DE1143199B - Verfahren zur Herstellung von Equilin - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

deutsches mmm. Patentamt

kl. 12 ο 25/07

INTERNAT. KL. C 07 C

AUSLEGESCHRIFT 1143 199

S62724IVb/12o

ANMELDETAG: 23. A P R I L 1959

BEKANNTMACHUNG DER ANMELDUNG UND AUSGABE DER AUSLEGESCHRIFT:

7. FEBRUAR 1963

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Equilin.

Equilin ist das einzige bekannte, natürlich auftretende, physiologisch aktive Steroidhormon, das bisher weder teilweise noch vollständig synthetisiert werden konnte. Dieses starke Östrogen konnte bisher nur aus Stutenurin gewonnen werden. Eine der Schwierigkeiten bei der wirksamen Herstellung von Equilin beruht auf der Anwesenheit der nichtkonjugierten Doppelbindungen im Ring B, die die leichte Isomerisation des Equilins mit Säure oder seine Aromatisierung zu Equilenin verursachen.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Equilin ist nun dadurch gekennzeichnet, daß man nach an sich bekannten Methoden einen 17-Ester des 6j3-Bromtestosterons oder von dessen 19-Nor-analogen dehydrohalogeniert, die erhaltene Δ ^β> '-Verbindung mit Acetylchlorid und Essigsäureanhydrid erhitzt, den erhaltenen 17-Ester des zl³>⁵-⁷-Androstatrien- bzw. 19-Norandrostatrien-3^-acetats mit einem Doppelhydrid hydriert und die 17-ständige Estergruppe hydrolysiert, die erhaltene Δ ⁵-⁷-3,17-Dihydroxyverbindung nach Oppenauer oxydiert, das erhaltene zH-⁷-3,17-Diketon, sofern es der Androstanreihe angehört, auf mikrobiologischem Wege oder durch Umsetzung mit Selendioxyd dehydriert und die erhaltene Verbindung durch Erhitzen aromatisiert, sofern das /H-⁷-3,17-Diketon der 19-Norandrostanreihe angehört,

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Verfahren zur Herstellung von Equilin

Anmelder: Syntex S.A., Mexiko (Mexiko)

Vertreter: Dr. W. Schalk, Dipl.-Ing. P. Wirth,

Dipl.-Ing. G. E. M. Dannenberg

und Dr. V. Schmied-Kowarzik, Patentanwälte, Frankfurt/M., Große Eschenheimer Str. 39

Beanspruchte Priorität: Mexiko vom 24. April 1958 (Nr. 50 809)

Albert Bowers, Carlos Casas Campillo, John Anthony Zderic und Carl Djerassi,

Mexiko (Mexiko), sind als Erfinder genannt worden

insbesondere auf mikrobiologischem Wege oder durch Behandlung mit Selendioxyd gleichzeitig dehydriert und aromatisiert.

Das nachstehende Formelschema erläutert das erfindungsgemäße Verfahren:

OR'

R ί

II

R²O

III

!I

/v/

R ! Μ/Χ/'

VIII

VII R ί

V
VI

HO

IV

In den obigen Gleichungen steht R für Wasserstoff oder einen Methylrest; R¹ für eine KohlenwasserstofF-carbonsäureestergruppe mit bis zu 12 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise eine niedrigere Fettsäureester-

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gruppe, wie ζ. B. Acetat; X für Chlor oder vorzugsweise Brom und R₂ für einen niedrigeren Fettsäurerest, vorzugsweise Acetat.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde das 6)3-Brom-19-nor-testosteronacetat(I) zu ^⁴'⁶-Androstadien-17(8-ol-3-on-!7-acetat bzw. seinem 19-Noranalogen (II) dehydrobromiert, indem z. B. mit Calciumcarbonat in Mischung mit Dimethylformamid unter Rückfluß erhitzt wurde. Dann wurde II mit einem Überschuß an Acetylchlorid und Essigsäureanhydrid, vorzugsweise in Gegenwart von Pyridin, erhitzt, wodurch Zl³>⁵<⁷-Androstadien-3,8,17/9-dioldiacetat (III; R = CH₃) oder sein 19-Noranaloges (III; R = H) erhalten wurde.

Sodann wurde die 3(4)-ständige Doppelbindung von III durch Umsetzung mit einem Doppelhydrid selektiv gesättigt, wobei gleichzeitig die Acetatgruppen hydrolysiert wurden; es wurde z. B. mit Natriumborhydrid in Gegenwart von Tetrahydrofuran, Methanol und Wasser unter Rückfluß erhitzt. Dabei wurde zl⁵>⁷-Androstadien-3/3,17/?-diol (IV; R = CH₃) bzw. 19-Nor-zJ⁶'⁷-androstadien-3^,17_je-diol (IV; R = H) erhalten.

Durch Oppenauer-Oxydation, d. h. durch Umsetzung mit Aluminiumisopropylat in Gegenwart eines Wasserstoffakzeptors, wurde die 10-Methylverbindung der Formel IV in Zf⁴>⁷-Androstadien-3,17-dion (V) umgewandelt, dessen Herstellung auf einem anderen Wege bereits in der Literatur beschrieben ist. Entsprechend wurde die 19-Nor-Verbindung der Formel IV in 19-Nor-Δ ⁴>⁷-androstadien-3,17-dion (VI) umgewandelt.

Darauf wurde V in 1(2)-Stellung auf mikrobiologischem oder chemischem Wege dehydriert, indem mit Mikroorganismen, wie Corynebacterium simplex, Mycobacterium sp. oder einem Fungus der Septomyxa-Art, bebrütet oder z. B. mit Selendioxyd unter Rückfluß erhitzt wurde. Die besten Ergebnisse wurden erzielt, wenn 12 bis 72 Stunden bei etwa 28 ⁰C unter Belüftung mit Septomyxa affinis ATCC 6737 in einem wäßrigen, Pepton und Getreideweichflüssigkeit enthaltenden Medium bebrütet wurde. Das erhaltene Zl¹>⁴'⁷-Androstatrien-3,17-dion (VIII) wurde zusammen mit Mineralöl oder Tetralin auf etwa 600⁰C erhitzt; diese Pyrolyse lieferte das gewünschte Equilin (VIII).

Beim 19-Nor-Zl⁴>⁷-androstadien-3,17-dion (VI) wurde die Aromatisierung des Ringes A in einer Stufe durch Bebrütung mit den obengenannten Mikroorganismen oder durch Behandlung mit Selendioxyd, N-Bromsuccinimid, N-Bromacetamid oder ähnlichen Reagenzien erreicht. Vorzugsweise wurde etwa 12 bis 72 Stunden bei einer Temperatur von etwa 28° C mit Corynebacterium simplex ATCC 4964 in einem wäßrigen, Hefeextrakt enthaltenden Medium bebrütet und so das Equilin (VIII) hergestellt.

Die obigen Reaktionen, die nach an sich bekannten Methoden durchgeführt werden, können innerhalb eines weiten Bereiches modifiziert werden, sowohl in bezug auf die verwendeten Reaktionsteilnehmer als auch in bezug auf die Bedingungen, unter denen sie durchgeführt werden.

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Beispiel 1

Rohes 6/9-Brom-19-nortestosteron-17-acetat (2,20g) wurde mit 3,2 g Calciumcarbonat und 40 ecm Dimethylformamid vermischt und 1 Stunde unter einer StickstofFatmosphäre zum Rückfluß erhitzt; die Mischung wurde gekühlt und filtriert, das Filtrat mit Wasser verdünnt und mit Äthylacetat extrahiert. Das Extrakt wurde mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Äthylacetat abgedampft. Der Rückstand wurde an neutraler Tonerde chromatographiert, und die festen Fraktionen wurden aus Aceton umkristallisiert. Man erhielt ίο 19-Nor-J⁴'⁶-androstadien-17|8-ol-3-on-17-acetat; F. = 113 bis 114°C; [«to =-38° (Chloroform);

JEtOH

282 bis 284 ηιμ; log E = 4,29.

Eine Mischung aus 2,5 g der obigen Verbindung, 2 ecm Pyridin, 20 ecm Acetylchlorid und 50 ecm Essigsäureanhydrid, wurde 2 Stunden unter einer Stickstoffatmosphäre zum Rückfluß erhitzt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abgedampft und Rückstand aus Methanol umkristallisiert. Man erhielt 19-Nor-Zl³'⁵'⁷-androstatrien-3,17/S-dioldiacetat; F. = 163 bis 165°C; [oc]_D = —28,6° (Chloroform); ^°^H = 300, 312 und 328 ΐημ; logE = 4,32, 4,41 und 4,21.

Eine Lösung aus 2 g der obigen Verbindung in einer Mischung aus 50 ecm Methanol und 50 ecm Tetrahydrofuran wurde mit einer Lösung aus 1 g Natriumborhydrid in 10 ecm Wasser vermischt und 1 Stunde unter Rückfluß gehalten; nach dem Abkühlen wurde der Überschuß an Hydrid durch langsame Zugabe von Essigsäure zersetzt und die Mischung dann auf ein kleines Volumen konzentriert, mit Wasser verdünnt und mit Äthylacetat extrahiert; der Extrakt wurde mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft. Die Umkristallisation des Rückstandes aus Methanol lieferte 19-Nor-zl⁵>⁷-androstadien-3j8,17j8-diol; F. = 192 bis 195°C; {«]_D = +287° (Chloroform); A='°^H = 272, 282 und 296 ηιμ; logE = 4,05, 4,06 und 3,80.

1,6 g des obigen Diols wurden in 300 ecm Toluol und 20 ecm Cyclohexanon gelöst, worauf 30 ecm des Lösungsmittels abdestilliert wurden, um Spuren der Feuchtigkeit zu entfernen. Zu der heißen Lösung wurden 1,6 g Aluminiumisopropylat in 20 ecm wasserfreiem Toluol zugegeben und die Mischung 3 Stunden unter Rückfluß gehalten, mit Wasser und einer wäßrigen Lösung von Natriumkaliumtartrat verdünnt und einer Wasserdampfdestillation unterworfen. Der gekühlte Rückstand wurde mit Äthylacetat extrahiert, der Extrakt mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft, Der Rückstand wurde an 60 g Silicagel chromatographiert. Die mit Benzol—Äther (9:1) erhaltenen Eluate lieferten einen festen Rückstand, der aus Äther umkristallisiert wurde. Man erhielt 19-Nor-Zl⁴'⁷-androstadien-3,17-dion; F. = 148 bis 149°C; [<x]_D = +127°(Chloroform); λ^°^Η = 238ηιμ; log E = 4,10.

Je 30 ecm eines l°/oig^en wäßrigen Hefeextraktmediums wurden in dreißig Erlenmeyerkolben mit einem Fassungsvermögen von 125 ecm gegeben und dann mit einer Kultur von Corynebacterium simplex ATCC 6946 beimpft. (Diese wurde erhalten, indem ein wäßriges Medium eines l%igen Hefeextraktes mit einer Suspension dieser Bakterien 24 Stunden bebrütet wurde. Das so beimpfte Medium wurde 24 Stunden bei 28° C gerührt und auf diese Weise eine Kultur Corynebacterium erhalten, die zur Bebrütung mit dem Steroid verwendet wurde.)

In jeden Kolben wurde dann 1 ecm einer l°/_oigen Äthanollösungvon 19-Nor-Zl *> ⁷-androstadien-3,17-dion gegeben; diese Lösung war ohne Erhitzen kurz vor der Verwendung in destilliertem Äthanol hergestellt worden. Die Mischungen wurden dann 24 Stunden bei 28⁰C unter kontinuierlichem Rühren bebrütet; bei anderen Versuchen wurde die Bebrütungszeit auf 72 Stunden ausgedehnt, ohne daß das Ergebnis verändert wurde.

Der Inhalt der dreißig Kolben wurde zu drei annähernd gleichen Teilen vereinigt und mit fünfmal je 500 ecm Methylenchlorid extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt, mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, und das Methylendichlorid wurde abgedampft. Der Rückstand wurde durch Chromatographie an gewaschener Tonerde gereinigt, wobei das Produkt mit Mischungen von Benzol und Äther eluiert wurde. Die Umkristallisation aus Äthylacetat lieferte Equilin, das mit natürlichen Proben dieses Materials identisch war.

Beispiel 2

Es wurde eine Kultur von Septomyxa affinis ATCC 6737 hergestellt, indem ein wäßriges Medium, das 2°/o Pepton und 5% Getreideweichflüssigkeit enthielt, mit einer wachsenden Kultur dieses Pilzes in dem gleichen Medium beimpft wurde. Die Mischung wurde unter Rühren bei einer Temperatur von etwa 28 ⁰C bebrütet.

Zu je 11 der so erhaltenen Septomyxakultur wurden 30 ecm einer Lösung des nach Beispiel 1 hergestellten 19-Nor-zl⁴'⁷-androstadien-3,17-dions in Äthanol zugegeben ; diese Lösung war kurz vor der Verwendung in destilliertem Äthanol hergestellt worden. Die Mischung wurde 24 Stunden bei einer Temperatur von etwa 28⁰C und unter Belüftung gerührt; bei anderen Versuchen wurde die Bebrütungszeit auf 72 Stunden verlängert, wobei die gleichen Endergebnisse erzielt wurden.

Das Produkt wurde mit mehreren Teilen Methylenchlorid extrahiert, der Extrakt mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck auf ein kleines Volumen konzentriert. Der Rückstand wurde einer Chromatographie an gewaschener Tonerde unterworfen, wobei die Mischung mit Benzol und Äther eluiert wurde. Die Umkristallisation aus Äthylacetat lieferte Equilin, welches dem gemäß Beispiel 1 erhaltenen Produkt entsprach.

Beispiel 3

Gemäß dem Verfahren des Beispiels 1 wurde 6-Bromtestosteronacetat in zJ⁴«⁷-Androstadien-3,l 7-dion umgewandelt. Das letztere wurde, wie im Beispiel 2 beschrieben, mit einer Kultur von Septomyxa affinis ATCC 6737 bebrütet und das Bebrütungsprodukt isoliert. Man erhielt Δ ¹'⁴'⁷-Androstatrien-3,17-dion.

Eine Mischung aus 500 mg /l¹'⁴-⁷-Androstatrien-3,17-dion und 50 ecm Mineralöl wurde langsam durch ein Glasrohr geleitet, welches mit Glasspänen gefüllt war, und auf etwa 600 ° C erhitzt. Die so erhaltene trübe Lösung wurde abgekühlt, in einer Säule an 20 g gewaschener Tonerde adsorbiert und die Säule mit Hexan gewaschen, um das Mineralöl zu entfernen, worauf das Produkt mit Mischungen aus Benzol und Äther eluiert wurde. Die Umkristallisation aus Äthylacetat lieferte Equilin, dessen Eigenschaften denen der nach den vorhergehenden Beispielen erhaltenen Endprodukten entsprachen.

Beispiel 4

Eine Mischung aus 1 g des nach Beispiel 1 hergestellten zl⁴-⁷-Androstadien-3,17-dions, 50 ecm tertiärem Butanol, 0,5 g Selendioxyd und 0,5 ecm Pyridin wurde 72 Stunden unter einer Stickstoffatmosphäre unter Rückfluß erhitzt. Die abgekühlte Mischung wurde durch Diatomeenerde (bekannt unter dem Handelsnamen Celit) filtriert und das Filter mit heißem tertiärem Butanol gewaschen; das Filtrat und die Waschlaugen wurden kombiniert, und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wurde in Aceton gelöst und die Lösung V2 Stunde mit Holzkohle unter Rückfluß erhitzt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Aceton abgedampft. Die Chromatographie des Rückstandes an neutraler Tonerde lieferte Δ ¹^. ⁷-Androstatrien-3,17-dion.

Claims (4)

PATENTANSPRÜCHE:

1. Verfahren zur Herstellung von Equilin, dadurch gekennzeichnet, daß man nach an sich bekannten Methoden einen 17-Ester des 6^-Bromtestosterons oder von dessen 19-Nor-analogen dehydrohalogeniert, die erhaltene /d⁶-⁷-Verbindung mit Acetylchlorid und Essigsäureanhydrid erhitzt, den erhaltenen 17-Ester des /J³'⁵>⁷-Androstatrien- bzw. 19-Norandrostatrien-3)3-acetats mit einem Doppelhydrid hydriert und die 17-ständige Estergruppe hydrolysiert, die erhaltene z!⁵«⁷-3,17-Dihydroxyverbindung nach Oppenauer oxydiert, das erhaltene Zl^4>7-3,17-Diketon, sofern es der Androstanreihe angehört, auf mikrobiologischem Wege oder durch Umsetzung mit Selendioxyd dehydriert und die erhaltene Verbindung durch Erhitzen aromatisiert, sofern das ^⁴>⁷-3,17-Diketon der 19-Norandrostanreihe angehört, insbesondere auf mikrobiologischem Wege oder durch Behandlung mit Selendioxyd gleichzeitig dehydriert und aromatisiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Dehydrobromierung durch Erhitzen mit Calciumcarbonat in Dimethylformamid erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reduktion der 3-ständigen Doppelbindung durch Erhitzen mit Natriumborhydrid in Tetrahydrofuran, Methanol und Wasser erfolgt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Dehydrierung der 1(2)-Stellung durch Bebrüten mit Mikroorganismen der Art Corynebacterium oder Arten des Septomyxapilzes durchgeführt wird.

In Betracht gezogene Druckschriften:

J. Am. Chem. Soc, 72, S. 4534 ff. (1950), 4531 ff. (1950); 78, S. 6213 (1956); 77, S. 4184ff. (1955); 79_T S. 2658 ff. (1957);

Bull. Soc. Chim. France, 1957, S. 1289ff.;

HeIv. Chim. Act., 39, S. 734 ff. (1956);

J. biol. Chem., 230, S. 31 ff. (1958);

Tetrahedron, 2, S. 165 ff. (1958).

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