Gebiet der Erfindung
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Die Erfindung betrifft ein Streptavidin-Bindungspeptid,
sowie Verfahren zur Herstellung eines
Streptavidin-Bindungspeptides in einem zellbasierten oder zellfreien
Proteinbiosynthesesystem.
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Weiterhin betrifft die Erfindung eine Verwendung eines
Streptavidin-Bindungspeptides zur Aufreinigung eines in
einem Proteinbiosynthesesystem hergestellten definierten
Proteins, sowie die Verwendung eines
Streptavidin-Bindungspeptides zur Markierung eines definierten Proteins.
Stand der Technik
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Verfahren zur effizienten Expression von definierten
Proteinen in verschiedensten pro- und eukaryontischen
Organismen sind bekannt und bedürfen keiner weiteren
Erläuterung. Unter definierten Proteinen werden in diesem
Zusammenhang Peptide und/oder Proteine verstanden, die in dem
zur Expression verwendeten Organismus oder zellfreien
Expressionssystem natürlicherweise oder nach Transformation
bzw. Einsatz definierter RNA exprimiert und in
Aufreinigungsschritten angereichert werden.
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Verfahren zur zellfreien Expression von definierten
Proteinen sind beispielsweise aus den Literaturstellen EP 0312 617 B1,
EP 0401 369 B1 und EP 0 593 757 B1 bekannt.
Demgemäß werden die für eine Transkription und/oder
Translation notwendigen Komponenten neben einem für ein
definiertes Protein kodierenden Nukleinsäurestrang in einem
Reaktionsgefäß inkubiert und nach der Expression die
Polypeptide/Proteine aus der Reaktionslösung isoliert. Sowohl
die für die Transkription, als auch die für die
Translation notwendigen Komponenten lassen sich aus den
Überstanden pro- oder eukaryontischen Zelllysaten nach
einer Zentrifugation gewinnen.
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Ein wesentliches Problem bei der Expression von
definierten Proteinen in pro- und eukaryontischen Organismen und
bei der zellfreien Expression liegt in der Aufreinigung
und/oder der Detektion der exprimierten definierten
Proteine. Dies ist insbesondere bei definierten Proteinen
problematisch, für die es keine Antiseren oder monoklonale
Antikörper gibt. Zur Vereinfachung der Aufreinigung und
der Detektion solcher definierten Proteine werden diese
als sogenannte Fusionsproteine exprimiert. Hierbei wird
dem definierten Protein N- und/oder C-terminal eine
Aminosäuresequenz angefügt oder zwischen zwei Proteindomänen
(intern) eingefügt, der Fusionspartner. Dies geschieht auf
der Nukleinsäureebene, so daß sowohl das definierte
Protein, als auch der zur Detektion und/oder Reinigung
angefügte Fusionspartner während eines
Transkriptions-/Translationsvorganges zusammen als ein chimäres (Fusions-)Protein
exprimiert werden, bestehend aus dem definierten Protein
und dem Fusionspartner. Hierbei kann es sich bei dem
angefügten Fusionspartner um einzelne Aminosäuren, aber auch
um Peptide oder Proteine handeln. Für diese angefügten
Fusionspartner stehen zur Aufreinigung immobilisierte
Bindungspartner zur Verfügung, mit denen die Fusionsproteine
isoliert werden können. Neben der Möglichkeit der
Reinigung der Proteine können diese auch mit für den
Fusionspartner spezifischen Bindungspartner nachgewiesen werden.
Diese Bindungspartner können für den Fusionspartner
spezifische Antikörper oder auch andere Proteine, Peptide oder
chemische Verbindungen sein, die an den Fusionspartner
spezifisch binden.
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Beispiele für solche Fusionspartner sind der Myc-tag
(Munro & Pelham (1986) Cell 46, 291-300; Ward et al. (1998)
Nature 341, 544-546), das Flag Peptid (Hopp et al.
(1988) Bio/Technology 6 1204-1210), das KT3 Epitop Peptid
(Martinet et al. (1990) Cell 63, 843-849; Martin et
al. (1992) Science 255, 192-194) und das alpha-tubulin
Epitop Peptid (Skinner et al. (1991) J. Biol. Chem. 266,
14163-14166), die alle erfolgreich für die Detektion und
teilweise auch für die Reinigung von Proteinen genutzt
wurden. Es konnte für einen Teil der Fusionspartner, die
normalerweise 3 bis 12 Aminosäuren lang sind, gezeigt
werden, daß sie nicht die biologische Funktion der
definierten Proteine beeinflussen. Die biologische Funktion des
definierten Proteins wird dagegen mit zunehmender Länge
des Fusionspartners beeinflußt, da die zusätzlich
exprimierten Aminosäuren z. B. die Ausbildung der Sekunder-,
Tertiär und/oder Quartärstruktur beeinflussen können.
Längere Fusionspartner sind daher zur Detektion der
Proteine, aber weniger zur Reinigung der Proteine geeignet.
Auf der anderen Seite weisen längere Fusionspartner oft
eine höhere Affinität mit ihren spezifischen
Bindungspartnern auf.
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Ein wesentlicher Nachteil der oben genannten
Fusionspartner bei der Aufreinigung ist darin begründet, daß die
Bindung an den Bindungspartner auf einer
Antigen/Antikörperbindung beruht und die Herstellung und Reinigung der als
Bindungspartner genutzten Antikörper aufwendig und teuer
ist. Ein weitere Nachteil liegt darin begründet, daß die
Antigen/Antikörperbindung eine sehr starke Bindung
zwischen dem Bindungspartner, z. B. an eine Matrix
immobilisierten Antikörper, und dem Fusionspartner bedingt. Diese
hat zur Folge, daß bei der Elution der über den
Fusionspartner gebundenen Fusionsproteine, teilweise extrem
unphysiologische Bedingungen bezogen auf das definierte
Protein geschaffen werden müssen. Unter unphysiologischen
Bedingungen sind in diesem Zusammenhang Bedingungen zu
verstehen mit z. B. sehr hohe oder äußerst geringe
Salzkonzentrationen, Einsatz von chaotrophen Salzen und pH-
Werte, die weit von dem natürlichen pH-Wert des
definierten Proteins abweichen. Diese kann u. U. die Struktur
und/oder Funktionalität des definierten Proteins
beeinflussen oder irreversibel zerstören. Dementsprechend sollte
die Reinigung der definierten Proteine unter möglichst
schonenden, physiologischen Bedingungen geschehen, um die
Funktionalität der Proteine zu erhalten. Zwar konnte bei
drei der oben genannten Fusionspartnern (Hopp et al.
(1988) (Martin et et al. (1990) (Skinner et al. (1991))
eine Elution auch unter schonenden Bedingungen mittels
kompetetiver Peptide erzielt werden, doch bleibt das
Problem der aufwendig und teuer herzustellenden und zu
reinigenden (als Bindungspartner dienenden) Antikörper und
deren Bindung an die Matrix.
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Weitere Fusionspartner, bestehend aus 8 bis 9 Aminosäuren,
sind aus den Literaturstellen US 5,506,121 und Schmidt &
Skerra (Protein Engineering, vol. 6, no. 1, 109-122, 1993)
bekannt. Die dort offenbarten Fusionspartner sind in der
Lage an das Streptavidin oder an das "core" Streptavidin,
ein proteolytisch gespaltenes Produkt des Streptavidin, zu
binden (Bayer et al. (1989) Biochem. J. 259, 369-376).
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Alle bekannten Fusionspartner, die an das Streptavidin
binden enthalten die Aminosäureabfolge HPQ, das sog. HPQ-
Bindungsmotiv, welches mit der Biotin-Bindungstasche des
Streptavidin in Wechselwirkung tritt. Zu den Bereits
bekannten Peptiden gehören dem sog. Strep-tag I: AWRHPQFGG
mit einer Dissoziationskonstanten Kd von 10-37 µM, der
sog. Strep-tag II: WSHPQFEK mit einer
Dissoziationskonstanten Kd von 18-72 µM und der sog. SBP-tag:
MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP mit einer
Dissoziationskonstanten Kd von 2,5 nM. Im Gegensatz zu den beiden
kurzen Strep-tags I und II besitzt der längere SBP-tag
eine wesentlich stärkere Bindung zum Streptavidin.
Allerdings wird, wie oben ausgeführt, die Funktion des
definierten Proteins insbesondere mit zunehmender Länge des
Fusionspartners beeinflußt. Auch stören besonders lange
Fusionspartner bei der Kristallisation der definierten
Proteine.
Technisches Problem der Erfindung
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Der Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, ein
möglichst kurzes Streptavidin-Bindungspeptid mit einer
starken Bindung zum Streptavidin zur Verfügung zu stellen.
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Grundzüge der Erfindung und bevorzugte Ausführungsformen.
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Zur Lösung des technischen Problems lehrt die Erfindung
ein Streptavidin-Bindungspeptid enthaltend eine
Aminosäuresequenz gemäß Seq.-ID 1-6.
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Mit dem erfindungsgemäßen Streptavidin-Bindungspeptid
enthaltend eine Aminosäuresequenz gemäß Seq.-ID 1-6
wird, verglichen mit dem Stand der Technik, eine wesentlich
stärkere Bindung zwischen dem Streptavidin-Bindungspeptid
und dem Streptavidin erreicht, bzw. kann bei gleicher
Bindungsstärke das Streptavidin-Bindungspeptid wesentlich
verkürzt werden.
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Des Weiteren lehrt die Erfindung ein Nukleinsäure
codierend für ein Streptavidin-Bindungspeptid gemäß Seq.-ID
1-6, sowie ein Plasmid enthaltend eine erfindungsgemäße
Nukleinsäure. Es versteht sich, daß die Nukleinsäure
codierend für ein erfindungsgemäßes Streptavidin-Bindungspeptid
und/oder das Plasmid dem jeweiligen
Expressionssystem/Proteinbiosynthesesystem angepaßt werden kann. Das Plasmid
kann als ein Expressionsvektor, insbesondere für
Bakterien, ausgelegt sein enthaltend einen Bereich mit mindestens
einer Schnittstelle für ein Restriktionsenzym, in dem die
Nukleinsäuresequenz codierend für ein definiertes Protein
inseriert werden kann und somit das definierte Protein
zusammen mit dem Streptavidin-Bindungspeptide gemäß
Seq.-ID 1-6 exprimiert wird. Es versteht sich, daß der
für das definierte Protein und für das
Streptavidin-Bindungspeptide gemäß Seq.-ID 1-6 codierende Bereich sich
unter der Kontrolle eines geeigneten Promoters und/oder
Operators und Terminators befinden. Der Bereich mit
mindestens einer Schnittstelle für mindestens ein
Restriktionsenzym kann sowohl in 5', als auch in 3' Richtung vom
Nukleinsäurebereich codierend für das
Streptavidin-Bindungspeptide gemäß Seq.-ID 1-6 liegen. Der
Nukleinsäurebereich codierend für das Streptavidin-Bindungspeptide gemäß
Seq.-ID 1-6 muß nicht unmittelbar an den
Nukleinsäurebereich codierend für das definierte Protein anschließen,
vielmehr können zwischen den beiden Bereich noch
Nukleinsäuren liegen, die für 1 bis 20 Aminosäuren,
insbesondere für 5 bis 10 Aminosäuren, codieren.
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Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung
eines Streptavidin-Bindungspeptides gemäß Seq.-ID 1-6,
wobei eine Nukleinsäure in einem zellbasierten oder
zellfreien Proteinbiosynthesesystem exprimiert oder
überexprimiert wird. Dieses so hergestellte Peptid läßt sich leicht
über die Bindung an Streptavidin isolieren. Das erhaltene
Translationsprodukt, i. e. ein Streptavidin-Bindungspeptid
gemäß Seq.-ID 1-6, wird mit immobilisiertem Streptavidin
kontaktiert und daran gebunden. Nach Abtrennung der Lösung
mit nicht an Streptavidin gebundenen Substanzen wird das
Translationsprodukt eluiert. Als Elutionsmittel können
Puffer verwendet werden, die Biotin oder verwandte
Substanzen und/oder Derivate, wie Iminobiotin, Desthiobiotin
und/oder Diaminobiotin, enthalten. Das erhaltene
Streptavidin-Bindungspeptid gemäß Seq.-ID 1-6 trägt im Falle
der Fusion mit dem definierten Protein dieses Protein. Es
kann der auch unabhängig von einem definierten Protein zur
Antikörperherstellung genutzt werden. Die erhaltenen
Antikörper können z. B. zur Detektion oder zur Aufreinigung
der Streptavidin-Bindungspeptide gemäß Seq.-ID 1-6, bzw.
im Fall, daß das Streptavidin-Bindungspeptide gemäß
Seq.-ID 1-6 als Fusionspartner eingesetzt wird, des an
diesen Fusionspartner gebundenen definierten Proteins
genutzt werden.
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Es versteht sich, daß die Herstellung eines solchen
Streptavidin-Bindungspeptides enthaltend eine Aminosäuresequenz
gemäß Seq.-ID 1-6 z. B. auch mittels chemischer
Festphasensynthese, beispielseise mit einem Syntheseautomat der
Firma Abimed (Langenfeld, BRD) möglich ist. Diese Methode
basiert auf den Standardprotokollen der Fmoc-Chemie
(Fmoc = 9-fluorenylmethoxycarbonyl).
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Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines
Streptavidin-Bindungspeptides gemäß Seq.-ID 1-6 zur
Aufreinigung eines in einem Proteinbiosynthesesystem hergestellten
definierten Proteins, wobei eine für das definierte
Protein und, hiermit verbunden, für das
Streptavidin-Bindungspeptid codierende Nukleinsäure einer Transkription und/oder
Translation unterworfen wird, wobei eine Lösung
enthaltend das so erhaltene Translationsprodukt mit
immobilisiertem Streptavidin kontaktiert und daran gebunden wird
und wobei nach Abtrennung der Lösung mit nicht an
Streptavidin gebundenen Substanzen das Translationsprodukt
eluiert wird. Die Elution kann unter schonenden Bedingungen
für das definierte Protein erfolgen. Als Elutionsmittel
können Puffer verwendet werden, die Biotin oder verwandte
Substanzen und/oder Derivate, wie Iminobiotin,
Desthiobiotin und/oder Diaminobiotin, enthalten. Das hergestellte
definierte Protein kann das als Fusionspartner dienende
Streptavidin-Bindungspeptid gemäß Seq.-ID 1-6 sowohl N-
und/oder C-terminal enthalten.
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Bei Verwendung einer Streptavidin-Sepharose-Säule kann das
zu untersuchende definierten Protein mittels des als
Fusionspartner dienenden Streptavidin-Bindungspeptides gemäß
Seq.-ID 1-6 an der Matrix immobilisiert und aus einem
Gemisch von Molekülen, z. B. einem Zelllysat, isoliert
werden.
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Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines
Streptavidin-Bindungspeptides gemäß Seq.-ID 1-6 zur Markierung
eines definierten Proteins, wobei eine für das definierte
Protein und, hiermit verbunden, für das
Streptavidin-Bindungspeptid codierende Nukleinsäure einer Transkription
und/oder Translation unterworfen wird, wobei das so
erhaltene Translationsprodukt mit einem Streptavidin-Konjugat
enthaltend ein Reportermolekül kontaktiert und daran
gebunden wird. Das markierte definierte Protein kann das zur
Markierung dienende Streptavidin-Bindungspeptides gemäß
Seq.-ID 1-6 N- und/oder C-terminal enthalten.
Reportermoleküle können z. B. radioaktive und/oder radioaktiv
markierte Substanzen sein. Es versteht sich, daß das
Streptavidin als solches auch radioaktiv markiert und/oder
radioaktiv sein kann; in diesem Fall kann auf ein
Reportermolekül verzichtet werden. Reportermoleküle können auch
fluoreszierende Substanzen oder Enzyme, wie z. B. alkalische
Phosphatase oder Peroxidase, sein. Durch solche mit einem
Reportermolekül gekoppelte Streptavidinverbindungen lassen
sich beispielsweise Proteine, die das
Streptavidin-Bindungspeptides gemäß Seq.-ID 1-6 als Fusionspartner
besitzen, auf einem Western-Blot oder im ELISA (Enzyme
linked immunosorbent assay) nachweisen und/oder
quantifizieren. Handelt es sich bei den definierten Proteinen um
Bindungsproteine, können auf diese Weise auch an diese
bindende andere Proteine nachgewiesen werden. Unter
Bindungsproteine sind in diesem Zusammenhang Proteine zu
verstehen, die selbst andere Proteine binden und/oder selber an
andere Proteine binden, wie z. B. bei einer
Antigen/Antikörperbindung oder bei einer Bindung eines Proteins an
einen Rezeptor.
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Bevorzugt ist ein Streptavidin-Bindungspeptid enthaltend
weniger als 30 Aminosäuren, vorzugsweise weniger als 20
Aminosäuren, höchstvorzugsweise weniger als 10
Aminosäuren.
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Im Folgenden wird die Erfindung anhand von lediglich
Ausführungsformen darstellenden Figuren sowie Beispielen
näher erläutert.
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Fig. 1 Reinigung von FABP mit
Streptavidin-Bindungspeptides gemäß Motiv 3 als Fusionspartner nach zellfreier
Proteinbiosynthese über eine Streptavidin-Affinitätssäule. Es
wurden von jeder Fraktion eine vergleichbare Menge mittels
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert. (A)
Coomassie gefärbt und (B) Autoradiogramm. Die Proben in den
numerierten Spuren sind (1) Molekulargewichtsmarker; (2)
Reaktionsmischung; (3) Durchlauf der Probenauftragung;
(4-6) Waschfraktionen; (7-9) Elutionsfraktionen; (10)
radioaktiver Molekulargewichtsmarker.
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Fig. 2 Reinigung von FABP mit
Streptavidin-Bindungspeptides gemäß Motiv 3 als Fusionspartner nach zellfreier
Proteinbiosynthese über eine StrepTactin-Affinitätssäule. Es
wurden von jeder Fraktion eine vergleichbare Menge mittels
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert. (A)
Coomassie gefärbt und (B) Autoradiogramm. Die Proben in den
numerierten Spuren sind (1) Molekulargewichtsmarker; (2)
Durchlauf der Probenauftragung; (3-5) Waschfraktionen;
(6-10) Elutionsfraktionen; (11) radioaktiver
Molekulargewichtsmarker.
Beispiel 1
erfindungsgemäße Bindungspeptide und
Vergleichspeptide mit Dissoziationskonstanten
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In fachüblicher Weise wurde das FAB Protein (fatty acid
binding protein) aus Rinderherzen in vitro in einem
zellfreien Proteinbiosynthese mittels eines gekoppelten
Transkriptions-Translationssystemes exprimiert. Das
exprimierte FAB Protein besaß am N-Terminus jeweils ein aus
fünfzehn Aminosäuren bestehendes zusätzliches Streptavidin
Bindungspeptid mit unterschiedlichen Aminosäuresequenzen
als Fusionspartner.
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Zwei Bindungspeptide enthalten in ihrer Aminosäuresequenz
das im Stand der Technik beschriebene HPQ-Motiv(Motiv 1
und 2) und zwei enthalten das erfindungsgemäße
Streptavidin-Bindungspeptid gemäß Seq.-ID 1-6 (Motiv 3 und 4).
Die Sequenzen der Peptide sind in der Tabelle 1
dargestellt. Zusätzlich wurden die exprimierten Proteine mit
einem am C-terminus befindlichen "His-tag", bestehend aus
6 Histidinen, versehen. Die Proteine wurden mittels
Affinitätschromatographie über Ni2+-IDA-Agarose in fachüblicher
Weise aufgereinigt. Man erkennt, dass bei gleicher Länge
Bindungspeptide mit einer erfindungsgemäßen Sequenz eine
wesentlich niedrigere Dissoziationskonstante als ein
Bindungspeptid mit HPQ-Motiv aufweist. Der Kd-Wert eines
erfindunggemäßen Bindungspeptids liegt in der Größenordnung
des SBP-Tags trotz des ca. 2,5-fachen Länge des SBP-Tags.
Tabelle 1
Beispiel 2
Messungsweise der Dissoziationskonstanten aus
Tabelle 1
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Die Messungen der Dissoziationskonstante wurden mit einem
BiacoreX-System und dem Sensor Chip NTA der Firma Biacore
durchgeführt. Vermessen wurden die aus der im Beispiel 1
beschriebenen Expression hervorgegangenen Proteine, d. h.
FAB Proteine, die am N-Terminus jeweils ein aus fünfzehn
Aminosäuren bestehendes Peptid als Fusionspartner und am
C-Terminus 6 Histidine besaßen, die zur Immobilisierung
auf dem Sensor Chip benötigt wurden. Die Bindungsaffinität
der aus der im Beispiel 1 beschriebenen Expression
hervorgegangenen Proteine zu Streptavidin wurde nach
Herstellerangaben im Biacore-Gerät vermessen. Dabei befindet sich
das zu vermessende Protein auf dem Sensor-Chip und eine
Streptavidinlösung mit definierter Konzentration wird
eingespritzt. Die Wechselwirkung (Bindung) zwischen den
beiden Molekülen wird vom Gerät gemessen und als sog.
Resonanz Units (RU) angegeben. Zur Messung wurden die vom
Hersteller angegebenen Puffer verwendet.
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Die Ergebnisse der Messungen sind in der Tabelle 2
dargestellt. Die erhaltenen Meßwerte wurden mit der zugehörigen
Software ausgewertet und führten zu den in der Tabelle 1
angegebenen Dissoziationskonstanten.
Tabelle 2
Beispiel 3
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In fachüblicher Weise wurde das FAB Protein, das am
N-terminus ein aus fünfzehn Aminosäuren bestehendes
zusätzliches Peptide mit der Aminosäuresequenz DVEAWLDERV
PLVET (Motiv 3) als Fusionspartner besaß, in vitro in
einem zellfreien Proteinbiosynthese mittels eines
gekoppelten Transkriptions-Translationssystems exprimiert.
Zur Aufreinigung des überexprimierten definierten Proteins
wurde das Streptavidin an einer Festphase gekoppelt. Als
Festphase diente eine Sepharose. Das exprimierte FAB
Protein wurde anschließend in fachüblicher Weise
affinitätschromatographisch über eine Säule enthaltend
Streptavidin-Sepharose oder StrepTactin-Sepharose aufgereinigt.
Für die Aufreinigung wurden folgende Puffer verwendet:
Waschpuffer (100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1 mM
EDTA).
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Für die Elution von Streptavidin enthielt der Waschpuffer
2 mM Biotin und für die Elution von StrepTactin enthielt
der Waschpuffer 2,5 mM Desthiobiotin.
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Die prozentuale Verteilung des eingesetzten definierten
Proteins auf die verschiedenen Fraktionen der
Affinitätschromatographie ist in der Tabelle 3 zu entnehmen. In der
Tabelle 3 steht D für den Auftragung der Probe/Durchlauf,
W für die Waschfraktion und E für die Elutionsfraktion.
Tabelle 3
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Bei der Verwendung von Streptavidin-Sepharose konnten 90%
des aufgetragenen Proteins von der Säule wiedergewonnen
werden, wobei 78% auf das Eluat entfielen. Die Qualität
der Aufreinigung ist in Fig. 1 dargestellt.
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Bei der Verwendung von StrepTactin-Sepharose konnten 84%
des aufgetragenen Proteins von der Säule wiedergewonnen
werden, wobei 71% auf das Eluat entfielen. Die Qualität
der Aufreinigung ist in Fig. 2 dargestellt.
Seq.-ID 1: DVEAW
Seq.-ID 2: DVEA
Seq.-ID 3: VEAW
Seq.-ID 4: DVE
Seq.-ID 5: VEA
Seq.-ID 6: EAW
SEQUENCE LISTING