DE10317402A1 - Ex-vivo-Hautorganmodell, insbesondere für männliche Haut - Google Patents

Ex-vivo-Hautorganmodell, insbesondere für männliche Haut Download PDF

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Tsianakas Athanasios
Ingrid Prof. Dr. Moll
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Abstract

Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines Exvivo-Hautorganmodells für männliche Haut bereit. Das Verfahren umfaßt das Entnehmen von Haut mit Dermis und Epidermis vom Körper oder Körperteil eines Schweins und das Inkontaktbringen der Haut mit einem Androgen, beispielsweise Testosteron. Das nach dem Verfahren hergestellte Hautorganmodell erlaubt die topische und systemische Untersuchung von Wirkstoffen unter standardisierten Bedingungen und in großem Umfang, insbesondere im Rahmen eines Screening.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Ex-vivo-Hautorganmodells, insbesondere für männliche Haut, Ex-vivo-Hautorganmodelle, die Verwendung der Ex-vivo-Hautorganmodelle und eine Anordnung zur Durchführung von Untersuchungen zu menschlicher und tierischer Haut.
  • Die Haut ist ein wichtiges Organ des Körpers von Menschen und Tieren. Die Untersuchung der menschlichen Haut ist insbesondere für die Medizin und die Hersteller von Kosmetika von großem Interesse.
  • Die Untersuchung der Wirkung von Wirkstoffen, Hautauflagen, Grundstoffen von Salben und Cremes usw. auf die menschliche Haut kann nur in Ausnahmefällen unmittelbar am Menschen vorgenommen werden. Es sind daher zahlreiche Alternativen zur direkten Anwendung am Menschen vorgeschlagen und angewendet worden. Beispiele hierfür sind Tierversuche, Einzelzell-Kulturen, Co-Kulturen, Hautäquivalente und humane Hautorgankulturmodelle.
  • Diese Alternativen weisen aber häufig Nachteile auf.
  • Die Durchführung von Tierversuchen ist vielfach unerwünscht oder gar gesetzlich verboten. Darüber hinaus verursachen sie, beispielsweise wegen der aufwendigen Tierhaltung, hohe Kosten und sind häufig, etwa im Fall von Nagern wie Mäusen oder Ratten, nur schlecht auf den Menschen zu übertragen. Die Haut von Nagern unterscheidet sich in wichtigen Parametern von der Haut des Menschen, beispielsweise in der Wundheilung durch den größeren Einfluß der Wundkontraktion, in der Epidermisdicke und der Art der Gap-Junctions und Mastzellen. Die Übertragbarkeit auf den Menschen ist dadurch deutlich beeinträchtigt.
  • Einzel- und Co-Kulturen bilden das komplexe Organ Haut nur sehr unzureichend nach, da in der Regel verschiedene Zelltypen und vor allem die speziellen Gewebeverbände fehlen.
  • Ein Hautäquivalent, d.h. eine künstlich gezüchtete Haut, ist ebenfalls nur eine unzureichende Alternative, da auch hier verschiedene Zelltypen fehlen. Zusätzlich handelt es sich um hyperproliferative Zellen und die Hautbarriere, die durch die Hornschicht (stratum corneum) der Epidermis gebildet wird, ist noch nicht komplett ausgebildet. Zudem sind Hautäquivalente sehr teuer.
  • Auch menschliche Hautorgankultur-Wundmodelle sind eingesetzt worden. Menschliche Haut ist aber nur in geringer Menge verfügbar. Die Haut stammt häufig von Menschen unterschiedlichen Alters und Geschlechts. Da in der Regel Hautabschnitte verwendet werden, die bei Operationen anfallen, ist die Vergleichbarkeit von Resultaten, die mit solchen Hautmodellen gewonnen werden, auch durch die unterschiedlichen Vorerkrankungen und Vorbehandlungen der Operierten in Frage gestellt. Zudem sind die Gewebestücke, die für die Gewinnung der Hautorganmodelle zur Verfügung stehen, kurz vorher einem größeren Gewebeverband bzw. Hautstück entnommen worden und sind in der Regel nicht sehr groß. An den Rändern dieser Gewebestücke finden massive Veränderungen durch Einsetzen der Wundheilung statt. Die für die Hautorganmodelle entnommenen Gewebeab schnitte ("Stanzen") müssen häufig in der Nähe der Randbereiche genommen werden und unterliegen daher dem Einfluß der "primären" Wundheilung. Standardisierte Untersuchungen sind daher häufig mit diesen Modellen entweder nur begrenzt oder gar nicht möglich. Die Durchführung von Screenings ist aufgrund der limitierten Verfügbarkeit von Haut mit sehr ähnlichen Ausgangseigenschaften unmöglich.
  • Die dermatologisch-kosmetische Forschung hat sich bislang vor allem auf die Haut der Frau konzentriert. Es ist aber zunehmend auch wirtschaftlich interessanter geworden, bessere Kenntnis über männliche Haut zu erhalten, die sich deutlich von weiblicher Haut unterscheidet.
    •
  • Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Modell für männliche Haut zur Verfügung zu stellen, bei dem auf Tierversuche verzichtet werden kann und das die oben beschriebenen Nachteile des Standes der Technik nicht aufweist.
  • Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung eines Ex-vivo-Hautorganmodells, umfassend das Entnehmen von Haut mit Dermis und Epidermis vom Körper oder Körperteil eines Tieres, und das In-Kontakt-bringen der Haut mit einem Androgen.
  • Unter Androgen wird jede androgen wirkende Substanz verstanden, d.h. jede Substanz, die auf die Ausbildung der primären und sekundären männlichen Geschlechtsorgane und/oder die Spermiogenese einwirkt.
  • Das mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellte androgensubstituierte Ex-vivo-Hautorganmodell ist insbesonde re sehr gut als Modell für die männliche menschliche Haut geeignet. Es können zuverlässige und gut übertragbare Ergebnisse erzielt werden, ohne daß Tierversuche vonnöten sind. Eine Standardisierung von Untersuchungen zu menschlicher, aber auch tierischer Haut, beispielsweise für Screenings, wird mit Hilfe des Modells ebenfalls möglich.
  • Bevorzugt stammt die Haut für das Modell vom Schwein (Sus scrofa). Die Haut des Schweins ist der menschlichen Haut in vielen Parametern sehr ähnlich (Meyer W., Hautarzt 47 :178–182, 1996; Meyer et al., Münch. Tierärztl. Wschr. 114: 92–99, 2001; Meyer et al., Münch. Tierärztl. Wschr. 114: 100–111, 2001), so daß sie für die Untersuchung der menschlichen Haut, beispielsweise in einem Ex-vivo-Hautorganmodell, gut geeignet ist. Haut von geschlachteten Schweinen ist darüber hinaus in ausreichender Menge, vergleichbarem Alter (jung adult) und, insbesondere aufgrund des Fehlens von Vorbehandlungen oder Vorerkrankungen, in vergleichsweise einheitlicher Qualität verfügbar.
  • Aufgrund der früh (spätestens im Alter von 6 Wochen) erfolgenden Kastration männlicher Schweine ist reife männliche Schweinehaut nicht in ausreichender Menge und Qualität erhältlich. Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, hier einen geeigneten Ersatz bereitzustellen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens ist das Androgen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Testosteron, Dihydrotestosteron, Androsteron, 5-Dehydro-androsteron. Es können aber auch andere Substanzen eingesetzt werden, die androgene Wirkung aufweisen.
  • Bevorzugt wird die Dermis der Haut mit einem Medium in Kontakt gebracht, das vorzugsweise wäßrig ist. Besonders bevorzugt ist die Dermis (Corium, Lederhaut) dabei von dem Medium umgeben. Die Epidermis ist vorzugsweise einer Gasphase, beispielsweise Luft, die bevorzugt mit CO2, z.B. in einer Konzentration von 5 % (Volumen/Volumen) angereichert ist, ausgesetzt ("Air-Liquid-Interphase"-Kultur).
  • In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Androgen in dem Medium enthalten. Das Androgen kann aber auch, entweder alternativ oder zusätzlich, auf die Epidermis der Haut aufgebracht werden.
  • Bevorzugt wird das Androgen in einer für menschliche Männer durchschnittlichen physiologischen Konzentration eingesetzt. Dies kann im Falle des Testosterons beispielsweise eine Konzentration von 5 ng/ml sein.
  • Zur Untersuchung des Einflusses von Wirkstoffen auf männliche (menschliche) Haut kann dem Medium ein Wirkstoff zugesetzt werden, der beispielsweise ausgewählt sein kann aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, DNA, RNA, Aminosäuren, Aminosäurederivaten, Oligopeptiden, Oligonukleotiden, Hormonen, Wachstumsfaktoren, Cytokinen, Steroiden, Retinoiden, Ionen, Metallen oder Metallionen, Insulin, Glukose, Honig, Rinderserumalbumin (BSA), vasoaktiven Substanzen, Pflanzenextrakten und deren Bestandteilen, Algenextrakten und deren Bestandteilen, neuroaktiven Substanzen, pigmentaktivierenden oder – hemmenden Substanzen, proliferationsfördernden oder – hemmenden Substanzen, migrationsfördernden oder -hemmenden Substanzen, pH-verändernden Substanzen, radikalerzeugenden oder -hemmenden Substanzen, osmolaritätsverändernden Substan zen, Anti-aging-Wirkstoffen, kosmetischen Rohstoffen (z.B. Wollwachs, Bienenwachs, ätherische Öle etc.), antientzündlichen und entzündungsfördernden Substanzen, UV-Licht-Schäden verhindernden Substanzen, schmerzhemmenden Substanzen, antiallergischen Substanzen, bakteriziden und virusstatischen Substanzen, antiandrogenen Substanzen, Enzymen (beispielsweise solchen, die in den Androgenstoffwechsel eingreifen), Enzyminhibitoren und -aktivatoren, Liposomen, eukaryontischen und prokaryontischen Zellen (z.B. Blutzellen), Pilzen, Viren und Prionen.
  • Es ist aber auch möglich, den Wirkstoff unmittelbar auf die Epidermis der Haut aufzubringen oder in die Haut zu injizieren.
  • In der Regel ist es erforderlich, die verwendete Haut zu reinigen. Dies kann beispielsweise durch einfaches oder gegebenenfalls mehrfaches Waschen mit Wasser geschehen.
  • Auch die Haare der Haut müssen in der Regel gekürzt oder gar entfernt werden. Dabei hat sich gezeigt, daß die Art und Weise der Haarkürzung einen Einfluß darauf hat, wie gut das Hautmodell zumindest für bestimmte Untersuchungen geeignet ist. Um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, ist es vorteilhaft, die Kürzung bzw. Entfernung in einer Weise vorzunehmen, daß die Hautbarriere intakt bleibt. Unter Hautbarriere wird in der vorliegenden Anmeldung die äußere Schicht der Epidermis, die Hornschicht (stratum corneum), verstanden. Unter einer intakten Hautbarriere wird eine Hornschicht verstanden, die nicht mechanisch beschädigt ist und/oder eine gegenüber dem Normalzustand veränderte quantitative oder qualitative Lipidzusammensetzung aufweist. Eine Beeinträchtigung bzw. Schädigung der Barrierefunktion kann beispielsweise durch Messung des transepidermalen Wasserverlusts (TEWL) festgestellt werden. Das Meß-Verfahren hierzu ist dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt. Erhöhte TEWL-Werte zeigen eine beeinträchtige Barrierefunktion an. Um Ob die Barrierefunktion der Haut eine Beeinträchtigung erfahren hat, kann beispielsweise durch Messung des durchschnittlichen TEWL-Werts der Haut bzw. eines Hautabschnitts vor und nach dem Kürzen/Entfernen der Haare bestimmt werden. Auch eine Vergleichsmessung mit Haut, die ansonsten gleich behandelt wurde, deren Haare aber nicht gekürzt oder entfernt wurden, kann hierzu herangezogen werden.
  • Es hat sich herausgestellt, daß das Kürzen der Haare beispielsweise durch Rasieren ungeeignet ist, weil dies zu einer Beschädigung der Hautbarriere führt, die sich anhand eines erhöhten transepidermalen Wasserverlusts feststellen läßt. Um eine Beschädigung oder Veränderung der Hautbarriere zu vermeiden bzw. minimal zu halten, ist es vorteilhaft, die Haare in Höhe der Epidermis oder knapp oberhalb der Epidermis, beispielsweise mit einer Schere, einem Messer, einem elektrischen oder mechanischen Bartschneider oder dergleichen, so abzuschneiden, daß ein mechanischer Kontakt mit der Epidermis unterbleibt oder minimal ist. Die Haare werden dabei beispielsweise soweit gekürzt, daß sie etwa ein bis vier, bevorzugt ein bis zwei Millimeter oberhalb der Epidermis enden. Der durchschnittliche transepidermale Wasserverlust der Haut mit gekürzten Haaren entspricht im wesentlichen dem durchschnittlichen transepidermalen Wasserverlust von Haut mit ungekürzten Haaren.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung entspricht der durchschnittliche transepidermale Wasserverlust der Haut mit gekürzten Haaren im wesentlichen dem durchschnittlichen transepidermalen Wasserverlust von Haut mit ungekürzten Haaren, wenn der durchschnittliche transepidermale Wasserverlust von Haut mit ungekürzten Haaren mindestens 70 %, bevorzugt mindestens 90 %, besonders bevorzugt mindestens 95 %, weiter besonders bevorzugt mindestens 98 % des durchschnittlichen transepidermalen Wasserverlusts von Haut mit gekürzten Haaren beträgt.
  • Vorzugsweise wird die Haut in geeigneter Weise desinfiziert, um eine Verkeimung mit Bakterien und/oder Pilzen zu verhindern oder zu hemmen. Eine solche Verkeimung kann, insbesondere bei Untersuchungen, die über mehrere Stunden oder Tage vorgenommen werden zu unerwünschten Veränderungen der Haut oder einer Verfälschung von Meßergebnissen führen. Die gewählte Methode zum Desinfizieren sollte die Hautbarriere ebenfalls nicht beschädigen bzw. beeinträchtigen. Als geeignet haben sich Desinfektionsmittel erwiesen, die zum Desinfizieren von Oberflächen geeignet sind, beispielsweise Hände-Desinfektionslösungen wie Sterillium® (Bode Chemie Hamburg; 45 g 2-Propanol, 30 g 1-Propanol, 0,2 g Mecetronium etilsulfat (INN) in 100 g Lösung), Cutasept S, (Bode Chemie) oder Desderman N (Schülke & Mayr). Die Desinfektion erlaubt es, bei längerfristigen Untersuchungen im Bereich von einem bis zu mehreren Tagen, die mit dem vorliegenden Hautmodell ohne weiteres durchführbar sind, eine Beeinträchtigung der Meßergebnisse durch Bakterien- oder Pilzbefall zu vermeiden bzw. zu minimieren.
  • Des weiteren ist es vorteilhaft, das Unterhaut-Fettgewebe der Haut zu entfernen, so daß die Haut nur noch die Epidermis und Dermis umfaßt. Dadurch kann die Versorgung des Gewebes optimal gewährleistet werden. Dies ist insbesondere dann von Bedeutung, wenn Transportprozesse untersucht werden sollen oder die Versuche längere Zeit (mehrere Tage) andauern.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens entstammt die Haut dem Ohr eines Schweins, bevorzugt der Innenseite des Ohrs, besonders bevorzugt einem Bereich der Innenseite des Ohrs, der wulstartige Verdickungen (plicae scaphae) aufweist. Es hat sich gezeigt, daß Haut aus solchen Bereichen besonders gut geeignet ist für die Zwecke der Erfindung.
  • Für Untersuchungen zur Wundheilung mit Hilfe des erfindungsgemäßen Hautorganmodells wird vorteilhafterweise eine Wunde in der Haut hervorgerufen. Dies kann dadurch geschehen, daß in einem Abschnitt der Haut die Epidermis, etwa durch Ausstanzen, entfernt wird. Das Entfernen der Epidermis kann beispielsweise vorgenommen werden, bevor die Haut mit dem Androgen in Kontakt gebracht wird oder aber auch danach. Bevorzugt wird dabei auch der obere Teil der Dermis mit entfernt. Das derart hergestellte Wundmodell eignet sich zur Untersuchung der Wirksamkeit von Wirkstoffen, Wundauflagen, Salben usw. auf die Wundheilung.
  • Die Erfindung betrifft auch ein Ex-vivo-Hautorganmodell, insbesondere für männliche Haut, das durch eines der vorstehend beschriebenen Verfahren erhältlich ist.
  • Darüber hinaus betrifft die Erfindung auch die Verwendung erfindungsgemäßer Ex-vivo-Hautorganmodelle zur Untersuchung von Wundheilungsprozessen. Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Ex-vivo-Hautorganmodelle zur Untersuchung des Einflusses von Wundauflagen, Wundcremes, Wundsalben und deren Bestandteilen auf Wundheilungsprozesse in männlicher Haut verwendet. Wundauflagen können beispielsweise Alginatfasern, Hydrokolloide, Folien (z.B. Polyurethanfolien), Schaumstoffe, (z.B. Polyurethanschäume), Hydrogele, Aktivkohleverbände usw. sein. Wundsalben und Wundcremes können z.B. Zinksalben und dergleichen sein.
  • Das erfindungsgemäße Ex-vivo-Hautorganmodelle kann vorteilhaft auch zur Untersuchung des Einflusses von Rasiercremes, After-Shave-Produkten, Rasierwasser und dergleichen verwendet werden.
  • Die Erfindung betrifft auch eine Anordnung zur Durchführung von Untersuchungen zu menschlicher oder tierischer Haut, die einen Hautabschnitt mit Dermis und Epidermis vom Körper oder Körperteil eines Tieres, bevorzugt eines Schweines, umfaßt, wobei der Hautabschnitt in Kontakt gebracht ist mit einem Androgen.
  • Bei der Anordnung ist das Androgen vorzugsweise in einem wäßrigen Medium enthalten, während die Epidermis des Hautabschnitts einer Gasphase, vorzugsweise Luft, die mit CO2 angereichert sein kann, ausgesetzt ist.
  • Das Androgen ist beispielsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Testosteron, Dihydrotestosteron, Androsteron, 5-Dehydro-androsteron. Vorteilhaft liegt das Androgen in einer für menschliche Männer durchschnittlichen physiologischen Konzentration vor. Beispielsweise liegt die physiologische Konzentration für Testosteron beim Mann in der Regel zwischen 3,5 und 9 ng/ml.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Anordnung ist in einem Abschnitt der Haut die Epidermis entfernt, so daß eine Wunde in der Haut gebildet ist. Diese Ausführungsform eignet sich gut für die Untersuchung von Wundheilungsprozessen bei männlicher Haut.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist dem wäßrigen Medium ein Wirkstoff zugesetzt, der beispielsweise ausgewählt sein kann aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, DNA, RNA, Aminosäuren, Aminosäurederivaten, Oligopeptiden, Oligonukleotiden, Hormonen, Wachstumsfaktoren, Cytokinen, Steroiden, Retinoiden, Ionen, Metallen oder Metallionen, Insulin, Glukose, Honig, Rinderserumalbumin (BSA), vasoaktiven Substanzen, Pflanzenextrakten und deren Bestandteilen, Algenextrakten und deren Bestandteilen, neuroaktiven Substanzen, pigmentaktivierenden oder -hemmenden Substanzen, proliferationsfördernden oder -hemmenden Substanzen, migrationsfördernden oder -hemmenden Substanzen, pH-verändernden Substanzen, radikalerzeugenden oder -hemmenden Substanzen, osmolaritätsverändernden Substanzen, Anti-aging-Wirkstoffen, kosmetischen Rohstoffen (z.B. Wollwachs, Bienenwachs, ätherische Öle, Wollwachsalkohole, Duftstoffe, Konservierungsstoffe, Emulgatoren, Harnstoff, Ceramide), antientzündlichen und entzündungsfördernden Substanzen, UV-Licht-Schäden verhindernden Substanzen, schmerzhemmenden Substanzen, allergieauslösenden Substanzen, antiallergischen Substanzen, bakteriziden und virusstatischen Substanzen, antiandrogenen Substanzen, energiespendenden Substanzen (z.B. ATP, NADH, Phosphoenolpyruvat, Phosphcreatin), Enzymen, Enzyminhibitoren und -aktivatoren, Liposomen, eukaryontischen und prokaryontischen Zellen (z.B. Blutzellen), Pilzen, Viren und Prionen.
  • Der Wirkstoff kann auch, alternativ oder zusätzlich, auf die Epidermis aufgebracht werden. Es ist auch möglich, den Wirkstoff direkt in die Wunde ein- bzw. aufzubringen und/oder intradermal zu applizieren, beispielsweise durch Injektion. Der Wirkstoff kann auch beispielsweise in einer Wundauflage oder dergleichen vorliegen.
  • Im folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen und der Figuren näher erläutert. Es zeigt:
  • 1 Ein Schweineohr unmittelbar nach dem Abtrennen von einem geschlachteten Schwein
  • 2 Die Innenseite eines gereinigten und desinfizierten Schweineohrs, bei dem die Haare gekürzt worden sind und dem Hautabschnitte ("Stanzen") entnommen wurden.
  • 3 Eine "Air-Liquid-Interphase"-Kultur einer Schweinehautstanze.
  • 4 Eine schematische Darstellung einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Ex-vivo-Hautorganmodells
  • 5 Eine schematische Darstellung einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Ex-vivo-Hautorganmodells
  • Beispiel 1
  • Das Ohr 7 eines geschlachteten Schweins (s. 1) wurde sofort nach der Schlachtung zwischen zwei mit physiologischer Kochsalzlösung getränkte Kompressen gegeben. Die Verarbeitung des so vorbereiteten Ohres 7 erfolgte so bald wie möglich. Das Ohr 7 wurde mindestens 5 min unter fließendem Wasser gewaschen. Anschließend wurden die Haare vorsichtig mit einer Schere abgeschnitten, so daß die Hautbarriere intakt blieb (s. 2). Das Ohr 7 wurde nochmals unter fließendem Wasser gewaschen. Anschließend wurde über beide Seiten ein Desinfektionsmittel (Sterillium®, Bode Chemie Hamburg) laufen gelassen. Nach einer Einwirkzeit des Sterillium® von etwa 2 Minuten wurde das Ohr 7 mit der Außenseite des Ohrs 7 nach unten einzeln auf mit Sterillium® getränkte Gaze gelegt. Auf die Innenseite des Ohrs 7 wurde ebenfalls sterile Gaze gelegt und diese mit Sterillium® getränkt. Nach 10 min Einwirkzeit wurde das Ohr 7 mit sterilen Handschuhen hochgehoben und mit steriler Kochsalzlösung gründlich abgespült. Das Ohr 7 wurde mit steriler Gaze abgetupft und in eine sterile Schale gelegt. Hautabschnitte (Stanzen) 9 (8 mm im Durchmesser) wurden an Stellen 8 von der Innenseite des Ohres 7 im Bereich wulstartiger Verdickungen (plicae scaphae) 11 des Ohres 7 unter Vermeidung von Druckartefakten entnommen (s. 2) und in eine sterile Schale mit Medium gegeben. Die Stanzen 9 wurden vorsichtig durch „Eindrehen" einer "Biopsy Punch" (Fa. Stiefel) gewonnen. Die Stanzen 9 wurden tief im Fettgewebe mit einer Schere abgeschnitten. Zum Entfernen von Sterillium®- und Kochsalzresten wurden die Stanzen 9 kurz in Medium geschwenkt. Das Medium hatte folgende Zusammensetzung:
    DMEM (Fa. Biochrom)
    5% FCS (Fa. Biochrom)
    59,9 μg/ml Penicillin (Fa. Grunenthal)
    0,125 mg/ml Streptomycin (Fa. HEFA Pharma)
    5 ng/ml Testosteron (Fa. Sigma)
  • Das Fettgewebe wurde von den Stanzen 9 entfernt. Die Hautstanzen 9 wurden mit der Epidermisseite nach oben in ein Loch 10 einer 12-Well-Platte gegeben (s. 3), deren Boden mit Gaze 5 bedeckt war. Das Loch 10 wurde soweit mit Medium aufgefüllt, daß die Dermis 3 von Medium umgeben, die Epidermis 2 aber in Luftkontakt war. Die Oberseite der Stanze 9 wurde leicht mit Gaze abgetupft.
  • Das so entstandene Hautmodell 1 wurde nach definierten Zeitpunkten (z.B. 1 h, 3 h, 6 h, 12 h, 18 h, 24 h, 48 h, 96 h, etc.) mit verschiedenen Wirkstoffen sowohl „systemisch" (über das Medium), als auch „topisch" (Auftragung auf die Stanze) behandelt. Auf diese Weise konnte deren Einfluß auf verschiedene Parameter untersucht werden.
  • Mögliche Parameter waren:
    • – Transepidermaler Wasserverlust
    • – Corneometrische Auswertung
    • – Eindringtiefe von Farbstoffen,
    • – Proliferationsrate
    • – Enzymaktivitäten
    • – Cytokinprofil und -dynamik
    • – Expression, Synthese und Aktivierung von Androgen- und Östrogenrezeptoren und Androgen/Östrogen verstoffwechselnden Enzymen
    • – Veränderung von stratum corneum und Zellverbindungen bezüglich der Morphologie und der Zusammensetzung
    • – Veränderung der direkten Zell-Zell-Kommunikation via Gap Junctions
    • – Ausschüttung von neuroaktiven oder -hemmenden Substanzen
    • – Veränderung von Keratinocyten, Fibroblasten, Melanocyten, Merkelzellen, Langerhangerhanszellen (Morphologie, Anzahl, etc.)
    • – Morphologie der Epidermis und der Adnexe
  • Mögliche Wirkstoffe:
    • – antiandrogene Stoffe
    • – Kosmetika für den Mann und deren Grundstoffe bzw. deren einzelne Wirkstoffe
    • – Rasiercremes
    • – Rasierwasser
    • – Aftershafe-Produkte
    • – Wachstumsfaktoren, Hormone, Cytokine, Steroide, Retinoide, Ionen, Metalle, Insulin, Glucose, Honig, BSA, andere energiespendende Substanzen (z.B. ATP, NADH, Phosphoenolpyruvat, Phosphcreatin), vasoaktive Substanzen, Pflanzenextrakte und deren Einzelsubstanzen, Algenextrakte und deren Einzelsubstanzen, neuroaktive Substanzen, pigmentaktive oder hemmende Substanzen, sonstige chemische Wirkstoffe
    • – Inhibitoren/Aktivatoren von Enzymen (z.B. testosteronumsetzende Enzyme, Metallomatrixproteinasen, Collagenasen, Elastasen) einschließlich enzymabsorbierender Substanzen (z.B. hochmolekulare Absorber)
    • – Inhibitoren und Aktivatoren von Signaltransduktionswegen in der Zelle
    • – Inhibitoren und Aktivatoren des Cytoskeletts
    • – Inhibitoren und Aktivatoren von Zell-Matrix-Verbindungen
    • – Inhibitoren und Aktivatoren des Aufbaus der Basalmembran
    • – Inhibitoren und Aktivatoren von Gap Junctions
    • – Inhibitoren und Aktivatoren von Desmosomen und Adhärenzverbindungen
    • – Inhibitoren und Aktivatoren von Tight Junctions
    • – Inhibitoren und Aktivatoren des Aufbaus der Hautbarriere, z.B. stratum corneum
    • – proliferationsfördernde und proliferationshemmende Substanzen
    • – migrationsfördernde und -hemmende Substanzen
    • – pH-Wert-verändernde Substanzen
    • – osmolaritätsverändernde Substanzen
    • – radikalerzeugende und -hemmende Substanzen
    • – WA, WB, Sonnenlicht
    • – Bakterien
    • – Viren
    • – Allergene
    • – Pilze
    • – Parasiten
    • – Prionen
    • – DNA (z.B. Einzelstrang-DNA, Doppelstrang-DNA, Plasmide)
    • – RNA (z.B. Einzelstrang-RNA, Doppelstrang-RNA, siRNA)
    • – Aminosäuren, Aminosäurederivate, Oligopeptide
    • – Oligonukleotide
    • – Liposomen
    • – Anti-aging-Wirkstoffe
    • – kosmetische Rohstoffe (z.B. Wollwachs, Bienenwachs, ätherische Öle etc.)
    • – antientzündliche (antiphlogistische) Stoffe
    • – entzündungsfördernde Substanzen
    • – Desinfektionsmittel
    • – Antiseptika, bakterizide und virusstatische Substanzen
    • – UV-Licht-Schäden verhindernde Substanzen
    • – schmerzhemmende Substanzen
    • – antiallergische Substanzen
  • Die Versuche wurden zu verschiedenen Zeitpunkten abgestoppt ( z . B . nach 6 h, 12 h , 18 h, 24 h, 48 h, 3 d, 4 d, 5 d, 6d, 7d) .
  • Beispiel 2 (Wundheilungsmodell)
  • Das Ohr wurde wie im Beispiel 1 beschrieben behandelt. Es wurden allerdings Stanzen 9 mit nur 6 mm Durchmesser hergestellt. Bevor die Stanzen 9 in die Multi-Well-Platte gegeben wurden, wurde aus dem zentralen Bereich der Stanze 9 mit Hilfe einer 3 mm Biopsy-Punch (Fa. Stiefel) die Epidermis 2 und der oberen Teil der Dermis 3 entfernen, so daß eine Wunde 6 entstand.
  • Das Modell diente zur Untersuchung von beispielsweise
    • – Wundauflagen (z.B. Gaze, Hydrogele, Alginatfasern, Hydrokolloide usw.)
    • – Wundsalben/Wundcremes
    • – Grundstoffen zu Wundsalben/Wundcremes
    • – Wirkstoffen, z.B. Wachstumsfaktoren, Hormone, Cytokine, Steroide, Retinoide, Ionen, Metalle, Insulin, Glucose, Honig, BSA, andere energiespendende Substanzen (z.B. ATP, NADH, Phosphoenolpyruvat, Phosphcreatin), vasoaktive Substanzen, Pflanzenextrakte und deren Einzelsubstanzen, Al genextrakte und deren Einzelsubstanzen, neuroaktive Substanzen, pigmentaktive oder hemmende Substanzen, sonstige chemische Wirkstoffe
    • – Fibrin/Thrombin, Blut, Serum, Plasma
    • – Inhibitoren/Aktivatoren für Enzyme (z.B. Metallomatrixproteinasen, Collagenasen, Elastasen usw.) einschließlich enzymabsorbierender Substanzen (z.B. hochmolekulare Absorber)
    • – Inhibitoren und Aktivatoren von Signaltransduktionswegen in der Zelle
    • – Inhibitoren und Aktivatoren des Cytoskeletts
    • – Inhibitoren und Aktivatoren von Zell-Matrix-Verbindungen
    • – Inhibitoren und Aktivatoren des Aufbaus der Basalmembran
    • – Inhibitoren und Aktivatoren von Gap Junctions
    • – Inhibitoren und Aktivatoren von Desmosomen und Adhärenzverbindungen
    • – Inhibitoren und Aktivatoren von Tight Junctions
    • – Inhibitoren und Aktivatoren des Aufbaus der Hautbarriere, z.B. stratum corneum
    • – proliferationsfördernden und proliferationshemmenden Substanzen
    • – migrationsfördernden und -hemmenden Substanzen
    • – Zellen, z.B. Keratinocyten, Fibroblasten, Melanocyten, Merkelzelltumorzellen, Melanomzellen, Blutzellen (Erythrocyten, Leukocyten wie Lymphocyten, Granulocyten und Monocyten, Thrombocyten), adulte Stammzellen, mesenchymale Stammzellen, embryonale Stammzellen, epidermale Stammzellen
    • – pH-Wert-verändernden Substanzen
    • – osmolaritätsverändernden Substanzen
    • – radikalerzeugenden und -hemmenden Substanzen
    • – WA, WB, Sonnenlicht
    • – Bakterien
    • – Viren
    • – Allergenen
    • – Pilzen
    • – Parasiten
    • – Prionen
    • – DNA (z.B. Einzelstrang-DNA, Doppelstrang-DNA, Plasmide)
    • – RNA (z.B. Einzelstrang-RNA, Doppelstrang-RNA, siRNA)
    • – Aminosäuren, Aminosäurederivate, Oligopeptide
    • – Oligonukleotide
    • – Liposomen

Claims (22)

  1. Verfahren zur Herstellung eines Ex-vivo-Hautorganmodells, insbesondere für männliche menschliche Haut, umfassend das Entnehmen von Haut mit Dermis (3) und Epidermis (2) vom Körper oder Körperteil eines Tieres, und das In-Kontakt-bringen der Haut mit einem Androgen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Tier ein Schwein ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Androgen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Testosteron, Dihydrotestosteron, Androsteron, 5-Dehydroandrosteron.
  4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, und die Dermis (3) der Haut mit einem vorzugsweise wäßrigen Medium (4) in Kontakt gebracht wird.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Dermis (3) der Haut von dem Medium (4) umgeben und die Epidermis (2) der Haut einer Gasphase, vorzugsweise Luft, ausgesetzt ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Androgen in dem Medium (4) enthalten ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Androgen auf die Epidermis (2) der Haut aufgebracht wird.
  8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Androgen in einer für menschliche Männer durchschnittlichen physiologischen Konzentration eingesetzt wird.
  9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiter umfassend die Schritte – Reinigen der Haut, – Kürzen der Haare der Haut in einer Weise, daß der durchschnittliche transepidermale Wasserverlust der Haut mit gekürzten Haaren im wesentlichen dem von Haut entspricht, bei dem die Haare nicht gekürzt wurden, – Desinfizieren der Haut, – Entfernen des Unterhaut-Fettgewebes der Haut.
  10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Haut dem Ohr eines Schweins, bevorzugt der Innenseite des Ohrs, besonders bevorzugt einem Bereich der Innenseite des Ohrs mit wulstartigen Verdickungen (plicae scaphae), entstammt.
  11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in einem Abschnitt der Schweinehaut die Epidermis, bevorzugt auch der obere Teil der Dermis, zur Erzeugung einer Wunde (6) entfernt wird.
  12. Ex-vivo-Hautorganmodell für männliche Haut, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11.
  13. Verwendung eines Ex-vivo-Hautorganmodells nach Anspruch 12 zur Untersuchung von Wundheilungsprozessen.
  14. Verwendung nach Anspruch 13 zur Untersuchung des Einflusses von Wundauflagen, Wundcremes, Wundsalben und deren Bestandteilen auf Wundheilungsprozesse.
  15. Anordnung zur Durchführung von Untersuchungen zu menschlicher oder tierischer Haut, gekennzeichnet durch einen Hautabschnitt (9) mit Dermis (3) und Epidermis (2) vom Körper oder Körperteil eines Tieres, wobei der Hautabschnitt (9) in Kontakt gebracht ist mit einem Androgen.
  16. Anordnung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Tier ein Schwein ist.
  17. Anordnung nach einem der Ansprüche 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Androgen in einem vorzugsweise wäßrigen Medium (4) enthalten ist und die Epidermis (2) des Hautabschnitts (9) einer Gasphase, vorzugsweise Luft, ausgesetzt ist.
  18. Anordnung nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Androgen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Testosteron, Dihydrotestosteron, Androsteron, 5-Dehydro-androsteron.
  19. Anordnung nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Androgen in einer für menschliche Männer durchschnittlichen physiologischen Konzentration in dem Medium (4) vorhanden ist.
  20. Anordnung nach einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß in einem Abschnitt der Haut die Epider mis (2) entfernt ist, so daß eine Wunde (6) in der Haut gebildet ist.
  21. Anordnung nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium (4) einen Wirkstoff enthält und/oder ein Wirkstoff auf oder in die Epidermis (2) oder auf oder in die Wunde (6) auf- oder eingebracht ist.
  22. Anordnung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, DNA, RNA, Aminosäuren, Aminosäurederivaten, Oligopeptiden, Oligonukleotiden, Hormonen, Wachstumsfaktoren, Cytokinen, Steroiden, Retinoiden, Ionen, Metallen oder Metallionen, Insulin, Glukose, Honig, Rinderserumalbumin (BSA), vasoaktiven Substanzen, Pflanzenextrakten und deren Bestandteilen, Algenextrakten und deren Bestandteilen, neuroaktiven Substanzen, pigmentaktivierenden oder -hemmenden Substanzen, proliferationsfördernden oder -hemmenden Substanzen, migrationsfördernden oder – hemmenden Substanzen, pH-verändernden Substanzen, radikalerzeugenden oder -hemmenden Substanzen, osmolaritätsverändernden Substanzen, Anti-aging-Wirkstoffen, kosmetischen Rohstoffen (z.B. Wollwachs, Bienenwachs, ätherische Öle etc.), antientzündlichen und entzündungsfördernden Substanzen, UV-Licht-Schäden verhindernden Substanzen, schmerzhemmenden Substanzen, allergieauslösenden Substanzen, antiallergischen Substanzen, bakteriziden und virusstatischen Substanzen, antiandrogenen Substanzen, energiespendenden Substanzen, Enzymen, Enzyminhibitoren und – aktivatoren, Liposomen, eukaryontischen und prokaryontischen Zellen, Pilzen, Viren und Prionen.
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