken (z. B. Penicillin). Nach beispielsweise 4 h Inkubation wird die Kultur zentrifugiert und die Antibiotika im Überstand werden entfernt.

Eine zeitweise dreidimensionale Zuordnung der Mikrokulturen wird z. B. durch die Kultivierung in Mikrokugeln erreicht. Die Vereinzelung wird durch die Herstellung von Mikrokugeln in an sich bekannter Weise erreicht. Hierzu wird einer Zellsuspension ein Gelbildner zugesetzt. Mit einem Array von Düsen werden kleine Tröpfchen mit einem Volumen zwischen 0,1 nl und 1 µl hergestellt. Diese werden in einer Flüssigkeit zu mehr oder weniger festen Kugeln gehärtet. Sehr weiche Kugeln können anschließend mit einer festeren Hülle versehen werden.

Über eine Verdünnung der verwendeten Mikroorganismensuspension wird erreicht, dass die Mehrheit der Kugeln nur einen und einige auch keinen Mikroorganismus enthalten. Die Kugeln werden in einer Art der Ausführung als Gesamtheit in einem flüssigen Medium unter Zuführung von Nährstoffen und/oder Effektoren und/oder von Inhaltsstoffen aus anderen Mikroorganismenkulturen als Mikrokulturen inkubiert. Anschließend werden die Gelkugeln beispielsweise mit Hilfe eines Portionierers auf Mikroarreale so aufgebracht oder in Mikrokavitäten so eingebracht, dass jedem durch die x-y-Koordinaten eindeutig bestimmten Oberflächenarreal bzw. jeder durch die x-y- Koordinaten eindeutig bestimmten Mikrokavität genau eine Mikrokugel zugeordnet ist. Unter Zuführung von Nährstoffen und/oder Effektoren und/oder von Inhaltstoffen aus anderen Mikroorganismenkulturen werden die Mikrokulturen in den Kugeln kultiviert, um Wachstum und Produktbildung der eingeschlossenen Mikroorganismen zu ermöglichen und anschließend zu detektieren.

Die Detektion der Produktbildung erfolgt mit Hilfe von spezifischen Indikatoren. In einem Fall der Ausführung erfolgt dies mit dem an sich bekannten Nachweis der antibiotischen Wirkung durch Hemmhofbildung in Agarschichten, die mit einem Indikatorstamm beimpft wurden. Hierzu wird die Standardprozedur abgeändert. Die Kugeln werden auf den Agar aufgelegt. Wenn nötig wird der direkte Kontakt zwischen Kugeln und Agaroberfläche durch eine dünne semipermeable Membran verhindert. Der Nachweis des Wachstums erfolgt bevorzugt mit spektroskopischen Methoden.

Die Mikrokultivierungen erfolgen bei weiteren Vorgehensweisen erfindungsgemäß in Mikrokavitäten, die mit den durch Vereinzelung erhaltenen Volumenäquivalenten vollständig oder teilweise gefüllt werden. Die erfindungsgemäße Vorgehensweise weist durch Nutzung der Möglichkeiten der Mikrosystemtechnik einen vorteilhaften neuartigen Weg zu einer systemgerechten Behandlung der bei mikrobiellen Problemstellungen in der Regel besonders hohen Individuenzahlen.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Mikrokavitäten sind in der Regel zweidimensional angeordnet. Das Volumen der Mikrokavitäten liegt zwischen 0,1 nl und 10 µl.

Die Vereinzelung der in der Suspension vorhandenen Mikroorganismen oder ein Vereinzeln der Mikroorganismen wird über die Befüllung von Mikrokavitäten in Form von Mikrokapillaren bzw. in einem Array angeordneten Mikrokapillaren mit einem Volumenäquivalent zwischen 0,1 nl und 1 µl realisiert.

Die Kultivierung der vereinzelten Mikroorganismen erfolgt bei diesem Verfahren in Mikrokapillaren mit einem Volumenäquivalent zwischen 0,1 nl und 1 µl.

Zur Vereinzelung der Mikroorganismen werden insbesondere ein miniaturisierter thermisch gesteuerter Fluidschalter oder ein miniaturisierter Fluidschalter in Verbindung mit einer Mikroinjektionseinheit verwendet.

Durch periodisches Wechseln der Volumenflußrate durch Gasblasen oder durch mit Wasser nicht mischbare Trennflüssigkeiten werden Flüssigkeitssegmente erhalten, die mit einer Wahrscheinlichkeit < 5% mehr als eine Zelle pro Segment enthalten. Eine Einzelkapillare wird mit einer Vielzahl solcher Flüssigkeitssegmente befüllt und enthält die beschriebene Vielzahl von separierten Einzelkompartimenten mit je einer Zelle.

Die Durchmischung bzw. der Sauerstoffübergang über das offene Ende der Kapillaren wird durch pulsierende Druckschwankungen in den Kapillaren verbessert.

Die Mikrokultivierung kann erfindungsgemäß auch in einer Vielzahl von Kapillaren erfolgen, wobei jede Kapillare eine Mikrokavität darstellt. Die Befüllung mit Kulturflüssigkeit bzw. der Beimpfungsprozeß erfolgt aktiv durch Zuführung oder passiv durch Ansaugen über die Kapillarkräfte. Durch pulsierende Druckänderung an einem Ende der Kapillare wird eine Hin- und Herbewegung der Kulturflüssigkeit in der Kapillare erzeugt und damit die Durchmischung bzw. der Sauerstoffübergang über das offene Ende der Kapillare verbessert.

Durch erfindungsgemäße Nutzung eines Fluidsystems mit serieller Probenauftrennung wird - eine eindimensionale Mikrokulturvariante eingesetzt. Die aus der Fließinjektionsanalyse bekannten technischen Anordnungen und Systeme werden hierbei für die mikrobielle Kultivierung benutzt. Durch parallele Mehrfachanordnung wird die Zahl der Mikrokulturen erhöht.

In Chips eingebrachte Mikrokapillaren dienen als Speicher- und Kulturräume. In einem einzigen Chip von etwas mehr als 2 cm² Fläche ist eine Kapillarlänge von etwa 1 m untergebracht. Mit einer Sperrflüssigkeit werden die Mikrokulturen in den Kapillaren voneinander getrennt. In der Kapillare von 1 m Länge werden etwa 5000 Proben mit einem Einzelvolumen von etwa 0,1 nl kultiviert. 200 dieser Chips werden eingesetzt, um etwa 1 Million Mikrokulturen aufzunehmen. Das Gesamtvolumen dieser Chips ist kleiner als 100 ml. Bei einer signifikanten Erhöhung der Einzelvolumina um den Faktor 10 (auf etwa 1 nl liegt das Gesamtvolumen aller Chips bei einem Liter.

Für die eindimensionale Kultivierung von Proben, deren Gesamtvolumen größer als 1 Liter ist, werden Schleifen von preisgünstig erhältlichem Schlauchmaterial für die durch kleine Fluidabschnitte segmentierte Speicherung der Proben verwendet.

Vorteilhaft an der erfindungsgemäßen Vereinzelung der Mikroorganismen enthaltenen Suspensionen oder Kulturen in die Volumenäquivalente ist, dass durch die Aufteilung jedes Volumenäquivalent im Durchschnitt einen individuellen Mikroorganismus enthält. Jeder der vereinzelten Mikroorganismen kann entsprechend seines Wachstumsverhaltens sehr schnell oder erst nach einer längeren Verzögerungsphase anwachsen, ohne dass die langsam wachsenden Individuen von schneller wachsenden Individuen überwachsen werden.

In einer bestimmten begrenzten Anzahl von Fällen, besonders dann wenn n₁ = N ist, enthalten sie einen, mehr als einen Mikroorganismus oder keinen. Die leeren Äquivalente können auf Grund des fehlenden Wachstums erkannt werden.

Zur Systemsteuerung wird zum Zeitpunkt der Mikroorganismen-Vereinzelung und deren Einbringung in eine Mikrokavität oder ein Mikroarreal die jeweilige Koordinatenzuordnung auf einem Festspeichermedium abgelegt und registriert, womit eine eindeutige Zuordnung zu jedem Zeitpunkt möglich ist.

Zum Vereinzeln der Mikroorganismen wird ein System von Portionierern benutzt, bei dem das Volumen der einzeln abgegebenen Tropfen zwischen 0,1 nl und 1 µl liegt und jeweils 1 Tropfen in ein Mikroarreal oder eine Mikrokavität abgegeben wird. Dabei werden die Tropfen mittels einer Volumenimpulsoptimierung ohne Bildung von Spritzern abgegeben.

Zum Vereinzeln der Gelkugeln wird ein Portionierer eingesetzt, durch den separate einzelne Gelkugeln in ein Mikroarreal oder in eine Mikrokavität oder in eine Vorrichtung zur analytischen Bestimmung von Prozeßparametern gegeben wird.

In einer anderen Ausführungsform wird zum Vereinzeln der Mikroorganismen ein Portionierer, dessen Zuführung mit einer Partikel- bzw. Zellzähleinrichtung versehen ist, benutzt, der die Mikroorganismen enthaltende Flüssigkeit in Einzeltropfen von 0,1 nl bis 1 µl Volumen abgibt und die Befüllung einer Aufnahmeposition abbricht, wenn entweder deren maximales Füllvolumen erreicht oder ein eine Zelle enthaltender Tropfen abgesetzt wurde.

Alternativ wird zum Vereinzeln der Mikroorganismen ein piezoelektrisch gesteuerter Portionierer eingesetzt, wobei die Tropfenfrequenz und die Tropfengröße der Vorschubbewegung der Positioniereinrichtung sowie der Zellkonzentration, dem Innenvolumen und der Ortsfrequenz der Probenaufnahmebereiche so angepaßt werden, dass mit einer Wahrscheinlichkeit < 5% mehr als eine Zelle pro Aufnahmeposition abgegeben wird.

Als eine weitere Variante zum Vereinzeln der Mikroorganismen wird ein pneumatisch oder elektropneumatisch gesteuerter Portionierer eingesetzt, wobei die Tropfenfrequenz und die Tropfengröße der Vorschubbewegung der Positioniereinrichtung sowie der Zellkonzentration, dem Innenvolumen und der Ortsfrequenz der Probenaufnahmebereiche so angepaßt werden, dass mit einer Wahrscheinlichkeit < 5% mehr als eine Zelle pro Aufnahmeposition abgegeben wird.

In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform werden für die kompartimentierte Kultivierung von Mikroorganismen Nanotiterplatten [8] mit Kavitäten im Volumenbereich von 0,01 bis 500 nl pro Kavität eingesetzt.

Nach dem Vereinzeln erfolgt die Kultivierung der Mikrokulturen in Mikrokavitäten, die in einem Array mit einem Abstand zueinander von gleich oder kleiner als 1,8 mm angeordnet sind.

Hierfür sind insbesondere Nanotiterplatten mit Mikrokavitäten, die eine konische oder eine zylinderförmige oder eine kugelsegmentförmige oder eine prismatische, pyramidale, doppel- oder mehrfach-pyramidale Form besitzen, geeignet.

Nach dem Vereinzeln werden die Mikrokulturen in den Kammern von Nanotiterplatten kultiviert.

Die Gas- und Nährstoffversorgung der Mikrokulturen kann durch eine Mikroporenmembran erfolgen, deren Porenweite vorzugsweise zwischen 0.1 µm und 4 µm und deren Membrandicke zwischen 0,2 µm und 10 µm liegt, so dass die Zellen zurückgehalten werden.

Zu diesem Zweck kann die Nährstoffversorgung in den Mikrokulturen durch eine Mikroporenmembran oder durch eine Nanoporenmembran erfolgen, die versorgungsseitig durch ein Mikrofluidkanalsystem abgedeckt ist.

Bei bestimmten Ausführungsformen erhalten die Mikrokavitäten der Nanotiterplaten über die Mikro- oder Nanoporenmembranen eine gemeinsame Versorgung, während Effektoren des mikrobiellen Wachstums optional von oben in die Mikrokavitäten appliziert werden.

Ebenso kann die Versorgung der Mikrokulturen durch eine Mikroporenmembran mit einem oder mehreren Mikrokanälen erfolgen, die dergestalt in eine (Mikro-)Fließ- Injektionsanordnung eingebunden sind, dass die Wirkung von Effektoren oder Nährsubstraten durch Injektion in den Perfusionskanal einfach und seriell getestet werden können.

Die Herstellung der zur Versorgung dienenden Mikrofluidkanäle, welche eine Mikroporenmembran tragen, wird durch eine Folge von einem isotropen und einem anistropen Ätzschritt in Silizium realisiert.

Zur Verbesserung der Handhabbarkeit und zur Vermeidung des fluidischen Übersprechens während der Befüllung können die Stege zwischen den Mikrokammern mit einer wasserabweisenden Oberflächenschicht versehen werden.

Voraussetzung für die Selektion von Mikroorganismen mit bestimmten Eigenschaften ist der analytische Zugang zu physiologischen und Kulturparametern. Erfindungsgemäß ist der vollständige oder teilweise Einsatz der nachfolgend benannten Methoden und konstruktiven Merkmale vorgesehen.

Zur Analyse physiologischer Parameter und zur Messung des Wachstums in den jeweiligen Mikrokulturen wird vorzugsweise die Methode der Elektroimpedanz spektroskopie (EIS) eingesetzt.

Die Kinetik der Kulturparameter pH, pO₂, pCO₂ wird mittels spektroskopischer Verfahren vor und nach dem Anströmen der diffusiven Versorgung der in Suspension vorhandenen Mikroorganismen detektiert.

Alternativ wird das Wachstum der Mikrokulturen mikroturbidometrisch oder photometrisch verfolgt.

Zur Messung des Wachstums der Mikrokulturen werden Chipkammern mit mindestens 2 zueinander parallel und in sich planparallel angeordneten transparenten Seitenwänden verwendet.

Diese zueinander planparallelen Seitenwände sind optional partiell mit einer hochreflektierenden Dünnschicht ausgestattet, wobei in diese mikrostrukturierte Fenster zum Ein- und Auskoppeln des Lichtes eingebracht sind.

Das Wachstum der Mikrokulturen wird durch die Erhöhung des Strömungswiderstandes beim Bewegen der kleinen Flüssigkeitsvolumina aufgrund der zunehmenden Gesamtviskosität der die Zellen enthaltenden Flüssigkeit verfolgt.

Alternativ wird Wachstum der Mikrokulturen durch die Verstärkung der Ablenkung, Fokussierung oder Defokussierung eines nichtabsorbierten Laserstrahles beim Aufheizen der die Zellen enthaltenden Flüssigkeit durch einen durch die Zellen teilweise absorbierten Laserstrahl verfolgt.

Zur Detektion der Strahlposition des Meßlichtes werden Empfänger-Doppelzeilen eingesetzt und mit deren Hilfe die den einzelnen Positionen entsprechenden Differenzen der Asymmetrien der Lichtintensitäten in den lokalen Kulturbereichen als Meßgrößen verwendet.

Ausführungsbeispiel

Ein Nährmedium mit 2 g Hefeextrakt, 20 g Malzextrakt und 10 g Glucose pro Liter wird mit Hefenzellen der Art Saccharomyces terevisiae beimpft. Nach 18 h Inkubation bei 30°C als Standkultur wird die Zahl der in der Kultur befindlichen Hefezellen unter Verwendung einer mikroskopischen Zählkammer durch Auszählen mit Hilfe eines Mikroskops ermittelt. Anschließend wird die Suspension so verdünnt und auf einem Agarmedium (2 g Hefeextrakt, 20 g Malzextrakt und 15 g Agar pro Liter, pH 6,2) in 10 cm-Petrischalen plattiert, dass ca. 25 Zellen pro cm² aufgetragen werden. Die Petrischalen werden 3 h bei 30°C inkubiert.

Zur kompartimentierten Klonierung werden Kavitäten von Nanotiterplatten mit flüssigem Agarmedium (2 g Hefeextrakt, 20 g Malzextrakt, 6 g Agar, pH 6,2) gefüllt und mit formschlüssigen Silikonstempeln gedeckelt. Nach dem Aushärten des Agars werden jeweils die Silikonstempel entfernt und durch einen zweiten Silikonstempel ersetzt, auf den vorher Zellen von den vorkultivierten Agarplatten durch Stempeln übertragen wurden. Vor dem Stempeln werden die vorkultivierten Agarplatten 20 min bei 37°C getrocknet und der Silikonstempel auf 37°C temperiert. Der beimpfte Silikonstempel wird mittels einer Klemmvorrichtung so an die Nanotiterplatte angedrückt, dass die Stege der Nanotiterplatte durch den Silikonstempel 1 abgedichtet werden. Die so beimpften Nanotiterplatten werden bei 30°C inkubiert. Das Wachstum in den Kavitäten der Nanotiterplatten wird mittels Trübungsmessung unter Verwendung eines Auflichtmikroskops verfolgt. Die Entnahme von Klonen zur weiteren Kultivierung und Prüfung erfolgt mittels einer sterilen Impfnadel unter Zerstörung der am Boden der Nanotiterplatte befindlichen Membran.

Für die Kultivierung werden Nanotiterplatten aus Silizium mit metallverstärkter Bodenmembran verwendet. Die Kammeröffnung beträgt 800 × 800 µm bei einem Raster von 1 mm. Die Bodenweite beträgt ca. 150 × 150 µm, das gesamte Kammervolumen etwa 150 nl. (Hersteller: Institut für Physikalische Hochtechnologie e.V. Jena, Abt. Biotechnische Mikrosysteme, Winzerlaer Straße 10, 07745 Jena, Fehler! Textmarke nicht definiert.). Silikonstempel werden durch Abformen von Nanotiterplatten mit identischer Geometrie und auf 100 µm verringerter Ätztiefe hergestellt. Als Abformmaterial wird handelsübliches additionsvernetzendes Silikon eingesetzt (Hersteller z. B. Sylgard). Literaturzitate [1] Chan, E.C.S., Pelczar, M.J., Krieg, N.R. (1993) Verwendung von Reinkulturen - Grundvorausetzung für Studium der Mikroorganismen. In: Laboratory Exercise in Microbiology. Chan, E. C. S., Pelczar, M.J., Krieg, N (eds.). McCraw-Hill, New York, 123-152
[2] Gottschal, J.C., Harder, W., Prins, R.A. (1992) In: The Procaryotes. Balows A., Trüper, H.G., Dworkin, M., Harder, W., Schleifer K.-H. (eds.). Springer, New York 149-196
[3] Huber, R. (1999) Die Laserpipette als Basis für Einzelkultivierungen. Biospektrum 4, 289-291
[4] Kroy, W., Seidel, H., Dette, E., Deimel, P., Binder, F., Hilpert, R., Königer, M.
DE 39 15 920 (22.11.1990)
[5] Schober, A., Schlingloff, G., Thamm, A., Vetter, D., Thomandl, D., Gebinoga, M., Kiel, H.J., Scheffler, C., Döhring, M., Köhler, J. M., Mayer, G. (1996) Systemintegration of Microsystems/Chip Elements in miniaturized automats for high-throughput synthesis and screening in biology, biochemistry and chemistry. Micro System Technologies (Potsdam Okt. 1996), Proc. S. 705, Vortrag
[6] Schober, A., Günther, R., Schwienhorst, A., Döring, M., Lindemann, B.F. (1993) BioTechniques 15, 324
[7] Omura, S. (1986) Philosophy of new drug discovery. Microbiol. Reviews 50, 259-279
[8] Mayer, G., Wohlfart, K., Schober, A., Köhler, J.M. (1999) Nanotiterplates for Synthesis and Screening. In: Microsystem technology: a powerful tool for biomolecular studies. Köhler, J.M., Mejevaia, T., Saluz, H.P. (eds.). p. 75-128, Birkhäuser Basel

Claims

1. Verfahren zur Parallelkultivierung von Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, dass einer von groben Feststoffen befreiten Suspension oder Kultur einer homogen oder heterogen zusammengesetzten Mikroorganismenpopulation Nährsubstrate und/oder Effektoren und/oder mikrobielle Metabolite zugesetzt werden, anschließend ein Volumen v der mikrobiellen Suspension, welche N Mikroorganismen enthält, mit einem Portionierer in n₁ gleichvolumige Volumenäquivalente geteilt wird, wobei die Zahl n₁ zwischen N und 100 N, bevorzugt zwischen N und 10 N gewählt wird, anschließend die Volumenäquivalente gegebenenfalls unter Zuführung von Nährsubstraten und/oder Effektoren zur Beimpfung von n₂ separaten Mikrokulturen in Mikroarealen oder Mikrokavitäten, wobei n₂ größer/gleich n₁ ist, verwendet werden, anschließend die Mikrokulturen inkubiert und während des Wachstums gegebenfalls weitere Nährsubstrate und/oder Effektoren und/oder Metabolite zugeführt und physiologische Parameter der Mikrokulturen bestimmt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Zahl n1 zwischen 10⁴ und 10⁸ liegt.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Volumen der bei der Vereinzelung entstehenden Kulturäquivalente zwischen 0,1 nl und 1 µl, das Volumen der sie aufnehmenden Mikrokavitäten und das Volumen der Mikrokulturen zwischen 1 n1 und 10 µl liegt.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass den vereinzelten Mikroorganismen bzw. den aus ihnen entstandenen Mikrokulturen wachstumsfördernde Metabolite enthaltende Kulturfiltrate von Mikroorganismen- und/oder eukaryontischen Zellkulturen und/oder Konzentrate derselben und/oder Extrakte aus Mikroorganismen- und/oder eukaryontischen Zellkulturen zugesetzt werden.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass den Mikrokulturen Effektoren wie Wachstumsaktivatoren oder Wachstumsinhibitoren, Ezyminhibitoren oder Enzymaktivatoren, Wirkstoffe, Antibiotika, Cytokine, Vitamine, Aminosäuren, Enzyme oder Antimetabolite zugesetzt werden.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die zu vereinzelnde Zellsuspension mit einem an sich bekannten, zur Gelierung befähigten Polymer versetzt wird, die Lösung in n Volumenäquivalente mit einem Volumen zwischen 0,1 nl und 1 µl geteilt und diese mit einer an sich bekannten Vorrichtung in Gelkugeln umgewandelt werden.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die vereinzelten Mikroorganismen enthaltenden Gelkugeln zusammen in einem wässrigen Medium unter Zuführung von Nährstoffen und/oder Effektoren und/oder von Inhaltsstoffen aus anderen Mikroorganismenkulturen als Mikrokulturen kultiviert werden und dass die Gelkugeln anschließend mit einem Portionierer getrennt werden.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die vereinzelte Mikroorganismen enthaltenden Gelkugeln mit einem Portionierer auf einer Oberfläche, bevorzugt einer Agaroberfläche, in Form eines definierten Arrays angeordnet werden.

9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen in den Gelkugeln emers unter Zuführung von Nährsubstraten, Effektoren und/oder mikrobiellen Metaboliten kultiviert werden.

10. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die vereinzelten Mikroorganismen enthaltenen Gelkugeln auf Mikroarreale oder in Mikrokavitäten eingebracht werden und unter Zuführung von Nährstoffen und/oder Effektoren und/oder von Inhaltstoffen aus anderen Mikroorganismenkulturen als Mikrokulturen kultiviert werden.

11. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Gelkugeln nach der Kultivierung auf eine mit einem Indikator versehene Agarschicht in Form eines Arrays abgelegt werden und die Detektion von Stoffwechselleistungen der in den Gelkugeln gewachsenen Mikroorganismen in an sich bekannter Weise erfolgt.

12. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die vereinzelte Mikroorganismen enthaltenden Gelkugeln auf Mikroarreale oder in Mikrokavitäten so eingebracht werden, dass jeder durch die x-y-Koordinaten eindeutig bestimmten Mikrokavität bzw. jedem durch die x-y-Koordinaten eindeutig bestimmten Oberflächenarreal genau eine Mikrokugel zugeordnet ist.

13. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Vereinzelung der in der Suspension vorhandenen Mikroorganismen oder ein Vereinzeln der Mikroorganismen über die Befüllung von Mikrokavitäten in Form von Mikrokapillaren bzw. in einem Array angeordneten Mikrokapillaren mit einem Volumenäquivalent zwischen 0,1 nl und 1 µl erfolgt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung der vereinzelten Mikroorganismen in Mikrokapillaren mit einem Volumenäquivalent zwischen 0,1 nl und 1 µl erfolgt.

15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass zum Vereinzeln der Mikroorganismen ein miniaturisierter thermisch gesteuerter Fluidschalter verwendet wird.

16. Verfahren nach den Ansprüchen 13 und 14, dadurch gekennzeichnet, dass zum Vereinzeln der Mikroorganismen ein miniaturisierter Fluidschalter in Verbindung mit einer Mikroinjektionseinheit verwendet wird.

17. Verfahren nach den Ansprüchen 13 und 14, dadurch gekennzeichnet, dass in einem geschlossenen Mikrokapillarsystem durch periodisches Wechseln der Volumenflußrate durch Gasblasen oder durch mit Wasser nicht mischbare Trennflüssigkeiten Flüssigkeitssegmente erzeugt werden, die mit einer Wahrscheinlichkeit < 5% mehr als eine Zelle pro Segment enthalten.

18. Verfahren nach den Ansprüchen 13 und 14, gekennzeichnet dadurch, dass die Durchmischung bzw. der Sauerstoffübergang über das offene Ende der Kapillaren durch pulsierende Druckschwankungen in den Kapillaren verbessert wird.

19. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem Vereinzeln die Kultivierung der Mikrokulturen in Mikrokavitäten erfolgt, die in einem Array mit einem Abstand zueinander von gleich oder kleiner als 1,8 mm angeordnet sind.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrokavitäten eine konische oder eine zylinderförmige oder eine kugelsegmentförmige oder eine prismatische, pyramidale, doppel- oder mehrfach-pyramidale Form besitzen.

21. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem Vereinzeln die Mikrokulturen in den Kammern von Nanotiterplatten kultiviert werden.

22. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Nährstoffversorgung der Mikrokulturen durch eine Mikroporenmembran erfolgt, deren Porenweite vorzugsweise zwischen 0,1 µm und 4 µm und deren Membrandicke zwischen 0,2 µm und 10 µm liegt, so dass die Zellen zurückgehalten werden.

23. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Nährstoffversorgung in den Mikrokulturen durch eine Mikroporenmembran oder durch eine Nanoporenmembran erfolgt, die versorgungsseitig durch ein Mikrofluidkanalsystem abgedeckt ist.

24. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass alle Mikrokavitäten der Nanotiterplaten über die Mikro- oder Nanoporenmembranen eine gemeinsame Versorgung erhalten und Effektoren des Wachstums von oben in die Mikrokavitäten appliziert werden.

25. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Versorgung der Mikrokulturen durch eine Mikroporenmembran unter Verwendung eines oder mehrerer Mikrokanäle erfolgt, die dergestalt in eine (Mikro-)Fließ- Injektionsanordnung eingebunden sind, dass die Wirkung von Effektoren oder Nährsubstraten durch Injektion in den Perfusionskanal einfach und seriell getestet werden kann.

26. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Versorgung dienenden Mikrofluidkanäle eine Mikroporenmembran tragen, die durch eine Folge von einem isotropen und einem anistropen Ätzschritt in Silizium hergestellt werden.

27. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Stege zwischen den Mikrokammern mit einer wasserabweisenden Oberflächenschicht versehen sind.

28. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass zur Analyse physiologischer Parameter und zur Messung des Wachstums in den jeweiligen Mikrokulturen die Methode der Elektroimpedanzspektroskopie (EIS) eingesetzt wird.

29. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Kinetik der Kulturparameter pH, pO₂, PCO₂, mittels spektroskopischer Verfahren vor und nach dem Anströmen der diffusiven Versorgung der in Suspension vorhandenen Mikroorganismen detektiert wird.

30. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Wachstum der Mikrokulturen mikroturbidometrisch oder photometrisch verfolgt wird.

31. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass zur Messung des Wachstums der Mikrokulturen Chipkammern mit mindestens 2 zueinander parallel und in sich planparallel angeordneten transparenten Seitenwänden verwendet werden.

32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass die zueinander planparallelen Seitenwände partiell durch eine hochreflektierende Dünnschicht ausgestattet sind, wobei in diese mikrostrukturierte Fenster zum Ein- und Auskoppeln des Lichtes eingebracht sind.

33. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Wachstum der Mikrokulturen durch die Erhöhung des Strömungswiderstandes beim Bewegen der kleinen Flüssigkeitsvolumina aufgrund der zunehmenden Gesamtviskosität der die Zellen enthaltenden Flüssigkeit verfolgt wird.

34. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Wachstum der Mikrokulturen durch die Verstärkung der Ablenkung, Fokussierung oder Defokussierung eines nichtabsorbierten Laserstrahles beim Aufheizen der die Zellen enthaltenden Flüssigkeit durch einen durch die Zellen teilweise absorbierten Laserstrahl verfolgt wird.

35. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass zur Detektion der Strahlposition des Meßlichtes Empfänger-Doppelzeilen eingesetzt und mit deren Hilfe die den einzelnen Positionen entsprechenden Differenzen der Asymmetrien der Lichtintensitäten in den lokalen Kulturbereichen als Meßgrößen verwendet werden.

36. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass zur Systemsteuerung zum Zeitpunkt der Mikroorganismen-Vereinzelung und deren Einbringung in eine Mikrokavität oder ein Mikroarreal die jeweilige Koordinatenzuordnung auf einem Festspeichermedium abgelegt und registriert wird, womit eine eindeutige Zuordnung zu jedem Zeitpunkt möglich wird.

37. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass zum Vereinzeln der Mikroorganismen ein System von Portionierern benutzt wird, bei dem das Volumen der einzeln abgegebenen Tropfen zwischen 0,1 nl und 1 µl liegt und jeweils 1 Tropfen in ein Mikroarreal oder eine Mikrokavität abgegeben wird.

38. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass zum Vereinzeln der Gelkugeln ein Portionierer eingesetzt wird, durch den separate einzelne Gelkugeln in ein Mikroarreal oder in eine Mikrokavität oder in eine Vorrichtung zur analytischen Bestimmung von Prozeßparametern gegeben wird.

39. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Tropfen mittels einer Volumenimpulsoptimierung ohne Bildung von Spritzern abgegeben werden.

40. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass zum Vereinzeln der Mikroorganismen ein Portionierer, dessen Zuführung mit einer Partikel- bzw. Zellzähleinrichtung versehen ist, benutzt wird, der die Mikroorganismen enthaltende Flüssigkeit in Einzeltropfen von 0,1 nl bis 1 µl Volumen abgibt und die Befüllung einer Aufnahmeposition abbricht, wenn entweder deren maximales Füllvolumen erreicht oder ein eine Zelle enthaltender Tropfen abgesetzt wurde.

41. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass zum Vereinzeln der Mikroorganismen ein piezoelektrisch gesteuerter Portionierer eingesetzt wird, wobei die Tropfenfrequenz und die Tropfengröße der Vorschubbewegung der Positioniereinrichtung sowie der Zellkonzentration, dem Innenvolumen und der Ortsfrequenz der Probenaufnahmebereiche so angepaßt werden, dass mit einer Wahrscheinlichkeit < 5% mehr als eine Zelle pro Aufnahmeposition abgegeben wird.

42. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass zum Vereinzeln der Mikroorganismen ein pneumatisch oder elektropneumatisch gesteuerter Portionierer eingesetzt wird, wobei die Tropfenfrequenz und die Tropfengröße der Vorschubbewegung der Positioniereinrichtung sowie der Zellkonzentration, dem Innenvolumen und der Ortsfrequenz der Probenaufnahmebereiche so angepaßt werden, dass mit einer Wahrscheinlichkeit < 5% mehr als eine Zelle pro Aufnahmeposition abgegeben wird.