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Definition der Herzmuskelschädigung
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Die häufigste Herzmuskelschädigung ist der Untergang von Herzmuskelzellen auf Grund einer Sauerstoffunterversorgungssituation (Ischämie) des Herzens bzw. einer umschriebenen Region des Herzens. Die Herzhyskelzellen sind nicht mehr (ausreichend) mit Sauerstoff und Nährstoffen versorgt, weshalb sie absterben. Die Ursachen für die Unterversorgung mit Sauerstoff sind vielfältig: Verengung der Herzkranzgefäße durch Verkalkung oder Verschluss. Gefördert wird dieser Umstand durch Zigarettenrauchen, Bluthochdruck, hohe Blutfette, Zuckerkrankheit, Übergewicht, Bewegungsmangel, Stress usw. Daneben gibt es weitere Ursachen für eine Herzmuskelschädigung wie Reizleitungsstörungen, infektiöse und postinfektiöse, metabolische, toxische Ursachen. Weiter führen erworbene oder genetisch bedingte Kardiomypoathien zu einer Herzmuskelschädigung.
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Definition „Remodelling”
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Remodelling beschreibt Umbauprozesse des Herzens, die aufgrund einer veränderten Herzbelastung entstehen. So hypertrophieren z. B. nach einem Herzinfarkt die Herzmuskelbezirke, die von der Sauerstoffunterversorgung (Ischämie) nicht betroffen sind. Diese Hypertrophie dient der Kompensation der geschädigten (infarzierten) und nicht mehr kontrahierenden Herzbereiche. Aber auch bei Bluthochdruck (Hypertonie) oder Herzklappenfehlern kann es zum Remodelling und somit zu einer Herzmuskelhypertrophie kommen. Das Remodelling ist pathophysiologisch von großer Bedeutung, weil es die Pumpfunktion des Herzens aufrecht erhält, diese jedoch im weiteren Verlauf bedingt durch die Hypertrophie zunehmend einschränken kann und schließlich zur Herzinsuffizienz führen kann. Im hypertrophierten Zustand ist das Herz auch sehr anfällig für Herzrhythmusstörungen (z. B. Tachyarrhythmien), die tödlich enden können. Auch die Kardiomyopathien (erworben oder vererbt) fallen unter den Begriff „Remodelling”.
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Vorkommen der Herzmuskelschädigung
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Der Herzinfarkt ist die führende Todesursache für die Bevölkerung in Industrienationen. In Deutschland sterben jährlich ca. 200.000 Menschen an einem Herzinfarkt. Männer haben ein Risiko von ca. 30% in ihrem Leben einen Herzinfarkt zu erleiden, für Frauen in Deutschland liegt dieses Risiko bei ca. 15%.
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Bei instabiler Angina Pectoris ist die Diagnose sehr unzuverlässig was die Interpretation einer Herzmuskelschädigung angeht. Bei der instabilen Angina Pectoris ist eine Verengung der Herzkranzgefässe durch Arteriosklerose die Ursache. Hier aber kommt des durch Risse und Brüche in den Ablagerungen zu einer Anlagerung von Blutplättchen (Thrombozyten), die einen Thrombus (Blutgerinnsel) bilden. Jedoch halten sich die Thrombusbildung und die thrombusauflösenden Vorgänge in etwa die Waage. So wird ein kompletter Gefäßverschluss verhindert. Gleichzeitig können aufgebrochene Plaques funktionell nicht richtig repariert werden. Der Zustand ist deshalb instabil. Die Gefahr, dass sich ein Thrombus löst und einen akuten Herzinfarkt bewirkt, ist sehr groß.
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Verlauf der Herzmuskelschädigung
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Je länger die Ischämiezeit (Zeit, in der der Herzmuskel mit Sauerstoff minderversorgt ist) andauert, umso ausgeprägter sind der Prozess des Zelluntergangs und desto schwerwiegender die Beeinträchtigung der Herzleistung.
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Bisherige Diagnose der Herzmuskelschädigung
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Die Diagnose stützt sich auf drei Bereiche:
- 1. Symptomatik (Druck und Engegefühl in der Brust).
- 2. Typischen EKG-Veränderungen (ST-Hebung).
- 3. Nachweis von Herzinfarktmarkern im Blut (vor allem Troponin I und T).
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Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) definiert das Vorliegen eines Infarktes für den Fall, dass mindestens zwei der drei oben genannten Kriterien beim Patienten vorliegen.
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Probleme der bisherigen Diagnose einer Herzmuskelschädigung
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Klinische Symptomatik: kann sehr unspezifisch sein. Bei bewusstlosen Patienten nur schwer zu erheben.
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EKG-Veränderungen
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Nur in 80% der Fälle zeigen sich die typischen EKG-Veränderungen bei einem frischen Infarkt. In 20% findet sich ein unauffälliges EKG bei bestehendem Infarkt. Der EKG-Befund kann innerhalb der ersten 24 Stunden nach dem Infarktbeginn negativ (unauffällig) sein, weshalb die Bestimmung von Herzinfarktmarkem (Laborwerte) im Blut die Verdachtsdiagnose auch bei unauffälligem EKG bestätigen müssen.
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Stand der Technik der Serumdiagnostik einer Herzmuskelschädigung
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Bei einem Herzinfarkt kommt es zu einer Verminderung des Blutflusses mit vermindertem Sauerstoffangebot, so dass der Erhaltungsstoffwechsel der Herzmuskelzelle nicht mehr aufrecht erhalten werden kann und es zu einem Absterben der Herzmuskelzellen kommt. Bisher werden zur Infarktdiagnostik kleine aus der Herzmuskelzelle freigesetzte Proteine (Troponine) und Enzyme (CK) verwendet, die herzspezifisch sind, d. h. nur in einer speziellen Isoform der Herzmuskelzelle vorkommen. Diese bisherigen Marker für eine Herzmuskelschädigung kommen in der Skelettmuskulatur auch vor, jedoch in anderen Isoformen. Da die Troponin-basierte Infarkdiagnostik gegen die Herz-spezifischen Abschnitte der Troponin-I, und -T-Isoformen gerichtet sein müssen und nur wenige herzspezifische Aminosäuren umfassen steht somit nur eine begrenzte Auswahl an herzspezifischen Troponin-Epitopen für die Antikörperentwicklung zur Verfügung.
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Als empfindliche (sensitive) Marker für einen Herzinfarkt haben sich die Herzmuskelproteine Troponin I und Troponin T etabliert: Troponin T und -I sind Proteine der Herzmuskelzellen, die eine wichtige Rolle für die Kontraktion des Herzens spielen. Bei einem Untergang von Herzmuskelzellen im Rahmen des Infarktgeschehens gelangen sie ins Blut, wo ihre Konzentration frühestens drei Stunden nach Beginn des Infarktes ansteigt. Das Konzentrationsmaximum im Blut wird nach 20 Stunden erreicht und ein bis zwei Wochen nach dem Infarktgeschehen haben sich die Troponin-Werte wieder normalisiert.
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Vor allem für Patienten, die an Schmerzen im Brustkorb leiden, aber keine EKG-Verlaufsveränderung aufweisen, dienen die Troponin-Marker der Diagnosestellung:
Ist die Menge der Troponine im Blut über einen bestimmten Wert erhöht, liegt mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit ein Myokardinfarkt mit Zelluntergang vor und ein Eingriff zur Gefäßwiedereröffnung ist angezeigt. Fällt die Troponinbestimmung negativ aus, d. h. liegen die Marker-Werte unter einer bestimmten Grenze, so kann ein Herzinfarkt nahezu ausgeschlossen und die Diagnose „instabile Angina pectoris” gestellt werden.
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Auch die Bestimmung des Enzyms CK-MB (Kreatinkinase des Herzmuskels) dient zur Feststellung einer Herzmuskelschädigung. Bei einem ausgedehnten Herzinfarkt gehen viele Muskelzellen unter, so dass dieses intrazelluläre Enzym in die Blutbahn übertritt. Zusammen mit dem klinischen Zeichen des Brustkorbschmerzes kann die CK-MB-Konzentration in der Blutprobe einen deutlichen diagnostischen Hinweis auf einen Herzinfarkt geben. Die Konzentration im Blut steigt ca. 4–8 Stunden nach Beginn des Infarkts an, womit die CK-MB-Konzentration im Gegensatz zu den Troponinen ein langsamer Marker des Myokardinfarktes ist. Die CK-MB-Bestimmung dient eher der Diagnosesicherung als ihrer Erhebung.
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Auch Myoglobin, GOT (AST), LDH, HBDH dienen zur nachträglichen Bestätigung der Infarktdiagnose.
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Myoglobin: Lokalisation im Zytosol, nicht herzmuskelspezifisch, hoher negativer prädiktiver Wert, Diagnose muss bei erhöhtem Myoglobin durch herzspezifischen Marker wie z. B. Troponin I bestätigt werden. Bei instabiler Angina Pectoris erbringen die Serumwerte der bisherigen Marker für eine Herzmuskelschädigung keine zuverlässigen prädiktiven Ergebnisse.
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Troponine als bisheriger Goldstandard
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Da eine schnelle Diagnostik und eine zügige Therapieeinleitung erreicht werden soll, um weiteres Myokardgewebe vor dem Untergang zu schützen, sind die Troponine der Goldstandard (die zurzeit beste und effizienteste Methode zur Feststellung einer vorliegenden Herzmuskelschädigung) in der Enzymdiagnostik (Blutuntersuchung) bei Verdacht auf Herzinfarkt. Aufgrund der Herzspezifität kann ein anderer Schädigungsort ausgeschlossen werden. Also nicht betroffen bei Muskelerkrankungen, Skelettmuskelverletzungen (Marathonläufen, operativen Eingriffen, Sturz), starke Muskelbeanspruchung, große Verletzungen bei der Wiederbelebung.
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- Normwert: negativ bzw. < 0,1 ng/ml
- Kinetik: Troponin T und I werden ca. 3,5 h nach Infarkt im Serum nachweisbar. Biphasische Freisetzung, erster Gipfel nach ca. 20 h, bei erfolgreicher Fibrinolyse nach 11 h. Troponin T bleibt ca. 6–14 Tage nachweisbar.
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Bestimmungsmethode:
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- Quantitativ: ELISA, Normwert: nicht nachweisbar, pathologisch: > 0,1 ng/ml.
- Qualitativ: Troponin T Schnelltest® (Streifentest). Positives Ergebnis, wenn Troponin T > 0,1 ng/ml.
- Bewertung: sensitivste Marker eines Herzmuskelschadens, ein Myokardinfarkt liegt bei Spiegeln > 1,5 ng/ml vor (Sensitivität und Spezifität > 95%). Früh positiv, d. h. es kann noch mit Fibrinolyse oder PTCA (Ballondilatation eines verengten Herzkranzgefäßes) reagiert werden.
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Charakterisierung von Troponin
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Troponin I ist ein 23 kDa Protein und bildet zusammen mit den weiteren Untereinheiten Troponin C (18 kDa) und Troponin T (35 kDa) den Troponin-Komplex für die kalzium-abhängige Interaktion zwischen den Aktin- und Myosinfilamenten. Für Troponin C gibt es keine herzspezifische Isoform, für Troponin I und T gibt es herzspezifische Isoformen, d. h. ihre Aminosäurensequenz unterscheidet sich von denen der Skelettmuskulatur, und lassen sich daher selektiv detektieren. Jedoch ist der Unterschied gering, so dass man nur eine geringe Anzahl an potentiellen herzspezifischen Troponinabschnitten hat, gegen die man Antikörper herstellen kann.
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Der im Patentanspruch 1 angegebenen Erfindung liegen die Mängel der bisherigen Methoden der Serumdiagnostik einer Herzmuskelschädigung bzw. von Herzumbauprozessen (Remodelling) zugrunde.
- 1. 4% des Troponins I liegt nicht komplexgebunden am Aktin vor und ist somit damit frei im Cytosol zu finden und kann bei schwerer Ischämie durch passagere Störung der Zellmembran freigesetzt werden. Die ist bei der instabilen Angina Pectoris der Fall. Hier kann es also zu falsch positiven Ergebnissen für einen Herzinfarkt kommen.
- 2. Bei Troponin T (nicht bei Troponin I) sind bei Nierenfunktionsstörungen falsch hohe Konzentrationen bekannt. Ursache wahrscheinlich durch verminderte Nierenausscheidung.
- 3. Heterophile Antikörper, Autoantikörper und Rheumafaktoren erzeugen falsch-positive Werte für den Immunoassays für Troponin I und T, weil diese Antikörper mit den im Immunoassay eingesetzten Antikörpern reagieren.
- 4. Problem der Kreuzreaktivität: CK-MB und Troponine sind zwar herzspezifisch, jedoch gibt es Isoformen auch in der Skelettmuskulatur. Je nach Spezifität der verwendeten Antikörper sind Kreuzreaktionen nicht ausgeschlossen, d. h. bei einer gleichzeitig vorliegenden Skelettmuskelschädigung (z. B. durch Sturz oder im Rahmen der Reanimation) können auch falsch positive Troponin- oder CK-MB-Werte angezeigt werden.
- 5. Bisher gibt es keine geeigneten Marker für Restrukturierungs(Umbau)-Prozesse des Herzens.
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Diese Probleme werden durch die im Patentanspruch 1 aufgeführten Merkmale gelöst.
- 1. Herzspezifität. Die Titin-Exon-49-(N2B)-Sequenz ist absolut herzspezifisch, d. h. diese Sequenz kommt nur im Herzmuskel vor und findet sich nicht in der Skelettmuskulatur und nicht im glatten Muskel. Es gibt somit keine Problematik der Kreuzreaktivität, da es keine Isoformen der Titin-Exon 49-(N2B)-Sequenz in anderen Muskeln (Skelettmuskel, glatter Muskel) gibt.
- 2. Spezifität für den Myofibrillenuntergang. Titin-Exon 49-(N2B)-Aminosäuren kommen nicht frei im Cytosol vor, sondern sind fest eingebunden in den elastischen Titinanteil des kontraktilen Apparates. Erst wenn die kontraktile Einheit geschädigt wird, können Titin-Exon 49-(N2B)-Proteine freigesetzt werden.
- 3. Hohe Spezifität und Sensitivität durch die ausgedehnte Zielstruktur für den Nachweis. Titin ist das größte Protein des Menschen und besteht aus bis zu 38.138 Aminosären mit einem Molekulargewicht bis zu 4,2 Mega-Dalton. Es umspannt die gesamte Myofibrille und ist im Verbund mit Aktin und Myosin an der Kontraktion beteiligt. Die herzspezifische Titinsequenz Exon-49-(N2B) besteht aus 928 Aminosäuren (Exon 49). Wir zeigen hier dass Abschnitte dieser Sequenz im Serum bei Herzmuskelschädigung mittels spezifischer Antikörper im ELISA quantitativ nachgewiesen werden können. Dabei ergibt die Kombination mehrer Antikörper aus dem Titin-Exon 49-(N2B)-Bereich eine besonders hohe Sensitivität und Spezifität. Da das Titin-Exons 49 (N2B) nach unseren Arbeiten der größten bekannten Herz-spezifischen Sequenz entspricht, können gegen eine Vielzahl von Titin-Exon-49-(N2B)-Epitopen Herzspezifische Antikörper hergestellt werden mit den üblichen Verfahren zur Gewinnung polyklonaler oder monoklonaler Antikörper. Dadurch ergeben sich vielfältige Kombinationsmöglichkeiten zur Erhöhung der Spezifität und Sensitivität. Durch die Sensitivitätssteigerung lassen sich erstmals auch sehr geringe Mengen an Titin-Exon 49-(N2B)-Peptiden in Körperflüssigkeiten nachweisen, wie sie bei Umbauprozessen im Rahmen von Restrukturierungsprozessen beim Herzen vorkommen. Somit konnten wir einen Remodelling und Marker für das für Kardiomyopathien finden.
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Ausführungsbeispiel
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Nachweisverfahren von Titin-Exon 49 (Titin-N2B) in Körperflüssigkeiten
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Bau eines ELISA als Nachweissystem für herzspezifisches Titin (Exon 49)
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Da die Menge der Freisetzung Titin-Exon 49 bei einer Herzschädigung (Zelluntergang beim Herzinfarkt) und Übergang ins Blutsystem sehr gering sein wird, ist eine direkte Nachweismethode nicht sinnvoll. Es bleibt nur die sehr empfindliche Nachweismethode über rekombinant hergestellte Antikörper, die sehr sensitiv und gleichzeitig auch hochspezifisch sind. Der ELISA („Enzyme-linked Immunosorbent Assay) ist ein antikörperbasiertes Nachweisverfahren und basiert auf einer enzymatischen Farbreaktion. Wir benutzten die Technik des Sandwich-ELISA. Elisa-Sandwich-Technik (1. Stand der Technik): Hier werden zum Nachweis des Proteins zwei Antikörper verwendet, die beide an das nachzuweisende Protein binden. Der erste Antikörper (1) (auch coat oder capture-Antikörper genannt) wird an die feste Phase, in unserem Fall an den Boden der Mikrotiterplatte gebunden. Wir benutzen einen ersten rekombinant aus dem Titin-Exon 49-Bereich hergestellten Antikörper. Anschließend wird die zu untersuchende Probe dazugegeben (2), (diese enthält durch die Herzmuskelschädigung freigesetztes Titin-Exon 49-Proteine). Der an der Platte gebundene Antikörper bindet die freigesetzten Titin-Exon-49-Proteine. Nun findet ein Waschschritt statt und alle nicht gebundenen Anteile werden herausgewaschen. Zurück bleibt nur das am Coat-Antikörper gebundene Titin-Exon 49-Protein. Nun kommt ein zweiter (3) rekombinant hergestellter Titin-Exon 49-Antikörper (sogenannte Detektionsantikörper) hinzu. Dieser zweite Antikörper bindet ebenfalls an das Titin-Exon 49-Protein. Durch erneutes Waschen wird wieder überflüssiger Detektionspuffer ausgewaschen. Nun kann das Titin-Exon 49-Protein nachgewiesen werden. Der letzte Schritt ist die Zugabe eines dritten Antikörpers (4) (sogenannter sekundärer Antikörper). Es handelt sich um einen Antikörper der gegen den zweiten Antikörper gewonnen wurde. Dieser sekundäre Antikörper wird industriell hergestellt und ist mit einem Enzym (5) gekoppelt. Diese Antikörper binden an die nicht variablen Antikörperregionen und sind deshalb universal gegen alle Antikörper einsetzbar. Zum Enzym wird farbiges Substrat hinzugegeben (6), mit dem das Enzym arbeiten kann. Diese Reaktion führt zu einer Farbveränderung, die dann photometrisch ausgewertet wird. Um die Menge zu bestimmen, wird eine Verdünnungsreihe mit bekannten Konzentrationen aufgestellt und die gemessenen Werte mit dieser Kurve verglichen. Der Capture-Antikörper und der Detektionsantikörper werden rekombinant aus Fragmenten der Exon 49 Titinregion hergestellt. Grundlage war die humane Aminosäuresequenz der Exon 49 Titinregion.
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Reaktionen im Einzelnen
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- Mikrotiterplatte mit 96 wells (NUNC, Maxisorp).
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Zugabe von 100 μl Capture-Anti-Titin-N2B (c = 5 μg/ml). Coating buffer bestehend aus 0,2 M sodium carbonate/bicarbonate pH 9,4). Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Waschen 3 mal mit TEST (TBS mit 0,05% Tween 20). Anschließend blocken mit 300 μl 5% BSA in TEST über Nacht. Blocking Buffer entfernen und 100 μl Probenbuffer zufügen. Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Nun 3 mal waschen mit TEST und hinzufügen von 100 ml Detektions-anti-titin-Exon 49 mit einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst in Blockingbuffer. Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur und anschließend waschen 3 mal mit 100 μl TBST. Nun 100 μl Sekundär-Antikörper-HRP (Dako) verdünnt 1:2000 in Blockingbuffer. Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur wiederum waschen mit TBST (6 mal mit 100 μl). Nun zufügen von 100 μl Substrat (1 mg/ml TMB in DMSO, verdünnt 1:10 in 50 mM Phosphat-Zitrat-Buffer, der 0.001% H2O2 enthält. Die Reaktion wurde nach 60 Minuten gestoppt durch Hinzufügen von einem gleichen Volumen von 1 N HCL. Im Photometer wurde die Absorption bei 450 nm gemessen.
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Ergebnis
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2: Vergleich der Troponin T für 6 verschiedene Blutproben (Serum) bei Patienten mit sicherem Herzinfarkt (Proben 4 und 6) und unsicherem Herzinfarkt (Proben 1 bis 3 und 5).
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2: Vergleich der Titin-Exon-49-Werte für 6 verschiedene Blutproben (Serum) bei denselben Patienten mit sicherem Herzinfarkt (Proben 4 und 6) und unsicherem Herzinfarkt (Proben 1 bis 3 und 5). Ein sicherer Herzinfarkt liegt vor, wenn Troponin T größer als 0.1 ng/ml, d. h. größer als 100 pg/ml ist.
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Auf der X-Achse ist jeweils die Konzentration von Troponin T, bzw. von Titin-Exon-49 (Titin-N2B) in pg/ml dargestellt. Auf der Y-Achse sind dargestellt die Patienten mit klinisch sicherem Herzinfarkt (4 und 6) und klinisch unsicherem Herzinfarkt (1, 2, 3 und 5).
- 1. Es konnten zirkulierende Titin-Exon-49-(N2B)-Proteine im Serum von Herzinfarktpatienten und bei Patienten mit instabiler Angina Pectoris quantitativ nachgewiesen werden.
- 2. Die Nachweisgrenze mit Titin-Exon 49-(Titin-N2B) beträgt zurzeit unter 10 pg/ml.
- 3. Bei gesunden Patienten wurden deutlich weniger als 10 pg/ml Exon-49-(Titin-N2B)-Protein oder Fragmente davon im Serum nachgewiesen.
- 4. Die Instabile Angina Pectoris Patienten werden mit größerer Sicherheit als solche klassifiziert als es mit den herkömmlichen Verfahren (Troponin T) möglich ist. Es findet ein deutlicherer Anstieg der Titin-Exon 49-Werte schon bei geringer Myokardschädigung statt im Vergleich zur Troponinbestimmung. Es findet bei den Patienten mit instabiler Pectoris eine Erhöhung der Nachweisempfindlichkeit um den Faktor 3 statt.
- 5. Sicherere Diagnose schon bei geringer Herzmuskelschädigung im Vergleich zur Troponinbestimmung.
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- 5. Es besteht eine hohe Korrelation zwischen den etablierten Troponin-T-Werten und den Titin-Exon-49-Werten (R = 0.92 bei 30 Fällen).
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Gewerbliche Anwendbarkeit
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Die Nachweismethode lässt sich automatisieren und es lässt sich auch ein Schnelltest entwickeln.
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Sequenzprotokoll: Titin Exon 49-(N2B) herzspezifische Sequenz Verfahren zur Bestimmung von Herzmuskelschäden und Herzumbauprozessen (Remodelling) durch den Nachweis von herzspezifischem Titin in Körperflüssigkeiten mittels Titin-Exon-49 (N2B) spezifischer Antikörper.
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